Document Type : Research Paper
Abstract
Sclerotinia is important fungal disease of sunflower in Iran that affects its yield. In this study, biochemical and enzymatic changes of sunflower lines (C39 and C100) were studied during different times after inoculation of the lines with Sclerotinia fungal isolates (SSU107 and SSKH41) under controlled conditions as a factorial based on completely randomized design (CRD). So, characteristics such as lipids peroxidation and accumulation of malon dialdehyde (MDA), antioxidant enzymes' activity like catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX) and guaiacol peroxidase (GPX) were studied. The results showed that Sclerotinia disease increased the biochemical and enzymatic changes of the plants infected with fungal isolates. Resistant and susceptible lines also showed a different response to the disease, so that the accumulation of MDA in resistant lines decreased, the least of which was related to resistant line C39 inoculation with the SSU107. In addition ascorbate peroxidase and guaiacol peroxidase enzymes' activities were more in resistant and susceptible lines, respectively. So, the APX enzymatic activity increased in the line C39 and the GPX enzymatic activity increased in the line C100 after inoculation with SSU107 fungal isolate. According to the results of this study, the line C39 showed good partial resistance, because of the lowest level of lipid peroxidation and the highest enzymatic activities that causes resistance mechanism of plant against pathogens.
Keywords
Main Subjects
بررسی تغییرات بیوشیمیایی و فعالیت آنزیمی لاینهای حساس و مقاوم آفتابگردان (Helianthus annuus L.) در واکنش به بیماری قارچی اسکلروتینیا
رضا درویشزاده1، 2*، نجمه ارجمند3، رقیه نجفزاده4و رضا حیدری3
1ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی، گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی
2ارومیه، دانشگاه ارومیه، پژوهشکده زیستفناوری
3ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده علوم پایه، گروه زیستشناسی
4میاندوآب، دانشگاه ارومیه، مرکز آموزش عالی شهید باکری، گروه گیاهان دارویی
تاریخ دریافت: 17/3/95 تاریخ پذیرش: 15/9/95
چکیده
اسکلروتینیا از بیماریهای قارچی مهم آفتابگردان در ایران میباشد که عملکرد این محصول را تحت تأثیر قرار میدهد. از اینرو، بررسی واکنش فنوتیپی و مولکولی ژنوتیپها به عامل بیماری برای تولید ارقام هیبرید مقاوم از اهمیت ویژهای برخوردار میباشد. در این پژوهش تغییرات بیوشیمیایی و آنزیمی لاینهای آفتابگردان 100) و (C39 در شرایط کنترل شده طی زمانهای مختلف پس از آلودگی با جدایههای قارچ اسکلروتینیا (SSKH41 و (SSU107 بصورت فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی بررسی گردید. بدینمنظور خصوصیاتی مانند میزان پراکسیداسیون لیپیدها و تجمع مالون دیآلدهید (MDA)، فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانتی مانند کاتالاز (CAT)، آسکوربات پراکسیداز (APX) و گایاکول پراکسیداز (GPX) بررسی شد. نتایج نشان داد که بیماری اسکلروتینیا باعث افزایش تغییرات بیوشیمیایی و آنزیمی در گیاهان آلوده به قارچ شد. لاینهای حساس و مقاوم نیز پاسخهای متفاوتی در واکنش به این بیماری از خود نشان دادند. بهطوریکه میزان مالون دیآلدهید در لاینهای مقاوم کاهش پیدا کرد که کمترین این میزان مربوط به لاین مقاوم C39 در مواجه با جدایه قارچی SSU107 بود. همچنین میزان فعالیت آنزیمهای آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز بهترتیب در لاینهای مقاوم و حساس به دو جدایه قارچی بیشتر بود. بهطوریکه فعالیت آسکوربات پراکسیداز در لاین مقاوم C39 و فعالیت گایاکول پراکسیداز در لاین حساس C100 پس از آلودگی با قارچ SSU107 افزایش یافت. طبق نتایج این تحقیق، لاین C39 به دلیل داشتن کمترین میزان پراکسیداسیون لیپید و بیشترین فعالیت آنزیمی که مکانیسمهای دفاعی گیاه را در برابر پاتوژنها ایجاد میکند، مقاومت نسبی خوبی از خود نشان داد. نتایج حاصل از این تحقیق میتواند در برنامههای بهنژادی آفتابگردان برای تولید ارقام مقاوم به این بیماری مفید واقع گردد.
واژههای کلیدی: آفتابگردان، اسکلروتینیا، پراکسیداسیون لیپید، فعالیت آنزیمی و مقاومت.
* نویسنده مسئول، تلفن: 09149734458، پست الکترونیکی: r.darvishzadeh@urmia.ac.ir
مقدمه
آفتابگردان (Helianthus annuus L.) یکی از 4 محصول مهم زراعی است که کشت آن به دلیل بهرهبرداری از روغن خوراکی حائز اهمیت میباشد. روغن آفتابگردان علاوه بر مصرف خوراکی، در مصارف صنعتی نیز مورد استفاده قرار میگیرد (33). همه ساله به علت بیماریهای گوناگونی که انواع قارچها و باکتریهای بیماریزا در گیاهان مختلف ایجاد مینمایند، خسارت فراوانی به محصولات کشاورزی وارد میشود (4). بهطوریکه در آفتابگردان نیز تنشهای زیستی یکی از عوامل محدود کننده رشد محصول میباشند. Sclerotinia sclerotiorum (Lib) de Bary یکی از عوامل بیماری گیاهی با دامنه وسیع میزبانی است که میتواند بیش از 400 گونه گیاهی متعلق به بیش از 70 خانواده را در مراحل مختلف آلوده کند (37، 38 و 40). این پاتوژن در آفتابگردان باعث پوسیدگی ریشه، ساقه، طوقه و طبق شده و موجب بوتهمیری گیاه میگردد و در شرایط آب و هوایی مساعد، خسارت زیادی به محصول وارد میکند (9، 18 و 35).
