Document Type : Research Paper
Authors
University of tarbiat modares
Abstract
Viola odorata, belongs to the family Violaceae, has medicinal properties due to presence of compounds such as carbohydrates and mucilage found in its leaves and flowers. Polysaccharide hydrocolloids, including mucilage compounds, are abundant in nature and commonly found in many higher plants. These polysaccharides constitute a structurally diverse class of biological macromolecules with a broad range of physicochemical properties, are widely used for various applications in pharmacy and medicine. This study was conducted to investigate and trace the mucilage compounds in the various stages of development of the leaves of V.o dorata, due to the economic and systematic values of these proprietary compounds. In this study, the seeds were growth under greenhouse conditions and conducted in a completely randomized design.To investigate and trace the mucilage compounds in various stages of plant growth, the cross-section of the leaves was made and painted with mucilage detection reagents . Results showed that the number of mucilage elements is very low at seedling stage and the mucilage compounds limited to cell wall. In the vegetative stage, an increase in the number and diameter of mucilage cells and their integration were observed. In the reproductive stage, the mucilage channels and cavities were created from fusion of adjacent cells especially in the area near the lower epidermis and main vein. Mucilage compounds increased with the increasing age of leaves, that this may be a developmental-protective reaction. This feature can be used in order to increase the production of exclusive pharmaceutical compounds of V. odorata.
Keywords
Main Subjects
ردیابی ترکیبات موسیلاژی در مراحل مختلف تکوین برگ بنفشه معطر
L.) (Viola odorata
زهراشفقت وفاطمهزرینکمر*
تهران، دانشگاهتربیتمدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم گیاهی
تاریخ دریافت: 5/2/96 تاریخ پذیرش: 16/11/96
چکیده
بنفشه معطر Viola odorata گیاهی متعلق به تیره بنفشگان میباشد که به دلیل وجود ترکیباتی از قبیل کربوهیدراتها و موسیلاژ در برگ و گل آن خواص دارویی دارد. هیدروکلوئیدهای پلی ساکاریدی از جمله ترکیبات موسیلاژ در بسیاری از گیاهان عالی یافت میشوند. این پلی ساکاریدها یک کلاس ساختاری متنوع از ماکرومولکولهای بیولوژیکی با طیف گستردهای از خواص فیزیکی تشکیل می دهند که به طور گستردهای در پزشکی و تولید دارو کاربرد دارند. این تحقیق با هدف بررسی و ردیابی ترکیبات موسیلاژی و انواع آن در مراحل مختلف تکوین برگ گیاه بنفشه معطر به دلیل ارزش اقتصادی و سیستماتیکی این ترکیبات انحصاری انجام گردید. بذرهای گیاه بنفشه معطر در شرایط مطلوب گلخانه در قالب طرح کاملا تصادفی کاشته شدند. جهت بررسی و ردیابی ترکیبات موسیلاژی در مراحل مختلف رشد گیاه، برش عرضی از برگ ها تهیه و با رنگهای شناساگر موسیلاژ رنگ آمیزی شدند. نتایج نشان داد که تعداد عناصر موسیلاژی در مرحله برگچه ای بسیار کم و موسیلاژ فقط محدود به دیواره سلولی است. در مرحله رویشی، افزایش تعداد و قطر سلول های موسیلاژی و نیز بهم پیوستن آنها مشاهده شد. در برگ های بالغ، کانالها و حفره های موسیلاژی، در ناحیه های نزدیک به اپیدرم تحتانی و رگبرگ اصلی، از بهم پیوستن سلول های موسیلاژی مجاور به وجود آمدند، این ویژگی باعث افزایش مقدار موسیلاز نیز میگردد که یک واکنش تکوینی-حفاظتی در گیاه بنفشه معطر محسوب می شود. این ویژگی می تواند در راستای بهره برداری و افزایش تولید ترکیبات دارویی منحصر گیاه بنفشه معطر مورد استفاده قرار گیرد.
واژه های کلیدی: تکوین برگ، عناصر موسیلاژی، بنفشه معطر.
