The effect of Sodium HydrogenSulfide (NaHS) on some phytochemical characteristics and the production of THC and CBD alkaloids in the cell suspension culture of Cannabis indica.

Document Type : Research Paper

Authors
Maryam Abedini 1
Alireza Iranbakhsh 1
sara saadatmand 1
Mostafa Ebadi 2
zahra oraghiardebili 3
1 Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, I.R. of Iran.
2 Department of Biology, Damghan Branch, Islamic Azad University, Damghan, I.R. of Iran.
3 Department of Biology, Garmsar Branch, Islamic Azad University, Garmsar, I.R. of Iran.
10.22034/jpr.2025.8473.3363
Abstract
Cannabis indica is recognized for its medicinal properties, particularly due to its secondary metabolites like cannabinoids. This study explored the use of cell suspension culture technology to identify, produce, and extract these compounds. It specifically examined the impact of sodium hydrogen sulfide (NaHS), a hydrogen sulfide donor, on cell suspension cultures of hemp. The research involved treating callus cultures with varying NaHS concentrations (50, 100, and 150 mg/L) and assessing their effects on phytochemical traits and cannabinoid production, particularly Cannabidiol and Tetrahydrocannabinol.

Results showed that NaHS treatment elevated the levels of enzymes such as catalase, peroxidase, and proline, while decreasing phenylalanine ammonia-lyase and phenolic compounds compared to control groups. Protein and soluble sugar levels increased, except in the 50 mg/L treatment. Cell growth rates improved from the second week onward, with 100 mg/L and 150 mg/L treatments enhancing cell survival rates. However, the alkaloid levels did not increase relative to controls.

Overall, the study concluded that sodium hydrogen sulfide mitigates growth-inhibiting factors like reactive oxygen species (ROS), reducing oxidative damage. This leads to an increase in defensive compounds, such as proline and antioxidant enzymes, helping hemp cells better withstand stress conditions in cell suspension culture. Thus, NaHS shows potential in optimizing the production of valuable cannabinoids from Cannabis indica through enhanced cellular resilience and metabolic activity.
Keywords
sodium hydrogen sulfide
tetrahydrocannabinoid acid
cannabidol
cellular suspension
cannabis indica
Subjects

اثر سدیم هیدروژن‌سولفید (NaHS) بر برخی ویژگی‌های فیتوشیمیایی و تولید آلکالوئیدهای THC و CBD در کشت سوسپانسیون سلولی

گیاه شاهدانه هندی (Cannabis indica)

مریم عابدینی1، علیرضا ایرانبخش1*، سارا سعادتمند1، مصطفی عبادی2 و زهرا اوراقی اردبیلی3

1 ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات، گروه زیست شناسی.

2                      ایران، دامغان، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان، گروه زیست شناسی.                            

3 ایران، گرمسار، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد گرمسار، گروه زیست شناسی.

تاریخ دریافت: 02/04/1403                                                         تاریخ پذیرش: 06/11/1403

چکیده

شاهدانه هندی (Cannabis indica)، گیاهی با خواص دارویی ارزشمند است که بدلیل فراوانی متابولیت‌های ثانویه از جمله کانابینوئیدها یکی از گونه‌های مورد مطالعه در فیتوشیمی می‌باشد. فناوری کشت سوسپانسیون سلولی می‌تواند روشی بهینه با هدف شناسایی، تولید و استخراج این ترکیبات خاص از گیاه شاهدانه باشد.  در این پژوهش اثر سدیم ‌هیدروژن‌سولفید (دهنده هیدروژن‌سولفید) بر کشت سوسپانسیون سلولی مورد بررسی قرارگرفت و پس از تولید کالوس مناسب جهت کشت سوسپانسیون سلولی، اثر تیمارهای مختلف این الیسیتور (50، 100 و150 میلی‌گرم بر لیتر) و در سه تکرار بر برخی ویژگی‌های فیتوشیمیایی و میزان تولید کانابینوئیدهای کانابیدیول و تتراهیدروکانابینول در زیست‌توده سوسپانسیون‌ سلولی گیاه شاهدانه ارزیابی‌شد. نتایج نشان‌داد میزان آنزیم‌های کاتالاز، پراکسیداز و پرولین با استفاده از محرک سدیم ‌هیدروژن‌سولفید نسبت به شاهد افزایش‌یافتند، درحالی که میزان آنزیم فنیل‌آلانین‌ آمونیالیاز و فنل نسبت به شاهد کاهش‌ نشان‌دادند. هم‌چنین میزان پروتئین و قند محلول نیز به‌جز تیمار mg/L 50 نسبت به شاهد افزایش نشان‌داد. از هفته‌ی دوم درصد سلول‌های رشدکرده نسبت به شاهد افزایش‌یافت و در سنجش درصد زنده‌مانی‌ سلول نیز در تیمارهای mg/L100 و mg/L 150 بهبود درصد زنده‌مانی سلول نسبت به شاهد مشاهده‌شد. باتوجه به نتایج سنجش، میزان آلکالوئیدهای مورد مطالعه نسبت به شاهد افزایش نشان ‌ندادند. بنابراین به‌نظر می‌رسد که سدیم ‌هیدروژن‌سولفید با کاهش اثر عوامل سرکوبگر رشد سلول‌ها از قبیل ROS و در نتیجه کاهش آسیب اکسیداتیو و هم‌چنین افزایش ترکیبات ‌دفاعی گیاه از جمله پرولین و افزایش آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی، سبب سازگاری سلول‌های گیاه شاهدانه با شرایط تنشی ایجاد‌شده در کشت سوسپانسیون‌سلولی گردید.

واژه های کلیدی: سدیم ‌هیدروژن‌سولفید، تتراهیدروکانابینوئیداسید، کانابیدول، سوسپانسیون‌سلولی، شاهدانه هندی.

