نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه شهرکرد
2 دانشکده علوم-گروه زیست شناسی
چکیده
جنس Stachys L. (Lamiaceae، Lamioideae) با داشتن ویژگیهای دارویی متعدد یکی از بزرگترین جنسهای این تیره محسوب می گردد. به واسطه وجود گونه های بسیار مشابه، تنوع ریخت شناسی بالا و دورگه گیریهای متعدد در این جنس، تاکسونومی این جنس بسیار پیچیده است. لذا هدف از این تحقیق بررسی تنوع الگوهای فلاونوئیدی، تعیین کلاس فلاونوئیدی و آشکار سازی موقعیت تاکسونومیکی 5 گونه و 3 زیرگونه متعلق به 4 بخش می باشد. بدین منظور، فلاونوئید برگ با استفاده از حلال متانول و روش کروماتوگرافی لایه نازک استخراج گردید. به منظور تعیین کلاس فلاونوئیدی نیز از کروماتوگرافی ستونی و سفادکس استفاده شد. همچنین، تنوع الگوهای فلاونوئیدی و موقعیت تاکسونومیکی گونه ها و جمعیتها با استفاده از تحلیل خوشه ای مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج حاصل از تحلیل خوشه ای نشان می دهد که بیشترین تنوع فلاونوئیدی در St. lavandulifolia Vahl. مشاهده می گردد. علاوه براین، تعداد 6 کلاس فلاونوئیدی شناسایی شد که اغلب آنها فلاون هستند و الگوهای تغییرات فلاونوئیدی نیز از نوع هیدروکسیلاسیون، متوکسیلاسیون و گلوکوزیلاسیون می باشند. شایان ذکر است که St. setifera subsp. daenesis به واسطه حضور پنج نوع فلاون و یک نوع فلاونول از دو زیر گونه setifera و Iranica متمایز می گردد. بر پایه نتایج حاصل از این مطالعه، ترکیبات فلاونوئیدی در تعیین موقعیت گونه های متعلق به جنسStachys کار آمد معرفی می گردد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
The study of flavonoid patterns diversity in five Stachys species in Iran
چکیده [English]
Stachys L. (Lamiaceae family, Lamioideae sub family) genus with enormous medicinal properties is one of the largest genera of this family. Due to the similarity among the species, high morphological diversity and several hybridizations, the taxonomy of this genus is greatly complicated. Consequently, the aim of this research is to study the flavonoid diversity, identify the flavonoid class and determine the taxonomical position of five species and three subspecies belonging to four sections. Therefore, the leaf flavonoid was extracted by methanol solvent and thin layer chromatography. In order to determine the flavonoid class, column chromatography and cephadex was used. As well, the diversity of flavonoid patterns and the taxonomic position of species and accessions were studied using cluster analysis. The results of cluster analysis showed that the highest flavonoid diversity was observed in St. lavandulifolia Vahl. Moreover, six flavonoid classes were identified which mostly included flavone and the variations of flavonoid patterns were hydroxylation, methoxylation and glucosylation. Obviously, St. setifera subsp. daenensis was separated from St. setifera subsp. setifera and St. setifera subsp. iranica using five kinds of flavones and a kind of flavonol. Based on the results of this study, the flavonoid compounds are useful to determine the position of Stachys species.
کلیدواژهها [English]
بررسی تنوع الگوهای فلاونوئیدی در 5 گونه از جنس Stachys در ایران
نواز خرازیان*، مژگان محمدی و لیلا شبانی
شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، دانشکده علوم، گروه زیستشناسی
تاریخ دریافت: 27/2/93 تاریخ پذیرش: 21/10/93
چکیده
جنس Stachys L. (Lamiaceae، Lamioideae) با داشتن ویژگیهای دارویی متعدد یکی از بزرگترین جنسهای این تیره محسوب میگردد. بدلیل وجود گونههای بسیار مشابه، تنوع ریختشناسی بالا و دورگهگیریهای متعدد در این جنس، تاکسونومی این جنس بسیار پیچیده است. ازاینرو هدف از این تحقیق بررسی تنوع الگوهای فلاونوئیدی، تعیین کلاس فلاونوئیدی و آشکارسازی موقعیت تاکسونومیکی 5 گونه و 3 زیرگونه متعلق به 4 بخش میباشد. بدینمنظور، فلاونوئید برگ با استفاده از حلال متانول و روش کروماتوگرافی لایه نازک استخراج شد. بهمنظور تعیین کلاس فلاونوئیدی نیز از کروماتوگرافی ستونی و سفادکس استفاده شد. همچنین، تنوع الگوهای فلاونوئیدی و موقعیت تاکسونومیکی گونهها و جمعیتها با استفاده از تحلیل خوشهای مطالعه گردید. نتایج حاصل از تحلیل خوشهای نشان میدهد که بیشترین تنوع فلاونوئیدی در St. lavandulifolia Vahl. مشاهده میگردد. علاوه براین، تعداد 6 کلاس فلاونوئیدی شناسایی شد که اغلب آنها فلاون هستند و الگوهای تغییرات فلاونوئیدی نیز از نوع هیدروکسیلاسیون، متوکسیلاسیون و گلوکوزیلاسیون میباشند. شایان ذکر است که St. setifera subsp. daenesis بدلیل حضور پنج نوع فلاون و یک نوع فلاونول از دو زیرگونه setifera و iranica متمایز میشود. بر پایه نتایج حاصل از این مطالعه، ترکیبات فلاونوئیدی در تعیین موقعیت گونههای متعلق به جنس Stachys کارآمد معرفی میگردد.
واژههای کلیدی: فلاونوئید، تنوع، Stachys ، Lamiaceae
* نویسنده مسئول، تلفن: 03832324419 ، پست الکترونیکی: nkharazian@gmail.com
مقدمه
جنس Stachys یکی از بزرگترین جنسهای تیره Lamiaceae محسوب میگردد که در سرتاسر جهان حدود 300 گونه دارد، بهطوریکه تعداد گونه های این جنس در ایران بیش از 34 گونه می باشد (14، 42). مرکز اصلی تنوع این جنس در نواحی جنوب و شرق آناتولی، قفقاز، شمال غرب ایران، شمال عراق و نواحی بالکان گزارش شده است و اغلب در نواحی گرم مدیترانه ای و جنوب غرب آسیا توزیع یا فته اند (8، 14). شکل رویشی در برخی از گونه های این جنس یکساله، دوساله، چند ساله، بوته ای یا نیمه بوته ای هستند که گاهی در نواحی صخره ای و استپهای کوهستانی رشد میکنند (8، 29). بعلت وجود ترکیبات ثانویه قابل توجه در جنس Stachys، این جنس در صنعت داروسازی و درمان بیماریها کاربرد فراوانی دارد. بهطوریکه در درمان بیماریهای قلبی- عروقی، تورم، زخم معده، اسکلروزیس و سرماخوردگی استفاده میشود و حاوی مقادیر قابل توجهی از ترکیبات ضد اکسیدانت و ضد باکتریال است (17، 19، 23، 32).