گیاهان در مواجه با تنشهای غیرزنده و زنده ازجمله پاتوژنها، دچار تغییرات بیوشیمیایی میشوند (2، 5 و 7). یکی از اولین تغییرات بیوشیمیایی و سریعترین پاسخهای دفاعی در گیاهان آلوده به پاتوژن، انفجار اکسیداتیو (Oxidative burst) میباشد که باعث تشکیل انواع گونههای اکسیژن فعال ROS, Reactive oxygen species)) و رادیکالهای آزادی مانند سوپراکسید (O2-) و پراکسیدهیدروژن (H2O2) میشود (10 و 30) که بهدنبال آن نیز پراکسیداسیون لیپیدها و تجمع مالون دیآلدهید MDA, Malon dialdehyde)) رخ میدهد (35 و 45). رادیکالهای آزاد میتوانند نقش دوگانهای داشته باشند. بهطوریکه از یکسو باعث تخریب سلول و از سوی دیگر بهعنوان مولکول سیگنال باعث فعال شدن مکانیسمهای دفاعی در سلول شوند. پاکسازی محتویات سیتوپلاسم از رادیکالهای اکسیژن در گیاهان مقاوم، به تحریک سیستم دفاعی آنتیاکسیدانتی وابسته میباشند (26). مکانیسمهای حفاظتی آنتیاکسیدانتی در گیاهان برای مقابله با تنش اکسیداتیو و رادیکالهای آزاد اکسیژن شامل القاء چندین آنزیم آنتیاکسیدانتی همانند سوپراکسید دیسموتاز
SOD, Superoxide dismutase))، کاتالاز
CAT, Catalase))، آسکوربات پراکسیداز
APX, Ascorbate peroxidase))، گایاکول پراکسیداز
(GPX, Guaiacol peroxidase)، گلوتاتیون ردوکتاز
GR, Glutathione reductase)) و دیگر سیستمهای آنتیاکسیدانتی میباشد (10، 15، 22، 23، 27 و 42). عموماً زمانی که گیاه در معرض شرایط تنش قرار میگیرد، فعالیت این آنزیمها افزایش مییابد. بهطوریکه سوپراکسید دیسموتازها به عنوان اولین خط دفاعی در تبدیل رادیکال سوپراکسید به پراکسیدهیدروژن عمل میکنند. در مرحله بعد پراکسیدهیدروژن توسط آنزیم آسکوربات پراکسیداز در چرخه آسکوربات-گلوتاتیون و یا توسط گایاکول پراکسیداز و کاتالاز در سیتوپلاسم یا دیگر بخشهای سلول، از بین میرود (10 و 20). پژوهشها نشان داده است که تغییر در بیان یا فعالیت آنزیمهای ROS میتواند گام مهمی در فعالسازی سیستم دفاعی گیاه در مواجه با پاتوژنهای زیستی باشد. زیرا فعالیت سیستم آنتیاکسیدانتی آنزیمی باعث کاهش رادیکالهای آزاد اکسیژن و تنش اکسیداتیو شده و در نهایت موجب حفظ سلول در مواجه با نفوذ پاتوژنهای قارچی اسکلروتینیا میشود (11، 16 و 34). تاکنون مطالعاتی در رابطه با بررسی تغییرات بیوشیمیایی و فعالیت آنزیمی به هنگام مواجه با انواع پاتوژنها در گیاهان نخود، سویا، یونجه، کتان و گوجهفرنگی (12، 16، 17، 20، 26 و 31) انجام شده است. در آفتابگردان نیز مطالعاتی در رابطه با بررسی این تغییرات به هنگام مواجه با بیماری اسکلروتینیا گزارش شده است (3، 14، 18، 25، 34 و 35). Davar و همکاران (14) در یک تحقیق که بهمنظور بررسی تغییرات بیوشیمیایی و فعالیت آنزیمی در لاینهای حساس و مقاوم آفتابگردان در پاسخ به بیماری اسکلروتینیا انجام شد، گزارش کردند که میزان تجمع MDA و فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانتی CAT، APX و GPX در لاینهای مطالعه شده متفاوت است. بهطوریکه میزان این تغییرات در گیاهان مقاوم و حساس در مقایسه با شاهد افزایش یافت. Emamgholi و همکاران (18) افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانتی را در گیاه آفتابگردان در پاسخ به قارچ اسکلروتینیا گزارش کردند. Peluffo و همکاران (34) نیز گزارش کردند که میزان فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانتی در آفتابگردانهای آلوده به
قارچ اسکلروتینیا در مقایسه با شاهد افزایش مییابد.
