Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)

Effect of different nitrate/ammonium ratios on biomass content and some biochemical characteristics of lattice henbane plant (Hyoscyamus reticulatus L.) hairy roots.

Document Type : Research Paper

Authors

Department of Horticulture, Faculty of Agriculture, Urmia University, Iran

Abstract

Hyoscyamus reticulatus L. is an herbaceous, biennial plant, belonging to Solanaceae family and Due to production of tropane alkaloids such as hyoscyamine and scopolamine are widely used in medicine. In the present study, in order to increase production of tropane alkaloids, cotyledon-derived hairy root cultures transformed with Agrobacterium rhizogenes strain A7, elicited by various ratio of nitrate to ammonium. The effect of different ratio of nitrate to ammonium (9.9:5.1, 19.75:10.25, 39.5:20.5 (control), 79:41 and 158:82 mM) in two exposure times (24 and 48 h) were investigated. According to the ANOVA results, the highest hyoscyamine and scopolamine production (about 1.5-fold and 1.17-fold increase over the control) was observed in treatment 9.9: 5.1 mM nitrate to ammonium at 24 hours of exposure time, respectively. Therefore, the highest catalase antioxidant enzymes activity (23/40 µmol min-1 mg-1 pro) and peroxidase (145/32 µmol min-1 mg-1 pro) and ascorbate peroxidase (24/22 µmol min-1 mg-1 pro), was obtained in nitrate to ammonium ratio (158: 82 mM) with 24 hours exposure time. According to these results, nitrate to ammonium ratio as elicitor can be used as effective strategies in plant biotechnology in order toenhance production of plant secondary metabolites such as tropane alkaloids.

Keywords

Main Subjects

تأثیر نسبت­های مختلف نیترات به آمونیوم بر میزان زیست توده و برخی ویژگی­های بیوشیمیایی ریشه­های موئین گیاه بذرالبنج مشبک (L.Hyoscyamus reticulatus)

مدینه خضرلو1، بهمن حسینی2* و جعفر امیری1

1 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی، گروه علوم باغبانی

2 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، پژوهشکده زیست‌فناوری، دانشکده کشاورزی، گروه علوم باغبانی

تاریخ دریافت: 11/9/96                تاریخ پذیرش: 15/8/97

چکیده

بذرالبنج مشبک گیاهی علفی، دوساله و متعلق به تیره سیب­زمینی سانان می­باشد و به­دلیل تولید آلکالوئیدهای تروپانی هیوسیامین و آسکوپولامین به­طور گسترده­ای در پزشکی مورد استفاده قرار می­گیرد. در پژوهش حاضر، به­منظور افزایش تولید آلکالوئیدهای تروپانی، کشت­ ریشه موئین مشتق شده از ریز نمونه­ برگ­های لپه­ای تراریخت شده با سویه­ی A7 Agrobacterium rhizogenes، توسط ­نسبت­های مختلف نیترات به آمونیوم تحریک گردیدند. تأثیر نسبت­های مختلف نیترات به آمونیوم (1/5 : 9/9، 25/10 : 75/19، (شاهد) 5/20 : 5/39، 41 : 79 و 82 : 158 میلی‌متر) در دو تیمار زمانی (24 و 48 ساعت) مورد بررسی قرارگرفت. براساس مقایسه میانگین، بیشترین محتوای هیوسیامین و آسکوپولامین (5/1 و 17/1 برابر بیشتر از شاهد)، به ترتیب در تیمار نسبت 1/5 : 9/9 میلی­مولار نیترات به آمونیوم به­مدت 24 ساعت مشاهده گردید. همچنین، بیشترین فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانی کاتالاز (612/35 میکرومول بر دقیقه بر میلی­گرم پروتئین)، 24 ساعت پس از تیمار با نسبت 82 : 158 میلی­مولار نیترات به آمونیوم، پراکسیداز ( 373/64 میکرومول بر دقیقه بر میلی­گرم پروتئین)، 48 ساعت پس از تیمار با نسبت 82 : 158 میلی­مولار نیترات به آمونیوم و آسکوربات پراکسیداز (16/156 میکرومول بر دقیقه بر میلی­گرم پروتئین)، 48 ساعت پس از تیمار با نسبت 25/10 : 75/19 میلی­مولار نیترات به آمونیوم به دست آمد. باتوجه به این نتایج، محرک نیترات به آمونیوم می­تواند در بیوتکنولوژی گیاهی به عنوان محرک­ مؤثر جهت تولید متابولیت­های ثانوی گیاهی ازجمله آلکالوئیدهای تروپانی مورد استفاده قرار گیرد.

واژه­های کلیدی: آلکالوئیدهای تروپانی، بذرالبنج مشبک، محرک، ریشه موئین، نیترات به آمونیوم

* نویسنده مسئول، تلفن: 04432779558 ، پست الکترونیکی: b.hosseini@urmia.ac.ir

مقدمه

 

