Document Type : Research Paper
Authors
razi university
Abstract
The response of twenty genotypes of durum wheat (Triticum turgidum var. durum) against drought stress was assessed via in vitro mature and immature embryo culture. The reaction of derived calli to drought stress was evaluated in Murashige and Skoog (MS) medium containing different concentration of PEG 6000 (0, 50, 100, 150 and 200 g/l), using a 20×5 factorial experiment based on completely randomized design with three replications. The traits including, callus growth rate, relative fresh weight growth, relative growth rate, water content, tolerance index and chlorosis percentage under stress condition were studied. There were significant differences amongst genotypes concerning all the traits and response of genotypes to drought different levels. Cluster analysis of the mature or immature embryo cultures classified the genotypes into four groups, but the result of classification for each group of mature and immature embryo cultures were in different manner. It can be concluded that the genotype No. 75-5-3-5 showed relative fresh weight growth, relative growth rate and water content and lowest chlorosis percentage. Furthermore, this genotype showed superiority concerning in vitro drought tolerance. Therefore, it may be used as a drought tolerant genotype in plant breeding programs.
Keywords
Main Subjects
بررسی تحمل به خشکی ژنوتیپهای گندم دوروم در شرایط درون شیشهای
لیلا اکبری1*، کیانوش چقامیرزا1و2 و عزتاله فرشادفر1و2
1 کرمانشاه، دانشگاه رازی کرمانشاه، دانشکده کشاورزی، گروه اصلاح نباتات
2 کرمانشاه، دانشگاه رازی کرمانشاه، دانشکده کشاورزی، گروه پژوهشی بیوتکنولوژِی مقاومت به خشکی
تاریخ دریافت: 16/2/93 تاریخ پذیرش: 16/5/93
چکیده
واکنش کالوسهای حاصل از کشت رویانهای بالغ و نابالغ بیست ژنوتیپ گندم دوروم به تنش خشکی در محیط کشت MS حاوی آگار با پنج مقدار مختلف پلیاتیلن گلیکول 6000 (200- 0 گرم در لیتر) بررسی شد. ارزیابی ژنوتیپها در قالب طرح کاملاً تصادفی به صورت آزمایش فاکتوریل 5 × 20 انجام شد. صفات سرعت رشد کالوس (میلیمتر قطر در روز)، رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر)، سرعت رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر)، درصد محتوای آب کالوس، شاخص تحمل کالوس و درصد کلروز کالوس در شرایط تنش مورد مطالعه قرار گرفتند. نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل آماری نشان داد که اثر ژنوتیپ، سطوح مختلف خشکی و اثر متقابل ژنوتیپ و خشکی برای کلیه صفات مختلف در سطح احتمال یک درصد معنیدار بود. تجزیه خوشهای، ژنوتیپهای مورد مطالعه را بر اساس صفات اندازهگیری شده کالوس حاصل از جنین بالغ و نابالغ تحت تنش خشکی به چهار دسته گروهبندی کرد. ژنوتیپهای 65-12-3-3 و 75-5-3-5 از ارقام بومی استان کرمانشاه در کشت جنین بالغ در یک گروه بودند، بهطوریکه این ژنوتیپها در کشت جنین نابالغ در گروههای متفاوت تحت عنوان گروه ژنوتیپهای مقاوم قرار گرفتند. با توجه به نتایج بدست آمده در کشت جنین بالغ و نابالغ، ژنوتیپ شماره 75-5-3-5 به علت دارا بودن رشد نسبی کالوس، سرعت رشد نسبی کالوس، درصد محتوای آب بیشتر و درصد کلروز پایینتر در سطوح مختلف خشکی در بین ژنوتیپهای مورد مطالعه بهعنوان ژنوتیپ احتمالی متحمل نسبت به خشکی در شرایط درون شیشهای شناسایی شد.