* نویسنده مسئول، پست الکترونیکی: iranbakhsh@iau.ac.ir

مقدمه

 

شاهدانه با نام علمیCannabis indica  گیاهی علفی، یک‌ساله، از خانواده‌ی Cannabaceae می‌باشد. در اصل بومی آسیای میانه است و اکنون به‌میزان وسیعی در سراسر جهان گسترش پیدا کرده‌است. این خانواده شامل حدود 117 گونه بصورت پراکنده در مناطق گرمسیری، نیمه‌گرمسیری و معتدل جهان می‌باشد (22). شاهدانه یکی از اولین گیاهانی بود که در دوره نوسنگی توسط چینی‌ها و برای هزاران سال بعنوان منبع فیبر، غذا و دارو مورد استفاده قرار ‌می‌گرفته‌است (15). این گیاه بیش از 3000 سال است که عمدتا بدلیل خواص ضد‌درد آن بصورت دارویی استفاده می‌شود.‌ فیتوکانابینوئیدهای غالب در گیاه شاهدانه،Δ9-تتراهیدروکانابینول (THC) (Tetrahydrocannabinol) و کانابیدیول (CBD) (Cannabidiol) هستند، ترکیبات اصلی شاهدانه دارویی (MC) (Medical Cannabis) حاوی هریک یا هردوی این ترکیبات در نسبت‌های مختلف بعنوان مواد‌ موثره، بصورت ایزوله و یا عصاره کامل می‌باشد (38). شاهدانه دارای خواص دارویی ارزشمندی از جمله حفاظت از سیستم ‌عصبی، درمان اضطراب، افسردگی، اختلالات خواب، درد، اختلالات عصبی می‌باشد (19). علی‌رغم تقاضای بالای کانابینوئیدها به‌ویژه THC و CBD در بخش دارویی راندمان تولید این ترکیبات پایین است و بنابراین روش‌های متنوعی از جمله استفاده از محرک‌های شیمیایی برای تحریک متابولیسم ثانویه در سلول‌های شاهدانه در شرایط آزمایشگاهی مورد استفاده قرار می‌گیرد (11).

کشت بافت گیاهی روشی عالی برای استخراج بسیاری از متابولیت های هدفمند است. بنابراین، کشت اندام‌ها، بافت‌های گیاهی و کشت‌ سوسپانسیون سلولی برای مطالعه ترکیبات ‌شیمیایی متعدد و  تبدیل زیستی ترکیبات فیزیولوژیکی نه‌چندان فعال به ترکیبات فعال دارویی مورد استفاده قرار می‌گیرند (8). علاوه‌براین، سوسپانسیون‌ سلولی، منبعی خوب و بستری استثنایی برای بررسی تغییرات متابولومیک و پروتئومی می‌باشد که در طول تولید ترکیبات فعال زیستی مختلف رخ می‌دهند (16). در مقایسه با سیستم‌های گیاهی کامل که چرخه رشد نسبتا طولانی‌تری دارند، در کشت سوسپانسیون سلولی، سلول‌ها چرخه زندگی نسبتا کوتاه‌تری دارند و تمایز نیافته باقی می‌مانند. چرخه‌ عمر کوتاه‌تر، امکان مطالعه‌ی سلول‌‌های موردنظر که تحت شرایط محیطی کاملا کنترل‌شده رشد می‌کنند را فراهم می‌نماید (34).

الیسیتورها (Elicitors) عموما به عواملی اطلاق می‌شوند که واکنش‌های دفاعی گیاهان را تحریک می‌کنند. پاسخ اصلی گیاهان به تنش‌های زیستی و غیرزیستی، تجمع متابولیت‌های ثانویه در کشت بافت گیاهی می‌تواند توسط محرک‌ها تحریک‌گردد (37). استفاده از الیسیتورها راهی مناسب و شناخته‌شده جهت دستیابی به کانابینوئیدهای مهم در گیاه شاهدانه می‌باشد (5). در پژوهش‌های انجام‌شده روی گیاهان، NaHS بعنوان یک القاکننده ارزان مورد استفاده قرارمی‌گیرد و بصورت خارجی به محلول هیدروپونیک، محیط‌کشت درون‌شیشه‌‌ای اضافه‌می‌شود و یا بصورت مستقیم روی گیاه محلول‌پاشی می‌گردد. NaHS که دهنده‌ی H2S با طور عمر کوتاه می‌باشد از روند پیوسته و کند تولید H2S در شرایط In vivo   تقلید نمی‌کند و در دامنه وسیعی از غلظت‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد (14). تعداد زیادی از مطالعات در زمینه گیاهان نشان داده‌اند که H2S می‌تواند بطور مستقیم یا غیرمستقیم در طیف گسترده‌ای از فرآیندهای فیزیولوژیکی گیاه از جمله حرکت روزنه، فتوسنتز، جوانه زدن بذر، رشد ریشه، رسیدن میوه و همچنین پیری گیاه نقش داشته باشد (39). استفاده از سدیم  هیدروژن‌سولفید در کشت سوسپانسیون سلولی گیاه شاهدانه با هدف تحریک و افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه این گیاه از جمله کانابینوئیدها و ترکیبات فنولیک که دارای خواص دارویی مهمی هستند می‌باشد. این ترکیب با القای تنش اکسیداتیو در سلول‌ها سبب تحریک مسیرهای بیوسنتزی متابولیت‌های ثانویه و در نتیجه افزایش تولید آن‌ها می‌گردد. بطورکلی استفاده از NaHS بعنوان یک محرک بیولوژیکی جدید در کشت سوسپانسیون سلول گیاهی رویکردی نوآورانه و کارآمد برای افزایش تولید ترکیبات دارویی و فعال زیستی می‌باشد.

مواد و روشها

بذرهای گیاه شاهدانه، گونه‌ی ایندیکا (Cannabis indica L.) جنس اسپشیال کوش (Special Kush) اوایل فروردین ماه سال 1400 جهت کشت گلدانی به گلخانه منتقل‌شد پس از رشد مناسب گیاه، جداکشت‌ها از برگ‌های جوان دارای رگبرگ اصلی انتخاب و پس از سترون‌سازی در محیط‌کشت موراشیگ ‌اسکوک (MS) (Murashige and Skoog) حاوی تیمارهای مختلف جدول1 کشت‌ شدند. سپس در اتاقک رشد در دمای °C 25±2 و تاریکی قرارگرفتند. پس از گذشت یک ماه، با مقایسه تاثیر تیمارهای هورمونی بر درصد کالوس‌زایی، رنگ و بافت کالوس‌ها مورد ارزیابی قرارگرفت و مناسبت‌ترین کالوس جهت استفاده در کشت سوسپانسیون ‌سلولی انتخاب‌شد.

 

جدول 1- غلظت و نوع تنظیم‌کننده‌ای رشد در مرحله کشت اولیه.

2,4-D

mg/L

NAA

mg/L

BA

mg/L

KIN

mg/L

Plant growth regulators treatments

0.5

0

0.1

0

1

0

1

0

0

2

0

0

0

1

3

0

2

0

0

4

2

1

0

0

5

0

1

0

1

6

0

2

0

2

7

1

0

0

0

8

2

1

0

1

9

 

بمنظور تهیه کشت سوسپانسیون ‌سلولی، میزان یک گرم از کالوس‌هایی که شرایط مناسبی از لحاظ رنگ، اندازه و بافت داشتند به ارلن‌های ml 250 حاوی ml 50 محیط‌کشت MS منتقل‌شد و روی شیکر با 110 دور در دقیقه، C°25 و در تاریکی قرارگرفت. پس از اینکه سوسپانسیونی یک‌دست در حجم مناسب بدست آمد، الیسیتور در مرحله رشد خطی اضافه‌گردید. پس از چهارده روز از شروع کشت، سوسپانسیون سلولی وارد فاز خطی گردید و در ادامه در روز چهاردهم، الیسیتور در غلظت‌های mg/L 50،100 و 150 به محیط کشت اضافه‌شد.