بر پایه مطالعات تاکسونومیکی، گزارشهایی در زمینه های مختلفی مانند تاکسونومی، ریز ریخت شناسی دانه گرده، فندقه، تریکوم، مطالعات بر روی آنزیم ها (ایزوزیم)، توالیهایInternal Transcribed Spacer (ITS) هسته ای و تشریح ارائه شده است که در تمایز برخی از تاکسونهای این جنس کارآمد معرفی می شوند (45-51). در سطوح فراگونه ای، گونه های جنس Stachys تشابه ریخت شناسی بالا همراه با تنوع ریخت شناسی و پلی مورفیسمی بالایی را نشان می دهند (46، 47). بر این اساس، این جنس بهعنوان یک جنس کمپلکس محسوب می گردد و تشخیص گونه های خویشاوند براحتی امکان پذیر نمی باشد و نظرات متفاوتی پیرامون طبقه بندی در این جنس ارائه شده است (8، 18، 55). بر این اساس، در برخی از بخشها تمایز و تشخیص تاکسونهای گونه ای و فرا گونه ای بسیار مشکل می باشد (18). بر پایه مطالعات فیتوشیمی، اغلب گزارشهای موجود در این جنس بر روی ترکیبات ثانویه ای نظیر روغنهای فرار، تریترپنوئیدها، اسیدهای چرب و ترکیبات فنولی متمرکز شده است (2، 3، 10، 31). ترکیبات روغن فرار و اسیدهای چرب توسط Radulovic و همکاران (2006 و 2007) در گونه های انحصاری جنسStachys در نواحی بالکان مورد بررسی قرار گرفت و چنین نتیجه گیری شد که اسیدهای چرب نشانگرهای مناسبی در سیستماتیک این جنس می باشند (40، 41). علاوه بر این، وجود ترکیبات روغن فرار در برخی از گونههای جنس Stachys در ایران نیز گزارش شده است (22، 43، 44). ترکیبات فلاونوئیدی نیز در چندین گونه از جنس Stachys مورد بررسی قرار گرفته است، بهطوریکه Skaltsa و همکاران (2007) و Kotsos و همکاران (2007) ترکیباتی مانند فلاونوئید آلوزید و استاخیسپینوزید را از St. spinosa L. جداسازی کردند (26، 55). Ahmad و همکاران (2006) نیز ترکیباتی مانند فلاونوئید گلوکوزید و سایر مشتقات آن را در
St. parviflora Benth. شناسایی کردند (4). همچنین در برخی از گونه های جنس Stachys فلاون گلیکوزید، فلاون گلوکوزید، هیدروکسی فلاونوئیدهای متیله شده و آگلی کون فلاونوئیدها همراه با جایگزینهای گلوکوزیدی، گلوکوپیرانوزیدی و آلوزید گلوکوزیدی معرفی شدند (6، 7، 13، 15، 16، 25، 27، 28، 34، 38). پیرامون ارزیابیهای کموتاکسونومیکی در سطوح فراگونه، چند شکلیهای موجود در بین زیر گونه های St. swaisonii Benth. آشکار گردید که مرتبط با فلاونوئیدهای متمایز کننده در بین این تاکسونها بود (55).
با توجه به اینکه جنس Stachys از لحاظ ریخت شناسی تنوع بالایی را در ناحیه زاگرس ایران آشکار میکند، و همچنین بدلیل حضور چند شکلیهای متعدد ریخت شناسی در سطوح درون گونه ای، شباهتهای ریخت شناسی قابل توجه در بین گونه ها و زیر گونه های این جنس و دورگه گیری فراوان در سطوح درون گونه ای و با توجه به اینکه در زمینه تعیین ترکیبات فلاونوئیدی و تنوع الگوهای این ترکیبات در ایران گزارشهای اندکی در دسترس است، ازاینرو اهداف زیر در این مطالعه مورد توجه می باشد: 1) تعیین کلاسهای فلاونوئیدی در هریک از اعضای متعلق به هریک از بخشها بمنظور تعیین روابط بین گونه های متعلق به هر بخش، معرفی نوع کلاس برای هریک از بخشها و گزارشی جدید از حضور نوع کلاسهای فلاونوئیدی موجود در گونه ها، 2) بررسی تنوع الگوهای این ترکیبات در بین جمعیتها و گونه ها بمنظور آشکار کردن اختلافات موجود در بین گونه ها و ارائه گزارشی از الگوهای تنوع زیستی (فلاونوئیدی) در منطقه زاگرس و 3) تعیین موقعیت تاکسونومیکی اعضای متعلق به بخشها در ناحیه زاگرس مرکزی ایران. لازم بذکر است که برخی از کلاسهای فلاونوئیدی و کلیه الگوهای تنوع در این مطالعه برای اولین بار از ایران گزارش می گردد. 4 بخش مورد مطالعه در این تحقیق شامل: 1) بخش Ambleia (St. inflata Benth.)، 2) بخش Zietenia (St. lavandilifolia)، 3) بخش Eriostomum (St. cretica L. و St. spectabilis Choicy ex DC.) و 4) بخش Setifolia ( St. setifera A. C. Mey. subsp setifera، St. setifera subsp. daenesis ،
St. setifera subsp. iranica) می باشند.
مواد و روشها
در این مطالعه 22 جمعیت متعلق به 5 گونه و 3 زیر گونه از رویشگاههای طبیعی ناحیه زاگرس مرکزی ایران جمعآوری شد (جدول 1). سپس هریک از گونه ها با استفاده از فلور ایرانیکا (43) و فلور ایران (1) بدقت شناسایی و نامگذاری شدند. نمونه های اصلی هریک از گونه ها در هرباریوم دانشگاه شهرکرد موجود می باشد.
جدول 1- فهرست گونهها و جمعیتهای جمعآوری شده جنس Stachys از رویشگاههای طبیعی زاگرس مرکزی در ایران
گونه و جمعیت |
محل جمعآوری |
ارتفاع محل از سطح دریا (متر) |
St. lavandulifolia 22 |
چهار محال و بختیاری- کوهجهانبین، تنگ خراجی، کوه زنگیان |
1975 |
St. lavandulifolia 24 |
کهگیلویه و بویر احمد- 20 کیلومتری یاسوج |
2036 |
St. lavandulifolia 60 |
اصفهان- فریدن، دامنه |
2175 |
St. lavandulifolia 93 |
چهار محال و بختیاری- شلمزار، کوه یومری |
1993 |
St. lavandulifolia 149 |
اصفهان- ونک سمیرم، چشمه ناز |
2030 |
St. lavandulifolia 175 |
کهگیلویه و بویر احمد- آبشار سی سخت |
2438 |
St. inflata 103 |
چهار محال و بختیاری- گردنه گل سفید |
1638 |
St. inflata 133 |
اصفهان- روستای ورق، بسمت سمیرم |
2303 |
St. inflata 162 |
کهگیلویه و بویر احمد- یاسوج |
2020 |
St. inflata 262 |
اصفهان- 5 کیلومتری دالان کوه |
1945 |
St. setifera subsp. setifera 141 |
اصفهان- ونک سمیرم، چشمه ناز |
1960 |
St. setifera subsp. setifera 267 |
چهار محال و بختیاری- بلداجی، کوه چیرو |
1871 |
St. setifera subsp. setifera 284 |