واژههای کلیدی: کشت جنین، تحمل خشکی، گندم دوروم
* نویسنده مسئول، تلفن: 8324820- 0831 ، پست الکترونیکی : Akbari.l1020@gmail.com
مقدمه
گندم دوروم از جنس تریتیکوم (Triticum) و با نام علمی تریتیکوم دوروم (Triticum durum) یک آلوتتراپلویید با تعداد کروموزوم 28 =x 4 = n2 و فرمول ژنوم AABB میباشد (6). گندم دوروم با داشتن 21 میلیون هکتار سطح زیر کشت، هشتمین رتبه را در میان غلات جهان داراست. در ایران این گیاه با سطح زیر کشت 338 هزار هکتار در استان های خوزستان، لرستان، اصفهان و خراسان در مزارع دیم کشت شده و به صورت مخلوط با گندم نان استفاده می شود. برای تولید ماکارونی و اسپاگتی در سطح جهان کشت داده میشود و از دیدگاه اقتصادی برای بیشتر کشورها حائز اهمیت است (20، 21). محدودیت منابع آبی و سایر عوامل باعث توجه بیشتر به مطالعه اثرات تنش خشکی و انتخاب ارقام مقاوم به خشکی شده است. روشهای اصلاح سنتی در بررسی تنشهای زنده و غیر زنده با مشکلاتی همانند نبود فضای مناسب، زمان کافی و نیز از بین رفتن زمینه ژنتیکی در هنگام مقایسه بین گونههای وحشی مقاوم با رقم های زراعی مواجه هستند (13). ایجاد گیاهان مقاوم به خشکی از طریق روشهای سنتی بسیار وقتگیر و گاهی غیر ممکن است. بنابراین تکنیکهای متعددی در جهت گزینش ژنوتیپهای متحمل به خشکی در گیاهان مورد استفاده قرارگرفته است (23). امروزه از شیوه های جدیدتر از جمله کشت بافت برای ایجاد گیاهان مقاوم به خشکی و سایر عوامل نامساعد استفاده میشود. در سالهای اخیر تلاشهای زیادی به منظور تولید گیاهان مقاوم در برابر تنش و بهویژه متحمل به شوری، با استفاده از تنوع موجود یا ایجاد شده در کشت بافت انجام شده است (10). سیستم کشت بافت برای ارزیابی تحمل به تنشهای محیطی مفید است، زیرا تنشهای محیطی در شرایط درون شیشهای به سادگی قابل کنترل هستند (14). انتخاب درون شیشه برای تحمل به تنش غیر زیستی به توسعه مؤثر و معتبر القای کالوس و سیستمهای باززایی گیاه بستگی دارد (11). روش های درون شیشه ای در مطالعات زیادی برای کوتاه کردن دورههای اصلاحی به کار برده شدهاند. از طریق سلولهای گیاهی کشت شده و بررسی واکنش آنها به تنشهای محیطی مؤثر میتوان اثرات یونها، علف کشها، آفت کشها و اثرات سمی را که توسط پاتوژنها تولید میشوند، مطالعه کرد (17). زمانی که بافت گیاهی در محیط کشت در سطح سلولی در حال رشد است میتوان آن را تحت تأثیر عوامل تنش قرار داد، بافتی که بتواند در شرایط تنش زنده بماند، میتواند با مقاومت به یک صفت از قبل مشخص شده (خشکی، شوری و ...) به یک گیاه کامل تبدیل شود (22). وزن تر کالوس های آفتابگردان گزینش شده در محیط تنش در مقایسه با کالوسهای گزینش شده در محیط بدون عامل تنشزا کاهش محسوسی را از خود نشان دادهاند و با افزایش سطوح تنش رشد گیاه کاهش پیدا کرده و بین شرایط In vitro و In vivo همبستگی معنیدار وجود دارد (24). پلی اتیلن گلیکول و مانیتول در مقایسه با غلظتهای متفاوت کلرید سدیم، موجب کاهش شدید تعداد ریشهها در گیاهچه های گندم دوروم شده است، همچنین میزان آسیب پلیاتیلن گلیکول بر رشد گیاهچهها بیشتر از کلرید سدیم بوده است. در حالی که غلظتهای متفاوت مانیتول، تأثیری بر روی درصد جوانهزنی و تعداد ریشهها نداشته است (9). نتایج بررسی بر روی کشت جنین پنج رقم گندم ایرانی نشان داد، با افزایش سطح پلی اتیلن گلیکول وزن تر کالوسها کاهش یافته و در غلظتهای بالای پلیاتیلن گلیکول بیشترین مقاومت مربوط به رقمی است که با کاهش رشد نسبی همراه است (13). از آنجائیکه شناسایی و کاربرد ژنوتیپهای متحمل به خشکی در برنامههای بهنژادی آینده دارای اهمیت بسزایی میباشد، از اینرو هدف این مطالعه بررسی واکنش ژنوتیپهای مختلف گندم دوروم و ارزیابی تحمل به خشکی ژنوتیپها با استفاده از کالوسهای حاصل از کشت جنین بالغ و نابالغ در شرایط درون شیشه بود.
مواد و روشها
مواد گیاهی: ژنوتیپهای مورد مطالعه شامل 9 ژنوتیپ از تودههای بومی گندم دوروم، 10 لاین از ایکاردا و یک رقم بومی زرد که به عنوان شاهد بود به منظور سهولت کار به هر یک از ژنوتیپهای مورد مطالعه کد 20-1 اختصاص داده شد (جدول1). آزمایش در آزمایشگاه کشت بافت دانشکده کشاورزی دانشگاه رازی کرمانشاه انجام شد. به منظور بررسی اثر تنش خشکی بر روی ژنوتیپهای دوروم، آزمایشی به صورت فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملا تصادفی با دو فاکتور، ژنوتیپ در 20 سطح و خشکی در پنج سطح (0، 50، 100، 150، 200 گرم در لیتر پلی اتیلن گلیکول 6000) با سه تکرار اجرا گردید. برای مقایسه درصد و سرعت رشد کالوس حاصل از کشت جنین و نیز واکنش آنها به محیط تحت تنش خشکی، جنین بالغ و نابالغ ژنوتیپهای مورد مطالعه تحت شرایط استریل جدا و 10 جنین در هر محیط کشت MS حاوی آگار با 5/2 میلیگرم در لیتر هورمون 2,4-D، برای تولید کالوس کشت داده شد. سپس کالوسهای تولید شده پس از واکشت برای بررسی مقاومت به خشکی به محیطهای کشت حاوی مقادیر مختلف پلی اتیلن گلیکول(PEG) به مدت 16 روز منتقل شدند.