بذرالبنج مشبک به لحاظ تولید آلکالوئیدهای تروپانی هیوسیامین و آسکوپولامین که ترکیبات مورد علاقه­ی صنعتی و دارویی هستند، به­طور گسترده­ای در پزشکی مورد استفاده قرار می­گیرد (1و 3). آسکوپولامین ارزشمندترین آلکالوئید تروپانی می­باشد و تقاضای جهانی آن حدود 10 برابر بیشتر از هیوسیامین است (23). در بسیاری موارد کشت­های درون شیشه­ای در شرایط کاملاً کنترل شده و به­طور دقیق می­توانند همان ترکیبات باارزش گیاهان را تولید کنند (25). با توجه به ارزش دارویی متابولیت­های ثانوی می­توان میزان تولید این ترکیبات را با استفاده از روش­های زیست­فناوری افزایش داد. ولی بااین‌حال بازده پایین و تکرارپذیری کم کشت­ها و عدم ثبات تولید، عامل محدودکننده در زمینه کشت­های تمایز نیافته مثل کشت پینه و تعلیق یاخته­ای می­باشد که امروزه تکنیک­های جدیدی در زمینه کشت بافت به­منظور رفع این عیوب مورد استفاده قرار می­گیرد که ازجمله این تکنیک­ها، تکنیک کشت ریشه­های موئین می­باشد (45). القای ریشه موئین از مناسب­ترین سیستم­ها برای تولید متابولیت­های ثانوی است. در شرایط آزمایشگاهی، تراریختی گیاه با باکتریAgrobacterium rhizogenes  موجب تولید سیستم ریشه موئین با سرعت رشد بالا و توانایی سنتز متابولیت­های مهم و حتی متابولیت­های ناشناخته می­شود (10 و 11). ثبات بیوشیمیایی، ژنتیکی و توانایی رشد در محیط فاقد تنظیم کننده­های رشد گیاهی از دیگر ویژگی­های ریشه­های موئین است که استفاده از آن­ها را در زیست­فن­آوری ترغیب می‌نماید (17). با توجه به این‌که آلکالوئیدهای تروپانی عمدتاً در ریشه سنتز و سپس به اندام­های هوایی منتقل می­شوند (21) همچنین، با توجه به جای­گیری اختصاصی بعضی از آنزیم­های کلیدی درگیر در مسیر بیوسنتز این آلکالوئیدها (به‌عنوان‌مثال بیان وابسته به پریسیکل پوتریسین­متیل­ترانسفراز (PMT= Putrescine N-methyltransferase) ، و جای­گیری اختصاصی هیوسیامین -6- بتا هیدروکسیلاز (H6H= Hyoscyamine-6β-hydroxylase) ، در دایره محیطیه ریشه)، تلاش­ برای تولید تروپان آلکالوئیدها به ویژه آسکوپولامین در سیستم­های زیست­فن­آوری عمدتاً مبتنی بر کشت ریشه­های موئین می­باشد (36). تجمع متابولیت­های ثانوی در گیاه بخشی از واکنش دفاعی گیاه در برابر حمله پاتوژن­هاست که به­وسیله محرک­ها که ترکیبات سیگنالی مربوط به واکنش­های دفاعی گیاهان هستند آغاز و فعال می­شود (50). در شرایط درون شیشه، گیاهان و سلول­های گیاهی به عوامل شیمیایی، فیزیکی و میکروبی تحت عنوان محرک­ها، واکنش­های فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی نشان می­دهند. تحریک­زایی (Stimulation) روندی است که باعث افزایش ساخت متابولیت­های ثانوی گیاهان شده و بقا، تداوم و رقابت­پذیری آن­ها را تضمین ­می­کند (35). عوامل تغذیه­ای از قبیل نیتروژن، شاخص مهمی است که تولید آلکالوئیدها را تحت تأثیر قرار می­دهد (16). از آنجایی که آلکالوئیدها ترکیبات نیتروژن دار هستند، پیش­بینی شده که قابلیت استفاده از نیتروژن نقش مهمی در بیوسنتز و تجمع آلکالوئیدها در گیاهان ایفا نمایند (48). پژوهش­های بن‍صداک و همکاران (15) بر روی ریشه­های مویین دو کلون شابیزک (Atropa belladonna) نشان داد که افزایش در نسبت آمونیوم منجر به کاهش رشد ریشه­های مویین شد، در حالی که نیترات اثر مشخصی بر مقدار آلکالوئید داشت. تولید آلکالوئیدها در نسبت­های 8/15 میلی­مولار نیترات و 5/20 میلی­مولار آمونیوم 4/1-2/1 برابر بیشتر از هنگامی که ریشه­ها در محیط MS (Murashig and Skoog) استاندارد (با 5/39 میلی مولار نیترات و 5/20 میلی مولار آمونیوم) رشد داده شدند، به دست آمد. در پژوهشی وانگ و تان (49) نشان دادند که غلظت بهینه نیتروژن کل برای تولید آرتمیزین (Artemisinin) در گیاه درمنه (Artemisia annua) 20 میلی­مولار می­باشد. همچنین بررسی­های چن و همکاران (18) در محیط B5 در کشت تعلیق سلولی سرخدار (Taxus yunnanensis) نشان داد که غلظت بهینه نیترات برای رشد و تولید تاکسول (Taxol) 30-20 میلی­مولار می­باشد. نتایج بررسی­های پان و همکاران (37) نیز نشان داد که بیشترین عملکرد کامپتوتسین (Camptothecin) (3/6 میلی­گرم بر لیتر) با 40 میلی­مولار نیتروژن کل به دست آمد. بررسی صورت گرفته توسط شینده و همکاران (43) در گیاه بابچی
(Psoralea corylifolia) نشان داد که محیط کشت MS تکمیل شده با نسبت 10 : 20 میلی­مولار آمونیوم به نیترات حداکثر زیست توده (86/13 گرم بر لیتر وزن خشک) را تولید کرد و این محیط بیشترین قابلیت تولید ایزوفلاون دایدزئین (Daidzein) (05/2 درصد وزن خشک) و جنیستئین (Genistein) (51/0 درصد وزن خشک) را دارا بود. بیشترین تولید ویتانولید (Withanolide A) (68/14 میلی­گرم بر گرم وزن خشک) در گیاه بوزیدان (Withania somnifera) در نسبت 80/18 : 00/00 میلی­مولار آمونیوم به نیترات گزارش شد (39). با توجه به اینکه تولید سریع و انبوه متابولیت­های ثانوی از طریق روش­های شیمیایی عمدتاً پر هزینه، مشکل و یا غیرممکن می­باشد و نیز به دلیل اهمیت اقتصادی این متابولیت­ها و تولید اندک آن­ها در گیاهان دارویی، استفاده از راهکارهایی مثل کشت ریشه موئین تراریخت و محرک­ها می­تواند تولید این متابولیت­ها را بهبود بخشد. ریشه­های موئین تراریخت منبع ارزشمندی برای تولید ترکیبات شیمیایی گیاهی با کاربرد دارویی، آرایشی و افزودنی غذایی می­باشند. این ریشه­ها همچنین می­توانند بیش از یک متابولیت تولید نمایند و بنابراین ثابت شده که از نظر تولید تجاری و اقتصادی هستند. تولید متابولیت­های ثانوی با استفاده از تکنولوژی کشت بافت گیاهی هنوز هم دچار محدودیت­های بیولوژیکی و بیوتکنولوژیکی است. یکی از این موارد، درصد پایین متابولیت­های تولیدشده در این تکنیک می­باشد. بنابراین رویکردهای متعددی مثل استفاده از محرک­های متفاوت و تحریک مسیر بیوسنتزی برای افزایش تولید متابولیت­ها در کشت ریشه­های موئین تراریخت استفاده شده است. بنابراین، در پژوهش حاضر، تأثیر محرک­ غیرزیستی نیترات به آمونیوم در نسبت­ها و زمان­های مختلف، بر ویژگی­های مورفولوژیکی و بیوشیمیایی کشت ریشه­های موئین تراریخت گیاه بذرالبنج مشبک مورد بررسی قرارگرفت.

مواد و روشها

کشت گیاه بذرالبنج مشبک: این پژوهش در سال 1394 در آزمایشگاه کشت بافت گروه علوم باغبانی دانشکده­ی کشاورزی دانشگاه ارومیه و پژوهشکده زیست­فن­آوری دانشگاه ارومیه انجام گردید. بذر­های گیاه بذرالبنج مشبک (H. reticulatus L.) از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه گردید. بذرها ابتدا به مدت یک دقیقه با اتانول 70 درصد (حجمی- حجمی) و سپس به­ مدت 10 دقیقه با هیپوکلریت سدیم 50 درصد (حجمی- حجمی) ضدعفونی شدند و در نهایت سه مرتبه با آب مقطر استریل شستشو انجام گردید. پس از ضدعفونی، بذرها در محیط کشت MS تکمیل شده با غلظت 30 گرم در لیتر ساکارز، 100 میلی­گرم در لیتر میواینوزیتول و 7 درصد آگار (وزنی- حجمی) کشت و به­منظور جوانه‌زنی به اتاق رشد با دمای 25 درجه­ی سانتی­گراد و دوره­ی نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی منتقل شدند.