کهگیلویه و بویر احمد- آبشار سی سخت |
1971 |
ادامه جدول 1-
|
گونه و جمعیت |
محل جمعآوری |
ارتفاع محل از سطح دریا (متر) |
||
St. setifera subsp. daensis 205 |
چهارمحال و بختیاری- تنگ چهراز گون، سبزه کوه |
2020 |
|||
St. setifera subsp. daensis 272 |
اصفهان- فریدن، کوه دامنه |
1839 |
|||
St. setifera subsp. daensis 281 |
کهگیلویه و بویر احمد- سی سخت، کوه گل |
1885 |
|||
St. cretica 250 |
چهارمحال و بختیاری- چغاخور، گهرو |
1858 |
|||
St. cretica 280 |
کهگیلویه و بویر احمد- سی سخت، کوه گل |
1885 |
|||
St. spectabilis 282 |
کهگیلویه و بویر احمد- سی سخت، بعد از اقامتگاه کوه گل |
1882 |
|||
St. spectabilis 283 |
کهگیلویه و بویر احمد- یاسوج، کوه میشی |
2012 |
|||
St. spectabilis 285 |
چهارمحال و بختیاری- آب ملخ، مال خلیفه |
2048 |
|||
St. setifera subsp. iranica 249 |
چهارمحال و بختیاری- چغاخور، گهرو |
1829 |
|||
استخراج فلاونوئید: 5/10 گرم از برگهای خشک شده هریک از جمعیتها و گونه ها وزن شد، سپس برگها با استفاده از هاون چینی کاملا پودر شده و محلول فلاونوئید با استفاده از متانول خالص (150 میلی لیتر) و دمای 60 درجه سانتیگراد و بمدت 30 دقیقه جداسازی گردید. بهمنظور حذف متانول از محلول بدست آمده، تقطیر در خلأ (Rotary Evaporator Eyala, Japan) با دمای 70 درجه سانتیگراد انجام شد (36). با استفاده از محلول 1-بوتانول، خالص سازی فلاونوئید از سایر ترکیبات مانند کاروتنوئید انجام شد و بعد برای تشکیل لکه های فلاونوئیدی از سیلیکاژل MERK (15 گرم و 5/67 میلی لیتر آب مقطر) و کروماتوگرافی لایه نازک (ضخامت 3 میکرون و ابعاد 20 در 20 سانتی متر مربع) در فاز آلی حاوی بوتانل- اسید استیک- آب (1:1:3) استفاده گردید (42). بهطوریکه محلول سیلیکاژل با استفاده از دستگاه TLC Plate Coater, CAMAG بر روی تیغه های شیشه ای (20 × 20) پخش شد و تیغه ها در ریز هود خشک گردید، سپس عصاره فلاونوئید با استفاده از لوله موئینه در سطح صفحات کروماتوگرام کاشته شدند. در نهایت با قرار دادن صفحات ذکر شده در فاز آلی، لکه ها به تفکیک مهاجرت کرده و مسیر این لکه ها مشاهده و ثبت شد. لکه های تشکیل شده در کروماتوگرام نیز با استفاده از اسید سولفوریک 5 درصد و متانول، و اسید کلریدریک 5 درصد و متانول در زیر اشعه ماوراءبنفش با طول موج 366 نانومتر رؤیت گردیدند. خالص سازی ترکیبات فلاونوئیدی هریک از گونه ها با استفاده از کروماتوگرافی ستونی با سفادکس LH20 Sigma انجام شد و فرکنشها بطور جداگانه و با استفاده از شیب غلظت متانول (20%، 40%، 60%، 80%، 100%) و استون خالص و با حجم 50 میلی لیتر جداسازی شدند. بهطوریکه با تزریق یک میلی لیتر محلول فلاونوئید در سطح ستون سفادکس، بهمراه شیب غلظت متانول در سطح ستون و با استفاده از قیف دکانتور، فراکشنها بطور کامل جداسازی شدند. این فراکشنها نیز با استفاده از کروماتوگرافی یک بعدی خالص سازی شدند و تعیین ترکیبات فلاونوئیدی بر مبنای غلظتهای متفاوت متانول (20%، 40%، 60%، 80%، 100%) و عوامل شیفتدهنده مانند کلرید آلومینیوم، کلرید آلومینیوم/اسید کلریدریک، استات سدیم، استات سدیم/ اسید بوریک و بر پایه طیف سنج ماوراءبنفش ( UV-vis (Ultraviolet visible ) در 366 نانومتر مورد بررسی قرار گرفتند (36، 42). بهمنظور تعیین تنوع الگوهای فلاونوئیدی در هریک از جمعیتها و تعیین موقعیت تاکسونومیکی گونه ها، آنالیزهای آماری با بهره گیری از وجود و عدم وجود لکه های کروماتوگرام، آنالیز خوشه ای با ضریب فاصله اقلیدسی و روش Ward و نرم افزار SPSS v. 20.0 مورد بررسی قرار گرفت. همچنین میزان تغییراتRf (Retension factor) برای هریک از گونه ها محاسبه شد (میزان مهاجرت لکه/ میزان مهاجرت حلال =Rf). کلیه مراحل آزمایش در آزمایشگاه تحقیقاتی دانشکده علوم، دانشگاه شهرکرد انجام شده است.
نتایج
نتایج حاصل از الگوهای کروماتوگرافی لایه نازک چنین نشان می دهد که در فاز آلی لکه های رنگی متفاوتی در هریک از گونه ها پدیدار می گردد. تغییرات لکه ها برای هریک از گونه ها در جدول 2 مشخص شده است. در برخی از گونه ها تغییرات رنگ و ایجاد رنگ جدید بعد از عمل اسپری نیز مشاهده شد که این رنگها اغلب زرد، آبی، نارنجی و یا بدون تغییر بودند (جدول 2). مقادیر Rf نیز برای هریک از لکه ها در هریک از گونه ها مورد بررسی قرار گرفتند (جدول 3). نتایج حاکی از این است که حداکثر مقدار Rf در St. cretica (9/1) و کمترین مقدار آن در St. lavandulifolia (51/0) مشاهده می گردد (جدول 3). همچنین، تعداد لکه های ایجاد شده در هریک از گونهها به شرح زیر می باشند: در جمعیتهای متعلق به
St. lavandulifolia 27 لکه، در جمعیتهای St. inflata 17 لکه، در جمعیتهای St. cretica 13 لکه، در جمعیتهای متعلق به St. spectabilis 17 لکه و در جمعیتهای متعلق به St. setifera زیر گونه های iranica، setifera و daensis بهترتیب 4، 13 و 9 لکه مشاهده شد.
بر پایه الگوهای کروماتوگرام، حضور و عدم حضور هریک از لکه ها برای هریک از 5 گونه و 3 زیر گونه جنس Stachys محاسبه شد. این داده ها برای نمایش تغییرات الگوی فلاونوئیدی و تعیین موقعیت تاکسونومیکی در بین 22 جمعیت بررسی شد.
جدول 2- حضور لکههای کروماتوگرام در بین گونههای جنس Stachys قبل و بعد از اعمال اسپری. a: لکههایی که بعد از اعمال اسپری ایجاد شدهاند. شمارهها بهترتیب: 1: بنفش، 2: آبی، 3: آبی روشن، 4: سبز، 5: قهوهای، 6: زرد، 7: زرد روشن، 8: زرد تیره، 9: نارنجی، 10: نارنجی تیره، 11: قرمز.