جدول 1- ژنوتیپهای مورد مطالعه در بررسی تنش خشکی گندم دوروم
نام ژنوتیپ |
کد ژنوتیپ |
نام ژنوتیپ |
کد ژنوتیپ |
Heider/Mt/Ho |
11 |
Zardak |
1 |
Syrian – 4 |
12 |
65-12-3-3 |
2 |
Waha- B53 |
13 |
25-25-1-5 |
3 |
Arthar 71/Bcr//ch5 |
14 |
75-5-3-5 |
4 |
Stj3/4/stn//Hvi/Somo/ 3/yav/ fg//Roh |
15 |
409 |
5 |
Grdara-2 |
16 |
259 |
6 |
Lgt3/4/Bcr/3/ch1//Gta/ stk |
17 |
15-15-1-3 |
7 |
Aghrass-2 |
18 |
240 |
8 |
Quadalete//Erp/mol/3/unk/4/Mrb3/Mnal |
19 |
37-24-2-3 |
9 |
Stj3//Bcr/lks4 |
20 |
249 |
10 |
انتقال کالوسها به محیط کشت حاوی پلی اتیلن گلیکول: کالوسهای حاصل از جنینهای بالغ و نابالغ کشت شده پس از 28 روز نگهداری در شرایط استریل واکشت شدند. دو هفته پس از واکشت، کالوس های سالم و با قطر مناسب در محیط کشت MS جامد (حاوی پلی اتیلن گلیکول) حاوی 5/2 میلیگرم در 2,4-D و 30 گرم در لیتر ساکارز مورد کشت دوباره قرار گرفتند. ژنوتیپهای مورد مطالعه تحت تأثیر پنج سطح تیمار خشکی 0، 50، 100، 150 و 200 گرم در لیتر قرار داده شدند. در هر پتریدیش حاوی پلی اتیلن گلیکول، پنج قطعه کالوس کشت شد و برای هر سطح تیمار خشکی در هر ژنوتیپ سه تکرار در نظر گرفته شد. پتریدیشها پس از علامت گذاری، در اتاقک کشت در شرایط تاریکی و دمای 25 درجهء سانتیگراد نگهداری شدند. در روزهای 0، 4، 8 ،12 و 16 روز پس از کشت، قطر کالوسها بوسیلهء کاغذ میلیمتری در ابتدا و پایان دوره تنش وزن تر و خشک کالوسها به کمک ترازوی دیجیتال اندازه گیری شد. در طی دوره کشت کالوسها در محیط تنش صفاتی همانند وزن کالوس، قطر کالوس، سرعت رشد کالوس، درصد کلروز، سرعت رشد نسبی، درصد محتوای آب کالوس و شاخص تحمل خشکی کالوس نیز اندازهگیری شدند.
صفات مورد مطالعه در بررسی تنش خشکی
سرعت رشد کالوس (Callus Growth Rate)(میلیمتر قطر در روز): قطر کالوسهای حاصل در محیط کشت MS حاوی PEG بعد از 0، 4، 8 و 12 روز پس از کشت مورد اندازهگیری قرار گرفت. نحوه محاسبه قطر کالوس بدین ترتیب بود که بهکمک کاغذ میلیمتری، طول و عرض کالوسها اندازهگیری شد و بعد در هم ضرب شده و از آن جذر گرفته شد تا قطر کالوس بدست آید. سپس با استفاده از میانگین کالوسها در هر تکرار متوسط سرعت رشد با استفاده از چهار عدد قطر کالوس محاسبه شد.
زمان / میانگین قطر کالوس = سرعت رشد کالوس
رشد نسبی کالوس (Relative Fresh Weight Growth Callus)(بر اساس وزن تر): رشد نسبی کالوسها بر اساس وزن تر (RFWG)، برای هر ژنوتیپ از روش مورد استفاده کارادیموا و دژامبوا محاسبه شد:
RFWG = [(W2-W1)/W1]
که در آن W1و W2به ترتیب وزن اولیه و نهایی کالوس در مرحله تنش میباشد.
سرعت رشد نسبی کالوس (Relative Growth Rate Callus)(بر اساس وزن تر): برای محاسبهء سرعت رشد نسبی کالوسها بر اساس وزن تر (RGR)، برای هر ژنوتیپ از فرمول زیر استفاده شد.
RGR= [Ln W2- Ln W1] دورهء رشد /
که در آن W1 و W2به ترتیب وزن اولیه و نهایی کالوس در مرحله تنش میباشد.