اسکلروتینیا از بیماریهای قارچی مهم آفتابگردان در ایران میباشد که عملکرد این محصول را تحت تأثیر قرار میدهد (1). در سالهای اخیر شیوع و توسعه این بیماری در منطقه شمالغرب کشور باعث کاهش سطح زیرکشت این محصول شده است. وسعت خسارت در حدی است که در بعضی از مزارع تحت کشت، عملاً محصولی برداشت نمیشود. با توجه به اینکه مدیریت زراعی این بیماری بسیار مشکل میباشد، در حال حاضر تأکید بر استفاده از ارقام مقاوم میباشد. متأسفانه تعداد ارقام آفتابگردان مقاوم به این بیماری در جهان کم میباشد. بنابراین، بررسی واکنش فنوتیپی و مولکولی ژنوتیپها به عامل بیماری برای تولید ارقام هیبرید مقاوم از اهمیت زیادی برخوردار میباشد (3، 6 و 18). در این پژوهش تغییرات بیوشیمیایی و فعالیت آنزیمی در لاینهای حساس و مقاوم آفتابگردان به دو جدایه قارچی اسکلروتینیا بررسی شد.
مواد و روشها
مواد گیاهی و کشتآنها: 2 لاین آفتابگردان با واکنش متفاوت به 2 جدایه قارچی اسکلروتینیا بر اساس نتایج پژوهشهای پیشین (3 و 6) انتخاب شدند. بدین منظور از لاین C100 (به ترتیب حساس و مقاوم به جدایه قارچی SSU107 و SSKH41) و لاین C39 (به ترتیب مقاوم و حساس به SSU107 و SSKH41) استفاده شد. بذرهای لاینها از مؤسسه آگرونومی فرانسه
(INRA, Institut National de la Recherche Agronomique) تهیه شدند و در گلدانهای مستطیلی شکل در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار و هر تکرار شامل 18 نمونه در محیط پیت ماس کشت گردیدند. گیاهان تا مرحله 8 برگی در شرایط دمایی 1±25 درجه سانتیگراد، رطوبت %65 و دوره نوری 12 ساعت روشنایی نگهداری شدند (37).
کشت جدایههای قارچی و تلقیح گیاهان: جدایههای
قارچی در محیط آگار دکستروز سیب زمینی
(PDA, Potato Dextrose Agar, 39 g L-1, pH=6) کشت شده و به اتاق تاریک با دمای 1±25 درجه سانتیگراد منتقل شدند. سپس دیسکهای میسیلیومی با قطر 3 میلیمتر از حواشی کلنی در حال رشد (با عمر 3 روز) بریده شدند و در مرحله 8 برگی گیاهان در ناحیه طوقه ساقه آنها قرار گرفتند. برای حفظ رطوبت، بر اساس روش Price و Colhoun (36) اطراف ساقه و دیسک میسیلیومی با پارافیلم بسته شد. نمونهبرداری از قسمت پایهای ساقه گیاهان در زمانهای 3، 6، 12، 24 و 48 ساعت پس از آلودگی با قارچ انجام شد. در تیمار کنترل، آلودگی لاینها با جدایههای قارچی انجام نشد.
اندازهگیری خصوصیات: پراکسیداسیون لیپیدها ومیزان مالوندیآلدهید (MDA): برای اندازهگیری میزان تجمع MDA که بهعنوان معیاری از پراکسیداسیون لیپیدها مطرح میباشد، از روش Heath و Packer (21) استفاده شد. بدین منظور 2/0 گرم از بافت تر ساقه گیاه در 5 میلیلیتر ﺗـﺮیﮐﻠﺮواﺳـتیکاسید (TCA) یک درصد ساییده شد. ترکیب یکنواخت حاصل به مدت 10 دقیقه با سرعت 8000 دور سانتریفیوژ و بعد روی یک میلیلیتر از محلول رویی، 4 میلیلیتر محلول حاویTCA %20 و تیوباربیتوریکاسید (TBA) %5/0 اضافه شد. نمونهها به مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 95 درجه سانتیگراد قرار گرفتند و پس از آن بلافاصله در آب یخ سرد شدند. سپس به مدت 5 دقیقه با سرعت 8000 دور سانتریفیوژ شدند و در نهایت جذب نمونهها در طول موجهای 532 و 600 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Biowave DAD, S2100, England) قرائت گردید. میزان MDA با ضریب خاموشیmM-1cm-1) 155 (و فرمول زیر محاسبه شد:
MDA (μmol /gFw)= [A532-A600/155] × 1000
سنجش فعالیت آنزیمی: برای سنجش فعالیت آنزیمی، ابتدا عصاره گیاهی به روش Kang و Saltiveit(23) استخراج شد. بدین منظور 5/0 گرم از بافت تر ساقه به همراه 3 میلیلیتر بافر استخراج تریس-اسیدکلریدریک 50 میلیمولار (pH=7) حاوی (3 میلیمولار MgCl2 و یک میلیمولار EDTA) در هاون سرد ساییده شد. بافر استخراجی برای آنزیم آسکوربات پراکسیداز علاوه بر ترکیبات ذکر شده، محتوی 2/0 میلیمولار آسکوربیکاسید نیز بود. ترکیب یکنواخت حاصل به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد با سرعت 5000 دور سانتریفیوژ شده و محلول رویی برای سنجش فعالیت آنزیمهای زیر استفاده شد.