بمنظور استخراج عصاره آنزیمی از بافرفسفات 1/0 (7/3pH )
 استفاده‌شد. زیست‌توده تازه به‌خوبی در نیتروژن مایع پودرشد، سپس بلافاصله هموژنات در C°4 سانتریفیوژ شد و ذرات شناور یا به‌عبارتی سوپرناتانت بصورت عصاره آنزیمی در دمای C°80- ذخیره شدند (21).

بررسی میزان فعالیت آنزیم کاتالاز با مطالعه کاهش مقدار H2O2 در nm240 در دقیقه با استفاده از اسپکتروفوتومتر T92 plus کمپانی  PG instrumentsانجام‌شد. مخلوط واکنش شامل بافر فسفات Mm50 و Mm H2O2 15 و عصاره بود. با تهیه منحنی استاندارد پراکسید‌هیدروژن، در نهایت فعالیت آنزیم براساس واحد آنزیم به ازای هر گرم بافت تر (Unit E g-1fw) محاسبه‌شد (12).

بمنظور سنجش محتوای فنلی، از ml1 معرف فولین 50% و ml2 کربنات سدیم 21% استفاده‌شد. ترکیب ml1 عصاره با این مواد به مدت ۱۰ دقیقه در تاریکی نگهداری و سپس سانترفیوژ شد. جذب نمونه‌ها در nm760 اندازه‌گیری شد و برای تعیین غلظت، منحنی استاندارد با استفاده از ترکیبات فنلی مانند اسیدگالیک ایجاد شد. در نهایت، محتوای فنول کل بصورت میلی‌گرم معادل اسیدگالیک (GAE) بیان‌شد (3).

برای سنجش پرولین، ابتدا زیست‌توده با ml10 اسید‌سولفوسالیسیلیک 3% هموژن‌شد. سپس معرف‌های نین‌هیدرین (برای تهیه آن cc30 اسید‌استیک، cc 20 فسفریک M6 به g 25/1 نین‌هیدرین اضافه‌‌شد و به‌آرامی مخلوط‌گردید، سپس مخلوط حاصله در °C4 نگه‌داری‌شد. این محلول تا 24 ساعت قابل استفاده است)، ml2 اسید استیک خالص و ml4 معرف تولوئن به نمونه‌ها اضافه‌شد. لوله‌ها در دمای C°100  قرار داده‌شد و سپس جذب نوری در nm520 اندازه‌گیری‌شد. محتوای پرولین نمونه‌ها با استفاده از منحنی استاندارد بر اساس میلی‌گرم بر گرم وزن‌تر (mgg-1fw)  محاسبه‌گردید (9).

جهت سنجش فعالیت آنزیم فنیل‌آلانین‌آمونیالیاز (PAL)( Phenylalanine ammonialyase)، عصاره آنزیمی به مخلوط واکنش حاوی بافر Tris-HCl و فنیل‌آلانین آمونیالیاز افزوده‌شد و در دمای C°37 به مدت ۶۰ دقیقه نگهداری‌شد. پس از توقف واکنش با HCl، جذب نمونه‌ها در nm290 اندازه‌گیری‌شد. فعالیت آنزیم بر اساس میکروگرم سینامات تولیدی در دقیقه به ازای هر میکروگرم پروتئین (Cin min-1Mg-1pr) محاسبه و گزارش‌شد (10). برای سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز،  پس از تهیه مخلوط واکنش که شامل بافر استات، پراکسیدهیدروژن و محلول بنزیدین بود، به این مخلوط عصاره آنزیمی افزوده شد و تغییرات جذب نمونه‌ها در طول‌موج nm 530 بررسی و مقایسه‌شد. فعالیت آنزیم برحسب واحد آنزیم (Unit E g-1 fw) به ازای یک گرم زیست‌توده بیان‌شد (6).

محاسبه

درصد زنده‌مانی سلول به روش ایونس بلو (Evans blue)

سنجش درصد زنده‌مانی سلول‌ها طی دوره کشت یک ماهه پس از القای الیسیتور انجام‌شد.mg 20 از سوسپانسیون (وزن‌تر پس از جداسازی محیط‌کشت اضافی) با   µl180 آب‌مقطر و  µl20 ایونس بلو 5/0% مخلوط‌شد و به‌مدت 15 دقیقه روی شیکر با دور آرام در دمای محیط قرار داده‌شد. بعد از انکوبه‌کردن، سلول‌‌ها به‌مدت 5 دقیقه در g2300 سانتریفیوژ شد (Hettich  1195-a Sweden)، سپس رونشست خارج‌‌گردید و ته نشست 3 بار با آب‌مقطر شسته‌شد و عمل سانتریفیوژ تکرارگردید تا جایی که مایع رویی بدون رنگ بدست آمد. سپس سلول‌ها در ml 2/1 SDS %1 آسیاب گردید و  به‌مدت 3 ساعت در دمای °C50 انکوبه‌شد. پس از انکوباسیون، به‌مدت 15 دقیقه با 2500 دور سانتریفیوژ گردید و رونشست جمع‌آوری شد. برای تعیین مرگ سلول‌های سوسپانسیون سلولی، زیست‌توده به‌مدت 10 دقیقه در دمای °C 95 روی بخاری بلوک خشک (Thermomixer compact eppendrof  Germany) گرما داده‌شد. سلول‌های مرده بصورت جداگانه با ایونس بلو رنگ‌آمیزی شد، سپس سلول‌های کشته‌شده با آن‌هایی که جوشانده نشده مقایسه‌گردید. چگالی نوری لکه‌آبی توسط اسپکتروفتومتر در nm 600 اندازه‌گیری‌شد. از SDS 1 % و متانول 50 % بعنوان بلانک استفاده‌گردید (30).

 

 

در این فرمول AB میزان جذب لکه آزاد‌شده از زیست‌توده جوشانده‌شد و AUB میزان جذب لکه آزاد‌شده از زیست‌توده جوشانده نشده می‌باشد.

اندازه‌گیری شاخص رشد

سلول در محیط‌کشت سوسپانسیون (GI)( Growth index)

بمنظور اندازه‌گیری شاخص رشد وزن‌تر زیست‌توده شاهد از وزن تر زیست‌توده سوسپانسیون سلولی تحت تاثیر NaHS که چهارده روز پس از القا جمع‌آوری شده‌بود کسر شد  و سپس تقسیم بر وزن‌تر زیست‌توده شاهد گردید (29).