درصد کلروز کالوس در خشکی: جهت محاسبهء درصد کلروز، 16 روز پس از کشت کالوس ها در محیط خشکی، به طور مشاهدهای برای کلیه ی ژنوتیپها، به هر کالوس رتبه ای عددی که نشانگر میزان کلروز در آن کالوس بود اختصاص یافت.
درصد محتوای آب کالوس: برای محاسبه درصد محتوای آب کالوس (Water Content Callus) بر اساس وزن تر و خشک آنها در پایان دوره تنش از فرمول زیر استفاده شد (15).
RWC = [(W2-W1)/W2]100*
که در آن W1 و W2به ترتیب وزن خشک و وزن تر نهایی کالوس در محیط تحت تنش میباشد.
شاخص تحمل خشکی: برای محاسبه شاخص تحمل خشکی (Index of Tolerance) براساس سرعت رشد نسبی کالوس از فرمول زیر استفاده شد (8).
INTOL=RGR treatment/RGR control
محاسبات آماری: تجزیهء واریانس و مقایسه میانگین با آزمون حداقل دامنههای معنیدار دانکن در سطح احتمال یک درصد، با استفاده از نرم افزارهای آماری MSTATC و SAS انجام شد. تبدیل دادهها با استفاده از نرم افزار آماری SPSS و MSTATC انجام شد. همبستگی صفات با یکدیگر با استفاده از نرم افزار آماری SPSS محاسبه شد. تجزیه خوشهای برای گروهبندی ژنوتیپها با روش Ward و با تعیین ضریب فاصلهء اقلیدسی با استفاده از نرم افزار SPSS.16 انجام گردید.
نتایج و بحث
نتایج تجزیه واریانس بدست آمده از کالوس حاصل از جنین بالغ کشت شده در محیط کشت MS حاوی سطوح مختلف پلیاتیلن گلیکول در جدول 2 ارائه شده است. نتایج نشان داد که بین ژنوتیپهای مورد مطالعه، سطوح مختلف خشکی و اثر متقابل ژنوتیپ و خشکی از نظر صفات سرعت رشد کالوس (میلیمتر قطر در روز)، رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر)، سرعت رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر)، درصد محتوای آب کالوس و درصد کلروز کالوس اختلاف بسیار معنیدار بود.
جدول 2- میانگین مربعات صفات اندازهگیری شده بر روی کالوس حاصل از جنین بالغ تحت تنش خشکی
منابع تغییرات |
درجات آزادی Df |
میانگین مربعات Mean of squares |
||||
درصد کلروز کالوس (CH) |
سرعت رشد نسبی کالوس (RGR) |
رشد نسبی کالوس (RFWG) |
سرعت رشد کالوس (CGR)
|
محتوای آب کالوس ( RWC) |
||
ژنوتیپ |
19 |
**0.264 |
**0.023 |
**0.059 |
**0.041 |
**4.465 |
خشکی |
4 |
**3.049 |
**0.025 |
**4.581 |
**0.030 |
*0.125 |
خطی(درجه 1) |
1 |
**10.815 |
**0.082 |
**15.351 |
**0.113 |
**17.324 |
درجه 2 |
1 |
**0.828 |
**0.018 |
**0.823 |
*0.012 |
*0.255 |
درجه 3 |
1 |
*0.285 |
**0.010 |
**0.358 |
ns 0.003 |
*0.275 |
درجه 4 |
1 |
*0.272 |
ns 0.003 |
** 0.796 |
ns 0.003 |
0.005 ns |
ژنوتیپ × خشکی |
76 |
**0.059 |
**0.031 |
**0.043 |
**0.023 |
**0.119 |
خطای آزمایشی |
200 |
0.047 |
0.009 |
0.029 |
0.006 |
0.006 |
کل |
299 |
|
|
|
|
|
درصدضریب تغییرات%CV |
|
12.98 |
16.88 |
15.02 |
5.67 |
10.22 |
**: معنیدار در سطح احتمال یک درصد
اثر خشکی با توجه به کمی بودن، سطوح آن به درجات مختلف رگرسیونی تفکیک گردید. بین سطوح مختلف خشکی و رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر) و درصد کلروز کالوس روابط رگرسیونی خطی، درجه دوم، درجه سوم و درجه چهار معنیدار شدند.
اما برای سرعت رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر) و درصد محتوای آب کالوس روابط خطی، درجه دوم و درجه سوم با سطوح مختلف خشکی معنیدار شدند. بین سطوح مختلف خشکی و سرعت رشد کالوس(میلیمتر قطر در روز) روابط رگرسیونی خطی و درجه دوم معنیدار بودند. نتایج حاصل از تجزیه واریانس شاخص تحمل خشکی در جدول 3 ارائه شده است. نتایج نشان داد که بین ژنوتیپهای مورد مطالعه، سطوح مختلف خشکی و اثر متقابل ژنوتیپ و خشکی از نظر شاخص تحمل کالوس (بر اساس وزن تر) اختلاف بسیار معنیدار وجود داشت. بین سطوح مختلف خشکی و شاخص تحمل کالوس روابط رگرسیونی خطی، درجه دوم و سوم معنیدار شدند.