آنزیم کاتالاز (CAT): سنجش فعالیت آنزیم CAT با استفاده از روش Aebi(8) انجام شد. مخلوط واکنش شامل 5/2 میلیلیتر بافر فسفات 50 میلیمولار (pH=7)، 2/0 میلیلیتر H2O2 یک درصد و 3/0 میلیلیتر عصاره استخراجی بود. فعالیت آنزیم CAT به صورت کاهش در جذب طی یک دقیقه در طول موج 240 نانومتر محاسبه شد. برای سنجش میزان فعالیت این آنزیم از ضریب خاموشی (mM-1cm-1 0436/0) و فرمول زیر استفاده شد )اختلاف جذب (doD::
12Unit mM/m=doD/minSlopeأ—Vol. of assay (0.0003) Extinction cofficient (0.0436)" o:preferrelative="f">
آنزیمآسکوربات پراکسیداز (APX): سنجش فعالیت APX با استفاده از روش Nakano و Asada (29) انجام شد. مخلوط واکنش شامل 5/2 میلیلیتر بافر فسفات 50 میلیمولار (pH=7) حاوی EDTA) 1/0 میلیمولار و آسکوربات سدیم یک میلیمولار)، 2/0 میلیلیتر H2O2 یک درصد و 1/0 میلیلیتر عصاره استخراجی بود. فعالیت APX به صورت کاهش در جذب طی یک دقیقه در طول موج 240 نانومتر محاسبه شد. برای سنجش میزان فعالیت این آنزیم از ضریب خاموشی (mM-1cm-1 8/2) و فرمول زیر استفاده شد:
12Unit mM/m=doD/minSlopeأ—Vol. of assay (0.0001) Extinction cofficient (2.8)" o:preferrelative="f">
آنزیمگایاکولپراکسیداز (GPX): سنجش فعالیت آنزیم
GPX با استفاده از روش Upadhyaya و همکاران (44) انجام شد. مخلوط واکنش شامل 5/2 میلیلیتر بافر فسفات 50 میلیمولار (pH=7)، یک میلیلیتر گایاکول یک درصد، یک میلیلیتر H2O2 یک درصد و 1/0 میلیلیتر عصاره استخراجی بود. فعالیت GPX به صورت افزایش در جذب طی یک دقیقه در طول موج 420 نانومتر محاسبه شد. برای سنجش فعالیت این آنزیم از ضریب خاموشی
(mM-1cm-1 6/26) و فرمول زیر استفاده شد:
12Unit mM/m=doD/minSlopeأ—Vol. of assay (0.0001) Extinction cofficient (26.6)" o:preferrelative="f">
تجزیه و تحلیل آماری: دادههای بهدست آمده بصورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفیبا 3 تکرار تجزیهوتحلیل شدند. تجزیه واریانس توسط نرمافزار SAS 9.2 و مقایسه میانگین اثرات معنیدار با آزمون LSD در نرمافزار MSTATC انجام شد. در مواردی که اثر متقابل عاملها معنیدار بود، مقایسه میانگین اثرات اصلی انجام نشد. در ضمن نمودارها با نرمافزار Excel رسم شد.
نتایج
نتایج تجزیه واریانس دادهها نشان داد که اثر لاین (گیاه میزبان)، جدایه قارچی و زمان آلودگی با قارچ روی برخی خصوصیات بیوشیمیایی و فعالیتهای آنزیمی معنیدار میباشد. بهطوریکه لاین اثر معنیداری بر میزان مالون دیآلدهید و فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در سطح احتمال 1 درصد (P<0.01) و اثر معنیداری بر فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز در سطح احتمال 5 درصد (P<0.05) دارد. اثر جدایه قارچی در سطح احتمال 1 درصد (P<0.01) بر فعالیت آنزیمهای کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز معنیدار بود. در ضمن اثرات مدت زمان پس از آلودگی نیز در سطح احتمال 1 درصد (P<0.01) بر فعالیت آنزیمهای کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز و در سطح احتمال 5 درصد (P<0.05) بر فعالیت آنزیم گایاکول
پراکسیداز معنیدار بود.
جدول 1- تجزیه واریانس خصوصیات بیوشیمیایی و فعالیت آنزیمی در لاینهای آفتابگردان طی زمانهای مختلف پس از آلودگی با جدایههای SSU107 و SSKH41 قارچ اسکلروتینیا
منبع تغییرات |
میزان مالون دیآلدهید (MDA) |
آنزیم کاتالاز (CAT) |
آنزیم آسکوربات پراکسیداز(APX) |
آنزیم گایاکول پراکسیداز(GPX) |
||||
df |
Ms |
df |
Ms |
df |
Ms |
df |
Ms |
|
لاین |
1 |
**31/5515 |
1 |
ns61/571115 |
1 |
**09/922 |
1 |
*57/0 |
جدایه |
2 |
ns92/615 |
2 |
**27/8436198 |
2 |
**75/720 |
2 |
ns02/0 |
زمان |
4 |
ns68/647 |
4 |
**05/4696650 |
4 |
**23/190 |
4 |
*32/0 |
لاین ´ جدایه |
2 |
**08/1504 |
2 |
ns08/355886 |
2 |
**60/843 |
2 |
*51/0 |
لاین ´زمان |
4 |
ns29/233 |
4 |
ns91/989439 |
4 |
**83/183 |
4 |
*29/0 |
جدایه ´ زمان |
8 |
*05/665 |
8 |
ns80/2433440 |
8 |
**07/234 |
8 |
*27/0 |
لاین ´ جدایه ´ زمان |
8 |
ns83/393 |
8 |
ns25/1494804 |
8 |
**32/255 |
8 |
**32/0 |
اشتباه |
54 |
02/256 |
55 |
7/1254262 |
59 |
18/50 |
60 |
11/0 |
df: درجهآزادی، Ms: میانگین مربعات. ** معنیدار در سطح احتمال 1 درصد (01/0)، * معنیدار در سطح احتمال 5 درصد (05/0) و nsعدم معنیدار.