گونه و جمعیت |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
St. lavandulifolia |
|
+ |
|
|
|
+ |
+ |
+ |
|
|
|
St. inflata 103 |
+ |
+ |
|
|
|
+ |
|
|
+a |
|
+ |
St. cretica 250 |
|
+ |
+ |
|
+ |
+ |
|
+ |
|
|
|
St. spectabilis 282 |
+ |
+a |
|
+ |
|
+a |
+ |
+ |
+ |
|
|
St. setifera subsp. iranica 249 |
+ |
|
|
|
|
+ |
|
|
+a |
|
|
St. setifera subsp. setifera 141 |
+ |
+ |
|
|
|
+ |
|
|
+a |
|
|
St. setifera subsp. daensis 205 |
+ |
|
|
|
|
+ |
|
+a |
+a |
+a |
|
جدول 3- مقادیر Rf هریک از لکهها در بین گونههای جنس Stachys در مرحله آلی
گونه و جمعیت |
Rf |
St. lavandulifolia |
1= 54/0، 2= 86/0، 3= 01/1، 4= 16/1، 5= 54/0، 6= 69/0، 7= 88/0، 8= 01/1، 9= 16/1، 10= 56/0، 11= 64/0، 12= 89/0، 13=1، 14= 16/1، 15=52/0، 16= 66/0، 17= 81/0، 18= 99/0، 19= 16/1، 20= 51/0، 21= 62/0، 22= 69/0، 23= 83/0، 24= 93/0، 25= 13/1، 26=84/0، 27= 15/1 |
St. inflata |
1=62/0، 2= 71/0، 3= 88/0، 4= 94/0، 5= 62/0، 6= 75/0، 7= 86/0، 8= 94/0، 9= 65/0، 10= 75/0، 11= 94/0، 12= 1، 13= 57/0، 14= 63/0، 15= 72/0، 16= 91/0، 17= 99/0 |
St. cretica |
1=01/1، 2= 1/1، 3= 2/1، 4= 4/1، 5= 6/1، 6= 9/1، 7=1، 8= 1/1، 9= 2/1، 10= 4/1، 11= 6/1، 12= 7/1، 13= 9/1 |
St. spectabilis |
1= 66/0، 2= 72/0، 3= 81/0، 4= 87/0، 5= 1، 6= 64/0، 7= 71/0، 8= 77/0، 9= 84/0، 10= 93/0، 11= 1، 12= 66/0، 13= 73/0، 14= 93/0، 15= 1 |
St. setifera subsp. iranica |
1= 83/0، 2= 89/0، 3= 95/0، 4= 01/1 |
St. setifera subsp. setifera |
1= 8/0، 2= 82/0، 3= 87/0، 4= 92/0، 5= 99/0، 6= 8/0، 7= 87/0، 8= 92/0، 9= 98/0، 10= 78/0، 11= 81/0، 12= 92/0، 13= 98/0 |
St. setifera subsp. daensis |
1= 81/0، 2= 94/0، 3= 99/0، 4= 8/0، 5= 92/0، 6= 98/0، 7= 8/0، 8= 91/0، 9= 1 |
تحلیل خوشه ای با استفاده از این داده ها نیز مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج حاصل از این تحلیل نشان داد که دو گروه تشکیل شده است، گروه 1: این گروه شامل دو زیر گروه است که بهترتیب شامل گروه الف) St. inflata 133، St. setifera subsp. setifera 284، 141 و گروه ب) St. setifera subsp. setifera 267،
St. setifera subsp. iranica 249 و St. setifera subsp. daensis 272، 205، 281 میباشد. گروه 2: این گروه نیز دو زیر گروه را دربرمیگیرد، گروه ج) St. lavandulifolia 24، 149، 60، 22، 175، 93 و گروه د) St. spectabilis 285، St. cretica250 ، 280، St. spectabilis 283، 282 و St. inflata 262، 103، 162. بر پایه این نتایج، گونه
St. inflata ، St. setifera subsp. setifera ،
St. setifera subsp. daensis و St. spectabilis هریک دو گروه و St. lavandulifolia 4 گروه را تشکیل می دهند. شایان ذکر است که St. setifera subsp. daensis از دو زیر گونه دیگر این گونه کاملا متمایز شده است، همچنین، حداکثر میزان تنوع در بین جمعیتهای St. lavandulifolia مشاهده شد (شکل 1).
شکل 1- دندروگرام حاصل از آنالیز خوشهای بر اساس حضور و عدم حضور لکههای فلاونوئیدی در بین گونههای متعلق به 4 بخش از جنس Stachys.Infl: St. inflata, lavan: St. lavandulifolia, spect: St. spectabilis, cret: St. cretica, set: subsp. setifera, stir: subsp. iranica, stdaen: subsp. daensis, A: Ambleia, E: Eriostomum, Z: Zietenia, S: Setifolia
بر پایه تغییرات الگوهای فلاونوئیدی، اغلب جایگزینی ها از نوع جایگزینی های هیدروکسیلاسیون، متوکسیلاسیون در موقعیتهای متفاوت و سایر جایگزینی هایی مانند گلوکوپیرانوزیلاسیون، گلوکوزیلاسیون، گلوکورونیداسیون، روتینوزیلاسیون، رامنوگلوکوزیلاسیون و رامنوزیلاسیون می باشد.
بر اساس داده های حاصل از کروماتوگرافی ستونی و میزان طیف جذبی بدست آمده از هریک از فراکشنهای فلاونوئیدی، در بین گونه های جنس Stachys 6 کلاس فلاونوئیدی شامل ایزوفلاون، فلاونون، دی هیدروفلاونول، فلاونول، فلاون و فلاون آگلیکون تشخیص داده شد که برای اولین بار از ایران گزارش می شود. تعداد ترکیبات شناسایی شده در هریک از گونه ها نیز بهشرح مقابل می باشد: 8 ترکیب در St. lavandulifolia، 4 ترکیب در St. inflata، 11 ترکیب در St. cretica ، 9 ترکیب در
St. spectabilis ، 12 ترکیب در St. setifera subsp. setifera، 11 ترکیب در St. setifera subsp. daensis و 9 ترکیب در St. setifera subsp. iranica. در بین گونه های مورد مطالعه، 3 ایزوفلاون، 3 فلاونون، 2 دی هیدروفلاونول، 4 فلاونول و 21 فلاون شناسایی شده است (جدول 4). بالاترین کلاس فلاونوئیدی در بین 5 گونه و 3 زیر گونه جنس Stachys فلاونها و کمترین آنها دی هیدروفلاونولها می باشد (جدول 4). ترکیبات مشاهده شده در St. lavandulifolia ایزوفلاونها و فلاونها و در
St. inflata اغلب از نوع ایزوفلاونها، فلاونها و فلاون آگلیکونها می باشد. در St. cretica ایزوفلاونها و در
St. spectabilis فلاون اگلی کونها، فلاونونها، فلاونولها و فلاونها، در St. setifera subsp. setifera دی هیدروفلاونولها و فلاونها، در St. setifera subsp. daensis فلاونولها و فلاونها و در St. setifera subsp. iranica دی هیدروفلاونولها و فلاونولها شناسایی شده اند (جدول 4).