القای ریشه موئین: برای تهیه ریشه­های موئین (Hairy root) از سویه A7 Agrobacterium rhizogenes استفاده شد که این سویه از بانک میکروبی مؤسسه­ی ملی مهندسی ژنتیک و زیست­فن­آوری تهران تهیه گردید. به منظور تلقیح ریزنمونه­های گیاهی، یک هفته پس از جوانه­زنی، برگ­های لپه­ای­ از گیاهچه­های مادری استریل جدا و به­مدت سه دقیقه درون محلول تعلیق باکتری غوطه­ور شدند. قطعات برگ­های لپه­ای آلوده بر روی محیط کشت MS جامد (محیط هم کشتی (Co-culture) ریزنمونه با باکتری) کشت شدند و به مدت 48 ساعت، داخل انکوباتور با دمای 25 درجه­ی سانتی­گراد و تحت شرایط تاریکی نگهداری شدند. پس از آن، به محیط کشت MS جامد عاری از تنظیم­کننده رشد که حاوی 200 میلی­گرم در لیتر آنتی­بیوتیک سفوتاکسیم منتقل شدند. بعد از گذشت 10 روز، جهت افزایش رشد ریشه­های موئین در محیط جامد، هریک از ریزنمونه­های ریشه­دار به‌صورت مجزا و لاین­های انفرادی به محیط کشت پایه MS جامد عاری از تنظیم­کننده رشد و حاوی 200 میلی­گرم در لیتر سفوتاکسیم منتقل شدند. واکشت ریز نمونه‌ها در محیط جدید هر 10 روز یکبار صورت گرفت. در هر مرحله واکشت، اندکی از بافت ریزنمونه حذف گردید و غلظت آنتی‌بیوتیک به نصف کاهش یافت. در نهایت پس از 4 مرحله واکشت، با حذف کامل ریزنمونه و آنتی‌بیوتیک، ریشه­های موئین تراریخت بدون آلودگی باکتریایی و با سرعت زیاد در محیط کشت تکثیر یافتند. از میان 45 لاین­ ریشه­موئین القاء شده، یک لاین پر رشد جهت انجام مراحل بعدی آزمایش انتخاب گردید.

تائید مولکولی ماهیت تراریختی ریشه­های موئین: برای تائید تراریختی ریشه­های موئین از روش مولکولی استفاده شد. بدین منظور ابتدا DNA ژنومی ریشه­های موئین به روش خان و همکاران (26) استخراج و پس از آن واکنش زنجیره­ای پلی­مراز (PCR) با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن rol B

Forward Primer: 5’- ATGGATCCCAAATTGCTATTCCCCCACGA- 3’

Reverse Primer: 5’- TTAGGCTTCTTTCATTCGGTTTACTGCAGC- 3’

و طبق برنامه (دمای 94 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه برای واسرشتگی اولیه، 35 چرخه شامل: دمای واسرشتگی 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 50 ثانیه، دمای اتصال 60 درجه سانتی‌گراد به مدت یک دقیقه، دمای طویل شدن 72 درجه سانتی‌گراد به مدت یک دقیقه و 10 ثانیه و دمای طویل شدن مرحله نهایی 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه) انجام شد. پس از انجام واکنش PCR، 5 میکرولیتر از محلول PCR به همراه 3 میکرولیتر بافر رنگ­آمیزی متیلن بلو در ژل آگارز 1 درصد حاوی اتیدیوم بروماید با ولتاژ ثابت 90 ولت، به مدت 1 ساعت الکتروفورز گردید. جهت مشخص شدن اندازه قطعات حاصل، از DNA مارکر Orange Rule 50 bp DNA Ladder (Sinaclon) استفاده گردید.

تحریک ریشه­های موئین توسط نسبت­های مختلف نیترات به آمونیوم: به­منظور تعیین تأثیر نسبت­های مختلف نیترات به آمونیوم بر روی رشد ریشه و تولید آلکالوئیدهای تروپانی هیوسیامین و آسکوپولامین، محیط کشت MS پایه تغییر داده شد. لازم به ذکر است که برای تهیه­ی محیط کشت MS پایه از دو نمک KNO3 و NH4NO3 که حاوی 5/20 : 5/39 میلی­مولار نیترات به آمونیوم می­باشد به­عنوان شاهد استفاده گردید و از نمک KNO3 برای تأمین نیترات و از نمک (NH4)2SO4 به منظور تأمین آمونیوم محیط کشت­های تغییر یافته با ترکیبات مختلف یون­های نیترات به آمونیوم (1/5 : 9/9، 25/10 : 75/19، 41 : 79 و 82 : 158 میلی­مولار) از نظر منبع نیتروژن استفاده گردید. برای انتخاب نسبت­ها و نمک­های مورد استفاده در محیط کشت تغییر یافته از نتایج مطالعات بن صداک و همکاران (15) باکمی تغییرات به­عنوان نمونه کار استفاده گردید. حدود یک گرم از لاین پر رشد ریشه­ موئین 10 روزه داخل محیط کشت MS مایع حاوی نسبت­های مختلف نیترات به آمونیوم، در سه تکرار، منتقل و داخل شیکر انکوباتور با 120 دور در دقیقه، دمای 25 درجه­ی سانتی­گراد و در تاریکی نگهداری شدند. پس از گذشت 24 و 48 ساعت از زمان تیمار، ریشه­های موئین از محیط کشت حاوی محرک، خارج و به محیط کشت MS مایع عاری از محرک انتقال یافتند. پس از گذشت 10 روز، عمل برداشت ریشه­های موئین صورت گرفت و بعد از شستشو با آب مقطر و حذف رطوبت اضافی ریشه­ها، وزن‌تر ریشه­ها با استفاده ار ترازوی حساس (با دقت 001/0 گرم) اندازه­گیری شد. سپس ریشه­ها به مدت دو روز در دمای اتاق، 25 درجه سانتی­گراد، هوا خشک شده و وزن خشک آن­ها ثبت گردید.

استخراج تروپان آلکالوئیدها: استخراج آلکالوئید­ها به روش کامادا و همکاران (24) با اندکی تغییر انجام شد. بدین منظور، 500 میلی­گرم ماده گیاهی خشک پودر شده با کلروفرم، متانول و آمونیاک 28 درصد (حجمی- حجمی) به ترتیب با نسبت­های 15 : 5 : 1 و به مدت یک ساعت در معرض حمام فراصوتی (دمای 43 درجه سانتی­گراد) قرار گرفت. پس از عبور عصاره از کاغذ صافی، فاز کلروفرمی به کمک دستگاه تبخیرکننده دوار خشک شد. در مرحله بعد، مخلوط 5 میلی­لیتر کلروفرم و دو میلی­لیتر اسیدسولفوریک یک نرمال به عصاره اضافه شد. محلول پایینی جدا و دور ریخته شد و محلول رویی حاوی آلکالوئید تا pH 10 الی 11 و با استفاده از آمونیاک 28 درصد (حجمی- حجمی)، بر روی یخ تنظیم شد. آلکالوئیدها یک­بار با دو میلی­لیتر کلروفرم و دو بار با یک میلی­لیتر کلروفرم استخراج شدند. ماده نهایی پس از اضافه کردن سولفات سدیم، آبگیری و صاف شد. در نهایت برای آنالیز GC-MS، نمونه در 500 میکرولیتر متانول حل شد.

سنجش آلکالوئیدها به روش GC-MS: به منظور شناسایی آلکالوئید­های تروپانی هیوسیامین و اسکوپولامین از دستگاه کروماتوگراف گازی (HP, Palo Alto, CA, USA  ) Hewlett-Packard، مدل HP 7890A GC و کروماتوگراف گازی متصل شده به طیف‌سنج جرمی Hewlett-Packard، مدل 5975C، مجهز به ستون موئینه HP-5 به طول 30 متر و قطر 25/0 میلی­متر، با ضخامت لایه­ی فاز ساکن 25/0 میکرومتر استفاده گردید. دمای رابط GC/MS، منبع یون و کوادروپل به ترتیب 280، 230 و 150 درجه سانتی­گراد تنظیم گردید. دمای محفظه تزریق 270 درجه­ی سانتی­گراد، میزان تزریق 1 میکرولیتر و انرژی یونیزاسیون 70 الکترون ولت بود. در کروماتوگرافی گازی در برنامه‌ریزی حرارتی ستون، دمای اولیه 60 درجه سانتی­گراد به مدت سه دقیقه بود که با افزایش پنج درجه سانتی­گراد در دقیقه به 220 درجه سانتی­گراد رسید و به مدت پنج دقیقه در این دما باقی ماند. سپس با افزایش پنج درجه سانتی­گراد در دقیقه به 240 درجه­ سانتی­گراد افزایش یافت و به مدت پنج دقیقه در این دما باقی ماند. دمای محفظه تزریق 270 درجه سانتی­گراد تنظیم شد. هلیوم با درجه خلوص 999/99 درصد (حجمی- حجمی) با سرعت جریان یک میلی­لیتر بر دقیقه به عنوان گاز حامل استفاده شد. برای آنالیز نتایج این مطالعه از نرم‌افزار MSD CHEMSTATION DATA ANALYSIS استفاده گردید. همچنین از دو کتابخانه WIELY و NIST استفاده شد. لازم به ذکر است که به­جهت فراریت کافی خود گونه­ها، مشتق­سازی صورت نگرفت.