معنیدار بودن اثر متقابل بین تیمارها نشان میدهد که اختلاف بین لاینها از سطحی به سطح دیگر جدایه قارچ و از زمانی به زمان دیگر در مواجه با قارچ متفاوت است (جدول 1).
نتایج مقایسه میانگینها نشان داد که آلودگی با جدایههای قارچ اسکلروتینیا باعث تغییرات بیوشیمیایی و فعالیت آنزیمی در گیاهان آلوده در مقایسه با شاهد شده است. لاینهای حساس و مقاوم طی زمانهای مختلف پس از آلودگی با جدایههای قارچ اسکلروتینیا، پاسخهای متفاوتی به بیماری نشان دادند (جدول های 2، 3 و 4).
جدول 2- میانگین مالون دیآلدهید (MDA) در آفتابگردان روغنی در واکنش به بیماری قارچی اسکلروتینیا
مقایسه میانگین لاین ´ جدایه |
||||
لاین/جدایه |
SSU107 |
SSKH41 |
شاهد |
|
C100 |
a 45/68 |
a 54/61 |
a 01/58 |
|
C39 |
b 41/38 |
a 03/59 |
b 56/44 |
|
مقایسه میانگین زمان ´ جدایه |
||||
زمان (ساعت)/جدایه |
SSU107 |
SSKH41 |
شاهد |
|
3 |
ab08/60 |
a 35/72 |
bc 29/51 |
|
6 |
c46/33 |
ab92/60 |
bc 29/51 |
|
12 |
bc 42/43 |
b 65/53 |
bc 29/51 |
|
24 |
a 52/73 |
ab85/55 |
bc 29/51 |
|
48 |
a 77/73 |
ab57/58 |
bc 29/51 |
|
جدول 3- میانگین آنزیم کاتالاز (CAT) در آفتابگردان روغنی در واکنش به بیماری قارچی اسکلروتینیا
مقایسه میانگین اثر اصلی جدایه |
||||||
|
SSU107 |
SSKH41 |
شاهد |
|
|
|
میانگین آنزیم کاتالاز |
b 57/861 |
a60/1768 |
b38/651 |
|
|
|
مقایسه میانگین اثر اصلی زمان |
||||||
|
3 |
6 |
12 |
24 |
48 |
|
میانگین آنزیم کاتالاز |
ab 73/1477 |
bc 87/796 |
a 46/1649 |
c 89/467 |
abc 59/964 |
|
پراکسیداسیون لیپیدها ومیزان مالوندیآلدهید: نتایج نشان داد که طی زمانهای 3، 24 و 48 ساعت پس از آلودگی با قارچ SSU107 و در تمامی زمانهای پس از آلودگی با قارچ SSKH41، میزان پراکسیداسیون لیپید و تجمع مالون دیآلدهید گیاهان آلوده در مقایسه با شاهد افزایش یافت. کمترین میزان پراکسیداسیون لیپید و تجمع MDA در لاین مقاوم به قارچ SSU107 (لاین C39) مشاهده شد که حاکی از مقاومت نسبی بالای این لاین به بیماری اسکلروتینیا میباشد (جدول 2 و نمودار 1).
آنزیم کاتالاز: نتایج نشان داد که بیماری اسکلروتینیا باعث افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز میشود، بهطوریکه میزان فعالیت این آنزیم به ترتیب در گیاهان آلوده شده با قارچ SSKH41 و SSU107 در مقایسه با گیاهان شاهد افزایش داشت. طبق این نتایج، بیشترین فعالیت آنزیمی در زمانهای 12 و 3 ساعت پس از آلودگی گیاهان مشاهده شد (جدول 3 و نمودار 2).
آنزیم آسکوربات پراکسیداز: نتایج نشان داد که میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در بین لاینهای مطالعه شده طی زمانهای مختلف پس از آلودگی با جدایههای قارچ اسکلروتینیا متفاوت بود. بهطوریکه لاین مقاوم C39 بیشترین فعالیت APX را به ترتیب طی 6 و 3 ساعت پس از آلودگی با قارچ SSU107 به خود اختصاص داد (جدول 4).