 

 

سنجش آلکالوئیدها

عصاره‌گیری جهت انجام HPLC روش گوباتی با اندکی تغییر انجام‌گرفت (17). در این روش نمونه‌ها در انکوباتور و دمای °C 35 خشک‌شد و تا زمان سنجش در فریزر °C 80- نگه‌داری ‌شد.  g2/0 از وزن خشک زیست‌توده در 5/1 میلی‌لیتر متانول 80 % سابیده‌شد و سپس به‌مدت 30 ثانیه ورتکس‌شد. پس از آن نمونه‌ها به‌مدت 10 دقیقه در °C 35 در دستگاه اولتراسونیک قرار‌گرفت سپس به‌مدت 24 ساعت در تاریکی روی شیکر با دور آرام و در دمای محیط قرارگرفت. بعد از 24 ساعت، نمونه‌ها به‌مدت 15 دقیقه در 8000 دور سانتریوفیوژ شد و سوپرناتانت آن با هدف انجام HPLC به میکروتیوپ منتقل‌شد و در °C 4 و تاریکی نگه‌داری شد.

جهت انجام سنجش HPLC، µl20 از عصاره‌ی بدست‌آمده به دستگاه (Alliance Waters 2695 Separations Module) تزریق‌شد. جداسازی کانابینوئیدها از طریق ستون (Knauer Bach NO:B2090813- Column SN: EA 211) انجام‌شد. فاز ساکن مورداستفاده با مشخصات (25VE181ESJ 250*4.6mm with precolumn Eurospher 100-5c18) بود و در فاز متحرک از آب و استونیتریل با نسبت  V/V50/50 استفاده‌شد.  مشخصات دتکتور در این سنجش (Alltech ELSD800 Waters996 Photodiode Array Detector) بود. پیک‌های مربوط به کانابینوئیدها در طول‌موج nm210 شناسایی‌شد و از طریق برون‌یابی مبتنی بر منحنی استاندارد تعیین‌گردید. استاندارد اسیدهای کانابینولیک بعنوان ماده مرجع (®Cerilliant) و از شرکت Sigma-Aldrich تهیه‌گردید. این سنجش توسط نرم‌افزار (Milinium 32) کنترل‌شد و ترکیبات با استفاده از شیب‌گرادیان شسته‌شدند. سرعت جریان (Flow rate)، به‌میزان mL/min 1 و زمان اجرا 40 دقیقه بود. ماده استاندارد با 5 دوز مختلف تزریق‌شد و با این تعداد منحنی کالیبراسیون رسم‌شد (شکل1).

 

 

شکل 1-منحنی استاندارد کانابینوئیدهای در گیاه شاهدانه.

 

آنالیز آماری داده‌ها

برای انجام آزمون‌های آماری از ضریب رگرسیون (پیرسون)، نرم‌افزار گراف‌پد و از آزمون‌های One-way ANOVA ،Two-way ANOVA آزمون مقایسه‌ی میانگین توکی و برای تجزیه واریانس و مقایسه‌ی داده‌های حاصل از آزمایش استفاده‌شد.

نتایج

نتایج حاصل از تیمارهای تنظیم‌کننده‌های

رشد برای تولید انواع کالوس در گیاه شاهدانه

بررسی   اثر    ترکیب    تنظیم‌کننده‌های    رشد    بر

جداکشت‌های برگی کشت­شده در محیط‌ کشت‌ جهت کالوس‌زایی نشان‌داد که اولین توده‌ کالوس دو هفته پس از کشت در محیط ایجاد‌ گردید و پس از گذشت حدود سی روز کالوس‌ها رشد مناسبی داشتند. کالوس‌ها دارای بافت‌هایی بسیار فشرده در تیمار شماره نه تا بافتی ترد و شکننده  در تیمار شماره هشت با طیف رنگی کرم روشن تا قهوه‌ای تیره بودند (شکل2). تیمار مناسب مورد استفاده از نظر بافت و رنگ کالوس جهت تهیه سوسپانسیون تیمار شماره‌ی هشت موجود در جدول1 بود.

 

شکل 2-انواع کالوس‌ها براساس بافت و رنگ.:A جداکشت برگB : کالوس‌زایی از جداکشت دمبرگ C: هفته‌ی دوم آغاز تشکیل کالوس بر سطح جداکشتD ,: (mgL1 2,4-D),  E :(mg/L1 NAA),  F: (mg/L 5/02.4-D  +  mg/L1/0 NAA),  G: (mg/L 2 NAA  +  mg/L2 KIN) H , :(mg/L1 KIN )  : I (mg/L 1 NAA  + mg/L1 KIN).

 

 

نتایج تولید سوسپانسیون سلولی در گیاه شاهدانه

کالوس تشکیل‌شده در محیط‌کشت حاوی mg/L1 2,4-D جهت کشت سوسپانسیون سلولی مورد استفاده قرارگرفت. بافت این کالوس ترد و دارای رنگ کرم تیره بود. پس از آن‌که سلول‌ها به‌خوبی در شرایط کشت سوسپانسیون سلولی رشد نموند، طی چهار هفته فاکتورهای درصد زنده‌مانی، شاخص رشد و درصد سلول‌های رشدکرده در سوسپانسیون‌های بدون الیسیتور (شاهد) و حاوی الیسیتور مورد بررسی قرارگرفت. بطورکلی غلظت‌های ایمن NaHS معمولا در محدوده 50 تا 150 میلی‌گرم بر لیتر برای بسیاری از گیاهان گزارش شده‌است و معمولا غلظت‌های بالای mg/L150 در گیاه سمیت ایجاد می‌کند. باتوجه به‌ اینکه هدف از این تحقیق مطالعه‌ی بهتر فیتوشیمی گیاه شاهدانه با دامنه‌ی وسیع‌تر در فضایی محدودتر و کیفیتی بهتر است بنابراین، مسیر این پژوهش از مرحله‌ی کالوس‌زایی، کشت سوسپانسیون، سنجش فیتوشیمی و سنجش میزان کانابینوئیدها بر این مهم تمرکز داشته‌است.

همان‌طور که در شکل3-A مشاهده می‌شود، درصد زنده‌مانی سلول‌های سوسپانسیون گیاه شاهدانه تحت تاثیر تیمارهای سدیم ‌هیدروژن‌سولفید، در پایان هفته‌ی دوم تیمار mg/L 50 (p≤0.0001) نسبت به شاهد تفاوت معنی‌داری را نشان‌داد و بالاترین میزان درصد زنده‌مانی مربوط به تیمار mg/L 150 و با میانگین 6/71 % بود که نسبت به شاهد افزایش را نشان‌داد و  پایین‌ترین میزان این شاخص مربوط به تیمار mg/L 50 و با میانگین 3/55% بود. در ارتباط با تاثیر الیسیتور سدیم ‌هیدروژن‌سولفید بر کشت سوسپانسیون گیاه شاهدانه، از هفته‌ی دوم سنجش درصد زنده‌مانی‌ در تیمارهای mg/L100 و mg/L 150 بهبود درصد زنده‌مانی، نسبت به شاهد حاصل‌گردید.