* نویسنده مسئول، تلفن: 02182884440 ، پست الکترونیکی: zarinkamar@modares.ac.ir
مقدمه
جنس Violaشامل حدود 129 گونه است و در بسیاری از مناطق عاری از یخبندان جهان پراکنده شدهاند. این جنس احتمالاً از جنوب آمریکا منشأ گرفته است اما بیشتر مراکز تنوع مورفولوژیکی و تاکسونومی آن در نیمکره شمالی واقع شده است(14). بنفشه معطر Viola odorata گیاهی علفی و بوتهای، پایا و چندساله، که توسط استولونهای مویی شکل و نازک یا بذر گسترش مییابد و ارتفاع آن بین 5 تا 15سانتی متر است. برگها معمولا به شکل روزت هستند و به رنگ سبز تیره مشاهده میشوند. گلها به صورت منفرد روی دمگل و گیاه قرار گرفتهاند (19). بنفشه معطر از زمانهای قدیم در طب سنتی به ویژه در درمان سرطان و سیاه سرفه استفاده میشده است (1). از قسمتهای مختلف این گیاه به عنوان ضد التهاب، معرق، ادرارآور، نرم کننده، خلط آور، ضد تب، ضد سرفه و ملین و همچنین در درمان اختلالات گوارشی استفاده میشود (6). عصاره برگی این گیاه فعالیت آنتی اکسیدانی در شرایط آزمایشگاهی از خود نشان میدهد (7). پلی ساکاریدهای محلول در آب استخراج شده از گیاه بنفشه معطر دارای فعالیت ضد التهابی میباشند، که این مورد از طریق سرکوب ترشح و تکثیر مراحل التهاب و با تغییر در نفوذ پذیری مویرگی مشخص شده است (5) .
از مهمترین ترکیبات گیاه بنفشه معطر می توان به موسیلاژ، آنتوسیانین، اسانس و مواد رنگی آن اشاره کرد (16). ترکیبات موسیلاژی از جمله ترکیبات گیاهی با طیف وسیع کاربردهای دارویی می باشند که یک پروتئوگلیکان قطبی و ترکیبی از پلیمرهای با وزن مولکولی مشابه، شامل یک بخش خنثی (75٪) و دو بخش اسیدی (25٪) هستند. علاوه بر این، آثاری از پکتین و گلوکان هم در آنها دیده میشود (24). این ترکیبات در گیاهان میتوانند به عنوان بخشی از محتویات سلول ، و یا در برخی موارد به عنوان یک محصول سازمان نیافته از محتویات سلولی هستند (20). علاوه بر موارد ذکر شده، موسیلاژ ممکن است به عنوان یک محصول جانبی داخل سلولی از دیواره اولیه یا به عنوان یک ماده بین سلولی، لایه بیرونی سازنده پیت، اشعه مغزی، پارانشیم و سلولهای دیگر بوجود آید (20). همچنین میتواند توسط تعدادی از کرکهای ترشح کننده (غدد) نیز ترشح شود.
در بسیاری از مطالعات فراساختاری به این نتیجه رسیدند که دستگاه گلژی در تولید ترکیبات موسیلاژی نقش دارد. دیکتیوزومهای متعددی در سلولهای ترشح کننده موسیلاژ وجود دارند. وجود پلیساکاریدها در ویزیکولهای گلژی توسط روشهای سیتوشیمی و هیستوشیمی به اثبات رسیده است (23). بسیاری از محققان بر این باور هستند که ژلاتینه شدن اپیدرم برگ بیشتر برای ذخیرهسازی در برگ است. ترکیبات موسیلاژی ممکن است در گیاه نقشهای متفاوتی داشته باشند ازجمله: تحمل سرما، انتقال آب، پاسخ به زخم، اثر متقابل پاتوژن و گیاه میزبان، تعادل یونی درسلولهای گیاهی، ذخیره کربوهیدرات، ذخیره مواد (10) تعادل آب (3)، با این حال عملکرد فیزیولوژیکی آنها در بسیاری از موارد نامشخص است. علاوه بر این، با توجه به غلظت بالایی که گروههای هیدروکسیل در پلی ساکاریدها دارند، ترکیبات موسیلاژی به طور کلی دارای ظرفیت آبگیری بالایی هستند و این امر موجب بررسی نقش آنها در زمینه روابط آبی شده است. توانایی ترکیبات موسیلاژی برای آبرسانی ممکن است به عنوان یک مکانیسم در گیاهان در برابر تنشهای غیر زیستی به خصوص تنش خشکی (4) ارایه شود. توجه به دانش زیست شناسی تکـوینی و مطالعـه مراحـل نمـوی بافتها برای حفظ گیاهان، به ویژه گیاهـانی کـه از نظر اقتصادی از ارزش بالایی بر خوردارند، از اهمیت خاصی برخوردار است. هدف از این تحقیق توصیف جنبههای مورفولوژیکی و سیتولوژی عناصر موسیلاژی در طول تکوین و بررسی تغییرات انواع و فراوانی عناصر موسیلاژی طی مراحل نمو برگ گیاه بنفشه معطر برای دستیابی به اطلاعات تکمیلی جهت شناسـایی دقیقتر این این ترکیبات میباشد. اطلاعات حاصـل بـه شناسـایی ویژگـیهـایی منجر میگردد که میتـوان از آنهـا در موارد اقتصادی و مطالعـات پایـهای دیگـر همچون رده بندی دقیقتر گیاه و پی بردن به روابـط تکـاملی در تیره Violaceae استفاده کرد.