اندازه­گیری فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانی: به منظور تهیه عصاره گیاهی جهت سنجش فعالیت آنزیم­ها، 5/0 گرم از بافت گیاهی با استفاده از 5/2 میلی­لیتر بافر Tris-HCl 50 میلی­مولار با 5/7 = pH بر روی یخ به مدت 20 دقیقه ساییده شد تا یک عصاره کاملاً همگن به دست آید. همگنای حاصل در 12000 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه در دمای چهار درجه سانتی­گراد با استفاده از دستگاه سانتریفیوژ یخچال­دار، سانتریفیوژ شد. محلول رویی از رسوب جدا شده و به منظور سنجش فعالیت آنزیم­ کاتالاز با استفاده از روش آبی (12)، آسکوربات پراکسیداز به روش ناکانو و آسادا (34) و پراکسیداز به روش مک آدام و همکاران (28) مورد استفاده قرار گرفت.

آنالیز داده­ها و محاسبات آماری: آزمایشات به صورت فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی و با 3 تکرار انجام گردید و داده­های حاصل از آزمایش با استفاده از نرم‌افزار SAS 9.1 مورد تجزیه‌وتحلیل قرار گرفت. مقایسات میانگین توسط آزمون چند دامنه­ای دانکن (DMRT=Duncan Multiple Range Test) صورت گرفت و برای رسم نمودارها از نرم‌افزار Excel استفاده گردید.

نتایج

القاء ریشه­های موئین در ریزنمونه­های گیاهی بذرالبنج مشبک: ریشه­های موئین دو هفته پس از تلقیح ریزنمونه­ با سویه­ی باکتری، به­تدریج ظاهر شدند. پس از گذشت 10 روز به­منظور افزایش رشد ریشه­های موئین در محیط MS جامد، هر یک ار ریزنمونه­های ریشه­دار به­صورت تکی و لاین­های مجزا به محیط MS جامد عاری از تنظیم­کننده­های رشد (شکل 1 الف و ب) و محیط کشت مایع منتقل شدند (شکل 1 ج).

تأیید مولکولی ماهیت تراریختی ریشه­های موئین: نتایج آنالیز الکتروفورز ژل آگارز یک درصد (وزنی- حجمی) محصول واکنش زنجیره­ای پلی­مراز برای ریشه­های تراریخت احتمالی، حضور قطعه bp 780 مربوط به ژن rol B را در ریشه­های حاصل از ریزنمونه­ برگ­های لپه­ای توسط سویه­ی A7 Agrobacterium rhizogenes  نشان داد (شکل 2) که هم‌اندازه‌ی قطعه تکثیر شده در نمونه­ی کنترل مثبت (آگروباکتریوم مورد استفاده در تلقیح) بود.

 

 

الف

ب

ج

شکل 1- القاء ریشه­های موئین از ریزنمونه­ برگ­های لپه­ای بذرالبنج مشبک: الف و ب: ریشه­های موئین رشد کرده در محیط جامد MS، ج) ریشه­های موئین رشد کرده در محیط MS مایع

 

 

همچنین در DNA حاصل از ریشه­های طبیعی گیاه (به عنوان کنترل منفی) هیچ باند تکثیری در PCR مشاهده نگردید. به عبارت دیگر، حضور باند قوی در منطقه bp 780 مؤید تکثیر قطعه مورد بررسی و حضور ژن rol B در ریشه­های موئین بود.

شکل 2- آنالیز واکنش زنجیره­ای پلی­مراز جهت تعیین حضور ژن rol B در ریشه­های تراریخت بذرالبنج مشبک. لاین M: DNA مارکر kb 1 (Fermentase)، لاین C+: باکتری آگروباکتریوم سویه­ی A7 به عنوان کنترل مثبت و لاین C-: ریشه­های غیر تراریخت بذرالبنج مشبک به عنوان کنترل منفی لاین 1، 2 و 3:

ریشه­های موئین القاء شده در ریز نمونه برگ­های لپه­ای توسط سویه­ی  A7  Agrobacterium rhizogenes.

 M      C+    C-1    C-2       1      2      3

 

 

 

 

 

 

 

 

 


وزن‌تر و خشک: تجزیه واریانس داده­ها نشان داد اثر ساده نسبت نیترات به آمونیوم در سطح احتمال یک درصد و اثر متقابل نسبت و زمان تیمار، در سطح احتمال پنج درصد بر تغییرات وزن‌تر ریشه­های موئین بذرالبنج مشبک معنی­دار بوده است (جدول 1). میانگین داده­ها نشان داد، تیمار با محرک نیترات به آمونیوم منجر به کاهش معنی­دار وزن‌تر ریشه­های موئین در مقایسه با کشت­های شاهد گردید. به­طوری که کمترین تغییرات وزن‌تر (03/7 گرم) در اثر تیمار با نسبت 41 : 79 میلی­مولار نیترات به آمونیوم به مدت 24 ساعت مشاهده شد و بیشترین تغییرات وزن‌تر ریشه­های موئین نیز در کشت­های شاهد (57/9 گرم) به­دست آمد (شکل 3 الف). طبق نتایج به­دست آمده اثر ساده نسبت­های مختلف نیترات به آمونیوم در سطح احتمال پنج درصد اثر معنی­داری بر تغییرات وزن خشک ریشه­های موئین بذرالبنج مشبک داشت و منجر به کاهش وزن خشک ریشه­های موئین در مقایسه با کشت­های شاهد گردید. به­طوری که حداقل تغییرات وزن خشک (39/0 گرم) در اثر تیمار با نسبت 82 : 158 میلی­مولار نیترات به آمونیوم و بیشترین تغییرات آن در شاهد (45/0 گرم) به­دست آمد (شکل 3 ب).

فعالیت­های آنزیمی: تجزیه واریانس داده­ها نشان داد اثر نسبت، زمان و اثر متقابل نسبت و زمان تیمار با محرک نیترات به آمونیوم در سطح احتمال یک درصد تأثیر معنی­داری بر تغییرات فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانی کاتالاز، پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز داشت (جدول1).

 

ب

 

 

الف

 

 

شکل 3- مقایسه میانگین اثر ساده نسبت­های مختلف نیترات به آمونیوم بر تغییرات الف: وزن‌تر و ب: وزن خشک ریشه­های موئین بذرالبنج مشبک. حروف مشابه نشان دهنده­ی عدم اختلاف معنی­دار در سطح احتمال پنج درصد آزمون دانکن می­باشد.