در پژوهش حاضر درصد سلول‌های دارای رشد (شکل3-B) هم مورد بررسی قرار گرفت که باتوجه به نمودار مقایسه‌ی میانگین در پایان هفته‌ی دوم، تیمار mg/L50 (p≤0.01)، mg/L100 (p≤0.05) و mg/L150 (p≤0.001) نسبت به شاهد تفاوت معنی‌داری را نشان‌دادند و بالاترین درصد سلول‌های رشدکرده مربوط‌ به تیمار mg/L 150 و با میانگین 83 % بود و پایین‌ترین میزان این شاخص مربوط به شاهد و با میانگین 69 % بود. در بررسی تاثیر تیمار سدیم  هیدروژن‌سولفید بر شاخص رشد گیاه شاهدانه (شکل3-C)، در پایان هفته‌ی اول تیمار mg/L 100 (p≤0.0001) و mg/L 150 (p≤0.0001) با شاهد تفاوت معنی‌داری نشان‌دادند و بالاترین میزان شاخص رشد در این هفته مربوط به تیمار mg/L 150 با میانگین  gr 43/1 بود و پایین‌ترین میزان این شاخص مربوط به تیمار mg/L 100 و با میانگین  gr 65/0 بود.  

 

 

 

شکل 3 -مقایسه‌ی درصد زنده‌مانی سلول (A)، درصد سلول‌های رشد کرده (B)، شاخص رشد (C)، سوسپانسیون سلولی گیاه شاهدانه به مدت چهار هفته پس از اعمال تیمار سدیم ‌هیدروژن‌سولفید.

یادآوری: در تمامی گراف‌ها ستاره‌ها بیان‌گر تفاوت معنی‌دار بین تیمارهای مورد استفاده و نمونه‌ی شاهد می‌باشد.

(p≤0.05):*  (p≤0.01):**  (p≤0.001):***  (p≤0.0001):****

 

 

در پایان هفته‌ی دوم نیز تیمارهای mg/L50 (p≤0.001) و mg/L100 (p≤0.0001) نسبت به شاهد تفاوت معنی‌داری داشتند و بالاترین  میزان شاخص رشد مربوط به تیمار mg/L 50 و با میانگین gr4/1 بود و پایین‌ترین میزان این شاخص مربوط به تیمار mg/L100 و با میانگین gr77/0 بود.

نتایج

سنجش فیتوشیمیایی سوسپانسیون سلولی گیاه شاهدانه

با مطالعه‌ی نمودار مقایسه‌ی میانگین (شکل5-A)،  میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در تیمار mg/L 50، mg/L 100 و mg/L 150 (p≤0.0001) الیسیتور نسبت به شاهد تفاوت معناداری داشته‌است. بیش‌ترین میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در تیمار mg/L 150 و پایین‌ترین میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در تیمار mg/L100 نسبت به شاهد مشاهده‌شد.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 4- سلول‌های زنده و مرده در سوسپانسیون سلولی گیاه شاهدانه در روز چهاردهم. (سلول‌های زنده بدلیل عدم نفوذ رنگ‌ به درون سلول به رنگ روشن و سلول‌های مرده بدلیل نفوذ رنگ به رنگ تیره دیده می‌شوند).

شکل 5-مقایسه نتایج تغییرات فعالیت آنزیم کاتالاز (A)، پراکسیداز (B) و فنیل آلانین آمونیالیاز (C) سوسپانسیون سلولی گیاه شاهدانه‌ی هندی به مدت چهار هفته پس از اعمال تیمار سدیم ‌هیدروژن‌سولفید. (حروف یکسان در هر نمودار نشان‌دهنده‌ی عدم تفاوت معنی‌دار بین تیمارها می‌باشد).

 

در نمودار مقایسه‌ی میانگین (شکل5-B) میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز، تیمار mg/L100 (p≤0.05) سدیم ‌هیدروژن‌سولفید

نسبت به شاهد تفاوت معناداری داشته‌است. بیش‌ترین میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز در تیمار mg/L 100 و پایین‌ترین میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز در تیمار mg/L 150 نسبت به شاهد مشاهده شد. با مطالعه‌ی نمودار مقایسه‌ی  میانگین (شکل5-C) میزان فعالیت آنزیم فنیل‌آلانین آمونیالیاز در تیمار mg/L50 (p≤0.0001)،mg/L 100 (p≤0.0001) و mg/L 150 (p≤0.0001) سدیم ‌هیدروژن‌سولفید نسبت به شاهد تفاوت معناداری داشته‌است. بیشترین میزان کاهش فعالیت آنزیم فنیل‌آلانین آمونیالیاز در تیمار mg/L 100 مشاهده‌شد و کمترین میزان کاهش فعالیت آنزیم فنیل‌الانین آمونیالیاز مربوط به تیمار mg/L 50 نسبت به شاهد بود.

مقایسه میانگین نتایج نشان‌داد که (شکل5-A) میزان پروتئین در تیمار mg/L 50 (p≤0.0001) mg/L100 (p≤0.0001) و mg/L150 (p≤0.001) نسبت به شاهد تفاوت معناداری داشته‌اند. بیشترین میزان پروتئین در نمونه‌های تیمار  mg/L100 سدیم ‌هیدروژن‌سولفید مشاهده‌شد و کمترین میزان پروتئین در تیمار mg/L 150 سدیم ‌هیدروژن‌سولفید نسبت به شاهد بدست‌ آمد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 6- مقایسه نتایج میزان تغییرات پروتئین: (A) ، پرولین: (B) ، فنل: (C)  و قند محلول: (D)  سوسپانسیون سلولی گیاه شاهدانه‌ی هندی به مدت چهار هفته پس از اعمال تیمار سدیم ‌هیدروژن‌سولفید. (حروف یکسان در هر نمودار نشان‌دهنده‌ی عدم تفاوت معنی‌دار بین تیمارها می‌باشد).

 

مقایسه میانگین نتایج نشان‌داد که (شکل5-B) میزان پرولین تیمارهای mg/L 50 ، mg/L 100 و mg/L 150 نسبت به شاهد تفاوت معناداری داشته‌اند (p≤0.0001). بیشترین میزان پرولین در نمونه‌های تیمار mg/L 100 سدیم  هیدروژن‌سولفید مشاهده‌شد و پایین‌ترین میزان پرولین مربوط به تیمار mg/L 150 سدیم  هیدروژن‌سولفید نسبت به شاهد بدست آمد.