مواد و روشها
مواد گیاهی، شرایط رشد: برای این مطالعه، بذرهای گیاه از مرکز تحقیقات جهاد و کشاورزی اصفهان تهیه و پس از ضد عفونی شدن در شرایط تاریکی و مرطوب در قالب طرح کاملا تصادفی کاشته شدند. پس از جوانه زدن گیاهان، به گلدانهای حاوی پرلیت منتقل و تحت شرایط گلخانه ای (16 ساعت نور/ 8 ساعت تاریکی، RH 80٪ و دمای 2 ± 25 درجه سانتی گراد) نگهداری شدند. به منظور بررسی صفات ریختشناسی، تعدادی از نمون ها در محلـول ) FAAفرمـالین، اتـانول و اسـتیک اسـید، بـه نـسبت حجمــی ۱ :۳ :۶ ) تثبیــت شــده و از بــرگ آنهــا برش گیری و اسلایدهای ثابت تهیه شد. این مقاطع با قرمز کنگو و سبز متیل رنگ آمیزی شدند. سپس با میکروسکوپ نوری مورد مطالعه قرار گرفتند. تعداد سـلولهـای روزنـه در واحد سطح )شاخص روزنه( برای سطح رویـین و زیرین برگ محاسبه و نـوع آنهـا نیـز شناسـایی شـد. بـرای اندازهگیری شاخص روزنه(SI) برحسب درصد، از معادله زیر استفاده شد(2).
SI = {S ÷S+E}.100
که در آن S و E به ترتیـب تعـداد روزنـه و تعـداد سـلولهـای اپیدرمی در واحد سطح (میلیمترمربع) هستند.
سایر اندازه گیریهای آناتومی توسط نرم افزارTs View صورت گرفت.
شناسایی ترکیبات موسیلاژی: جهت بررسی و ردیابی ترکیبات موسیلاژی در مراحل مختلف رشد گیاه، به ترتیب در 2 ،6 و 12 هفتگی پس از جوانه زنی برش عرضی از برگها در سه تکرار تهیه و شناسایی ترکیبات موسیلاژی توسط آلسین بلو (آلسین بلو 1/0 % در استیک اسید 3 %) (سیگما آلدریچ) در 3pH= به مدت 10 دقیقه و روتنیوم رد (05/0 %) به مدت 30 دقیقه با برشهای تازه دستی در دمای آزمایشگاه انجام شد. سپس برشها در آب مقطر شسته و زیر میکروسکوپ نوری زمینه روشن مشاهده شدند.