جدول 1- نتایج تجزیه واریانس تأثیر نسبت و مدت‌زمان تیمار با نسبت‌های مختلف نیترات به آمونیوم بر ویژگی‌های رشدی و بیوشیمیایی اندازه‌گیری شده ریشه‌های موئین بذرالبنج مشبک

 

 

 

 

 

 

میانگین مربعات (MS)

 

 

 

منابع تغییرات

درجات آزادی

وزن‌تر

(گرم)

وزن خشک

(گرم)

CAT

POD

APX

محتوای هیوسیامین (درصد)

محتوای آسکوپولامین (درصد)

نسبت محرک نیترات به آمونیوم

4

**4.97

*0.0037

**370.79

**2.43

**1.11

**238.82

**389.62

زمان تیمار (b)

1

ns1.47

ns 0.0051

ns 41.46

*0.43

ns 0.006

**30.24

**411.57

اثر متقابل (a×b)

4

*0.39

ns 0.0022

**99.92

**0.16

**0.194

**9.60

**50.75

خطای آزمایشی

20

0.91

0.0019

23.39

0.071

0.135

2.33

2.26

ضریب تغییرات (درصد)

 

11.53

10.67

23.40

8.15

8.38

3.76

3.89

** و * و ns به ترتیب نشان­دهنده­ی وجود اختلاف معنی­دار در سطح احتمال یک درصد و پنج درصد و عدم وجود اختلاف معنی­دار می­باشد.

 

میانگین داده­ها نشان داد بیشترین تغییرات فعالیت آنزیم کاتالاز (612/35 میکرومول بر دقیقه بر میلی­گرم پروتئین)، در اثر تیمار ریشه­های موئین به مدت 24 ساعت با نسبت 82 : 158 میلی­مولار نیترات به آمونیوم به­دست آمد و کمترین تغییرات آن (509/10 میکرومول بر دقیقه بر میلی­گرم پروتئین)، مربوط به کشت­های شاهد بود (شکل 4 الف). بیشترین تغییرات فعالیت آنزیم پراکسیداز (373/64 میکرومول بر دقیقه بر میلی­گرم پروتئین)، مربوط به ریشه­های موئین تیمار شده با نسبت 82 : 158 میلی­مولار نیترات به آمونیوم به­مدت 48 ساعت به­دست آمد و حداقل فعالیت آنزیم پراکسیداز (426/10 میکرومول بر دقیقه بر میلی­گرم پروتئین)، در کشت­های شاهد بود (شکل 4 ب). در رابطه با آنزیم آسکوربات پراکسیداز نیز بیشترین فعالیت آنزیمی (16/156 میکرومول بر دقیقه بر میلی­گرم پروتئین)، در اثر تیمار ریشه­های موئین با نسبت 25/10 : 75/19 میلی­مولار نیترات به آمونیوم به مدت 48 ساعت به­دست آمد که اختلاف معنی­داری با تیمار 41 : 79 میلی­مولار به مدت 24 و 48 ساعت و نسبت 82 : 158 میلی­مولار نیترات به آمونیوم به­مدت 24 ساعت نداشت و کم­ترین تغییرات فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (212/39 میکرومول بر دقیقه بر میلی­گرم پروتئین)، مربوط به کشت­های شاهد بود (شکل 4 ج).

 

الف

ب

ج

شکل 4- مقایسه میانگین اثرات متقابل نسبت و زمان تیمار با محرک نیترات به آمونیوم بر میزان فعالیت آنزیم الف: کاتالاز، ب: پراکسیداز، ج: آسکوربات پراکسیداز. حروف مشابه نشان دهنده­ی عدم اختلاف معنی­دار در سطح احتمال یک درصد آزمون دانکن می­باشد.

 

آلکالوئیدهای تروپانی: تجزیه واریانس داده­ها نشان داد نسبت­های مختلف نیترات به آمونیوم، زمان و اثر متقابل نسبت و زمان اثر معنی­داری در سطح احتمال یک درصد بر تولید آلکالوئیدهای تروپانی هیوسیامین و آسکوپولامین در ریشه­های موئین بذرالبنج مشبک داشتند (جدول 1). تیمار ریشه­های موئین با نسبت 1/5 : 9/9 میلی­مولار نیترات به آمونیوم به مدت 24 ساعت، منجر به تولید بیشترین محتوای آسکوپولامین (77/50 درصد) شد و کم­ترین محتوای آن (93/23 درصد) در اثر تیمار با نسبت 82 : 158 میلی­مولار نیترات به آمونیوم به مدت 48 ساعت به­دست آمد (شکل 5 الف). میانگین داده­ها نشان داد بیشترین محتوای هیوسیامین (34/54 درصد) در اثر تیمار ریشه­های موئین با نسبت 1/5 : 9/9 میلی­مولار نیترات به آمونیوم به­مدت 24 ساعت به­دست آمد که محتوای تولید آن را نسبت به ریشه­های موئین شاهد حدود 5/1 برابر افزایش داد. کم­ترین محتوای هیوسیامین (92/35 درصد) در اثر تیمار با نسبت 82 : 158 میلی­مولار نیترات به آمونیوم به مدت 48 ساعت به­دست آمد (شکل 5 ب).

 

الف

ب

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 5- مقایسه میانگین اثر متقابل نسبت و زمان تیمار با محرک نیترات به آمونیوم بر محتوای تولید آلکالوئید الف: آسکوپولامین و ب: هیوسیامین. حروف مشابه نشان دهنده­ی عدم اختلاف معنی­دار در سطح احتمال یک درصد آزمون دانکن می­باشد.

 

بحث

اثر نسبت­های مختلف نیترات به آمونیوم بر تغییرات وزن‌تر و خشک ریشه­های موئین: نیتروژن، یک عنصر معدنی مهم برای گیاهان و یکی از اجزای عمده تشکیل دهنده­ی اسیدهای آمینه، پروتئین­ها و اسیدهای نوکلئیک می­باشد، همچنین شناخته شده که نیتروژن ممکن است رشد و نمو گیاهی را تحت تأثیر قرار دهد (42). در پژوهش حاضر، نتایج نشان داد که با افزایش نسبت نیترات به آمونیوم (نسبت به شاهد)، میزان وزن‌تر و خشک ریشه­های موئین بذرالبنج مشبک به­طور معنی­داری کاهش یافت. وقتی نیترات وارد ریشه می­شود مقداری از آن احیا شده و به آمونیوم و بعد به پروتئین تبدیل می­شود. احیای نیترات نیاز به انرژی و مواد هیدروکربنه برای تهیه اسیدهای آلی اسکلت اسیدهای آمینه دارد. بنابراین اگر مقدار زیادی نیترات توسط گیاه جذب شود احیای آن­ها انرژی و مواد هیدروکربنه زیادی را مصرف می­کند و ریشه ازلحاظ مواد هیدروکربنه فقیر می­شود و بنابراین رشد نمی­کند (6). از طرفی، آمونیوم به دلیل انتشار سریع به­آسانی در بافت­ها تجمع یافته و درصورتی‌که فوراً متابولیزه نگردد ایجاد سمیت می­کند (5 و 40). یکی از پیامدهای تجمع آمونیوم این است که می­تواند به­طور مستقیم یا غیرمستقیم از آسیمیله شدن نیترات جلوگیری کند (19). ممانعت آمونیوم از رشد گیاهان از بی­نظمی در احیای آمونیوم، کاهش pH، اثر سمیت آمونیوم آزاد، کمبود مواد غذایی معدنی مثل پتاسیم، کلسیم و منیزیم و محدودیت کربوهیدرات­ها ناشی از مصرف بیش‌ازحد قندهای محلول برای آسیمیلاسیون آمونیوم، تأثیر می­پذیرد (41).