همان‌طور که در شکل5-C مشاهده می‌گردد میزان فنل درتیمارهایmg/L  50 (p≤0.0001)، mg/L 100 (p≤0.0001) و mg/L 150 (p≤0.0001) نسبت به شاهد تفاوت معناداری داشته‌اند. بیشترین میزان فنل در تیمار mg/L 100 مشاهده‌شد و کمترین میزان فنل مربوط به تیمار mg/L150 سدیم  هیدروژن‌سولفید نسبت به شاهد مشاهده‌شد.

مقایسه میانگین نتایج نشان‌داد که (شکل5-D) میزان قند محلول در تیمار mg/L100 (p≤0.001) و mg/L150 (p≤0.0001) نسبت به شاهد تفاوت معناداری داشته‌اند. بیشترین میزان قند محلول در نمونه‌های تیمار mg/L 50 سدیم هیدروژن‌سولفید مشاهده‌شد و کمترین میزان پروتئین تیمار mg/L150 سدیم ‌هیدروژن‌سولفید نسبت به شاهد مشاهده‌شد.

 شکل 7- مقایسه‌‌ی نتایج میزان آلکالوئیدهای CBD و THC در زیست‌توده سوسپانسیون گیاه شاهدانه تحت تاثیر تیمار سدیم ‌هیدروژن‌سولفید.

یادآوری: در تمامی گراف‌ها ستاره‌ها بیان‌گر تفاوت معنی‌دار بین تیمارهای مورد استفاده و نمونه‌ی شاهد می‌باشد.

(p≤0.05):*  (p≤0.01):**  (p≤0.001):***  (p≤0.0001):****

 

مقایسه‌ی میانگین حاصل از نتایج سنجش HPLC (شکل7)

نشان‌داد که میزان آلکالوئید CBD در زیست‌توده سوسپانسیون گیاه شاهدانه در تیمارهای mg/L50 (p≤0.0001)، mg/L 100 (p≤0.0001) و mg/L150 (p≤0.0001) نسبت به شاهد تفاوت معنی‌داری را نشان‌دادند. بیش‌ترین میزان CBD مربوط به تیمار شاهد با میانگین mg100g-1dw 456/0 بود و کمترین میزان آلکالوئید CBD مربوط به تیمار mg/L 100 با میانگین mg100g-1dw 14/0 بودکه نسبت به شاهد 4/69 % کاهش داشت. هم‌چنین  میانگین حاصل از نتایج نشان‌داد که میزان آلکالوئید THC در زیست‌توده سوسپانسیون مورد مطالعه در تیمارهای mg/L 50 (p≤0.0001)، mg/L 100 (p≤0.0001) و  mg/L 150 (p≤0.0001) نسبت به شاهد تفاوت معنی‌داری را نشان‌دادند. بیش‌ترین میران THC مربوط به تیمار شاهد با میانگین mg100g-1dw 22/0 بود و کمترین میزان آلکالوئید THC  مربوط به تیمارmg/L50 با میانگین mg100g-1dw 045/0 بود که نسبت به شاهد 6/79 % کاهش داشت. بنابراین الیسیتور سدیم  هیدروژن‌سولفید در تمام تیمارهای مورد استفاده سبب افزایش میزان آلکالوئیدهای CBD و THC نسبت به شاهد نگردید و طبق نتایج این پژوهش این الیسیتور با این غلظت، محرک خوبی بمنظور القای تولید آلکالوئیدهای موجود در زیست‌توده سوسپانسیون گیاه شاهدانه شناخته‌نشد.

با هدف بررسی تاثیر الیسیتور سدیم  هیدروژن‌سولفید بر زیست‌توده سوسپانسیون گیاه شاهدانه، در شرایط شاهد (شکل8-A) آنزیم کاتالاز با کاهش میزان آلکالوئید CBD و نسبت آلکالوئید CBD به آلکالوئید THC دارای همبستگی مثبت بود. این آنزیم با میزان کاهش آلکالوئید THC همبستگی منفی داشت. در ارتباط با تاثیر سدیم ‌هیدروژن‌سولفید بر زیست‌توده سوسپانسیون گیاه شاهدانه (شکل8-B)، همبستگی معنی‌داری مشاهده نشد.

بحث

شناخت گیاهان دارویی و ویژگی بیوشیمیایی آن‌ها، گام‌های

اساسی جهت بهره‌برداری بهینه از ترکیبات و خواص دارویی آن‌ها را فراهم می‌کند (2).

گیاهان دارویی در هر قسمت از جمله ریشه، ساقه، گل، میوه، برگ و دانه دارای مقادیر زیادی مولکول‌های فیتوشیمیایی هستند و این مولکول‌ها نقش مهمی در تولید داروهای جدید دارند. تولید گیاهان دارویی و مولکول‌های فعال زیستی آن‌ها با روش‌های بیوتکنولوژیکی مزایای بسیاری نسبت به روش‌های تولید کلاسیک دارد و کشت سوسپانسیون سلولی یکی از این تکنیک‌های کاربردی می‌باشد (18). در این تحقیق استفاده از جداکشت برگ بدلیل تکثیرسریع سلول‌ها، آلودگی کمتر، تنوع ژنتیکی و سازگاری بهتر با محیط‌کشت گزینه مناسبی بود. تیمار هورمونی مورد استفاده در باززایی کالوس جهت تهیه سوسپانسیون  از جداکشت اهمیت دارد و مقایسه تیمارهای هورمونی مورد استفاده از لحاظ تولید کالوس مناسب جهت دستیابی به کشت سوسپانسیون نشان‌داد که تیمار mg/L1  2,4-D مناسب‌ترین بافت کالوس را بمنظور تولید سوسپانسیون ایجاد‌کرد زیرا کالوس‌های که دارای بافتی ترد و شکننده، سوسپانسیونی هموژن تولیدنموده و بنابراین تیمار مورد استفاده یکنواخت اعمال‌گردید (33). در بررسی تاثیر تنظیم‌کننده رشد 2,4-D بر کشت سوسپانسیون گیاه گوجه‌فرنگی اثرات مثبت غلظت بالای 2,4-D ( mg/L1-2) بر القای سریع سلول‌ها در کشت سوسپانسیون این گیاه گزارش شده‌است (26). در مطالعه‌ای مشابه در کشت سوسپانسیون سلولی گیاه شاهدانه، از جداکشت‌های برگ و دمبرگ جهت تولید کالوس‌ مورد نیاز استفاده‌ نمود. وی در تحقیق خود با استفاده از ترکیب mg/L1 بنزیل‌آدنین (BA) (Benzyl adenine) و mg/L2/0 نفتالین‌استیک ‌اسید (NAA)( Naphthaleneacetic acid) بالاترین میزان کالوس را بدست‌آورد و سپس از کالوس‌های تولید‌شده جهت کشت ‌سوسپانسیون سلولی بهره‌برد (13). در مطالعات کشت‌بافت صورت‌گرفته در گیاه شاهدانه اثر تیمارهای مختلف از تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی بر جداکشت برگ و هیپوکوتیل مورد بررسی قرارگرفت و بیشترین حجم کالوس تولیدشده در غلظت mg/L1/1 2,4-D در ترکیب با mg/L5/1 BAP در جداکشت برگ و کمترین حجم کالوس مربوط به جداکشت هیپوکوتیل در استفاده از تیمار هورمونی mg/L2 NAA به همراه  mg/L 5/1 BAP بدست‌آمد (4). بهترین کالوس مورد نیاز خود جهت کشت سوسپانسیون گیاه Cannabis sativa  را با استفاده از mg/L1  2,4-Dتهیه نمود (27).