استخراج و اندازه گیری مقدار موسیلاژ: برگ های گیاه بنفشه معطر در سه مرحله گیاهچهایی، رویشی و زایشی برداشت شدند. بافتها در دمای oC 40 توسط آون به مدت 1 هفته خشک شدند و سپس با استفاده از آسیاب خرد و از غربال315/0 میلی متری مش عبور داده شدند. نیم گرم از مواد پودر هموژن شده در یک استوانه مدرج شیشهای 25 میلی لیتری با ارتفاع بیش از 120 تا 130 میلی لیتری با تقسیمات 5/0 میلی لیتری، با چوب پنبه بسته شده بود، قرار داده شد. پودر با یک میلی لیتر اتانول (96٪) خیس شد، آب مقطر تا 25 میلی لیتر اضافه شد و سپس در استوانه بسته شد. این مخلوط هر 10 دقیقه یک بار به مدت یک ساعت به شدت تکان داده شد و سپس به مدت 3 ساعت ساکن باقی ماند. حجم اشغال شده توسط عامل تجزیه کننده از جمله موسیلاژ بهم پیوسته ثبت شد. موسیلاژ خام با آب (500 میلی لیتر) از برگ های گیاه (5 گرم) همگن شده، تحت تکان دادن به مدت 40 ساعت در دمای اتاق استخراج شد. پس از سانتریفیوژ کردن (5 دقیقه، o 41درجه سانتیگراد،rpm 20000 )، مایع رویی برداشته شد و در دمای41 درجه سانتیگراد ذخیره شد. رسوب یک بار دیگر با استفاده از همین روش مجددا استخراج شد و مایع رویی آبی توسط تبخیر به 150 میلی لیتر تغلیظ شد. محلول موسیلاژ به 600 میلی لیتر از مخلوطی از 96٪ اتانول و 1٪ استیک اسید اضافه شد. رسوب با اتانول سرد شسته و لیوفیلیزه شد. موسیلاژ خشک شده وزن شد (11).
آنالیزهای آماری: آنالیز دادهها توسط آنالیز واریانس و آزمون دانکن با استفاده از نرم افزار19 Spssبه منظور مقایسه میانگین دادهها برای پی بردن به اختلافات معنیدار در سری دادهها صورت گرفت. آنالیز مطالعات آناتومی توسط نرم افزار Ts View صورت گرفت.
نتایج و بحث
خصوصیات تشریحی و ریخت شناسی برگ: از نظر تشریحی، برگ در گیاه بنفشه معطر شامل دو قسمت اصلی پهنک و رگبرگ میانی است. پهنک از لحاظ بافتشناسی شامل دو لایه اپیدرم تک ردیفه فوقانی و تحتانی و مزوفیل است. اپیدرم فوقانی دارای یک لایه نسبتا ضخیم کوتیکول بر روی سطح بیرونی می باشد. مزوفیل شامل دو لایه پارانشیم نردهایی به سمت اپیدرم فوقانی و پارانشیم اسفنجی به سمت اپیدرم تحتانی (برگ از نوع برگ پشتی-شکمی bifacialیا dorsiventral) است(شکل1-الف). پارانشیم نردهایی شامل یک لایه سلولهای کشیده و متراکم است. پارانشیم حفرهایی شامل سه تا پنج لایه سلول تقریبا متراکم میباشد و دستجات آوندی (رگبرگ های فرعی) به طور یکنواخت بین لایههای پارانشیم اسفنجی پراکنده شدهاند. دستههای آوندی توسط یک ردیف از سلولهای پارانشیمی غلاف آوندی احاطه شده است. به این حالت که غلاف آوندی دستجات چوب و آبکش را در بر میگیرد پریدرمیک گفته میشود (شکل1-الف). سطح خارجی پهنک عموما توسط کرکهای ساده تک سلولی و طویل پوشیده شده است و کرکها با تراکم بیشتری در سطح بالایی برگ مشاهده میشوند (شکل1-ب). این کرکها در همه مراحل تکوین گیاه دیده میشوند و با افزایش سن گیاه بر تعداد آنها افزوده میشود. از ویژگیهای منحصر به فرد بنفشه معطر وجود یک یا دو کرک تک سلولی در قسمت فوقانی رگبرگ میانی است (شکل1-ج). رگبرگ میانی تقریبا به صورت تخم مرغی شکل با یک برجستگی به سمت اپیدرم فوقانی مشاهده میشود. نکته قابل توجه در مورد رگبرگ میانی این است که در سطح فوقانی دقیقا لایه زیر اپیدرم رویی، یک لایه سلول وجود دارد، به نظر میرسد این سلولها محل ساخت و تجمع موسیلاژ هستند (شکل4-ب). علاوه بر آن، زیر اپیدرم فوقانی رگبرگ میانی یک لایه پارانشیم نردهای وجود دارد که ادامه پارانشیم نردهایی پهنک است. بین دو لایه اپیدرم رگبرگ میانی یک دسته آوند هلالی شکل یک جانبه وجود دارد. آوندهای چوب به سمت اپیدرم فوقانی و آوند آبکش به سمت اپیدرم تحتانی قرار گرفته است و فضای مابین با پارانشیم زمینه پر شده است.