جدول 4- کلاسهای فلاونوئیدی تعیین شده در بین گونههای جنس Stachys با استفاده از دادههای طیف جذبی اشعه ماوراءبنفش (نانومتر) بر اساس باند یک در عوامل شیفتدهنده متانول، کلرید آلومینیوم، کلرید آلومینیوم/اسید کلریدریک، استات سدیم، استات سدیم/اسید بوریک
Daens. |
Iran. |
Set. |
Spect. |
Cret. |
Infl. |
Lavan. |
گونه و ترکیب |
- |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
ایزوفلاون 1 |
- |
+ |
- |
- |
- |
- |
+ |
ایزوفلاون 2 |
- |
- |
- |
- |
+ |
- |
- |
ایزوفلاون3 |
+ |
+ |
- |
- |
+ |
- |
- |
فلاونون 1 |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
فلاونون 2 |
- |
- |
+ |
- |
- |
- |
- |
فلاونون 3 |
- |
- |
+ |
+ |
- |
- |
- |
دی هیدروفلاونول1 |
- |
+ |
- |
- |
+ |
- |
- |
دی هیدروفلاونول2 |
- |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
فلاونول 1 |
- |
- |
- |
- |
+ |
- |
- |
فلاونول2 |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
فلاونول3 |
+ |
- |
+ |
- |
- |
- |
- |
فلاونول4 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
فلاون1 |
- |
- |
- |
- |
+ |
- |
- |
فلاون2 |
- |
- |
- |
+ |
- |
- |
- |
فلاون3 |
- |
- |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
فلاون4 |
- |
+ |
+ |
- |
+ |
- |
+ |
فلاون5 |
- |
- |
+ |
- |
- |
- |
- |
فلاون6 |
ادامه جدول 4-
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
فلاون7 |
+ |
- |
+ |
- |
+ |
- |
- |
فلاون آگلیکون8 |
- |
- |
- |
+ |
- |
+ |
- |
فلاون آگلیکون 9 |
- |
- |
- |
+ |
- |
- |
- |
فلاون آگلی کون10 |
- |
- |
- |
+ |
- |
- |
- |
فلاون11 |
+ |
- |
- |
+ |
- |
- |
- |
فلاون12 |
- |
- |
- |
+ |
- |
- |
- |
فلاون 13 |
- |
- |
+ |
- |
- |
- |
+ |
فلاون14 |
- |
+ |
- |
- |
- |
- |
+ |
فلاون15 |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
فلاون 16 |
- |
- |
- |
- |
+ |
- |
- |
فلاون17 |
+ |
- |
+ |
- |
- |
- |
- |
فلاون 18 |
|
|
+ |
|
|
|
|
فلاون 19 |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
فلاون20 |
- |
- |
+ |
- |
- |
- |
- |
فلاون21 |
طول موجها بهترتیب عوامل شیفتدهنده در هر کلاس فلاونوئیدی شامل ایزوفلاون 1: 284، 285، 274، 352، ایزوفلاون 2: 323، 363، 336، 343، 335، ایزوفلاون 3: 301، 300، 301، 304، 302، فلاونون 1: 317، 312، 310، 314، 313، فلاونون 2: 326، 383، 379، 328، 326، فلاونون 3: 312، 311، 311، 335، 312، دی هیدروفلاونول1: 332، 383، 379، 329، 338، دی هیدروفلاونول2: 310، 349، 308، 334، 314، فلاونول 1: 340،396،402،396،343، فلاونول2: 340، 393، 391، 364، 332، فلاونول3: 356،402،399،396،360، فلاونول4: 354، 410، 408، 396، 380، فلاون1: 364، 366، 395، 274، 287، فلاون2: 335،398،403،336،339، فلاون3: 334،359،341،385،350، فلاون4: 330،398،381،389،355، فلاون5: 323، 375، 346، 360، 333، فلاون6: 332،407، 408، 390، 336، فلاون7: 338، 338، 340، 334، 335، فلاون آگلیکون8: 332، فلاون آگلیکون 9 : 325،347،345،329،327، فلاون آگلی کون10: 325، 347، 345، 386، 327، فلاون11: 336، 365، 412،378،329، فلاون 12: 324،383،381،324،328، فلاون 13: 33،386،382،387،340، فلاون14: 311، 380، 381، 359، 315، فلاون15: 336،387، 387،369،339، فلاون 16: 343،458،409،373،360، فلاون 17 : 348،424،389،403،370، فلاون 18: 349،426،385،384،430، فلاون 19: 348،367،365،400، فلاون20 : 325،375،378،356،330، فلاون21 : 326، 383،382،340،327.
بحث
نتایج حاصل از تنوع الگوهای فلاونوئیدی در گونه های جنس Stachys در این مطالعه می تواند حاکی از تغییرات درون گونه ای و الگوی پراکنش جغرافیایی در گونه های متعلق به این جنس باشد (55). بر مبنای نتایج حاصل، الگوهای فلاونوئیدی در جداسازی تاکسونهای متعلق به 4 بخش جنس Stachys و حل مشکلات این جنس کارآمد معرفی می گردد. بر این اساس، موقعیت کموتاکسونومیکی اعضای هریک از بخشها بطور جداگانه و به شرح زیر ارائه شده است:
بخش Eriostomum : نتایج حاصل از تحلیل خوشه ای بیانگر این است که در بخش Eriostomum تنها
St. spectabilis دارای دو گروه متفاوت است، بهطوریکه یکی از جمعیتها (شماره 285) نامشابهترین گروه را نسبت به سایر جمعیتها نشان میدهد. حضور و عدم حضور برخی از لکه ها در کروماتوگرام تأییدی بر این اختلاف است (جدول 2). در حالی که در جمعیتهای St. cretica تنوع الگوهای فلاونوئیدی مشاهده نشد. این اختلاف در ویژگیهای ریخت شناسی نیز منعکس شده است، بهطوریکه St. spectabilis با شماره جمعیت 285 در ویژگیهایی مانند شکل برگ، شکل حاشیه برگ، پوشش محور گل آذینی، شکل کاسبرگ و طول دندانه های کاسبرگ اختلاف ریخت شناسی را با سایر جمعیتها نشان می دهد. در مطالعات فیلوژنی بر مبنای توالیهای ژن ITS هسته ای، جمعیتهای متعلق به St. spectabilis در ترکیه تنها یک گروه را تشکیل داده اند (14) که مطابق با نتایج حاصل از الگوهای فلاونوئیدی در این مطالعه نمی باشد. بر پایه ویژگیهای تشریحی در بخش Eriostomum، Salmaki و همکاران (2009 و 2011) این بخش را یک گروه یکنواخت معرفی میکنند و این یکنواختی در پوشش سطوح رویشی نیز متمرکز است (49، 50). با وجود این، Salmaki و همکاران (2008) با مطالعه بر روی دانه گرده در این بخش نشان دادند که St. spectabilis دارای ویژگیهای متنوع در تزئینات سطح دانه گرده می باشد و از لحاظ شیارهای سطح فندقه نیز متفاوت است (46)، همچنین با استفاده از توالیهای ژنی ITS در بین گونه های Stachys در ترکیه مشخص شد که زیرگونه های متعلق به گونه St. cretica دو کلاد در مجاور یکدیگر، ولی متمایز را تشکیل می دهند که با نتایج الگوهای فلاونوئیدی در این مطالعه مطابقت میکند (14). شایان ذکر است که
St. cretica مورد بررسی در این مطالعه از لحاظ شکل برگ، تراکم کرک در سطوح برگ و ساقه با سایر نمونه های تیپ متفاوت بود. Salmaki و همکاران (2013) با بهره گیری از توالیهای ITS هسته ای و روش فیلوژنتیکی دو گروه مجزا را برای این دو گونه معرفی کردند که با تنایج این مطالعه هماهنگی دارد (52). قابل ذکر است که St. spectabilis و St. cretica از نظر ریخت شناسی تاکسونهای بسیار مشابهی می باشند. Salmaki و همکاران (2008) با بهره گیری از تزئینات سطح فندفه این دو گونه را متفاوت از یکدیگر گزارش کردند (47). جدا بودن این دو گونه در این بخش نیز توسط Bhattacharjee (1980) به اثبات رسیده است، بهطوریکه در این بخش دو زیر بخش Creticae وSpectabilis معرفی شده است (8). با وجود اینکه اغلب گونه ها دارای صفات یکنواخت یا هوموژن هستند ولی در عین حال نیز تنوع ریخت شناسی بالایی در بین برخی از جمعیتهای آن مشاهده می گردد که با نتایج حاصل از مطالعات توالی یابی ژنهای هسته ای و فیلوژنی این دو گونه مطابقت میکند (14).
