مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)
اثر متیل جاسمونات بر فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان، ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی در کشت سلول Scrophularia straita Boiss.
نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه تربیت مدرس
2 هیات علمی/تربیت مدرس
3 هیات علمی/ تربیت مدرس
چکیده
در این پژوهش اثر متیل¬جاسمونات 1/0 میلی¬مولار به عنوان یک الیسیتور (elicitor) بر فعالیت آنزیم-های آنتی¬اکسیدان سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیداز در کشت سلول Scrophularia striata و محتوای ترکیبات فنولی و فلاونوئید آن در بازه زمانی 4، 8، 12، 24، 48 و 72 ساعت مورد مطالعه قرار گرفت. فعالیت سوپراکسید دیسموتاز در طی 12 ساعت اولیه دوره تیمار کاهش و پس از آن تا پایان دوره آزمایش افزایش یافت. در حضور متیل¬جاسمونات فعالیت کاتالاز در کلیه نمونه¬ها در مقایسه با شاهد افزایش معنی¬داری داشت در حالیکه فعالیت پراکسیداز پس از 12 ساعت به طور معنی¬داری افزایش یافت. به منظور درک بهتر سازوکار متیل¬جاسمونات، میزان تجمع پراکسید هیدروژن و پراکسیداسیون لیپیدهای غشا نیز بررسی شد. میزان پراکسید هیدروژن تنها در کشت¬هایی که به مدت 8 ساعت در تیمار متیل¬جاسمونات بودند نسبت به کشت¬های شاهد افزایش معنی¬داری داشت در حالیکه میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا تغییر معنی¬داری نشان نداد. بررسی میزان فنول کل در سلول¬های شاهد و تیمار شده نشان داد که میزان ترکیبات فنولی با شیب ملایمی رو به افزایش بود و در کشت¬های تیمار شده با متیل¬جاسمونات پس از 48 و 72 ساعت افزایش معنی¬دار ترکیبات فنولی نسبت به شاهد دیده شد. نمونه¬های تیمار شده با متیل¬جاسمونات، از 24 ساعت پس از تیمار تا آخر دوره، نسبت به 12 ساعت اول به طور معنی¬داری از محتوای فلاونوئیدی بالاتری نسبت به شاهد برخوردار بودند. در حضور متیل¬جاسمونات افزایش توان آنتی¬اکسیدانی و افزایش میزان ترکیبات فنولی با کاهش شاخص¬های تنش اکسیداتیو هماهنگ می¬باشد.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Effect of methyl jasmonate on antioxidant enzyme activities, phenolic and flavonoid compounds in Scrophularia striata cell culture
نویسنده [English]
- Narges Khanpour-Ardestani 1
چکیده [English]
Effects of 0.1 mM MeJA as an elicitor on the activity of antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD) and contents of phenolics and flavonoids during 4-72 hours in Scrophularia striata cell culture were studied. Decreasing in SOD activity was observed during first 12- hours after 0.1 mM MeJA treatment and then increased. Activity of CAT enzyme was increased in 0.1mM MJ treated samples significantly in comparing to the control, while POD activity was increased 12 hours after treatment. To study of MeJA mechanism, H2O2 content and lipid peroxidation were investigated. H2O2 content was increased after 8 hour post treatment with MeJA while lipid peroxidation was not changed. The amount of total phenols in control and treated cells showed a gentle slope rising levels of phenolic compounds and 0.1 mM MeJA significantly increased total phenolic compoundes in S. striata cells culture 48 and 72 hours after treatment. Also, flavonoids significantly increased in treated cells compared with controls 24 hours after treatment toward the first 12 hours. Increasing in antioxidant capacity and phenolics and flavonoids contents after elicitation is in accordance with decreasing in oxidative stress index.
کلیدواژه‌ها [English]
- antioxidant
- Flavonoids
- Methyl Jasmonate
- Phenolic compounds
- Scrophularia striata
اثر متیل جاسمونات بر فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان، ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی در کشت سلول Scrophularia straita Boiss.
نرگس خانپور اردستانی1، مظفر شریفی1* و مهرداد بهمنش2
1 دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم گیاهی
2 دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه ژنتیک
تاریخ دریافت: 12/6/92 تاریخ پذیرش: 26/8/92
چکیده
در این پژوهش اثر متیلجاسمونات 1/0 میلیمولار به‌عنوان یک الیسیتور (elicitor) بر فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیداز در کشت سلولScrophularia striata و محتوای ترکیبات فنولی و فلاونوئید آن در بازه زمانی 4، 8، 12، 24، 48 و 72 ساعت مورد مطالعه قرار گرفت. فعالیت سوپراکسید دیسموتاز در طی 12 ساعت اولیه دوره تیمار کاهش و پس از آن تا پایان دوره آزمایش افزایش یافت. در حضور متیلجاسمونات فعالیت کاتالاز در کلیه نمونهها در مقایسه با شاهد افزایش معنیداری داشت، در حالیکه فعالیت پراکسیداز پس از 12 ساعت به طور معنیداری افزایش یافت. به‌منظور درک بهتر سازوکار متیلجاسمونات، میزان تجمع پراکسید هیدروژن و پراکسیداسیون لیپیدهای غشا نیز بررسی شد. میزان پراکسید هیدروژن تنها در کشتهایی که به مدت 8 ساعت در تیمار متیلجاسمونات بودند نسبت به کشتهای شاهد افزایش معنیداری داشت، در حالیکه میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا تغییر معنیداری نشان نداد. بررسی میزان فنول کل در سلولهای شاهد و تیمار شده نشان داد که میزان ترکیبات فنولی با شیب ملایمی رو به افزایش بود و در کشتهای تیمار شده با متیلجاسمونات پس از 48 و 72 ساعت افزایش معنیدار ترکیبات فنولی نسبت به شاهد دیده شد. نمونههای تیمار شده با متیلجاسمونات، از 24 ساعت پس از تیمار تا آخر دوره، نسبت به 12 ساعت اول به طور معنیداری از محتوای فلاونوئیدی بالاتری نسبت به شاهد برخوردار بودند. البته در حضور متیلجاسمونات افزایش توان آنتیاکسیدانی و افزایش میزان ترکیبات فنولی با کاهش شاخصهای تنش اکسیداتیو هماهنگ میباشد.