طبق جدول1 ضخامت بافتهای برگ گیاه بنفشه معطر اندازه گیری شد و شواهد افزایش این ضخامت ها را در مراحل مختلف تکوین با افزایش سن گیاه بیان می کنند. نوع دستگاه روزنهایی در گیاه بنفشه معطر از نوع آنیزوسیتیک میباشد (شکل1-د) و تراکم روزنه در سطح فوقانی کمتر از سطح تحتانی است (جدول1).
جدول1- میانگین و انحراف معیار پارامترهای آناتومیکی اندازه گیری شده در مراحل مختلف تکوین برگ
مرحله زایشی |
مرحله رویشی |
مرحله گیاهچه ای |
پارامترها/برگ |
a4/0±69/3 a3/1±94/14 a4/2±61/19 a9/3±79/56 a2/3±36/38 a1/5±53/73 a8/2±29/17 a6/2±40/15 a8/12±09/286 a7/19±79/645 a2/41±38/5669 a4/3±33 a8/2±86/23 a6/3±77/36 |
b2/0±01/2 b1/1±76/9 a8/2±34/18 b4/3±95/37 c5/2±05/20 b6/4±27/57 ab3/2±55/15 b1/1±15/10 b4/4±64/60 b5/17±32/553 bc4/37±78/3643 b7/3±30 b3/2±79/17 b2/2±07/26 |
c1/0±82/0 c8/0±32/7 b9/0±62/9 c7/3±74/31 b8/1±81/14 c3/4±22/49 c7/1±66/9 c9/0±28/6 - - c5/32±08/3042 c6/2±23 c8/1±86/12 c5/2±58/19 |
ضخامت کوتیکول(μm) ضخامت اپیدرم تحتانی(μm) ضخامت اپیدرم فوقانی(μm) ضخامت مزوفیل تحتانی(μm) ضخامت مزوفیل فوقانی(μm) ضخامت پهنک برگ(μm) اندازه سلول اپیدرمی(μm) اندازه سلول موسیلاژی(μm) مساحت کانال موسیلاژی(μm) مساحت حفره موسیلاژی(μm) قطر دستجات آوندی (μm) تعداد سلول موسیلاژی(%) ایندکس روزنه فوقانی(%) ایندکس روزنه تحتانی(%) |
به طور کلی روزنهها در هر دو سطح فوقانی و تحتانی دیده میشوند که بر این اساس از نوع آمفی استوماتیک است. تمام ویژگیهای تشریحی و ریخت شناسی گیاه بنفشه معطر که مورد مطالعه قرار گرفت با مشاهداتی که قبلا در خانواده Violaceae گزارش شده مطابقت دارد (22).
عناصر موسیلاژی: براساس تصاویر تهیه شده از برشهای عرضی برگ مشخص شد که، عناصر موسیلاژی در برگ گیاه بنفشه معطر بر حسب سن برگ دارای اشکال و جایگاه متفاوتی میباشند (شکل های 3،2و4). به طور کلی تقریبا همه انواع عناصر موسیلاژی، شامل سلولها، حفرهها و کانالهای موسیلاژی در مراحل مختلف رشد و تکوین برگهای بنفشه معطر مشاهده شدند.
سلولهای موسیلاژی: باتوجه به نتایج بدست آمده، در مراحل اولیه رشد گیاه تعداد سلولهای موسیلاژی اندک است و ترکیبات موسیلاژی بیشتر در دیوارههای سلولی، که توسط آلسین بلو (یک رنگ پایه است، برای رنگ آمیزی پلی ساکارید اسیدی سولفاته و گلیکو پروتئین سولفاته بکار می رود و قابلیت جداسازی طیف ظریفی از ترکیبات موجود در دیواره سلولی را دارد) رنگ آمیزی شدند، این ترکیبات به رنگ آبی دیده شدند (شکل2-الف).
شکل 1- برش عرضی از برگ بنفشه معطر. الف) بخشهای مختلف برگ کوتیکول (Cu)، اپیدرم (Ep)، پارانشیم نرده ای (Pm)، پارانشیم اسفنجی (Sm)، آوند آبکش (Ph)، آوند چوب (Xy)، کلانشیم (Coll)، غلاف آوندی (Bs). ب) کرک های ساده تک سلولی. ج) کرک های تک سلولی منحصر به فرد بنفشه معطر در ناحیه رگبرگ میانی. د) روزنه های آنیزوسیتیک در
برگ بنفشه معطر
.