جدول 4- میانگین فعالیت آنزیمهای آسکوربات پراکسیداز (APX) و گایاکول پراکسیداز (GPX) در لاینهای آفتابگردان طی زمانهای مختلف پس از آلودگی با جدایههای SSU107 و SSKH41 قارچ اسکلروتینیا
زمان (ساعت) |
لاین |
جدایه |
آنزیم آسکوربات پراکسیداز(APX) μmolmin-1/gFW |
آنزیم گایاکول پراکسیداز(GPX) μmolmin-1/gFW |
|
|
SSU107 |
d 28/0 |
b 41/0 |
|
C100 |
SSKH41 |
d 19/4 |
b 34/0 |
3 |
|
شاهد |
d 03/1 |
b 36/0 |
|
SSU107 |
b 29/27 |
b 15/0 |
|
|
C39 |
SSKH41 |
d 60/0 |
b 39/0 |
|
|
شاهد |
d 61/0 |
b 40/0 |
|
|
SSU107 |
d 69/0 |
b 39/0 |
|
C100 |
SSKH41 |
d 32/2 |
b 35/0 |
6 |
|
شاهد |
d 03/1 |
b 36/0 |
|
SSU107 |
a 45/51 |
b 30/0 |
|
|
C39 |
SSKH41 |
d 99/1 |
b 34/0 |
|
|
شاهد |
d 61/0 |
b 40/0 |
|
|
SSU107 |
d 92/0 |
b 24/0 |
|
C100 |
SSKH41 |
d 38/1 |
b 56/0 |
12 |
|
شاهد |
d 03/1 |
b 36/0 |
|
SSU107 |
bc 94/17 |
b 22/0 |
|
|
C39 |
SSKH41 |
d 60/1 |
b 31/0 |
|
|
شاهد |
d 61/0 |
b 40/0 |
|
|
SSU107 |
d 76/0 |
b 21/0 |
|
C100 |
SSKH41 |
d 93/0 |
b 36/0 |
24 |
|
شاهد |
d 03/1 |
b 36/0 |
|
SSU107 |
d 93/0 |
b 16/0 |
|
|
C39 |
SSKH41 |
cd 68/6 |
b 31/0 |
|
|
شاهد |
d 61/0 |
b 40/0 |
|
|
SSU107 |
d 36/1 |
a 05/2 |
|
C100 |
SSKH41 |
d 62/2 |
b 43/0 |
48 |
|
شاهد |
d 03/1 |
b 36/0 |
|
SSU107 |
d 78/0 |
b 17/0 |
|
|
C39 |
SSKH41 |
d 08/5 |
b 40/0 |
|
|
شاهد |
d 61/0 |
b 40/0 |
LSD 0.05 |
57/11 |
53/0 |
نمودار 1- تغییرات پراکسیداسیون لیپیدها و میزان مالون دیآلدهید (MDA) در لاینهای C100 و C39 آفتابگردان
طی زمانهای مختلف پس از آلودگی با جدایههای SSU107 و SSKH41 قارچ اسکلروتینیا
1: C100/SSU107, 2: C100/SSKH41, 3: C100/Control, 4: C39/SSU107, 5: C39/SSKH41, 6: C39/Control
طبق نمودار 3، اگرچه فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در لاینهای مقاوم به 2 قارچ در مقایسه با گیاهان شاهد بیشتر بود، اما این فعالیت طی زمانهای پس از آلودگی کاهش یافت. با توجه به این نتایج، بیشترین فعالیت آنزیم APX مربوط به لاین مقاوم C39 در مواجه با قارچ SSU107 (گروه 4) بود. این لاین در مقایسه با لاین حساس C100 (گروه 1) فعالیت آنزیمی بیشتری در زمانهای 3، 6 و 12 ساعت پس از آلودگی از خود نشان داد. در جدایه قارچی SSKH41 نیز، لاین حساس C39 در مقایسه با لاین مقاوم C100 طی زمانهای 24 و 48 ساعت پس از آلودگی، فعالیت آنزیمی بیشتری داشت. البته میزان آنزیم در لاین حساس به 2 جدایه قارچی تغییرات معنیداری نسبت به شاهد نشان نداد. طبق این نتایج، بیشترین فعالیت آنزیمی در بیشتر زمانهای آلودگی به 2 قارچ در لاین C39 مشاهده شد که حاکی از مقاومت نسبی بالای این لاین میباشد.
آنزیم گایاکول پراکسیداز: میزان فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز در بین لاینهای مطالعه شده طی زمانهای مختلف پس از آلودگی با جدایههای قارچ اسکلروتینیا متفاوت بود. بهطوریکه بیشترین فعالیت این آنزیم در لاین حساس C100طی زمان 48 ساعت پس از آلودگی با قارچ SSU107 مشاهده شد (جدول 4). با توجه به نمودار 4، لاین حساس C100 (گروه 1) بیشترین و لاین مقاوم C39 (گروه 4) کمترین فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز را در مواجه با قارچ SSU107 داشتند. بهطوریکه لاین C100 در مقایسه با C39 در تمامی زمانهای پس از آلودگی، فعالیت آنزیمی (GPX) بیشتری داشت. در گیاهان آلوده به قارچ SSKH41 نیز، لاین مقاوم C100 (گروه 2) در مقایسه با لاین حساس C39 (گروه 5) بیشترین فعالیت آنزیمی را در تمامی زمانهای پس از آلودگی با این قارچ دارا بود. بنابراین به نظر میرسد برخلاف نتایج آنزیم آسکوربات پراکسیداز، لاین C100 در مقایسه با C39 در تمامی زمانهای پس از آلودگی، فعالیت آنزیمی بیشتری را دارا بود.
نمودار 2- تغییرات فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) در لاینهای C100 و C39 آفتابگردان
طی زمانهای مختلف پس از آلودگی با جدایههای SSU107 و SSKH41 قارچ اسکلروتینیا
1: C100/SSU107, 2: C100/SSKH41, 3: C100/Control, 4: C39/SSU107, 5: C39/SSKH41, 6: C39/Control
نمودار 3- تغییرات فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX)در لاینهای C100 و C39 آفتابگردان
طی زمانهای مختلف پس از آلودگی با جدایههای SSU107 و SSKH41 قارچ اسکلروتینیا
1: C100/SSU107, 2: C100/SSKH41, 3: C100/Control, 4: C39/SSU107, 5: C39/SSKH41, 6: C39/Control
نمودار 4- تغییرات فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز ((GPX در لاینهای C100 و C39 آفتابگردان
طی زمانهای مختلف پس از آلودگی با جدایههای SSU107 و SSKH41 قارچ اسکلروتینیا
1: C100/SSU107, 2: C100/SSKH41, 3: C100/Control, 4: C39/SSU107, 5: C39/SSKH41, 6: C39/Control
بیشترین تفاوت فعالیت آنزیم بین دو لاین C39 وC100 نیز در فاصله زمانی 48 ساعت پس از آلودگی با قارچSSU107 و 12 ساعت پس از آلودگی با قارچ SSKH41 مشاهده شد.