واژههای کلیدی: آنتیاکسیدان، ترکیبات فنولی، فلاونوئید، متیلجاسمونات، Scrophularia striata
* نویسنده مسئول، تلفن: 82884479-021، پست الکترونیکی:msharifi@modares.ac.ir
مقدمه
گیاه Scrophularia striata یک گیاه بومی ایران است که در مناطق سردسیر و کوهستانی زاگرس رشد میکند. از زمانهای قدیم از این گیاه برای درمان و بهبود زخمهای حاصل از سوختگی استفاده میکردند (1). همواره اعتقاد بر این بوده که این گیاه علاوه بر اینکه باعث تسریع التیام زخم میگردد از عفونتهای شایع باکتریایی در زخم نیز جلوگیری میکند؛ دارای اثرات ضد میکروبی، ضد تومور و ضد التهاب است (2). برخلاف تأثیرات دارویی شناخته شده، در مورد ترکیبات مؤثره موجود در این گیاه اطلاعات بسیار کمی در دست میباشد. بسیاری از خواص دارویی این جنس را به حضور فنیلاتانوئید گلیکوزیدها نسبت میدهند. روشهای کشت بافت گیاهی اغلب به‌عنوان مدل برای بررسیهای گوناگون فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و ژنتیکی در گیاهان مورد استفاده قرار میگیرد (8). کشت سلولهای گیاهی در شرایط آزمایشگاهی برای تولید فراوردههای دارویی گیاهی به‌عنوان یک روش جایگزین و قابل قبول نسبت به استفاده از عصاره گیاه کامل به‌کار گرفته شده و منبع مناسب و مهمی برای تولید متابولیتهای ثانوی با ارزش میباشد. محتوای متابولیتهای ثانوی در کشت سلول به وسیلۀ دست‌ورزی تنظیم کنندههای رشد، بهینه سازی ترکیبات محیط کشت مانند قند، نیترات، فسفات و افزودن پیش سازها، الیسیتورها و بهینه کردن شرایط کشت با تغییر پارامترهایی مانند نور، pH و هوادهی قابل ارتقا میباشد. استفاده از الیسیتورها یکی از مؤثرترین راهکارها برای بهبود تولید متابولیتهای ثانوی زیستی است، این مولکولها تولید متابولیتهای ثانوی مانند آلکالوئیدها، ترپنوئیدها، فلاونوئیدها، ترکیبات فنولی و فیتوالکسینها را در کشت سلول گیاهی به طور مؤثری تحریک میکنند (34).
جاسموناتهاJas) )، شامل جاسمونیک اسیدJA)) و متیلجاسمونات MeJA))، یک خانواده از ترکیبات سیکلوپنتانون هستند که از طریق مسیر اکتادکانوئیک از لینولنیک اسید ساخته میشوند. به طور کلی این ترکیبات از رشد گیاه جلوگیری مینمایند، اما به‌عنوان یک شاخه از تنظیمکنندههای رشد گیاهی، فرایندهای متنوعی از قبیل رسیدن میوه، پیری، تشکیل غده، تشکیل دانه گرده، پاسخهای دفاعی علیه آسیبهای مکانیکی و حمله حشرات و بیماری‌زاها را راهاندازی میکنند (20). این ترکیبات به‌عنوان الیسیتور و از طریق القای (Elicitation) دستگاه دفاعی باعث بیوسنتز و انباشت متابولیتهای ثانوی نیز میشوند (20 و 41). به‌علاوه اینکه متیلجاسمونات تولید گونههای واکنشگر اکسیژن (ROS) (Reactive Oxygen Species) را القا میکند (40). مهمترین گونههای فعال اکسیژن، رادیکالهای آنیون سوپراکسید (O2•-)، هیدروکسیل (•OH) و هیدروژن پراکسید (H2O2) هستند (17). این ترکیبات نقش پیامبر ثانوی را در پاسخهای سلولی بر عهده دارند ولی مقادیر بالای آنها باعث آسیب شدید به سلول میشود (28). رادیکالهای آزاد در واکنش با پروتئینها، لیپیدها و DNA در سلول میتوانند باعث تغییر فعالیت و یا غیرفعال شدن آنها شده و در نهایت باعث آپوپتوزیس و مرگ سلولها گردند (12). رادیکالهای آزاد با پراکسیداسیون لیپیدهای غشای سلول سبب تغییر ساختار و نسبت لیپیدهای غشا شده و باعث کاهش تمامیت غشا و در نتیجه افزایش نفوذپذیری آن میگردند. گیاه با استفاده از مکانیسمهای آنزیمی و غیرآنزیمی میتواند غلظت گونههای واکنشگر اکسیژن را کاهش دهد و از این طریق از اثرات مخرب آن بکاهد. البته موفقیت کامل گیاه در این راستا به میزان فعالیت دستگاه آنتیاکسیدانی گیاه و غلظت گونههای واکنشگر اکسیژن بستگی دارد (32). دستگاه دفاعی آنتیاکسیدان شامل آنزیمهای نظیر سوپراکسید دیسموتاز (SOD) ، کاتالاز (CAT) ، پراکسیداز POD)) و آنتیاکسیدانهای غیرآنزیمی شامل فلاونوئیدها، آنتوسیانینها و سایر ترکیبات فنولی، آسکوربات، آلفا توکوفرول، بتاکاروتن و غیره میباشد (22).