اثر نسبت­های مختلف نیترات به آمونیوم بر فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانی: یکی از پاسخ­های مهم در برابر محرک­های زیستی و غیر زیستی توسط سلول­های گیاهی، تولید گونه­های فعال اکسیژن (ROS) مانند رادیکال­های سوپراکسید، پراکسید هیدروژن و رادیکال هیدروکسیل می‍باشد (32 و 46). این ترکیبات نقش پیام­بر ثانوی را در پاسخ­های سلولی بر عهده دارند ولی مقادیر بالای آن­ها باعث آسیب شدید به سلول می­شود (31). گیاهان به وسیله­ی سیستم­های آنتی‌اکسیدان آنزیمی و غیر آنزیمی گونه­های اکسیژن واکنش­گر را کنترل کرده و از این طریق اثرات مخرب آن­ها را کاهش می­دهند (13 و 47). طبق نتایج به­دست آمده، فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانی کاتالاز و پراکسیداز با افزایش نسبت نیترات به آمونیوم افزایش داشته است. در مورد آنزیم آسکوربات پراکسیداز نیز، 24 ساعت پس از تیمار با نسبت­های مختلف نیترات به آمونیوم افزایش داشت و در بازه­ی زمانی 48 ساعت پس از تیمار، فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز ابتدا افزایش و سپس روند کاهشی داشت. تغییر در میزان متابولیسم اولیه و ثانویه تحت تأثیر عوامل درونی ژنتیکی و تغییر عوامل محیطی می­باشد. با تغییر میزان و نسبت تأمین نیتروژن در محیط کشت، تولید برخی از متابولیت­ها به­ویژه متابولیت­های ثانوی با ساختار نیتروژن نیز دچار تغییر می­گردد. نتایج مطالعات نشان داده است که تغییر منبع ازت و افزایش آن در محیط می­تواند با ایجاد شرایط تنش در محیط باعث افزایش تولید آلکالوئیدها شود (22). در شرایط تنشی که متابولیسم اولیه دچار تغییر شده است، تولید یکسری از ترکیبات اکسیژن مانند هیدروکسید اکسیژن و یا گونه‌های فعال اکسیژن شود. در این شرایط، سلول و یا بافت گیاهی به منظور برطرف کردن اثرات نامطلوب این ترکیبات، با تغییر در تولید آنزیم­های آنتی‌اکسیدان، باعث کاهش اثرات مخرب این ترکیبات بر سلول و بافت گیاهی می­گردد (27).

اثر نسبت­های مختلف نیترات به آمونیوم بر آلکالوئیدهای تروپانی هیوسیامین و آسکوپولامین: گیاهان خانواده بذرالبنج از مهم­ترین منابع تأمین آلکالوئیدهای تروپانی می‍باشند و با توجه به این موضوع که غلظت این مواد در بافت گیاهی به‌شدت پایین بوده و تحت تأثیر شدید شرایط محیطی می­باشد، به­منظور افزایش تولید متابولیت­های ثانوی ازجمله آلکالوئیدها، روش­های مختلف بیوتکنولوژیکی امروزه استفاده می­گردد. از این روش­ها می­توان به کشت سلول و اندام، مهندسی ژنتیک، مهندسی متابولیک، تیمار با پیش­سازها و تحریک­زایی اشاره کرد. کشت ریشه موئین به­دلیل ثبات بالا، رشد سریع و عدم نیاز به کاربرد هورمون خارجی در مقایسه با کشت سلول، گسترش روزافزونی داشته است. پس از القای ریشه موئین میزان بیومس تولیدی افزایش می‌یابد اما میزان تولید متابولیت­های ثانوی خیلی دچار تغییرات معنی‌دار نمی­گردد. به همین دلیل از روش­هایی نظیر تحریک­زایی (Elicitation) با انواع محرک­های زیستی و غیرزیستی استفاده می­شود. تغییر نسبت نیترات به آمونیوم نه تنها می­تواند به عنوان یک تنش و محرک باشد بلکه با تغییر منبع تأمین نیتروژن مورد نیاز ساختار آلکالوئیدها، باعث بهبود تولید آنها نیز بشود. براساس نتایج به­دست آمده، کاربرد نسبت­های کم­تر نیترات به آمونیوم منجر به افزایش تولید آلکالوئیدهای تروپانی مذکور گردید ولی با افزایش نسبت نیترات به آمونیوم، محتوای تولید هیوسیامین و آسکوپولامین به­صورت تدریجی کاهش یافت. فاکتورهای تغذیه­ای از قبیل نیتروژن شاخص مهمی است که تولید آلکالوئیدها را تحت تأثیر قرار می­دهد (16). از آنجایی که آلکالوئیدها ترکیبات نیتروژن دار هستند، پیش­بینی شده که قابلیت استفاده از نیتروژن نقش مهمی در بیوسنتز و تجمع آلکالوئیدها در گیاهان ایفا می­کنند (48). نیتروژن یک عنصر معدنی مهم برای گیاهان و یکی از اجزای عمده تشکیل دهنده­ی اسیدهای آمینه، پروتئین­ها و نوکلئیک اسیدها می­باشد (42). آمونیومی که از جذب آمونیوم و احیای نیترات به­دست می­آید از مسیر گلوتامین سینتتاز و گلوتامات سنتاز به ترکیبات آلی وارد می­شود. اسیدآمینه­های مختلفی نظیر متیونین، اورنیتین (Ornithine)، آرژنین (Arginine) و لیزین (Lysine) می­توانند به عنوان پیش­ماده ترکیبات پلی­آمینی بکار روند. (2و 8). دی آمین پوتریسین از اسیدآمینه آرژنین و اورنیتین به وجود می­آید. در چرخه نیتروژن، دو اسیدآمینه آرژنین و اورنیتین قابل تبدیل به یکدیگر هستند که این تبدیل به‌وسیله آنزیم آرژیناز کاتالیز می­شود. دی آمین پوتریسین می­تواند از دو مسیر سنتز شود: مسیر اول تک­مرحله­ای است و شامل دکربوکسیله شدن اورنیتین به‌وسیله اورنیتین دکربوکسیلاز (ODC= Ornithine Decarboxylase) می­باشد که به تولید پوتریسین منجر می­شود (31). مسیر دوم یک فرایند سه مرحله­ای است: در این مسیر ابتدا آرژنین به‌وسیله آنزیم آرژنین دکربوکسیلاز (ADC= Arginine Decarboxylase) دکربوکسیله شده و به اگماتین تبدیل می­شود و سپس به پوتریسین تبدیل می­گردد (29). از این­رو پلی­آمین­ها پیش­ماده تعداد کثیری از متابولیت­های ثانویه ازجمله آلکالوئیدهای تروپان و فرم­های اتصالی اسید سینامیک هستند که نقش اساسی در مکانیسم­های دفاعی گیاه ایفا می­کنند (9). همان­طور که قبلاً نیز گزارش شده رقیق­سازی محیط کشت و کاهش غلظت نیتروژن، رشد و مقدار آلکالوئید را در کشت ریشه­های موئین تیره سیب­زمینی­سانان فراهم می­کند (38و 44) که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد.