بحث
پراکسیداسیون لیپیدها ومیزان مالوندیآلدهید: هنگام مواجه با پاتوژنها، پراکسیداسیون لیپیدها رخ میدهد (35 و 45). پراکسیداسیون لیپیدها باعث تغییر در میزان مالون دیآلدهید میشود که بهعنوان شاخصی معتبر در آفتابگردان در پاسخ به قارچ اسکلروتینیا در نظر گرفته میشود (14 و 35). در پژوهشی که Garcia-Limones و همکاران (20) روی برهمکنش نخود با قارچ فوزاریوم (Fusarium oxysporum) انجام دادند، افزایش پراکسیداسیون لیپیدها بر اثر واکنشهای اکسیداتیو گزارش شد. بهطوریکه میزان مالون دیآلدهید در گیاهان حساس و مقاوم افزایش یافت. اگرچه این افزایش در گیاهان مقاوم بیشتر و سریعتر از گیاهان حساس رخ داد. Malencic و همکاران (26) گزارش کردند که سطوح بالای ROS در سویا، باعث آسیب غشاء پلاسمایی و افزایش میزان مالون دیآلدهید در گیاهان آلوده به اسکلروتینیا میشود. Prats و همکاران (35) انفجار اکسیداتیو در گیاهان آفتابگردان آلوده به اسکلروتینیا را گزارش کردند. در پژوهش آنان میزان مالون دیآلدهید در مواجه با قارچ اسکلروتینیا افزایش یافت که این نشاندهنده القاء تنش اکسیداتیو بر اثر بیماری بود. در پژوهشی دیگر، میزان مالون دیآلدهید به طور قابل توجهی در ریشههای گیاه آفتابگردان آلوده به قارچ تریکودرما (Trichoderma harzianum) افزایش یافت (43). در این پژوهش تجمع مالون دیآلدهید در گیاهان آلوده به بیماری بیشتر بود. این افزایش در لاین حساس بیشتر از لاین مقاوم مشاهده شد، بهطوریکه کمترین میزان مالون دیآلدهید مربوط به لاین مقاوم C39 در مواجه با قارچ SSU107 بود. احتمالاً افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانتی برای جلوگیری از پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء سلولی در این ترکیب لاین-جدایه کافی نبوده است. این نتیجه با پژوهش Davar و همکاران (14) مبنی بر افزایش میزان مالون دیآلدهید در هر 2 لاین مقاوم و حساس آفتابگردان آلوده به قارچ اسکلروتینیا تطابق داشت. همچنین در گزارش آنان افزایش در لاین حساس بیشتر از لاین مقاوم بود.
فعالیت آنزیم کاتالاز: کاتالاز اولین آنزیم آنتیاکسیدانتی است که باعث تجزیه پراکسید هیدروژن به آب و اکسیژن میشود (10 و 13). Djebali و همکاران (16) علت تفاوت در فعالیت کاتالاز و فرایندهای بیوشیمیایی اساسی در ریشه یونجه (Medicago truncatula) آلوده به کپک (Aphanomyces euteiches) را، بیان ژنهای دخیل در مقاومت دانستند.Peluffo و همکاران (34) نیز در بررسی فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانت در آفتابگردانهای آلوده به اسکلروتینیا گزارش کردند که میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در لاین مقاوم به طور قابل توجهی حدود 3 برابر در مقایسه با شاهد افزایش پیدا کرد. افزایش آنزیمهای آنتیاکسیدانت در مطالعه El-Khallal (17) نیز در مواجه گیاه گوجهفرنگی با فوزاریوم گزارش شده است. همچنینNaglaa و Hebe (31) گزارش کردند که فعالیت آنزیم کاتالاز به طور قابل توجهی در برگهای لاینهای حساس و مقاوم کتان تحت بیماری کپک پودری افزایش مییابد. Davar و همکاران (14) گزارش کردند که بیشترین فعالیت آنزیم کاتالاز در لاینهای مقاوم و کمترین آن در لاینهای حساس آفتابگردان در مواجه با اسکلروتینیا میباشد. همچنین در پژوهشی دیگر روی گیاه آفتابگردان توسط Emamgholi و همکاران (18) فعالیت بیشتر این آنزیم گزارش شده است. طبق نتایج حاصل از این پژوهش لاینهای حساس و مقاوم در مقایسه با گیاهان شاهد در بیشتر زمانهای پس از آلودگی، فعالیت کاتالازی بیشتری داشتند. بیشترین فعالیت آنزیمی طی زمانهای 12 و 3 ساعت پس از آلودگی گیاهان مشاهده شد.
فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز: آسکوربات پراکسیدار یکی از آنزیمهای آنتیاکسیدانت میباشد که در فرایند تبدیل پراکسیدهیدروژن به آب نقش دارد (10، 19 و 41). در گیاه برنج مشاهده شده است که افزایش پراکسیدهیدروژن در شرایط تنش، باعث افزایش بیان ژنهای آسکوربات پراکسیداز شده است. در گیاه آرابیدوپسیس نیز افزایش پراکسیدهیدروژن تحت تأثیر نور زیاد، سبب تغییراتی در انتقال الکترون در پلاستوکینون شد که احتمالاً این تغییر سبب القای ژنهای مرتبط با آن میشود (41). مشخص شده است که افزایش فعالیت پراکسیدازها اغلب همراه با تشکیل تعدادی از فرمهای جدید و از بین رفتن تعدادی از فرمهای آنزیم آسکوربات پراکسیداز میباشد (32). Singh و همکاران (43) گزارش کردند که فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در گیاه آفتابگردان آلوده به قارچ تریکودرما افزایش مییابد. گیاهچههای حساس و خیلی حساس گوجهفرنگی نیز در مقایسه با انواع مقاوم، فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز کمتری را در مواجه با پوسیدگی باکتریایی از خود نشان دادند (12). در این پژوهش، میزان آنزیم آسکوربات پراکسیداز در گیاهان مقاوم و حساس افزایش پیدا کرد، اما این افزایش در گیاهان مقاوم محسوستر و بیشتر بود. این نتایج با نتایج دیگر پژوهشها (3 و 14) مطابقت داشت. بیشترین فعالیت این آنزیم نیز در بیشتر زمانهای پس از آلودگی، در لاین C39 مشاهده شد.
فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز: پراکسیدازها متعلق به خانواده بزرگ آنزیمهایی میباشند که در همه موجودات وجود دارند. آنزیم گایاکول پراکسیداز یکی از مهمترین پراکسیدازها میباشد (29). این آنزیم در واکنشهای دفاعی به پاتوژنها و در حذف پراکسیدهیدروژن نقش دارد. بهطوریکه حضور پاتوژن در سلولهای پارانشیمی بافت میزبان، باعث فعال نمودن چرخه آسکوربات-گلوتاتیون و تجزیه مولکولهای پراکسیدهیدروژن میشود (20). Malencic و همکاران (25) لاینهای خالص آفتابگردان با حساسیتهای متفاوت را به قارچ اسکلروتینیابا اگزالیک اسید تیمار کردند. نتایج آنان نشان داد که تفاوت قابل ملاحظهای در فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز در لاینهای بررسی شده دیده میشود. بهطوریکه این میزان در ساقه و برگ لاینهای مقاوم بیشتر بود. در پژوهش Singh و همکاران (43) نیز میزان این آنزیم در گیاه آفتابگردان آلوده به قارچ تریکودرما افزایش یافت. در نتایجDavar و همکاران (14) میزان فعالیت این آنزیم با توجه به زمان و لاین مورد مطالعه آفتابگردان متفاوت بود. بهطوریکه در هر 2 لاین مقاوم و حساس میزان فعالیت این آنزیم افزایش یافت. اما در بیشتر زمانهای پس از آلودگی، میزان این فعالیت در انواع مقاوم در مقایسه با شاهد بیشتر بود. طبق نتایج حاصل از این پژوهش، بیشترین فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز در لاین حساس C100 در 48 ساعت پس از آلودگی با قارچ SSU107 مشاهده شد. بنابراین به نظر میرسد مسیر تحریک ژنهای آنتیاکسیدانتی مختلف متفاوت است و تابع ژنتیک رقم میباشد، در نتیجه پیام واحدی برای تحریک کل سیستم دفاع آنتیاکسیدانتی صادر نمیشود.
نتیجهگیری کلی
نتایج این پژوهش نشان داد که بیماری اسکلروتینیا باعث افزایش تغییرات در خصوصیات بیوشیمیایی و فعالیت آنزیمی گیاهان آلوده میشود. لاینهای حساس و مقاوم نیز پاسخهای متفاوتی در واکنش به این بیماری نشان دادند که این خود به علت تفاوت گیاهان مقاوم و حساس میباشد. طبق این نتایج، میزان پراکسیداسیون لیپیدها و تجمع مالون دیآلدهید در لاینهای مقاوم کاهش یافت که کمترین این میزان در لاین مقاوم C39 در مواجه با قارچ SSU107 مشاهده شد. همچنین میزان فعالیت آنزیمهای آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز بهترتیب در لاینهای مقاوم و حساس به جدایههای قارچی بیشتر بود. بهطوریکه لاین مقاوم C39 بیشترین فعالیت آسکوربات پراکسیداز را پس از آلودگی با قارچ SSU107 به خود اختصاص داد. این در حالی است که لاین حساس C100 فعالیت گایاکول پراکسیداز بیشتری پس از آلودگی با قارچ SSU107 داشت. طبق نتایج این تحقیق، لاین C39به دلیل دارا بودن کمترین میزان پراکسیداسیون لیپید و بیشترین فعالیت آنزیمی که ازجمله مکانیسمهای دفاعی گیاه را در برابر پاتوژنها است، مقاومت نسبی مناسبی از خود نشان داد. با بررسی تغییرات بیوشیمیایی و مکانیسمهای مقاومت به بیماری اسکلروتینیا در لاینهای آفتابگردان، میتوان تحقیقات وسیع و دقیقتری در دیگر لاینهای این محصول و سایر مکانیسمهای مقاومت به این بیماری انجام داد. نتایج حاصل از این پژوهش میتواند در برنامههای بهنژادی این گیاهان برای تولید ارقام مقاوم به این بیماری مفید واقع شود. امید است با تحقیقات تکمیلی در برنامههای بهنژادی این محصول، به شناسایی مکانهای ژنی مرتبط با مقاومت برای دستیابی به ارقام مقاوم به بیماری اسکلروتینیا دست یافت.
سپاسگزاری
بدینوسیله نویسندگان از مسئولان محترم دانشکده کشاورزی، پژوهشکده زیستفناوری دانشگاه ارومیه و همچنین از دست اندرکاران انستیتو تحقیقات آگرونومی تولوز فرانسه به دلیل در اختیار گذاشتن بذر لاینهای مورد مطالعه، تشکر و قدردانی مینمایند.