جدول 3- میانگین مربعات شاخص تحمل کالوس حاصل از جنین بالغ در سطوح مختلف تنش خشکی
منابع تغییرات |
درجات آزادی df |
میانگین مربعات |
ژنوتیپ |
19 |
*0.321 |
خشکی |
3 |
**31.760 |
خطی (درجه 1) |
1 |
**17.430 |
درجه 2 |
1 |
**82.730 |
درجه 3 |
1 |
**6.366 |
ژنوتیپ× خشکی |
57 |
*0.256 |
خطای آزمایشی |
160 |
0.168 |
کل |
239 |
|
درصد ضریب تغییرات %CV |
|
17.47 |
**: معنیدار در سطح احتمال یک درصد
نتایج حاصل از مقایسه میانگین ژنوتیپهای مختلف از نظر صفات مورد بررسی در جدول 4 ارائه شده است. در مقایسه میانگین صفت درصد کلروز کالوس و سرعت رشد نسبی کالوس ژنوتیپهای شماره 2، 3 و 4 به ترتیب کمترین مقدار کلروز و بیشترین سرعت رشد نسبی را نشان دادند. ژنوتیپهای شماره 4، 18، 19 و 20 بیشترین سرعت رشد کالوس را در سطوح مختلف خشکی داشتند. برای صفت شاخص تحمل، ژنوتیپهای شماره 4 و 8 تحمل بالاتری را در مقایسه با سایرین نشان دادند. ژنوتیپ شماره 4 از درصد محتوای آب بالاتری نسبت به بقیه برخوردار بود. با توجه به نتایج بدست آمده ژنوتیپ شماره 4 دارای رشد نسبی کالوس، سرعت رشد نسبی کالوس و درصد محتوای آب کالوس بالاتر و درصد کلروز پایینتر بود، پس میتوان آن را در این آزمایش به عنوان ژنوتیپ متحملتر نسبت به خشکی ایجاد شده در شرایط شیشه شناسایی کرد.
در مقایسه میانگین اثرات متقابل ژنوتیپ و سطوح مختلف خشکی، صفات رشد نسبی کالوس، سرعت رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر)، محتوای آب کالوس (بر اساس وزن تر)، سرعت رشد کالوس (میلیمتر قطر در روز) با افزایش سطوح خشکی تا سطح 15 درصد کاهش نشان دادند، پس از آن روند تغییرات ثابت ماند. در مقایسه میانگین صفت درصد کلروز کالوس، با افزایش سطح خشکی درصد کلروز کالوس تا سطح 20 درصد پلی اتیلن گلیکول افزایش یافت (شکل 1). نتایج بدست آمده در این تحقیق با نتایج تحقیقات دیگر مطابقت داشت. در مطالعه کالوسهای حاصل از گندم دوروم در سطوح مختلف تنش خشکی با افزایش غلظت پلی اتیلن گلیکول در محیط کشت، از مقادیر رشد نسبی کالوس و محتوای آب نسبی کالوس کاسته میشود (19). کالوسهای حاصل از جنینهای نابالغ یک ژنوتیپ زمستانه و دوازده ژنوتیپ بهاره گندم تحت تأثیر پلی اتیلن گلیکول 6000 در شرایط درون شیشهای قرار داده شد. در مقایسه با گروه شاهد کاهش معنیداری در وزن تر و حجم نسبی کالوسها مشاهده نشد (18). کالوسهای حاصل از دو رقم نیشکر تحت تأثیر تنش خشکی با سطوح مختلف پلی اتیلن گلیکول، کاهش معنی داری را در سرعت رشد نسبی و محتوای آب کالوس نشان دادند (14). کالوسهای بدست آمده از قطعات فوقانی ساقه نخل خرما در محیط کشتMS حاوی ده میلیگرم نفتالین استیک اسید و یک و نیم میلیگرم ایزوپنتیل آدنین به همراه غلظتهای متفاوت صفر تا سی درصد پلی اتیلن گلیکول 8000 برای القای تنش خشکی مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج نشان داده است با افزایش سطوح پلی اتیلن گلیکول سرعت رشد نسبی، شاخص تحمل و محتوای آب کالوس در ارقام مورد مطالعه بهطور معنیدار کاهش نشان داد (8). کالوسهای حاصل از کشت جنین بالغ سه رقم گندم دوروم به مدت یک ماه تحت تأثیر تنش های شوری و خشکی قرار داده شدند.