بخش Setifolia : تحلیل خوشه ای در بخش ستیفولیا نشان دهنده مجزا بودن St. setifera subsp. daensis از دو زیر گونه دیگر setifera و iranica است. الگوهای کروماتوگرام در جمعیتهای St. setifera subsp. daensis متفاوت از دو زیر گونه دیگر می باشد. در حالی که الگوهای کروماتوگرام در زیر گونه های iranica و setifera مشابه اند، حتی در بین زیر گونه های setifera و daensis نیز چندین خوشه متفاوت تشکیل شده است. Salmaki و همکاران (2012) در مطالعه تاکسونومی بر روی این جنس St. setifera subsp. daensis و
St. setifera subsp. iranica را مترادف با St. setifera قرار دادند (51). همچنین Salmaki و همکاران (2008، 2009 و 2011) وجود شباهت های سطح فندقه، تریکوم و ویژگیهای تشریحی برگ را در این سه زیر گونه گزارش کردند (47، 49، 50). آنان اذعان کردند که ویژگیهای سطح فندقه برای تعیین روابط فیلوژنی در این جنس و در گونه های خویشاوندی که تغییرات زیادی دارند حائز اهمیت نمی باشد، زیرا این سه زیر گونه را از یکدیگر متمایز نساخته است. Salmaki و همکاران (2009) در مطالعه دیگر بر روی تریکومهای این بخش نشان دادند که این ویژگی قادر به تفکیک تاکسونها در سطوح فراگونه ای نمی باشد، بهطوریکه قادر به جداسازی این سه زیر گونه نیست (49). در حالی که با استناد بر ویژگیهای مربوط به تزئینات دانه گرده St. setifera subsp. daensis و
St. setifera subsp. iranica از یکدیگر مجزا می شوند (46). جمزاد (1391) نیز تفکیک این سه زیر گونه را مشکل می داند، بهطوریکه نمونه های بینا بینی نیز در این گونه گزارش شده است (1). در نتایج این مطالعه، الگوهای فلاونوئیدی قادر به جداسازی زیر گونه های St. setifera بودند. همچنین نوع کلاس فلاونوئیدی در بین زیر گونه ها حاکی از وجود تمایز بین St. setifera subsp. daensis از دو زیر گونه دیگر می باشد.
بخش Ambleia و Zietenia : در بخش Ambleia جمعیتهای متعلق به St. inflata با شماره 133 از سایر جمعیتهای متعلق به این گونه مجزا شده است و این تنوع در الگوهای فلاونوئیدی نیز به چشم می خورد. این تنوع در ویژگیهای ریخت شناسی جمعیتهای این گونه در صفاتی مانند شکل برگ، طول دندانه کاسبرگ، رنگ کاسبرگ، طول کاسبرگ، شکل براکته و طول براکته مشاهده شده است. Samaki و همکاران (2012) نیز حضور تغییرات ریخت شناسی در نوع کرکهای ساقه، شکل و ابعاد کاسبرگ و دندانه های کاسبرگ را در زیر گونه های این گونه معرفی کردند (51). در تحلیل خوشه ای بخش Zietenia، St. lavandulifolia تنوع الگوهای فلاونوئیدی قابل ملاحظه ای را در بین جمعیتها بنمایش می گذارد و 4 گروه را تشکیل می دهد و در عین حال از St. inflata نیز کاملا مجزا شده است. Salmaki و همکاران (2008) با بهره گیری از دانه گرده و فندقه
St. lavandulifolia را یک بخش مونوتیپیک معرفی میکنند (46، 47). Salmaki و همکاران (2008 و 2011) براین عقیده اند که گونه های متعلق به بخش Ambleia یک گروه مستقل را تشکیل می دهد ولی در الگوهای تزئینات فندقه ویژگی منحصر بفردی را نشان نمی دهند (46، 47، 48). با وجود دورگه گیریهای متعدد در بین St. lavandulifolia و St. inflata (50)، این دو گونه از یکدیگر مجزا شدهاند و الگوهای فلاونوئیدی متفاوتی را بنمایش گذاشته اند. با استفاده از توالیهای هسته ای ITS نیز مشخص شد که اعضای این دو بخش گروههای متفاوتی را نشان می دهند (52).
بر پایه طیفهای جذبی حاصل از هریک از فراکشنهای فلاونوئیدی، تعداد 6 کلاس فلاونوئیدی در بین گونه های متعلق به چهار بخش از جنس Stachys شناسایی شده است، بهطوریکه 3 ایزوفلاون، 4 فلاونول، 3 فلاونون، دو دی هیدروفلاونول و 21 فلاون تشخیص داده شدند. در واقع فلاونها با فراوانی بالاتری نسبت به سایر کلاسهای فلاونوئیدی در 5 گونه و 3 زیر گونه این جنس مشاهده شده است.
بررسی نوع ترکیبات فلاونوئیدی توسط محققان چنین نشان می دهد که ترکیبات فلاونوئیدی مانند آپی ژنین، لوتئولین و فلاونوئید گلی کوزیدها از شاخص ترین ترکیبات شناخته شده در اعضای تیره Lamiaceae و بهویژه در جنس Stachys می باشند، بهطوریکه El-Ansari و همکاران (1991 و 1995) با بهره گیری از روش NMR (Nuclear Magnetic Resonance) طیفهای جذبی را گزارش کردند که این طیفها با طیف جذبی کلاسهای فلاونوئیدی مانند فلاون گلوکوزیدهای شناسایی شده در این مطالعه مطابق میکند (15، 16). بر اساس نوع ترکیبات فلاونوئیدی در گونه های جنس Stachys، تعدادی از مشتقات فلاونوئیدی شامل انواع فلاونها، فلاون گلوکوزیدها و همچنین انواع دیگری از متوکسی فلاونها توسط برخی از محققان و با بهره گیری از روش NMR گزارش شدند (6، 15، 16). از متداولترین ترکیبات فلاونوئیدی که با استفاده از روشهای کرواتوگرافی ستونی، HPLC (High Performance Liquid Chromatography) و NMR شناسایی شده اند می توان به ترکیباتی مانند آپی ژنین-7-o-گلوکوزید، ایزواسکوتلارین، گزانتومیکرول، ویسنین-2 (آپی ژنین-8،6-دی-سی-گلوکوزید)، 4،5'-دی هیدروکسی-3'،8،7،6-تترامتوکسی فلاون، 4'،3'،5-تری هیدروکسی-8،7،6،3-تترامتوکسی فلاون، 4'،5-دی هیدروکسی-3'،8،7،6-تترا متوکسی فلاون، 5-هیدروکسی-4'،3'،8،7،6-پنتا متوکسی فلاون و 5-هیدروکسی-4'،8،7،6،3-پنتامتوکسی فلاون اشاره کرد که اغلب در گونه هایی مانند St. aegyptiaca Pers.، St. tibetica Vatke، St. schtschegleevii Sosn. ex Grossh. ، St. bombycina Boiss، St. neglecta Klok. ex Kossko. ، و St. bizantina C. Koch. شناسایی شده اند. بهطوریکه با استفاده از روشهای ذکر شده در بالا طیفهای جذبی متانولی مختلفی در متوکسی فلاونها مانند 311-430 نانومتر و برای ترکیبات فلاونوئیدی مذکور 301- 396 نانومتر گزارش شده است (25، 33، 36، 53). این یافته ها بشدت در توافق با نتایج حاصل از داده های طیف جذبی بر پایه طیف سنج UV-vis در کلاسهای فلاونوئیدی مانند فلاونها، ایزوفلاونها، فلاونولها، دی هیدروفلاونولها و فلاونونها در این مطالعه می باشد. بهطوریکه در پنج نوع از عوامل شیفت دهنده در این مطالعه محدوده ای از کلاسهای فلاونوئیدی مانند فلاونها، فلاون گلوکوزیدها، فلاونهای متیله شده و فلاونونها مشاهده شدند. در ترکیبات مختلف فلاونها بهمراه متانول و محدوده bandI، طیفهای جذبی 311-430 نانومتر می باشد. همچنین، فلاون گلوکوزیدها با طیفهای جذبی 328-350 نانومتر، فلاونهای متیله شده با طیفهای جذبی 330-403 نانومتر، ایزوفلاونها با طیفهای جذبی 301-353، فلاونولها با طیفهای جذبی 340-396، دی هیدروفلاونولها با طیفهای جذبی 310-332 نانومتر و فلاونونها با طیفهای جذبی 312-326 نانومتر شناسایی شدند. طیفهای جذبی همراه با سایر عوامل شیفت دهنده در جدول 4 ذکر شده است.