از آنجا که تحقیقات چندانی راجع به گیاه S. striata انجام نشده است، هدف تحقیق حاضر مطالعه ارتباط بین فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان، تجمع گونههای واکنشگر اکسیژن و محتوای ترکیبات فنولی در کشت سلول این گیاه پس از تیمار با متیلجاسمونات در زمانهای متفاوت میباشد.
مواد و روشها
جمعآوری و کشت بذرها: بذرهای Scrophularia striata Boiss. از منطقه آسمان آباد، روستای جانجان، استان ایلام جمعآوری شدند. بذرها پس از شستشوی سطحی با مایع شوینده، به مدت 70 ثانیه در الکل 70% قرار گرفتند، پس از آبکشی با آب مقطر، 10 دقیقه در پراکسید هیدروژن 3/3% قرار داده شدند. سپس 15 دقیقه به محلول هیپوکلریت سدیم 2% منتقل شدند، پس از شستشوی کامل در مرحلۀ آخر 70 ثانیه در الکل 70% قرار گرفتند و با آب مقطر استریل آبکشی شدند. بذرهای استریل به مدت یک شبانه‌روز در محلول 75/0 گرم در لیتر جیبرلین که از قبل توسط فیلتر 2/0 میکرومتر استریل شده بود در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار گرفت و بعد در محیط MS (Murashige and Skoog) بدون هورمون کشت داده شدند. بذرها به مدت سه روز در فیتوترون در تاریکی و پس از آن دو هفته در دمای 25 درجه سانتیگراد و دوره 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار گرفتند و از گیاهچههای حاصل برای کشت بافت استفاده شد.
تشکیل کالوس و راهاندازی کشت سلولی: به‌منظور ایجاد کالوس، قطعاتی از ساقه گیاهچهها به طول یک تا دو سانتیمتر به محیط کشت MS پایه حاوی 5/0 میلیگرم در لیتر نفتالن استیک اسید و 2 میلیگرم در لیتر بنزیل آمینو پورین منتقل شد. بعد از گذشت 3 تا 7 روز القای کالوسها در قطعات شروع شد. کالوسها در محیط جامد هر دو هفته یکبار واکشت شدند. برای راهاندازی کشت سلولی تعلیقی، درون هر ارلن 250 میلیلیتری، حاوی 50 میلیلیتر محیط کشت مایع MS با ترکیبات هورمونی یاد شده در بالا و بدون آگار، مقدار 2 گرم کالوس ترد و همسن وارد گردید و با سرعت 110 دور در دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد در تاریکی روی شیکر قرار گرفتند و به‌منظور تکثیر و همگنسازی، هر دو هفته یکبار واکشت گردید. در هر مرحله سلولها با استفاده از قیف بوخنر و در شرایط مکش جمعآوری شدند و به محیط تازه منتقل گردیدند.
تیمار سلولها با متیلجاسمونات: قبل از اعمال تیمار، دوره رشد برای سلولها تعیین گردید. بدین منظور بعد از انتقال 1 گرم توده سلول کاملاً همگن شده به ارلن 100 میلیلیتری حاوی 50 میلیلیتر از محیط کشت مایع جدید MS دارای 5/0 میلیگرم بر لیتر نفتالن استیک اسید و 2 میلیگرم بر لیتر بنزیل آمینو پورین، از روز اول تا روز 29 بعد از انتقال، به فاصله زمانی دو روز یکبار، نمونهبرداری انجام شد و بر اساس وزن تر توده سلولی منحنی رشد ترسیم گردید.
به‌منظور اعمال تیمار، مجدداً محیط کشت تعلیقی تهیه گردید و 1 گرم سلول (وزن تر) با استفاده از قیف بوخنر و در شرایط مکش برداشت و به ارلن حاوی 50 میلیلیتر از محیط کشت مایع منتقل گردید. از طرفی محلول متیلجاسمونات تهیه و توسط فیلتر با قطر منافذ 2/0 میکرومتر استریل شد. با توجه به منحنی رشد بدست آمده، در روز هفتم از دوره رشد سلولی به محیط کشتهای سلولی مقداری از محلول متیلجاسمونات اضافه گردید، به گونهای که غلظت نهایی آن 1/0 میلیمولار باشد. این غلظت با توجه به آزمایشهای مقدماتی در سه غلظت 01/0، 1/0 و 1 میلیمولار متیل و اندازهگیری رشد و درصد زندهمانی سلولها انتخاب شد. محیطهای کشت در دمای 25 درجه سانتیگراد روی شیکر با 110 دور در دقیقه قرار گرفتند و در زمانهای 4، 8، 12، 24، 48 و 72 ساعت پس از تیمار برداشت شدند. در این آزمایش حداقل 3 تکرار برای هر زمان در نظر گرفته شد. میزان رشد سلولی در حضور متیلجاسمونات براساس اندازهگیری وزن تر سلولها در ساعات پس از تیمار تعیین شد.