شکل 2- الف) برش عرضی از برگ در مرحله رویشی و مشاهده سلول های موسیلاژی (Mc) و دیواره حاوی موسیلاژ ب) سلول های موسیلاژی طی روند بلوغ از هم دور می شوند و این عمل آغاز تشکیل حفره های ترشحی را در پی دارد و جایگاه این سلول ها در بخش های مختلف بافت قابل رویت است.
شکل 3- الف) حفره های موسیلاژی(Cv) در نواحی اپیدرمی، زیراپیدرمی و رگبرگ اصلی برگ ب)حفره های موسیلاژی ایجاد شده در لایه اپیدرم فوقانی برگ بنفشه معطر
شکل 4- الف) برش عرضی برگ در مرحله زایشی ب) افزایش ضخامت کانال (Ch)در مرحله زایشی
تعداد این سلولها در این مرحله طبق جدول 1 مورد شمارش شدند و این تعداد در مقابل مراحل بعدی تکوین تعداد کمتری را به خود اختصاص میدهند. در این مرحله بدلیل اینکه موسیلاژ مانند یک لایه سوم دیواره رسوب میکند، برخی از سلولها، دیواره ضخیمتری نسبت به سایر سلولها دارند. رسوب لایههای سلولز در بالای رسوبات ترکیبات موسیلاژی در سلولهای اپیدرمی به وفور در مطالعات میکروسکوپی نوری گزارش شده است و این لایه را به عنوان دیواره سوم در نظر گرفتهاند(13،27). طبق نتایج حاصل از این مطالعه سلولهای موسیلاژی در نواحی اپیدرمی و زیراپیدرمی، مزوفیل اسفنجی و کلانشیمی مشاهده میشوند و فراوانی این سلولها در مرحله رویشی برگ بیشتر می باشد(جدول1) (شکل2-ب). سلولهای موسیلاژی ممکن است در تمام قسمتهای گیاه وجود داشته باشند. برخی از نویسندگان با توجه به اهمیت الگوهای توزیع سلولهای موسیلاژی به طبقه بندیهای مختلف پرداخته اند. از جمله: توزیع سلولهای موسیلاژی اپیدرمی در برگ که توسط رادل کوفر (25) و کراچ (17) مورد بحث قرار گرفت. سلولهای موسیلاژی گیاه سرخدار، در سلولهای مزوفیل طبیعی قرار دارند و در آیدوبلاستها مشاهده نمیشوند. واکوئل های اغلب سلول های پارانشیم نردهای و در حدود یک سوم از سلولهای پارانشیم اسفنجی حاوی موسیلاژهستند (24). در گیاه Thuja occidentalis، سلولهای موسیلاژی در غلاف آوندی مشاهده شدند (4). بسیاری از سلولهای غلاف آوندی و برخی از سلولهای پارانشیم و آیدیوبلاست ها در مزوفیل نیز دارای موسیلاژ هستند.
حفرههای موسیلاژی: حفرههای موسیلاژی در نواحی
اپیدرمی، زیراپیدرمی و رگبرگ اصلی برگ مشاهده شدند و فراوانی این حفرهها در انتهای مرحله رویشی برگ بیشتر بود (شکل3 -الف). در این مرحله تعداد و اندازه سلولهای موسیلاژی افزایش یافته است (جدول 1،شکل 3-ب). ساختارهای ترشحی اکثر گونه های Zorniaشامل اپیدرم حاوی موسیلاژ، حفره های موسیلاژی و ایدئوبلاست ترشح کننده ترکیبات فنلی میباشد. اپیدرم حاوی موسیلاژ در اکثر گونه ها یافت میشود و حفرههای موسیلاژی در هر دو سطح اپیدرمی وجود دارند(8). مطالعات انجام شده توسط تراچ تنبرگ و فاهن (28)، در مورد آیدوبلاستهای موسیلاژی و گروههای سلول های موسیلاژی که باعث ایجاد حفرهها و یا کانالها می شوند، همگی نشان دادند که موسیلاژ توسط سیتوپلاسم به عنوان یک لایه (لایه ها) دیواره اضافی ذخیره می شود و حفرات ممکن است با شکست و یا لیز دیواره های عادی نازک در سلول های مجاور در اواخر مرحله نمو بوجود آیند. نتایج بدست آمده در این مطالعه با نتایج بدست آمده میکروسکوپی نوری توسط استوارت (27)، و اسپج (26) مطابقت دارد.