شکل 1- پاسخ بیست ژنوتیپ گندم دوروم از نظر صفات مورد بررسی کالوس حاصل از جنین بالغ در سطوح مختلف خشکی
در پایان آزمایش مشخص گردید که در حضور غلظتهای متفاوت پلی اتیلن گلیکول سرعت رشد نسبی کالوسها کاهش یافت و کالوسهایی که تحت تأثیر پلی اتیلن گلیکول قرار داشتند در مقایسه با کالوسهای تحت تأثیر مانیتول قابلیت بازگشت بیشتری را داشتهاند (20). در بررسی کالوسهای نخل روغنی در سطوح مختلف تنش خشکی با افزایش سطوح تنش از میزان محتوای آب نسبی کالوس و رشد نسبی کالوس کاسته میشود ولی مقدار پرولین کالوس با افزایش سطح تنش افزایش نشان داده است (8). در مطالعه بر روی کالوسهای به دست آمده از نیشکر در سطوح مختلف تنش محتوای آب نسبی و رشد نسبی کالوس در سطوح بالای تنش خشکی کاهش یافتند (14). در مطالعه بر روی کالوسهای به دست آمده از جنین گندم دوروم با افزایش سطوح مختلف کلرور سدیم، سرعت رشد و رشد نسبی کالوس کاهش و درصد کلروز افزایش یافته است (1).
همبستگی و روابط بین صفات مورد بررسی: نتایج حاصل از تجزیه همبستگی صفات اندازهگیری شده کالوس در شرایط تنش خشکی در جدول 4 ارائه شده است. نتایج تجزیه همبستگی نشان داد که بین صفت درصد کلروز کالوس با سرعت رشد کالوس در شرایط تنش همبستگی معنیداری وجود داشت. همبستگی معنیداری بین صفت محتوای آب کالوس با صفات سرعت رشد، رشد نسبی، سرعت رشد نسبی، شاخص تحمل و درصد کلروز در شرایط تنش همبستگی معنی دار مشاهده نشد. البته بین سرعت رشد نسبی کالوس و سرعت رشد کالوس در شرایط تنش همبستگی وجود داشت. بین شاخص تحمل خشکی کالوس در شرایط تنش با صفات سرعت رشد نسبی کالوس و رشد نسبی کالوس در شرایط تنش همبستگی معنیداری مشاهده شد.
جدول 4- ضرایب همبستگی صفات مورد مطالعه در کالوس حاصل از جنین بالغ
صفت |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
1-کلروز Chlorosis |
1 |
|
|
|
|
|
2-محتوای آبRWC |
0.151 |
1 |
|
|
|
|
3- رشد نسبیRFWG |
-0.325 |
0.303 |
1 |
|
|
|
4- سرعت رشد نسبی RGR |
-0.170 |
0.373 |
**0.820 |
1 |
|
|
5- شاخص تحمل INTOL |
-0.068 |
0.232 |
**0.802 |
**0.838 |
1 |
|
6- سرعت رشد CGR |
**0.825 |
0.007 |
-0.602 |
-0.013 |
0.040 |
1 |
**: معنیدار در سطح احتمال یک درصد
دستهبندی ژنوتیپها: از تجزیه خوشهای، برای دستهبندی ارقام و ژنوتیپها، به منظور پی بردن به فاصله ژنتیکی آنها و استفاده از تنوع موجود در آنها از نظر صفات مورد بررسی در برنامههای اصلاح نبات استفاده میشود. در این تحقیق، تجزیه خوشهای به روش Ward بر روی صفات سرعت رشد، رشد نسبی، سرعت رشد نسبی، درصد محتوای آب، شاخص تحمل و درصد کلروز کالوس انجام شد. بر این اساس ژنوتیپها به چهار گروه تقسیم شدند (شکل2). ژنوتیپهای زردک شمارههای 2، 4،7 و10 در گروه اول، ژنوتیپهای 6، 8، 9، 14، 15، 16، 17، 19 و20 درگروه دوم، ژنوتیپهای 3 و 12 در گروه سوم، ژنوتیپ های 5، 13،11 و 18 در گروه چهارم قرار گرفتند. بر اساس نتایج بدست آمده ژنوتیپهای متحمل در گروه اول قرار داشتند. نتایج حاصل از تجزیه تابع تشخیص نیز این گروهبندی را صد در صد تأیید کرد. در مطالعه نتایج گروه بندی ژنوتیپ های گندم دوروم در کشت جنین بالغ و نابالغ تحت تنش شوری نشان داد که ژنوتیپها در چهار دسته قرار گرفتند و ژنوتیپهای زردک و شمارههای 2 و 4 در گروه اول و به عنوان گروه متحمل معرفی شدند. این می تواند نشان از ارتباط تحمل به تنش شوری و خشکی در ژنوتیپهای زردک و شماره های 2 و 4 داشته باشد (5).
شکل 2- نمودار خوشهای حاصل از تجزیه صفات اندازهگیری شده کالوس حاصل از جنین بالغ تحت تنش به روش Ward
نتایج تجزیه واریانس کالوس حاصل از جنین نابالغ: تجزیه واریانس صفات کالوسهای بدست آمده از جنین های نابالغ کشت شده در محیط تنش در جدول 5 ارائه شده است. تجزیه واریانس برای صفات مورد بررسی نشان داد که اثرات ژنوتیپهای مورد مطالعه، سطوح مختلف خشکی و اثر متقابل ژنوتیپ و خشکی معنیدار بودند.