Komissarenko و همکاران (1979)، Lenherr و همکاران (1984)، El-Ansari و همکاران (1995 و 1999)، Meremeti و همکاران (2004) و Serrilli و همکاران (2005) با بهره گیری از کروماتوگرافی لایه نازک، و با استفاده از نمودارهای استاندارد که توسط Markham (1982) ارائه شده است فلاونوئید آگلیکونهایی مانند 4'-o-متیل ایزواسکوتلارین، اسکوتلارین، ایزواسکوتلارین و ایزواسکوتلارین-7-o-بتا-دی-گلوکوپیرانوزید را در
St. baldaccii (May) Hand.-Mazz ، St. recta L. ،
St. inflata وSt. corsica Pers. شناسایی کردند که حاوی طیف جذبی متانولی 323- 334 نانومتر می باشند (15، 16، 24، 28،36، 38، 53). حضور فلاونوئید آگلی کون و جایگزینی گلوکوپیرانوزید در St. inflata حاصل از این تحقیق از شواهد مذکور پیروی میکند. همچنین، Zinchenko (1970)، Tomas-Barberan و همکاران (1992)، Meremeti و همکاران (2004) و Skaltsa و همکاران (2007) ترکیبات فلاونوئیدی مانند هسپریدین (فلاونون)، لوتئولین-7-o-بتا-گلوکوزید، (فلاون)، بایکالئین (فلاون) و پندولتین (فلاونول) را در
St. swainsonii، St. neglecta Klok. ex Kossko.،
St. sylvatica L.، St. ionica Halácsy و
St. palustris L. و در محدوده طیفهای جذبی متانولی 323- 430 نانومتر گزارش کردند که با کلاسهای فلاونوئیدی مانند فلاونون، فلاون و فلاونول در این مطالعه هماهنگی نشان می دهد (36، 38، 55، 56، 60). با توجه به توضیحات ارائه شده، بنظر می رسد که آپی ژنین و مشتقات آن در ترکیبات فلاونوئیدی مانند فلاونهای گزارش شده در این تحقیق وجود داشته باشد. در این تحقیق حضور فلاونوئید آگلی کونها با طیفهای جذبی 325-332 نانومتر همراه با متانول و باند یک، با مطالعات سایر محققان بر روی ترکیبات فلاونوئیدی در این جنس هماهنگی نشان می دهد. در طیفهای جذبی باند یک و متانول فلاونهایی با طول موج 323 نانومتر و طول موجهای 370-430 نانومتر، فلاونونهایی با طول موج 326 نانومتر و فلاونولهایی با طول موج 396 نانومتر با نتایج ترکیبات ارائه شده در تحقیقات اخیر هماهنگی نشان می دهد. با توجه به طول موجهای حاصل از ترکیبات بدست آمده در این تحقیق و با استفاده از استانداردهای ارائه شده توسط Markham (1982) و Rahman (2005)، بنظر می رسد که ترکیباتی مانند بایکالئین، هسپریدین، لوتئولین و مشتقات آن و پندولتین در ترکیبات حاصل وجود داشته باشد (15، 16، 24، 28، 36، 38، 42، 53، 55، 57، 60).
در نتایج حاصل از این مطالعه، کلاسهای فلاونوئیدی دیگری در طیفهای جذبی متانول و باند یک مانند فلاونهایی با 274 و 323 نانومتر، پنتامتوکسی فلاون با 340 نانومتر، تری هیدروکسی تترامتوکسی فلاون با 330 و 339 نانومتر، دی هیدروکسی فلاون با 325 نانومتر و ایزوفلاونهایی با 274 نانومتر مشاهده شد. این داده ها با ترکیبات حاصل از سایر تحقیقات مانند پومیفرین (ایزوفلاون)، نورووگونین (فلاون)، هیدروکسی فلاونها و متوکسی فلاونها که بر روی جنس Stachys و جنسهای وابسته به تیره Lamiaceae و با بهره گیری از روشهای HPLC، NMR، کروماتوگرافی لایه نازک و استانداردهای ارائه شده توسط Markham (1982) گزارش شده است، مطابقت میکند، بهطوریکه طیف جذبی متانولی 274- 340 نانومتر گزارش شده است (30، 31، 36، 38، 42، 54، 57، 58، 59). کلاسهای فلاونوئیدی جدیدی که در این جنس مشاهده گردید شامل 2 ایزوفلاون با 5 عامل شیفت دهنده متانول، کلرید آلومینیوم، کلرید آلومینیوم/اسیدکلریدریک، استات سدیم، استات سدیم/اسیدبوریک و طیفهای جذبی 336،363،323،335،343 نانومتر (ایزوفلاون 2) و 301، 300، 301، 304، 302 نانومتر (ایزوفلاون 3)، یک فلاونول با طول موجهای 340، 393، 391، 364 و 332 نانومتر (فلاونول 2)، 2 فلاونون با طول موجهای 317، 312، 310، 314، 313 نانومتر (فلاون 1) و 312، 311، 311، 335 و 312 نانومتر(فلاونون 3)، یک دی هیدروفلاونول با طول موجهای310، 349، 308، 334 و 314 نانومتر (دی هیدروفلاونول 2) و یک فلاون با طول موجهای 326، 327، 340، 382، 383 نانومتر (فلاون 21) شناسایی شدند که برای اولین بار برای این جنس در ایران گزارش می گردد. با وجود این، بررسیهای فیتوشیمیایی بیشتری برای شناسایی این ترکیبات طبیعی لازم است. با توجه به تنوع کلاسهای فلاونوئیدی در جنس Stachys چنین استنباط می گردد که تمایز ترکیبات شیمیایی مرتبط با الگوهای متنوع ترکیبات فلاونوئیدی و توزیع جغرافیایی تاکسونها باشد، بهطوریکه دهقان و همکاران (1393) و رجبیان و همکاران (1393) طول و عرض جغرافیایی، ارتفاع از سطح دریا و شرایط اقلیمی را بهعنوان عوامل دخیل در تمایز این ترکیبات معرفی میکنند (2، 3، 38).
از فلاونول هایی مانند ایزورامنتین، می توان به تحقیق Tomas-Barberan و همکاران (1992) بر روی فلاونوئیدهای تعدادی از جنسهای تیره Lamiaceae اشاره کرد که با استفاده از روشهای کروماتوگرافی لایه نازک و HPLC در جنس Stachys این ترکیب را شناسایی کردند، بهطوریکه حاوی طیف جذبی متانولی 360 نانومتر است (56). قابل ذکر است که در St. setifera subsp. daensis حضور فلاونول 3 در این تحقیق نیز تأییدی بر وجود این ترکیب می باشد. همچنین Skaltsa و همکاران (2007) نیز بوجود این نوع فلاونول در زیر گونه های St. swainsonii و با بهره گیری از روشهای مختلفی مانند کروماتوگرافی لایه نازک و HPLC پی بردند (55). در این مطالعه، فلاونولهای دیگری نیز مانند فلاونول 4 و در St. setifera subsp. setifera و St. setifera subsp. daensis شناسایی شدند که مطابق با نظرات Tomas-Barberan و همکاران (1992) بر روی تیرهLamiaceae و با طیف جذبی متانولی 354 می باشد (56)، بهطوریکه این نوع فلاونول از مشتقات کمپفرول محسوب می گردد. Marin و همکاران (2001) حضور مشتقات فلاونی مانند آکاستین را در دو جنس از تیره Lamiaceae شناسایی کردند که با نتایج حاصل از این مطالعه هماهنگی نشان می دهد (35). در این تحقیق، فلاون 12 در گونه های St. spectabilis و
St. Setifera subsp. daensis این امر را تأیید میکند، همچنین Hossein و همکاران (2010) و Martínez-Vázquez و همکاران (2012) نیز مشتقاتی از این نوع فلاون را در تیره Lamiaceae و با استفاده از روشهای LC/MS (Liquid Chrromatography/Mass Spectrometry) و HPLC گزارش کردند، بهطوریکه این ترکیب دارای طیف جذبی متانولی 328 نانومتر است (20، 36، 37). Chemesova (1993) ترکیب فلاونی مانند کرایزین را در جنس Scutellaria L. و با استفاده از کروماتوگرافی ستونی شناسایی کرد (11) که در این مطالعه نیز فلاون 14 در گونه های St. lavandulifolia و
St. setifera subsp. setifera حاکی از وجود این ترکیب می باشد و طیف جذبی آن 311 نانومتر گزارش شده است (36). علاوه براین، حضور مشتقات فلاونول گالانژین و دی هیدروفلاونول انگلتین نیز توسط Polya (2003) در تیره Lamiaceae و با طیف جذبی متانولی 340 و 332 نانومتر گزارش شده است (39) که مطابق با ترکیبات بدست آمده مانند فلاونول 2 و دی هیدروفلاونول 1 در این تحقیق و بهترتیب در گونه های St. cretica ،
St. setifera subsp. setifera و St. spectabilis می باشد. حضور نوعی فلاونون مانند ساکورانین و مشتقات آن نیز توسط Lu و Foo (2002) و در تیره Lamiaceae با طیف جذبی متانولی 317 نانومتر گزارش شده است (31) که در این تحقیق فلاونون 1 در گونه های St. cretica ،
St. setifera subsp. daemsis و St. setifera subsp. iranica تأییدی بر حضور این ترکیب می باشد.