تعیین فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز: با همگنسازی 1/0 گرم سلول در 3 میلیلیتر بافر HEPES- KOH 50 میلیمولار (8/7=pH) دارای EDTA 1/0 میلیمولار و سانتریفیوژ عصاره حاصل در 12000 (rpm) به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد، آمادهسازی تمام نمونهها انجام شد و بخش روشناور حاصل برای تعیین غلظت پروتئین به روش Bradford (1976) و سنجش فعالیت سوپراکسید دیسموتاز مورد استفاده قرار گرفت. ترکیب واکنش در حجم نهایی 3 میلیلیتر شامل بافر HEPES-KOH 50 میلیمولار (8/7=pH) حاوی EDTA 1/0میلیمولار، کربنات سدیم 50 میلیمولار (2/10=pH)، L-متیونین12 میلیمولار، نیترو بلو تترازولیوم (NBT) 75 میلیمولار، ریبوفلاوین 1 میکرومولار و 300 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. در کنار هر نمونه، یک شاهد در نظر گرفته شد که دارای تمام موارد فوق بدون عصاره آنزیمی بود و به جای آن همان اندازه از بافر استخراج اضافه گردید. نمونهها و شاهد به مدت 15 دقیقه در معرض نور لامپ فلورسنت قرار گرفتند تا تغییر رنگ حاصل گردد. سپس جذب آنها در طول موج 560 نانومتر قرائت گردید و تفاوت جذب بین هر نمونه و شاهد محاسبه گردید. واحد فعالیت سوپراکسید دیسموتاز به‌عنوان مقدار آنزیمی در نظر گرفته شد که منجر به مهار 50 درصد احیای NBT در حضور نور گردید (10).
تعیین فعالیت آنزیم کاتالاز و پراکسیداز
روش استخراج پروتئین: در این مرحله 1/0 گرم از سلولها در 3 میلیلیتر بافر سدیم فسفات 25 میلیمولار (8/6=pH) کاملاً ساییده شد. همگنای حاصل در 12000 (rpm) به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. محلول رویی با دقت جدا و برای سنجش غلظت پروتئین موجود در سلولها و نیز فعالیت آنزیم استفاده شد. غلظت پروتئین نمونهها به روش Bradford (1976) تعیین گردید.
فعالیت آنزیم کاتالاز براساس میزان تجزیه H2O2 و در نتیجه کاهش میزان جذب آن در طول موج 240 نانومتر سنجیده و به ازای میلیگرم پروتئین عصاره آنزیمی برای یک دقیقه محاسبه شد. مخلوط واکنش (3 میلیلیتر)، شامل 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی، 2450 میکرولیتر بافر پتاسیم فسفات 25 میلیمولار (8/6=pH) و 500 میکرولیتر H2O2 10 میلیمولار تهیه شد. کلیه مراحل استخراج آنزیمی روی یخ انجام شد (9).
برای سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز به روش ذکر شده Pandolfini و همکاران (1992) عمل گردید. مخلوط واکنش شامل بافر فسفات سدیم 60 میلیمولار (1/6=pH)، گایاکول 28 میلیمولار و پراکسید هیدروژن 5 میلیمولار و 500 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. جذب نمونهها در طول زمان یک دقیقه در طول موج 470 نانومتر قرائت گردید و فعالیت آنزیم پراکسیداز به صورت تغییرات جذب به میلیگرم پروتئین عصاره بیان گردید.
تعیین مقدار پراکسید هیدروژن (H2O2): بدین منظور 1/0 گرم سلول، روی یخ با 3 میلیلیتر تریکلرو استیک اسید 1/0% تا مرحله همگن شدن سائیده و بعد سانتریفیوژ (rpm12000، به مدت 15 دقیقه) شدند. به 1 میلیلیتر از محلول روشناور، 1 میلیلیتر بافر فسفات پتاسیم (10 میلیمولار، 7=pH) و 1 میلیلیتر یدید پتاسیم اضافه شد و جذب آن در طول موج 390 نانومتر با اسپکتروفتومتر قرائت شد. با استفاده از منحنی استاندارد مقدار پراکسید هیدروژن محاسبه گردید (37).
تعیین میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا: میزان آسیب به غشاها با اندازهگیری مقدار مالونیل دیآلدئید (MDA) به‌عنوان فراورده نهایی پراکسیداسیون لیپیدهای غشا تعیین شد. به‌منظور اندازهگیری MDA میزان 1/0 گرم از سلول با 3 میلیلیتر تریکلرو استیک اسید 10% سائیده شد. نمونهها پس از همگنسازی، سانتریفیوژ (rpm12000، به مدت 15 دقیقه) شدند. به 1 میلیلیتر از نمونههای صاف شده، 1 میلیلیتر تیو باربیتوریک اسید (TBA) 25/0% اضافه گردید و به مدت نیم ساعت در دمای 100 درجه ساننتیگراد قرار داده شد. میزان MDA با اندازهگیری جذب در طول موجهای 532 نانومتر و 600 نانومتر با استفاده از ضریب ثابت خاموشی )1-cm1-mM 155= ε) محاسبه گردید (15).