جدول 5- میانگین مربعات صفات اندازهگیری شده بر روی کالوس حاصل از جنین نابالغ تحت تنش خشکی
منابع تغییرات |
درجات آزادیdf |
میانگین مربعاتmean of squares |
||||
درصد کلروز کالوس (CH) |
سرعت رشد نسبی کالوس (RGR) |
رشد نسبی کالوس (RFWG) |
سرعت رشد کالوس (CGR) |
درصد محتوای آب کالوس |( RWC) |
||
ژنوتیپ |
19 |
**0.685 |
**0.002 |
*0.226 |
**0.029 |
**0.014 |
خشکی |
4 |
**9.564 |
**0.175 |
**6.229 |
*0.021 |
**0.426 |
خطی(درجه 1) |
1 |
**37.341 |
**0.631 |
**18.768 |
* 0.041 |
**1.003 |
درجه 2 |
1 |
**0.267 |
**0.047 |
**0.867 |
**0.057 |
**0.094 |
درجه 3 |
1 |
**0.349 |
**0.025 |
**2.213 |
ns 0.013 |
**0.612 |
درجه 4 |
1 |
**0.291 |
0.005 ns |
** 3.071 |
ns 0.003 |
0.011 ns |
ژنوتیپ× خشکی Genotype*Drought |
76 |
*0.051 |
*0.008 |
*0.156 |
**0.015 |
**0.017 |
خطای آزمایشی Error |
200 |
0.037 |
0.017 |
0.124 |
0.013 |
0.009 |
کل Total |
299 |
|
|
|
|
|
درصد ضریب تغییرات CV% |
|
11.45 |
16.88 |
8.49 |
1.12 |
10.67 |
** معنیدار در سطح احتمال یک درصد **: Significant at 1% probability level
تنوع موجود بین ژنوتیپها از نظر صفات مختلف کالوس نشان دهنده وابستگی این صفات به نوع ژنوتیپ است. بین سطوح مختلف خشکی و رشد نسبی کالوس (بر اساس وزن تر) و درصدکلروز کالوس روابط رگرسیونی خطی، درجههای دوم، سوم و چهارم معنیدار شدند. برای سرعت رشد نسبی (بر اساس وزن تر) کالوس و درصد محتوای آب کالوس روابط خطی، درجههای دوم و سوم با سطوح مختلف خشکی معنیدار بودند. در سرعت رشد کالوس روابط خطی و درجه دوم معنیدار شد. نتایج به دست آمده در تجزیه واریانس صفات کالوس جنینهای نابالغ تحت تنش خشکی با نتایج حاصل از کالوسهای بالغ در همین مطالعه مطابقت داشت. تجزیه واریانس برای صفت شاخص تحمل کالوس (بر اساس وزن تر) نشان داد که بین ژنوتیپهای مورد مطالعه، سطوح مختلف خشکی و اثر متقابل ژنوتیپ و خشکی اختلاف معنیدار بود (جدول6). بین سطوح مختلف خشکی و شاخص تحمل روابط رگرسیونی خطی، درجه دوم و سوم معنیدار بودند.
جدول 6- میانگین مربعات شاخص تحمل کالوس حاصل از جنین نابالغ در سطوح مختلف تنش خشکی
منابع تغییرات |
درجات آزادیdf |
میانگین مربعات |
ژنوتیپ |
19 |
**0.504 |
خشکی |
3 |
**5.602 |
خطی (درجه 1) |
1 |
**17.43 |
درجه 2 |
1 |
**2.73 |
درجه 3 |
1 |
**6.366 |
ژنوتیپ× خشکی |
57 |
**0.098 |
خطای آزمایشی |
160 |
0.153 |
کل |
239 |
|
درصد ضریب تغییرات CV% |
|
16.03 |
**: معنیدار در سطح احتمال یک درصد
در مقایسه میانگین صفت درصد کلروز کالوس، ژنوتیپهای شماره 2، 3 و 4 کمترین مقدار کلروز را در کالوس نشان دادند. ژنوتیپهای شماره 2، 3، 4، 17 و 18 بیشترین سرعت رشد را داشتند. با توجه به نتایج بدست آمده ژنوتیپ شماره 4 دارای رشد نسبی کالوس، سرعت رشد نسبی کالوس و سرعت رشد کالوس بالایی بود، پس میتوان آن را در این آزمایش به عنوان ژنوتیپ متحملتر نسبت به خشکی شناسایی کرد. نتیجه بدست آمده با نتایج حاصل از کالوسهای بهدست آمده جنین بالغ همین ژنوتیپها در مطالعه حاضر تا حدودی مطابقت داشت. بر اساس نتایج حاصل از مقایسه میانگینها، صفات درصد کلروز کالوس، رشد نسبی کالوس، سرعت رشد نسبی کالوس، محتوای آب کالوس، شاخص تحمل و سرعت رشد کالوس با افزایش سطوح مختلف خشکی کاهش معنی داری را از خود نشان دادند و نیز با افزایش غلظت پلی اتیلن گلیکول تا سطح 20 درصد، درصد کلروز کالوس افزایش یافت (شکل 3). واکنش