 

 

 

شکل 8- همبستگی عوامل فیزیولوژیک و میزان کانابینوئیدها در زیست‌توده سوسپانسیون گیاه شاهدانه در شرایط شاهد (A) و تیمار سدیم ‌هیدروژن‌سولفید (B).

 

در شرایط تاریکی، تهویه سلول‌ها و میزان اکسیژن بسیار حائز اهمیت است. بنابراین می‌توان با توجه یه اینکه سدیم هیدژون‌سولفید در غلظت‌های ذکرشده از هفته‌ی دوم توانسته میزان زنده‌مانی سلول را نسبت به شرایط شاهد بهبود بخشد می‌تواند نقش مهمی در مقابله با تنش‌اکسیداتیو احتمالی ایجاد شده در سوسپانسیون سلولی مورد مطالعه ایفاکند. در گذشته سولفید هیدروژن (H2S) بعنوان ترکیبی سمی برای گیاهان شناخته‌می‌شد، اما در حال‌حاضر بدلیل عملکردهای متنوع آن در تنظیم جنبه‌های مختلف رشد گیاهان، بعنوان یک سیگنال‌دهنده قابل‌توجه درنظر گرفته می‌شود (36). در ارتباط با درصد سلول‌های رشدیافته در این پژوهش نیز از هفته‌ی دوم افزایش رشد سلولی نسبت به شاهد مشاهده‌شد. سلول‌های گیاهی در سوسپانسیون ممکن است به مرحله رشد فعال برسند و تقسیم‌سلولی بیشتری را تجربه‌کنند. این تقسیم سلولی منجر به افزایش درصد سلول‌های رشدکرده می‌شود. هم‌چنین بهینه‌سازی عواملی مانند حرارت، رطوبت، محیط‌کشت و ترکیب‌غذایی می‌تواند رشد سلول‌ها را تحت تأثیر قرارداده و افزایش درصد سلول‌های رشدکرده را تسریع‌کند. در طول دو هفته اول، سلول‌هایی که توانایی رشد و تقسیم بیشتری دارند، ممکن است به برتری در محیط‌کشت برسند و تعداد آن‌ها افزایش‌ یابد، که در نتیجه درصد سلول‌های رشد کرده افزایش می‌یابد. در کشت سوسپانسیون سلولی گیاه تنباکو (Nicotiana tabacum L.) استفاده از تیمار سدیم هیدروژن‌سولفید بطور قابل‌توجهی درصد بقای سلول‌های کشت‌شده در سوسپانسیون این گیاه که تحت تنش گرمایی بودند و توانایی رشد مجدد پس از تنش گرمایی افزایش‌داد تجمع مالون دی آلدئید (MDA) را کاهش داد (24).

 در ارتباط با مطالعه فیتوشیمی تاثیر سدیم  هیدروژن‌سولفید بر کشت سوسپانسیون گیاه شاهدانه میزان آنزیم‌های کاتالاز و پراکسیداز نسبت به شاهد افزایش داشتند در حالی‌که میزانPAL  نسبت به شاهد کاهش نشان‌داد. کاتالاز و پراکسیداز آنزیم‌هایی هستند که در تجزیه گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) در سلول‌های گیاهی نقش دارند. آن‌ها نقش مهمی در سم‌زدایی ترکیبات مضر و محافظت از سلول‌ها از آسیب اکسیداتیو دارند. از سوی دیگر PAL  یک آنزیم درگیر در مسیر فنیل‌پروپانوئید می‌باشد که منجر به تولید متابولیت‌های ثانویه مختلف از جمله ترکیبات فنلی می‌شود. هنگامی که سلول‌های گیاهی تحت تاثیر فشار و یا آسیب قرار می‌گیرند، مانند آسیب مکانیکی، پاتوژن‌ها و یا عوامل محیطی، اغلب با افزایش فعالیت کاتالاز و پراکسیداز پاسخ می‌دهند. این افزایش بخشی از مکانسیم دفاعی گیاه در برابر تنش اکسیداتیو است. ROS می‌تواند در سلول‌های گیاهی تحت شرایط تنش انباشته شود و کاتالاز وپراکسیداز به تجزیه این ROS به ترکیبات بی‌ضرر کمک می‌کند و در نتیجه آسیب اکسیداتیو سلول‌ها را کاهش می‌دهد. در مقابل فعالیت PAL ممکن است در کشت سوسپانسیون سلولی تحت شرایط تنش کاهش یابد. کاهش فعالیت PAL اغلب با کاهش مسیر فنیل‌پروپانوئید همراه است. این مسیر مسئول سنتز متابولیت‌های ثانویه مختلف از جمله لیگنین، فلاونوئیدها و فیتوالکسین‌ها است که در پاسخ دفاعی سلول نقش دارند. در شرایط تنش‌زا، سلول ممکن است به‌جای سرمایه‌گذاری در تولید متابولیت‌های ثانویه منابع را به سمت مکانسیم‌های دفاعی فوری، مانند حذف ROS، الویت‌بندی کند. در نتیجه فعالیت PAL ممکن است به منظور هدایت منابع متابولیک به سمت سایر فرآیندهای مرتبط با دفاع گیاه کاهش یابد. کاربرد سدیم  هیدروژن‌سولفید با افزایش متابولیت­های ثانویه، تنظیمات اسمزی، و فعالیت آنتی‌اکسیدانی اثر منفی آبیاری کم را بر صفات رشد گیاه تاج‌خروس (Amaranthus tricolor) کاهش‌ می‌دهد (31). سدیم هیدروژن‌سولفید بعنوان دونر سولفید هیدروژن یک مولکول سیگنال‌دهنده جدید است که در رشد و نمو گیاهان و پاسخ آن‌ها به به شرایط تنش نقش‌دارد (25). در گیاه کدوسبز (Cucurbita pepo L.) تحت تاثیر تنش نیکل محلول‌پاشی با NaHS (100 میکرومولار) و CaCl2 (15 میلی مولار) به‌تنهایی یا ترکیبی پارامترهای رشد و محتوای کلروفیل a، b و کاروتنوئیدها را در شرایط بدون تنش و تنش نیکل بهبود بخشید. محلول‌پاشی برگ با NaHS و CaCl2 و به‌ویژه کاربرد ترکیبی آنها باعث کاهش تجمع نیکل در ریشه و اندام‌هوایی، کاهش جذب نیکل و مقادیر فاکتور جابجایی در گیاهان و افزایش فعالیت کاتالاز در برگ‌ها شد. محلول‌پاشی با NaHS باعث بهبود هموستاز مواد مغذی درشت و ریز (N، P، K، Ca، Mg، Fe، و Cu) در ریشه و اندام هوایی، افزایش محتوای پروتئین کل و افزایش فعالیت نیترات‌ردوکتاز شد. بنابراین در این شرایط سدیم  هیدروژن‌سولفید نه تنها استرس اکسیداتیو را کاهش می‌دهد، بلکه به حفظ هموستاز مواد مغذی و کارایی متابولیسم نیتروژن در گیاهان کمک می‌کند (35).