در پژوهشی موراناکا و همکاران (33) گزارش نمودند که غلظت­های بالای نیترات ممکن است برخی اثرات سمی را در شرایط فیزیولوژیکی بافت ریشه داشته باشد. احیا نیترات سبب افزایش pH محل احیا نیترات می­گردد (14). افزایش مقدار پوتریسین در گیاهانی که با آمونیوم تغذیه می­شوند می­تواند به­عنوان واکنش ریشه­ها نسبت به pH کم سلول باشد و همچنین می­توان آن را به عنوان جزیی از مکانیزم تنظیم pH سلول به­وسیله­ی ساخت این ترکیبات بازی در نظر گرفت. بدین ترتیب تغذیه آمونیوم هنگامی که pH محیط بالا می­باشد در تشکیل پوتریسین کم­تر مؤثر می­باشد (30). بنابراین احتمال دارد که با افزایش نسبت نیترات به آمونیوم محتوای تشکیل پوتریسین و به­دنبال آن سنتز آلکالوئیدهای تروپانی کاهش یابد. از طرفی، اکسیژن مولکولی برای تبدیل هیوسیامین به آسکوپولامین نیاز می­باشد. ثابت شده که میزان تنفس در شرایط تاریکی با افزایش سطح نیتروژن، افزایش می­یابد (21) که این می­تواند به افزایش میزان ورود سوبسترا به چرخه کرپس برای فراهم شدن اسکلت­های کربنی بیشتر برای ورود آمونیوم به ساختمان مواد آلی مربوط شود (8). بنابراین به­نظر می­رسد که سطوح بالاتر نیتروژن در محیط رشد می­تواند از طریق افزایش تنفس، مقدار اکسیژن مورد نیاز برای تولید آسکوپولامین را کاهش دهد (20). که همین امر می­تواند منجر به کاهش تولید آسکوپولامین در نسبت­های بالاتر نیترات به آمونیوم گردد. در ارتباط با اثرات آنزیم­های آنتی اکسیدانی بر مسیر تولید ترکیبات تروپان آلکالوئیدی گزارش شده است که در مسیر تبدیل هیوسیامین به آسکوپولامین، دو مرحله اصلی وجود دارد که مرحله­ی اول شامل هیدروکسیلاسیون هیوسیامین به 6- بتا هیدروکسی هیوسیامین است که نیازمند 2- اکسوگلوتارات، Fe2+، اکسیژن مولکولی و آسکوربات می­باشد و از آنجایی که فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز با افزایش غلظت فزونی یافته می­توان این احتمال را داد که آسکوربات مورد نیاز جهت تبدیل هیوسیامین به آسکوپولامین با محدودیت مواجه گردیده است و از اینرو در غلظت­های بالای نیترات به آمونیوم، سنتز آسکوپولامین به‌تدریج کاهش یافته است (23).

نتیجه­گیری کلی

نتایج آزمایش حاضر نشان داد که بهترین تیمار نیترات به آمونیوم به­منظور سنتز آلکالوئیدهای تروپانی هیوسیامین و آسکوپولامین نسبت 1/5 : 9/9 میلی­مولار به مدت 24 ساعت می­باشد. در این مطالعه، با افزایش نسبت نیترات به آمونیوم فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی بسته به زمان تیمار تغییر نمود. فعالیت آنزیم کاتالاز، پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز با افزایش نسبت نیترات به آمونیوم افزایش نشان داد. اما در زمان تیمار 48 ساعت، فعالیت آنزیم کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز در غلظت بالا کاهش نشان داد. در مسیر تبدیل هیوسیامین به آسکوپولامین، با توجه به جمع‍بندی نتایج، به­نظر می­رسد که تغییر نسبت نیترات به آمونیوم به­عنوان یک محرک غیرزیستی می­تواند راهکار مناسبی جهت افزایش تولید متابولیت­های باارزش دارویی در شرایط کشت درون شیشه ریشه موئین مورد توجه قرار گیرد.

تقدیر و تشکر

این تحقیق با استفاده از اعتبارات پژوهشکده زیست­فن­آوری دانشگاه ارومیه انجام شده است. از ریاست پژوهشکده و کارشناسان محترم آن تشکر و قدردانی می‌شود.

1- اسمعیل­زاده بهابادی، ص.، و شریفی، م.، 1392. افزایش تولید متابولیت­های ثانوی گیاهی با استفاده از الیسیتورهای زیستی، مجله سلول و بافت، 4 (2)، صفحات 128-119.
2- اصغری، م. ر.، 1394. هورمون­ها و تنظیم­کننده­های رشد گیاهی جدید (غیر کلاسیک)، انتشارات دانشگاه ارومیه، 345 صفحه.
3- پارسا، ا.، و زینالی، ا.، 1396.اثیر الیسیتورهای جاسمونیک اسید و متیل جاسمونات بر میزان تروپان آلکالوئیدهای آتروپین و اسکوپولامین در ریشه‌های مویین و ریشه‌های حاصل از کشت بافت گیاه Hyoscyamus niger L.، مجله پژوهش­های گیاهی، 30(4)، صفحات 955-943.
4- جوانمردی، ش.، فتوت، ر.، و صبا، ج.، 1389. رابطه بین کربوهیدرات­های محلول و پرولین با تنظیم اسمزی و نقش تنظیم اسمزی در عملکرد گندم تحت شرایط تنش خشکی، مجله علوم و فنون کشاورزی و منابع طبیعی، علوم آب‌وخاک، سال 14، شماره 53، صفحات 72-65.
5- خارا، ج.،1385. کمبود و سمیت عناصر غذایی در گیاهان زراعی، انتشارات مهد تمدن، چاپ اول، 277 صفحه.
6-  سالاردینی، ع. الف.،1384. حاصلخیزی خاک، انتشارات دانشگاه تهران، چاپ هفتم، 434 صفحه.
7- سیدطباطبایی، ب. الف.، و امیدی، م.،1390. کشت بافت و سلول گیاهی، انتشارات دانشگاه تهران، چاپ دوم، 368 صفحه.
8- طباطبائی، ج.، 1392. اصول تغذیه معنی گیاهان، انتشارات دانشگاه تبریز، چاپ اول، 544 صفحه.
9- فهیمی، ح.،1376. تنظیم­کننده­های رشد گیاهی، انتشارات دانشگاه تهران، 172 صفحه.
10-  سهرابی­نژاد، ز.، مرعشی، ح.، و مشتاقی، ن.، 1396. بهینه‌سازی کشت ریشه‌های مویین گیاه دارویی همیشه بهار
Calendula officinalis به منظور تولید ترکیب دارویی اولئانولیک اسید، مجله پژوهش­های گیاهی، 31(3): 654-640.
 