بر اساس یافته های حاصل از فراکشنهای بدست آمده و طیف جذبی اشعه ماوراء بنفش، بنظر می رسد که تمایلی بسمت الگوهای اکسیداسیون مانند هیدروکسیلاسیون، متوکسیلاسیون و الگوهایی مانند گلوکوزیلاسیون، گلوکوپیرانوزیلاسیون، روتینوزیلاسیون، گلوکورونیداسیون، رامنوگلوکوزیلاسیون و رامنوزیلاسیون در موقعیتهای مختلف برقرار باشد. اغلب این جایگزینی ها مطابق با سایر نتایج حاصل در جنس Stachys و جنسهای دیگر تیره لامیاسه با استفاده از روشهای مختلفی مانند کروماتوگرافی ستونی، NMR و HPLC می باشد (5، 9، 12، 16، 21، 24، 26، 28، 30، 31، 42، 53، 55، 57، 58). قابل ذکر است که الگوهای تری هیدروکسیلاسیون در موقعیتهای 5 و 4' در St. spectabilis مطابق با نتایج حاصل از Derkach و همکاران (1980) با استفاده از کروماتوگرافی کاغذی و ستونی بر روی همین گونه می باشد (13). علاوه براین، الگوهای 4'-o-بتا-گلوکوپیرانوزیل و 2-o-رامنوزیل ازجمله الگوهای جایگزینی جدید در این جنس هستند. شایان ذکر است که بیشتر جایگزینی ها از نوع هیدروکسیلاسیونها در موقعیتهای 5، 6، 7، 8، 3' و 4' و متوکسیلاسون در موقعیت 4' می باشد.
در کلیه بخشهای مورد مطالعه در این تحقیق و در طیفهای جذبی متانول، دو ترکیب فلاون 1 و ایزوفلاون 1 با طول موجهای 353 و 364 نانومتر مشترک هستند. در بخشAmbleia و Zietenia گونه های St. lavandulifolia و St. inflata وجه اشتراکی از لحاظ هیدروکسیلاسیون در موقعیتهای 5، 7، 8، 3'، 4' و متوکسیلاسیون در موقعیت 4' مشاهده می گردد که احتمالا بعلت وجود گونه های حدواسط می باشد (1). در St. lavandulifolia ایزوفلاون 2 و فلاونهای 14، 15 و 16 مشاهده می گردد ولی در
St. inflata فلاون 5 و آگلیکون 9 وجود دارد (جدول 4). در اعضای بخش Eriostomum اختلافات اکثرا متعلق به جایگزینی های هیدروکسیلاسیون در موقعیتهای 3، 6، 5'، 3' و متوکسیلاسون در موقعیتهای 7، 8 و 3' می باشد. اختلاف بین دو گونه St. cretica و St. spectabilis بدلیل حضور کلاسهای فلاونوئیدی مانند ایزوفلاون 3، فلاونون 1، دی هیدروفلاونول 1 و 2، فلاونول 2، فلاون 2، 3، 4، 5، 11، 12، 13، 17و فلاون آگلی کون 8، 9 و 10 می باشد. در بخش Setifolia، وجه اشتراک دو زیر گونه setifera وiranica مربوط به فلاونول 1 و فلاون 5 می باشد و علت اختلاف زیر گونه daensis با سایر زیر گونه های این بخش مربوط به حضور فلاونهای 7، 12، 16، 17 و 20 و فلاونول 3 است. همچنین در این زیر گونه استخلافهایی مانند 7-o-روتینوزیل، 7-o-گلوکورونید، 7-o-بتا-گلوکورونید، 3-o-بتا-گلوکوپیرانوزیل و 4'-o-بتا-گلوکوپیرانوزیل مشاهده شده است که در دو زیر گونه دیگر St. setifera متعلق به این بخش وجود ندارد. این سه زیر گونه در الگوهای اکسیداسیون مانند متوکسیلاسسیون و هیدروکسیلاسیون نیز اختلاف نشان می دهند. در این بخش اغلب ترکیباتی مانند فلاونون 1 و 2، فلاونول 1 و فلاونهای 1، 5 و 18 وجود دارد. قابل ذکر است که ترکیبات فلاونوئیدی متفاوتی در موقعیتهای تاکسونومیکی متفاوت مشاهده می گردد (55). علاوه براین، جنس Stachys از لحاظ ترکیبات شیمیایی تنوع بسیار بالایی را نشان می دهد که وابسته به حضور چند شکلیهای متعدد ریخت شناسی و مراحل مختلف نمو است (10) .
نتیجهگیری
بهعنوان نتیجه گیری کلی از این تحقیق، کلاسهای فلاونوئیدی در جنس Stachys تنوع زیادی را در ناحیه زاگرس مرکزی ایران نشان می دهد. علاوه براین، تمایز ترکیبات شیمیایی مرتبط با ساختار شیمیایی متغیر و سازگاریهای مختلف در تاکسونها می باشد. بر اساس نتایج حاصل از تحلیل خوشه ای چنین نتیجه گیری می گردد که St. setifolia subsp. daensis از سایر زیر گونه های متعلق به این گونه کاملا تفکیک شده است، همچنین با وجود شباهتهای ریخت شناسی و ویژگیهای حدواسط میان
St. cretica و St. spectabilis این دو گونه از یکدیگر تفکیک شده اند و در نهایت اینکه St. lavandulifolia بالاترین تعداد گروه را در این تحلیل به نمایش می گذارد. شایان ذکر است که در این تحقیق الگوهای اکسیداسیون مانند هیدروکسیلاسیون، متوکسیلاسیون و گلی کوزیلاسیون از ویژگیهای اختصاصی در جنس Stachys محسوب میشوند و حضور این تغییرات در تاکسونومی این جنس حائز اهمیت می باشد. علاوه براین، در این رابطه روش کروماتوگرافی لایه نازک مبتنی بر فلاونوئیدها مفید و کاربردی معرفی می گردد.
سپاسگزاری
نویسندگان مقاله از مسئولان محترم تحصیلات تکمیلی و معاونت پژوهشی دانشگاه شهرکرد کمال تشکر را دارند.