تعیین میزان فنول کل: میزان ترکیبات فنولی کل بر اساس روش رنگ‌سنجی فولین- سیوکالتیو و بر حسب منحنی استاندارد گالیک اسید در طول موج 762 نانومتر اندازهگیری شد. بدین ترتیب که ابتدا 3/0 گرم سلول در 3 میلیلیتر متانل80% همگن شد. سپس با سرعت 5000 (rpm) به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد و عصاره متانلی از رسوب جدا شد. عصاره متانلی برای سنجش فنول کل و فلاوونوئیدها مورد استفاده قرار گرفت. به 500 میکرولیتر عصاره متانلی، 5/2 میلیلیتر محلول فولین- سیوکالتیو اضافه شد. به مخلوط حاصل بعد از 2 دقیقه 2 میلیلیتر محلول سدیم کربنات 7% اضافه شد و جذب بعد از 60 دقیقه در طول موج 762 نانومتر خوانده شد (27). در نهایت، مقدار فنول کل بر حسب میلیگرم بر گرم وزن تر محاسبه شد.
سنجش و اندازهگیری فلاونوئید: به 500 میکرولیتر عصاره متانلی، 100 میکرولیتر از محلول آلومینیومکلرید 10%، 100 میکرولیتر پتاسیم استات 1 مولار، 5/1 میلیلیتر متانول 80% و 8/2 میلیلیتر آب دیونیزه اضافه شد. پس از گذشت 30 دقیقه، جذب هر یک از نمونهها در طول موج 415 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر سنجیده شد و میزان فلاونوئید براساس منحنی استاندارد روتین (Rutin) محاسبه شد (11).
تحلیل‌های آماری: کلیه آزمایشها در سه تکرار از حداقل سه نمونه مستقل انجام شد. مقایسه میانگینها با استفاده از روش anova و نرمافزار MSTAT-C و معنیدار بودن اختلاف بین آنها با آزمون دانکن در سطح 05/0≥ P انجام شد.
نتایج
تعیین منحنی رشد سلول: پیش از اعمال تیمار، میزان رشد سلولها در مدت 29 روز در کشت تعلیقی بررسی شد (شکل 1). نتایج نشان داد که پس از کشت، سلولها به مدت سه روز در فاز تأخیری بودند، سپس میزان سلولها افزایش یافته که این روند تا روز پانزدهم ادامه داشت. پس از این زمان وزن سلولها نسبتاً بدون تغییر ماند. شیب رشد سلولی در روز هفتم افزایشی بود که در این زمان سلولها در دوره لگاریتمی رشد بوده و بشدت در حال تقسیم بودند. در این زمان حجم توده سلولی به میزان مناسبی رسیده، بنابراین روز هفتم به‌عنوان زمان مناسب برای افزودن تیمار انتخاب گردید.
شکل 1- منحنی رشد سلولی در کشت تعلیقی S. striata در محیط کشت MS. مقادیر میانگین 3 تکرار ± SE است.
تأثیر متیلجاسمونات بر رشد سلولی: اندازهگیری وزن تر سلولها نشان داد که تیمار 1/0 میلیمولار متیلجاسمونات از روز هفتم در بازه زمانی 4 تا 24 ساعت در نمونههای تیمار شده نسبت به نمونههای شاهد، تأثیری بر رشد نداشت (شکل 2)، در حالیکه در بازه زمانی 48 تا 72 ساعت رشد سلولی به طور معنیداری کاهش یافت (05/0P≤).
تأثیر متیلجاسمونات بر فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان
تغییرات فعالیت سوپراکسید دیسموتاز: همان گونه که در شکل a3 نشان داده شده است، مقایسه میانگینها در سطح 05/0 P≤نشان داد که فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز از روز هفتم در بازه زمانی 4 تا 12 ساعت در نمونههای شاهد رو به افزایش بود و بعد تا 72 ساعت که معادل روز دوازدهم از منحنی رشد میباشد کاهش معنیداری داشت.
|
c |
شکل 2- تاثیر متیلجاسمونات بر رشد سلولی در کشت تعلیقی S. striata. متیلجاسمونات در روز هفتم دوره رشد به محیط کشت اضافه شد و سلولها در زمانهای 4، 8، 12، 24، 48 و 72 ساعت پس از تیمار برداشت شدند. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح 05/0≥P است.
در نمونههای تیمار شده با 1/0 میلیمولار متیلجاسمونات، در زمان 4 ساعت پس از شروع تیمار فعالیت آنزیم کاهش یافت و بعد تا 48 ساعت پس از آغاز تیمار، افزایش یافت و بعد شروع به کاهش نمود. از طرفی مقایسه بین نمونههای شاهد و تیمار شده در هر زمان نشان داد که در زمانهای 4 و 12 ساعت پس از شروع تیمار، فعالیت آنزیم مذکور در نمونههای تیمار شده پایینتر از نمونههای شاهد بود، درحالیکه در بازه زمانی 24 تا 72 ساعت فعالیت آنزیم در نمونههای تیمار شده به صورت معنیداری بالاتر از نمونههای شاهد بود.
تغییرات فعالیت پراکسیداز: بررسی نتایج اندازهگیری فعالیت پراکسیداز نشان داد که از روز هفتم در بازه زمانی مورد مطالعه ( 4 تا 72 ساعت)، بجز 12 ساعت پس از تیمار، تغییر معنیداری در نمونههای شاهد وجود نداشت (05/0P≤). در حالیکه در نمونههای تیمار شده با متیلجاسمونات از 24 ساعت پس از شروع تیمار افزایش معنیداری در فعالیت آنزیم پراکسیداز در مقایسه با زمان آغاز آزمایش یعنی روز هفتم داشت (شکل b3). این نتایج نشان داد که در حضور متیلجاسمونات پس از 12 ساعت فعالیت پراکسیداز از نمونههای شاهد به طور معنیداری بیشتر است.