11- Aberham, A., Pieri, V., Croom, E. M. J. R., Ellmerer, E., and Stuppner,H., 2011. Analysis of iridoids, secoiridoids and xanthones in Centaurium erythraea, Frasera carpliniensis and Gentiana lutea using LC-MS and RP-HPLC, Journal of Pharmceutical and Biomedical Analysis, 54, PP: 517-525.
12- Aebi, H., 1984. Catalase in vitro. Methods in enzymology, 105, PP: 121-126.
13- Asada, K., 1999. The water-water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygen and dissipation of excess photons. Annuol Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 50, PP: 601-639.
14- Assimakopolou, A., 2006. Effect of iron supply and nitrogen form on growth, nutritional status and ferric reduction activity of spinach in nutrient solution culture. Scientia Horticulturae, 110, PP: 21-29.
15- Bensaddek, I., Gillet, F., Edmundo Nava Saucedo, J., and Fliniaux,M. A., 2001. The effect of nitrate and ammonium concentrations on growth and alkaloid accumulation of Atropa belladonna hairy roots. Journal of Biotechnology, 85, PP: 35-40.
16- Berlin, J., Beier, H., Fecker, L., Noe, W., Sasse, F., Schiel, O., and Wray,V., 1985. Conventional and new approaches to increase the alkaloid production of plant cell cultures. In: Neumann, K.-H., Barz, W., Reinhard, E. (Eds), Primary and secondary metabolism of plant cell cultures. Springer Berlin, PP: 272-280.
17- Chandra, S., and Chandra,R., 2011. Engineering secondary metabolite production in hairy roots. Phytochemistry Reviews, 10, PP: 371-395.
18- Chen, Y. Q., Yi, F., Cai, M., and Luo,J. X., 2003. Effects of amino acids, nitrate and ammonium on the growth and taxol production in cell cultures of Taxus yunnanensis, Plant Growth Regulation, 41, PP: 265-268.
19- Crawford, N. M., 1995. Nitrate: nutrient and signal for plant growth. The Plant Cell, 7, PP: 859-868.
20- Demeyer, K., and Dejaegere,R., 1998. Nitrogen and alkaloid accumulation and partitioning in Datura stramonium L, Journal of Herbs, Spices and Medicinal Plants, 5, PP: 15-23.
21- Flores, H. E., Vivanco, J. M., and Loyola-Vargas, V.M.,1999. Radicle biochemistry: the biology of root-specific metabolism. Trends Plant Science, 4, PP: 220-6.
22- Ghorbanpour, M., Ghafarzadegan, R., and Hatami, M., 2014. Seed alkaloids content and antioxidant enzymes activity in black henbane as influenced by ammonium nitrate application and water deficit stress. Journal of Medicinal Plants, 1(49), PP: 75-86.
23- Hashimoto, T., and Yamada, Y., 1994. Alkaloid biogenesis: molecular aspects. Annual Review of Plant Physiology, 45, PP: 257-285.
24- Kamada, H., Okamura, N., Satake, M., Harada, H., and Shimomura, K.,1986. Alkaloid production by hairy root cultures in Atropa belladonna Plant, Cell Reports, 5, PP: 239-242.
25- Karuppusamy, S., 2009. A review on trends in production of secondary metabolites from higher plants by in vitro tissue, organ and cell cultures. Journal of Medicinal Plants Research, 3, PP: 1222-1239.
26- Khan, S., Irfan, Q. M., Kamaluddin, A. T., and Abdin,M. Z., 2007. Protocol for isolation of genomic DNA from dry and fresh roots of nedicinal plants suitable for RAPD and restriction digestion. African Journal of Biotechnology, 6, PP: 175-178.
27- Liu, J. R., Chen, G. F., Shi, H. N., and Kuo,P. C., 2008. Enhanced antioxidant bioactivity of Salvia miltiorrhiza (Danshen) products prepared using nanotechnology, Phytomedicine, 15, PP: 23-30.
28- Macadam, J. W., Nelson, C. J., and Sharp,R. E., 1992. Peroxidaes activity in the leaf elongation zone of tall fescue, Plant Physiology, 99, PP: 872-878.
29- Malmberg, A., Lewis, G., David, A., and Allebeck,P., 1998. Pre – morbid adjustment and personality in people with schizo- phrenia. British Journal of Psychiatry, 172, PP: 308-313. 
30- Marshner, H., 2001. Superior plant mineral nutrition. Shiraz university press. First, 26 volume. First edition, 495 p.
31- Martin-Tanguy, J., 2001. Metabolism and function of polyamines in plants: recent development (new approaches). Plant Growth Regulation, 34 (1), PP: 135-148.
32- Mittler, R., Vanderauwera, S., Suzuki, N., Miller, G., Tognetti, V. B., Vandepoele, K., Gollery, M., Shulaev, V., and Van Breusegem,F., 2011. ROS signaling: the new wave. Trends in Plant Science, 16, PP: 300-309.
33- Muranaka, T., Ohkawa, H., and Yamada,Y., 1992. Scopolamine release into media by Duboisia leichhardtii hairy root clones. Appl Microbiology Biotechnology, 37, PP: 554-559.
34- Nakano, Y., and Asada,K., 1981. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts. Plant and Cell Physiology, 22 (5), PP: 867-880.
35- Namdeo, A. G., 2007. Plant cell elicitation for production of secondary metabolites: Areview. Pharmacognosy Reviews, 1, PP: 69-79.
36- Palazon, J., Navarro-Ocana, A., Hernandez-Vazquez, L., and Mirjalili,M. H., 2008. Application of metabolic engineering to the production of scopolamine. Molecules, 13, PP: 1722-1742.
37- Pan, X. W., Xu, H. H., Liu, X., Gao, X., and Lu, Y. T., 2004. Improvement of growth and camptothecin yield by altering nitrogen source supply in cell suspension cultures of Camptotheca acuminate. Biotechnology Letters, 26, PP: 1745-1748.
38- Payne, J., Hamill, J. D., RobinsMZ, R. J. M., and Rhodes,J. C., 1987. Production of hyoscyamine by hairy root cultures of Datura stramonium. Planta Medica, 53, PP: 474-478.
39- Praveen, N., and Murthy, H. N., 2013. Withanolide A production from Withania somnifera hairy root cultures with improved growth by altering the concentrations of macro elementsand nitrogen source in the medium, Acta Physiologiae Plantarum, 35, PP: 811-816.
40- Richter, G.,1993. Metabolisme des vegetaux, physiologie et biochimie, Polytechniques et Universitaires Romandes, Lausanne, PP: 341-344.
41- Ruiz, J. M., Castilla, N., and Romero,L., 2000. Nitrogen metabolism in pepper plants applied with different bioregulators. Journal Agreculture and Food Chemical, 48, PP: 2925-2929.
42- Scheible, W. R., Morcuende, R., Czechowski, T., Fritz, C., Osuna, D., Palacios- Rojas, N., Schindelasch, D., Thimm, O., Udvardi, M. K., and Still,M., 2004. Genome-wide reprogramming of primary and secondary metabolism, protein synthesis, cellular growth processes, and the regulatory infrastructure of Arabidopsis in response to nitrogen. Plant Physiological, 136, PP: 2483-2499.
43- Shinde, A. N., Malpathak, N., and Fulzele,D. P., 2010. Impact of nutrient components on production of the phytoestrogens daidzein and genistein by hairy roots of Psoralea corylifolia, Journal of Natural Medicines, 64, PP: 340-353.
44- Sugimoto, Y., Sugimura, Y., and Yamada,Y., 1988. Effects of culture conditions on bisbenzylisoquinoline alkaloid production in cultured roots of Stephania cepharantha. Agricultural and Biological Chemistry, 52, PP: 1495-1498.
45- Tripathi, L., and Tripathi,J. N., 2003. Role of biotechnology in medicinal plants. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 2, PP: 243-253.
46- Van Breusegem, F., James, F., Dat, D., and Inze,D., 2001. The role of active oxygen species in plant signal transduction, Plant Science, 161, PP: 405-414.
47- Vranova, E., Inze, D., and Van Breusegem, F., 2002. Signal transduction during oxidative stress, Journal of Experimental Botany, 53, PP: 1227-1236.
48- Waller, G. R., and Nowacki,E. K., 1979. Alkaloid biology and metabolism in plants. Plenum Press, New York.
49- Wang, J. W., and Tan, R. X., 2002. Artemisinin production in Artemisia annua hairy root cultures with improved growth by altering the nitrogen source in the medium. Biotechnology Letters, 24, PP: 1153-1156.
50- Zhao, J., Davis, L. C., and Verpoorte,R., 2005. Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites, Biotechnology Advances, 23, PP: 283-333.
Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 33, Issue 2
March 2020
Pages 334-348
  • Receive Date: 02 December 2017
  • Revise Date: 15 July 2018
  • Accept Date: 06 November 2018