ژنوتیپها به سطوح مختلف تنش در طول دوره متفاوت بود. در آزمایشی که به منظور بررسی اثرات تنش خشکی بر کالوسهای گلرنگ نشان داده شده است، با افزایش سطح خشکی محتوای آب نسبی کالوس، سرعت رشد کالوس، رشد نسبی کالوس و شاخص تحمل کالوس کاهش مییابد (4). در بررسی اثر تنش خشکی بر کالوسهای ایجاد شده توسط کشت هیپوکوتیل در کلزای پاییزه مشخص گردید که با افزایش سطح تنش خشکی، محتوای آب نسبی کالوس و رشد نسبی کالوس کاهش مییابد (15). در مطالعه بر روی کالوسهای به دست آمده از نیشکر در سطوح مختلف تنش خشکی نشان دادند که محتوای آب نسبی و رشد نسبی کالوس در سطوح بالای تنش خشکی کاهش مییابند ولی محتوای پرولین کالوس با افزایش تنش افزایش مییابد (14). در بررسی اثر تنش خشکی بر کالوسهای حاصل از کشت هیپوکتیل کلزا با افزایش سطوح مختلف محتوای آب نسبی کالوس، سرعت رشد کالوس، رشد نسبی کالوس و شاخص تحمل کالوس کاهش یافته است (3). در بررسی تنش خشکی بر روی کالوسهای حاصل از جنین نابالغ گندم نان مشاهده گردید که با افزایش سطوح مختلف خشکی صفات سرعت رشد، رشد نسبی، سرعت رشد نسبی و درصد محتوای آب کالوس کاهش و درصد کلروز کالوس افزایش را نشان میدهد (2).
شکل 3- پاسخ بیست ژنوتیپ گندم دوروم از نظر صفات مورد بررسی کالوس حاصل از جنین نابالغ در سطوح مختلف خشکی
همبستگی و روابط بین صفات مورد بررسی: نتایج تجزیه همبستگی صفات مورد مطالعه در جدول 7 ارائه شده است. شاخص تحمل کالوس با درصد کلروز کالوس در شرایط تنش خشکی همبستگی معنیدار داشت. بهطوریکه بین سرعت رشد کالوس و صفات رشد نسبی و سرعت رشد نسبی کالوس در شرایط تنش همبستگی مثبت و معنیدار بود، همچنین بین رشد نسبی کالوس و سرعت رشد نسبی کالوس در شرایط تنش همبستگی معنیداری مشاهده شد که این نتایج با نتایج بدست آمده از کشت جنین بالغ در مطالعه حاضر بود.
جدول 7- ضرایب همبستگی بین صفات در شرایط تنش برای ژنوتیپهای مورد مطالعه در کالوس حاصل از جنین نابالغ
صفت |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
1- درصدکلروز Chlorosis |
1 |
|
|
|
|
|
2- محتوای آبRWC |
0.131 |
1 |
|
|
|
|
3- رشد نسبیRFWG |
-0.380 |
0.280 |
1 |
|
|
|
4- سرعت رشد نسبیRGR |
-0.229 |
0.202 |
**0.767 |
1 |
|
|
5- شاخص تحملINTOL |
**0.850 |
0.014 |
-0.107 |
-0.450 |
1 |
|
6- سرعت رشدCGR |
-0.095 |
0.100 |
**0.770 |
**0.794 |
0.111 |
1 |
**: معنیدار در سطح احتمال یک درصد
دستهبندی ژنوتیپها: بر اساس نتایج تجزیه خوشهای ژنوتیپها در چهار دسته گروهبندی شدند (شکل 4) که ژنوتیپ های 1، 2، 5، 8، 13، 14، 15، 16 و 17 در گروه اول، ژنوتیپهای 3، 6، 11 و 12 در گروه دوم، ژنوتیپهای 4، 7، 9 و 10 در گروه سوم و ژنوتیپ های 18، 19 و 20 در گروه چهارم قرارگرفتند. دستهبندی ژنوتیپها در یک گروه بیانگر شباهت بیشتر آنها از نظر صفات مورد نظر می باشد. بهطوریکه در گروه سوم ژنوتیپهای متحمل و گروه چهارم ژنوتیپهای حساس جای گرفتند. ژنوتیپ شماره 4 در خوشهبندی بدست آمده از صفات کالوس حاصل از جنین بالغ و نابالغ بهعنوان ژنوتیپ متحمل به خشکی شناسایی شد. این احتمالاً نشاندهنده مقاومت به خشکی این ژنوتیپ در شرایط درون شیشه میباشد.
شکل 4- نمودار خوشهای حاصل از تجزیه صفات اندازهگیری شده از کالوس حاصل از جنین نابالغ تحت تنش خشکی به روش Ward
سپاسگزاری
بدینوسیله از جناب آقای مهندس رضا محمدی (محقق
معاونت مؤسسه تحقیقات دیم سرارود) بهدلیل در اختیار گذاشتن بذرهای این مطالعه تشکر و قدردانی میشود.