فعالیت کاتالاز: به طور کلی فعالیت کاتالاز در کشت سلولی از روز هفتم به بعد در نمونههای شاهد و نمونههای تیمار شده با متیلجاسمونات رو به افزایش بود. فعالیت کاتالاز در سلولهای تیمار شده با متیلجاسمونات تقریباً در کلیه نمونهها در مقایسه با شاهد افزایش یافت (شکل c3).
مقدار پراکسید هیدروژن: اندازهگیری میزان تجمع پراکسید هیدروژن در سلولها نشان داد که این ترکیب از روز هفتم تا 72 ساعت، هم در سلولهای شاهد و هم در نمونههای تیمار شده با متیلجاسمونات رو به افزایش بود، اما تنها در سلولهایی که به مدت 8 ساعت پس از تیمار متیلجاسمونات برداشت شدند نسبت به سلولهای شاهد افزایش معنیداری داشت و در سایر تیمارها میزان پراکسید هیدروژن بین تیمار و سلولهای شاهد تغییر معنیداری نداشت (شکل a4).
|
cde |
|
a |
|
b |
|
c |
|
i |
شکل 3- تاثیر متیلجاسمونات بر فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز (a)، پراکسیداز(b) و کاتالاز (c). متیلجاسمونات در روز هفتم به محیط کشت اضافه گردید. سلولها در زمانهای 4، 8، 12، 24، 48 و 72 ساعت پس از تیمار برداشت شدند. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح 05/0≥P است.
|
a |
|
d |
|
cd |
|
b |
|
|
شکل 4- تاثیر متیلجاسمونات بر میزان پراکسید هیدروژن (a) و پراکسیداسیون لیپید (b). متیلجاسمونات در روز هفتم به محیط کشت اضافه گردید. سلولها در زمانهای 4، 8، 12، 24، 48 و 72 ساعت پس از تیمار برداشت شدند. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح 05/0≥P است.
پراکسیداسیون لیپیدهای غشا: با توجه به نتایج بدست آمده، میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا از روز هفتم تا 72 ساعت، هم در سلولهای شاهد و هم در نمونههای تیمار شده با متیلجاسمونات تغییری نداشت و تنها در نمونههایی که به مدت 8 و 24 ساعت برداشت شدند افزایش معنیداری دیده شد. همچنین در حضور 1/0 میلیمولار متیلجاسمونات در میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشای سلولهای تیمار شده در مقایسه با نمونههای شاهد تفاوت معنیداری (05/0P≤) مشاهده نگردید (شکل b4).
تأثیر متیلجاسمونات بر تجمع متابولیتهای ثانوی: بررسی میزان فنول کل در سلولهای شاهد و تیمار شده نشان داد که در کشت تعلیقی میزان ترکیبات فنولی با شیب ملایمی رو به افزایش است که از روز هفتم تا 72 ساعت مورد مطالعه، در هر گروه نسبت به روز هفتم معنیدار بود. به علاوه اینکه مقایسه مقدار فنول در سلولهای تیمار شده با متیلجاسمونات با نمونههای شاهد نشان داد که میزان این ترکیبات در تمام ساعات پس از اعمال تیمار به طور جزئی بیشتر بوده و در 48 و 72 ساعت پس از تیمار افزایش معنیداری داشت (شکل a5).
|
a |
|
e |
|
b |
|
e |
شکل 5- تاثیر متیلجاسمونات بر فنل کل (a) و فلاونوئید (b). میزان فنل کل بر اساس استاندارد گالیک اسید و میزان فلاونوئید بر اساس استاندارد روتین (Rutin) اندازهگیری شدند. متیلجاسمونات در روز هفتم به محیط کشت اضافه گردید. سلولها در زمانهای 4، 8، 12، 24، 48 و 72 ساعت پس از تیمار برداشت شدند. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنیدار در سطح 05/0≥P است.
نتایج اندازهگیری محتوای فلاونوئید نشان داد که با گذشت زمان هم در نمونههای شاهد و هم در نمونههای تیمار شده با متیلجاسمونات، میزان فلاونوئید سلولها روند افزایشی دارد. شدت افزایش میزان فلاونوئید در نمونههای تیمار شده بسیار بیشتر بود، به گونهای که از 24 ساعت پس از تیمار، این سلولها نسبت به 12 ساعت اول به طور معنیداری از محتوای فلاونوئیدی بالاتری برخوردار بودند (شکل b5).