کانال های موسیلاژی: کانالهای موسیلاژی در نواحی زیر اپیدرمیِ اپیدرم تحتانی پهنک برگ، در قسمت فوقانی رگبرگ اصلی و همچنین در دمبرگهای برگهای مرحله زایشی که توسط رنگ روتنیوم قرمز (رنگ غیر اختصاصی کاتیونی شش ظرفیتی (هگزا والانت) است که به پلی آنیونهای متنوع متصل میشود) به وضوح مشاهده شدند (شکل 3-الف). بیشترین تعداد این کانالها در مرحله زایشی برگ توسط رنگ امیزی با آلسین بلو مشاهده شدند (شکل 3-ب). در راسته مالواسه حفره یا کانال حاوی موسیلاژ در مزوفیل قرار دارند. کانالهای موسیلاژی در گیاهM. Guatemalense در دستجات آوندی قرار دارند (15).
تعداد و اندازه سلولهای موسیلاژی و مساحت حفرات در این مرحله به مقدار قابل توجهی افزایش یافته است (جدول1). میزان ترکیبات و عناصر موسیلاژی در برگهای مرحله زایشی گیاهان مختلف بسته به نوع گیاه متفاوت است. به عنوان مثال، کانتز (1891) اشاره کرد که کانالهای موسیلاژی با افزایش سن در پنیرکیان افزایش مییابند (18). با این حال، با افزایش سن گیاه ابتدا تعداد سلولهای موسیلاژی زیاد و موسیلاژ وارد فضای بین سلولی میشود (جدول1). همچنین با بلوغ گیاه از ضخامت دیواره کاسته شده و به مرور با از بین رفتن دیواره سلولی جای خود را به کانال موسیلاژی میدهند. لازم به ذکر است که با افزایش سن اندازه حفرات نیز بیشتر شده و تعدادآن افزایش یافت (جدول1).
تغییرات میزان موسیلاژ در مراحل مختلف تکوین: نتایج مربوط به تغییرات میزان موسیلاژ در مراحل مختلف تکوین برگ در نمودار 1 ارائه گردیده است.
مشاهده میشود که مقدار موسیلاژ در مراحل مختلف تکوین برگ اختلاف معنیداری دارد. با توجه به اثر معناداری این تغییرات بر میزان موسیلاژ، در نمودار 1 مقایسه موسیلاژ در مراحل مختلف ارائه شده است. مقدار موسیلاژ برگ در مراحل مختلف تکوینی متفاوت بود و با افزایش سن گیاه میزان موسیلاژ گیاه نسبت به مرحله گیاهچهای افزایش می یابد. لیکن افزایش میزان موسیلاژ در شرایط مختلف رشد روند متفاوتی را نشان میدهد و در مرحله زایشی بیشترین میزان موسیلاژ نسبت به سایر مراحل مشاهده میشود. این میزان در مرحله گیاهچهای از 33/4 درصد به 2/9 درصد در مرحله زایشی میرسد. سنتز، ترشح، ذخیره و اصلاحات ترکیبات موسیلاژی در مراحل مختلف رشد تحت تاثیر عوامل محیطی و داخلی هستند. لازم به ذکر است که سنتز و ترشح ترکیبات موسیلاژی در مراحل مختلف توسط شبکه تنظیمی از ژنهای مختلف و عوامل رونویسی کنترل میشود. این عوامل طوری تنظیم میشوند که مقدار موسیلاژ در مرحله زایشی افزایش پیدا میکند(9).
به نظر میرسد که چون در این مرحله برگ از نظر میزان فتوسنتز در بیشترین مقدار خودش است، تولید کربوهیدرات در مراحل زایشی افزایش می یابد. تا به امروز در مورد تغییرات میزان موسیلاژ در برگ گزارشی منتشر نشده است. در مطالعات قبلی مشخص شده است که بین مقدار موسیلاژ و تعداد سلول های موسیلاژی یا حفره ارتباط وجود دارد (12).