بحث
متیلجاسمونات باعث القای تنش اکسیداتیو در گیاهان تحت تیمار میشود (13). به دلیل اینکه متیلجاسمونات تولید ROS را در گیاهان القا میکند، بنابراین یک دستگاه آنتیاکسیدانی مؤثر برای حفظ عملکردهای متابولیسم در شرایط القا ضروریست. دستگاه آنتیاکسیدان آنزیمی شامل سوپراکسید دیسموتاز، پراکسیداز، کاتالاز و گلوتاتیون ردوکتاز حفاظت علیه تأثیرات سمی ROS را بر عهده دارد. سوپراکسید دیسموتاز اولین آنزیم در فرایند سمیت‌زدایی ROS به‌شمار میرود. این آنزیم نقش حیاتی در دفاع آنتیاکسیدانی ایفا میکند، زیرا تبدیل O2- را به H2O2 کاتالیز میکند، درحالیکه کاتالاز و پراکسیداز، H2O2 را تخریب میکنند. در این مطالعه کاهش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در 12 ساعت اول پس از اعمال تیمار متیلجاسمونات ممکن است به دلیل غیرفعال کردن آنزیم در اثر تولید بیش از حد ROS باشد (36). در حالیکه فعالیت این آنزیم در سلولهایی که در بازه زمانی 24 تا 72 ساعت پس از اعمال تیمار برداشت شدند، نسبت به گروه شاهد افزایش معنیداری را نشان داد. فعالیت سوپراکسید دیسموتاز احتمالاً بدلیل سنتز از نو (De-novo) پروتئینهای آنزیمی و القای بیان ژن رمزگذاری سوپراکسید دیسموتاز میباشد (38). فعالیت سوپراکسید دیسموتاز موجب تبدیل رادیکال سوپراکسید به H2O2 میگردد، سپس H2O2 توسط کاتالاز در پراکسیزوم و آسکوربات پراکسیداز در سیتوپلاسم، میتوکندری و کلروپلاست سمزدایی میگردد (5 و 16).
در گیاهچه بادامزمینی، متیلجاسمونات در غلظتهای 100 و 250 میکرومولار باعث افزایش فعالیت آنزیمهای سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیداز گردیده است (25). همچنین در گیاه آرابیدوپسیس و کلزا، تیمار متیلجاسمونات فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیداز را افزایش داد (20). از آنجا که H2O2 سوبسترای کاتالاز میباشد، میتوان فرض کرد که بخشی از افزایش فعالیت کاتالاز به دلیل تولید H2O2 در سلولهای تیمار شده با متیلجاسمونات و یا فعالیت سوپراکسید دیسموتاز است. با توجه به نتایج این مطالعه، اندازهگیری میزان تجمع پراکسید هیدروژن در سلولها نشان داد که این ترکیب تنها در سلولهایی که به مدت 8 ساعت پس از تیمار متیلجاسمونات برداشت شدند نسبت به سلولهای شاهد افزایش معنیداری داشت و در سایر تیمارها در میزان پراکسید هیدروژن نسبت به سلولهای شاهد تغییر معنیداری مشاهده نشد. بنابراین با توجه به فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز و میزان تجمع پراکسید هیدروژن میتوان نتیجه گرفت که غلظت 1/0 میلیمولار متیلجاسمونات به‌عنوان القا کننده عمل نموده و با افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان مانع از رخ دادن انفجار اکسیداتیو شده است. علامترسانی جاسمونات توسط یک ROS یعنی H2O2 وساطت میشود، بنابراین افزایش سطح H2O2 در ساعت 8 پس از تیمار به‌عنوان یک مولکول محرک باعث فعال شدن دستگاه آنتیاکسیدانی، افزایش فعالیت آنزیمهای کاتالاز و پراکسیداز و جلوگیری از انفجار اکسیداتیو شده است، ازاین‌رو تعدیل سطح H2O2 انجام شده است.
از طرفی ایجاد گونههای فعال اکسیژن در تنشهای مختلف میتواند باعث پراکسیداسیون لیپیدهای غشا شده که افزایش میزان مالونیل دیآلدئید به‌عنوان محصول نهایی این اکسیداسیون نشان‌دهنده تخریب و افزایش نفوذپذیری غشا سلولهاست. رادیکالهای آزاد موجود در سلول باعث صدمه به لیپیدها و اسیدهای چرب غشا شده و رادیکالهای لیپید و پراکسی و هیدروپراکسی تولید میکنند، رادیکالهای جدید تولید شده میتوانند به واکنشهای اکسیداسیون لیپیدها سرعت بخشند. مالونیل دیآلدئید یک محصول پراکسیداسیون اسیدهای چرب اشباع نشده در فسفولیپیدها است. بنابراین مالونیل دیآلدئید به‌عنوان یک معرف برای بررسی صدمات غشا در شرایط تنش مورد استفاده قرار میگیرد و شاخص مناسبی برای پراکسیداسیون لیپید غشا محسوب میشود (19، 23 و 35). Wang در سال 1999 گزارش کرد که در گیاه توت فرنگی، متیلجاسمونات با غلظت 1/0 میلیمولار موجب تغییر نسبت اسیدهای چرب غشا شده و در نتیجه سوبسترا برای رادیکاهای آزاد و پراکسیداسیون لیپیدی کاهش مییابد. متیلجاسمونات با بالا نگهداشتن سطح فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان مانند کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز مانع اثر رادیکالهای آزاد حاصل از تنش بر غشا میگردد (39). آنزیم پراکسیداز نیز به‌عنوان گیرنده و جمع کننده پراکسیدها عمل کرده و از اثرات مخرب این مولکولها میکاهد (42). بنابراین در این مطالعه، عدم تغییر معنیدار میزان مالونیل دیآلدئید موید کارآمدی دستگاه آنتیاکسیدانی برای مقابله با تنش اکسیداتیو در غلظت استفاده شده متیلجاسمونات میباشد.
گیاهان ترکیبات فنولی را در پاسخ به برخی ترکیبات پیامرسان که نقش دفاعی مهمی دارند، آزاد میکنند. ترکیبات فنولی به خصوص فلاونوئیدها و همچنین فلاونولها به دلیل خاصیت آنتیاکسیدانی قوی قادر به بدام انداختن رادیکالهای آزاد و کاهش تنش اکسیداتیو هستند (3). این ترکیبات با مکانیسمهای متعددی مانند پاکروبی رادیکالهای آزاد، دادن هیدروژن، خاموش کردن اکسیژن یکتایی، کلات کردن یونهای فلزی و یا در همکاری با پراکسیدازها در جمعآوری یا حذف پراکسید هیدروژن، نقش آنتیاکسیدانی خود را ایفا میکنند (14 و 24). مطالعات نشان میدهد که رابطه مثبتی بین محتوای فنول کل و فعالیت آنتیاکسیدانی آنها وجود دارد (18). در سلولهای گیاهی ترکیبات فنولی به‌ویژه پلیفنولها در کاهش سمزدایی پراکسید هیدروژن بسیار کارا عمل کرده و به‌عنوان سیستم پشتیبان چرخه آسکوربات- گلوتاتیون در دفع رادیکالهای پراکسید هیدروژن شرکت میکنند. وقتی فنولها به‌عنوان آنتیاکسیدان در این واکنشها شرکت میکنند، به رادیکال فنوکسیل اکسید میشوند. رادیکالهای فنوکسیل از طریق واکنش با آسکوربات به حالت اولیه برمیگردند (33). در این مطالعه، افزایش ترکیبات فنولی با گذشت زمان بیانگر راهبرد سلولها برای مقابله با تنش اکسیداتیو است. به‌علاوه، فلاونوئیدها یکی از گستردهترین و متنوعترین ترکیبات طبیعی هستند که همانند سایر ترکیبات فنولی توانایی جذب رادیکالهای آزاد را دارند. در تنشهای اکسیداتیو ترکیبات فنولی به‌ویژه فلاونوئیدها میتوانند با فسفولیپیدهای غشا از طریق پیوند هیدروژنی با سرهای قطبی فسفولیپیدها ارتباط برقرار کنند، در نتیجه این ترکیبات در سطح داخل و خارج غشا جمع شده و به دلیل جلوگیری از دستیابی مولکولهای آسیب‌رسان به ناحیه هیدروفوبی دوقطبی به حفظ سیالیت و تمامیت غشا کمک میکنند (26). این گیاه دارای مقادیر قابل توجهی از فلاونوئیدها مثل نپترین (Nepetrin)، کوئرستین(Quercetine) و ایزورامنتین-3- روتینوزید (Isorhamnetin-3-o-rutinoside) میباشد (29). با توجه به وجود ترکیبات فلاونوئیدی در این گیاه میتوان نتیجه گرفت که بخشی از اثرات حفاظتی در آن از طریق تقویت سیستم آنتیاکسیدانی و مهار تولید ROS اعمال میگردد (4).
کاربرد متیلجاسمونات مقدار ترکیبات فنولی را در برخی گیاهان نظیر سیب زمینی، سیب قرمز، مارچوبه و لوبیا سبز افزایش داد (6). Pinot و همکارانش در سال 1998 بیان کردند که چالکون سنتتاز که پیش‌ساز فلاونوئیدها را تولید میکند توسط متیلجاسمونات القا میشود. متیلجاسمونات دارای نقش دوگانه در تکامل و دفاع میباشد. این ترکیبات میتوانند با القای مسیرهای علامترسانی باعث فعالشدن واکنشهای دفاعی در گیاه شده و در نتیجه باعث افزایش تولید متابولیتهای ثانوی گردند (41). با توجه به اینکه تأثیر متیلجاسمونات بر سنتز ترکیبات فنولی به غلظت آن وابسته است (21)، با توجه به نتایج به‌دست آمده از اندازهگیری ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی در سلولها پس از تیمار با متیلجاسمونات، میتوان نتیجه گرفت که این مولکول در غلظت 1/0 میلیمولار باعث تحریک آبشار علامترسانی در سلول شده و از این طریق باعث افزایش تولید ترکیبات فنولی مختلف میشود. بنابراین به نظر می رسد که متیلجاسمونات به‌عنوان الیسیتور سبب افزایش قدرت سیستم آنتیاکسیدانی و کاهش تنش اکسیداتیو شده و سنتز این ترکیبات را افزایش داده است.
نتیجه گیری
با توجه به اینکه گیاه S. striata از گذشته به‌عنوان یک گیاه دارویی کاربرد داشته است و از سوی دیگر نقش ترکیبات فنولی در موارد بالینی به خوبی شناخته شده است، استفاده از متیلجاسمونات در غلظت مناسب میتواند راهکاری مؤثر برای راهاندازی آبشار علامترسانی سلولی و افزایش تولید متابولیتهای ثانوی ارزشمند در کشتهای سلولی در بازه زمانی کوتاه باشد و سبب افزایش کارایی درمانی آن گردد. علاوه بر آن، افزایش ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی به دلیل افزایش توان آنتیاکسیدانی سلول در حفاظت سلول علیه تنشهای اکسیداتیو نیز نقش مؤثری خواهد داشت.
(علمی)', './data/plant/coversheet/621437973774.jpg'))
دوره 27، شماره 5
اسفند 1393صفحه 840-853
- تاریخ دریافت: 12 شهریور 1392
- تاریخ بازنگری: 23 شهریور 1392
- تاریخ پذیرش: 26 آبان 1392