تیمار با NaHS همچنین منجر به القای وابسته به دوز فنیل‌آلانین آمونیالیاز ، تولید اسیدهای فنولیک (اسید سینامیک، اسید کوماریک، اسید فرولیک، اسید کافئیک و اسید سالیسیلیک) و تجمع اکتئوزید می‌شود که در نهایت منجر به افزایش ظرفیت آنتی‌اکسیدانی در گیاه Scrophularia striata می‌شود. تعدیل محتویات قندهای محلول شامل گلوکز، مانوز و رامنوز/گزیلوز، پس از تیمار با NaHS رخ داد که احتمالا بدلیل فعالیت بیولوژیکی و اثرات ساختاری، تحمل گیاه را افزایش می‌دهد (23). گزارش شده‌است که تیمار پس از برداشت با H2S از رسیدن و پیری میوه‌های اقلیمی و غیراقلیمی جلوگیری می‌کند. این اثرات به کاهش تجمع ROS و افزایش فعالیت‌ سیستم‌های آنتی‌اکسیدانی، احتمالا به مهار سنتز اتیلن و/یا سیگنال‌دهی، تعدیل متابولیسم قند و کنترل فرآیندهای اتوفاژیک نسبت داده می‌شود (42). وجود آنتی‌اکسیدان‌ها جهت جاروب‌کردن رادیکال‌های آزاد، دادن هیدروژن و جمع‌آوری اکسیژن یکتایی به جهت جلوگیری از تخریب سلول امری حیاتی است تا از ایجاد اختلال در روند فعالیتی سلول‌ها، جلوگیری کند (1).

 H2S در دوزهای بالا  تعادل  یونی،  تنفس  میتوکندری  و

بیان‌ژن، سلول‌های گیاهی را مختل می‌کند و منجر به کاهش رشد، کلروز، نکروز و استرس اکسیداتیو می‌شود (41). با این‌حال، می‌تواند بعنوان یک مولکول سیگنال‌دهنده در گیاهان عمل‌کند و پاسخ آن‌ها به تنش‌های مختلف را در مقادیر کم تعدیل نماید (7)

سدیم  هیدروژن‌سولفید سبب کاهش فعالیت آنزیم فنیل‌آلانین آمونیالیاز (PAL)، افزایش عملکرد آنزیم‌های کاتالاز و پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز گردیده و سبب از بین‌رفتن گونه‌های اکسیژن فعال می‌شود که تمام این‌ها پایداری غشای‌سلولی را حفظ می‌کند (20) که این گزارش با پژوهش انجام‌گرفته مطابقت‌دارد. نتایج حاصل از این پژوهش نیز نشان‌دهنده افزایش شدید میزان پرولین در شرایط استفاده از الیسیتور سدیم  هیدروژن‌سولفید می‌باشد. پرولین در گیاهان بعنوان یک ماده تنظیم اسمزی برای مقاومت در برابر تنش خارجی، هنگامی که گیاهان تحت تنش غیرزیستی قرار می‌گیرند به سرعت تجمع می‌یابد و در نتیجه آسیب ناشی از تنش را کاهش می‌دهد (40) در پژوهش صورت‌گرفته کاهش میزان فنل نسبت به شاهد بدست آمد که این امر می‌تواند در تولید میزان متابولیت‌های مورد مطالعه موثر باشد. ترکیبات فنلی معمولا به واکنش‌های دفاعی در گیاه مربوط می‌شوند. با این‌حال، متابولیت‌های فنولیک نقش مهمی در سایر فرآیندها از جمله پیش‌ساز متابولیت‌های ثانویه دارد (26). با مطالعه تاثیر سدیم  هیدروژن‌سولفید بر کشت سوسپانسیون گیاه ژینکو (Ginkgo biloba L.) محققان به این نتیجه رسیدند که تیمار دوز بالای این الیسیتور (mM3) به مدت 7 روز سبب کاهش رشد سلول‌ها می‌گردد درحالی‌که تیمار سلول‌ها با دوز پایین (mM1) و به مدت یک روز سبب افزایش آلکالوئیدهای این گیاه می‌گردد. این نتیجه با نتایج ذکرشده در این پژوهش جهت تولید آلکالوئیدهای گیاه شاهدانه از طریق کشت سوسپانسیون سلولی مطابقت نداشت (28). در تحقیقات انجام‌شده در ارتباط با تاثیر سدیم  هیدروژن‌سولفید بر گیاه کلم (Brassica oleracea) به این نتیجه دست یافتند که سطوح پایین تیمار باعث افزایش کاروتنوئیدها، آنتوسیانین‌ها، فلاونوئیدها، فنل کل و سینیگرین در گیاه شد (32).

نتیجه‌گیری

در این پژوهش تاثیر سه تیمار سدیم ‌هیدروژن‌سولفید بر فاکتورهای فیتوشیمی، فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی  در سوسپانسیون سلولی گیاه شاهدانه مورد بررسی قرارگرفت. نتایج نشان‌داد که درصد زنده‌مانی سلول از هفته دوم در تیمار mg/L100 و mg/L150 نسبت به شاهد افزایش‌داشت. هم‌چنین میزان آنزیم کاتالاز وپراکسیداز در تمامی تیمارهای مورد استفاده نسبت به شاهد کاهش داشت که بدلیل ایجاد تنش اکسیداتیو و تنظیم متابولیسم سلولی در سوسپانسیون مورد مطالعه بود. از طرفی میزان آلکالوئیدهای هدف تحت تاثیر غلظت‌های مورد مطالعه سدیم ‌هیدروژن‌سولفید افزایش نیافت که می‌تواند به‌علت اختلال در متابولیسم، ایجاد سمیت توسط این الیسیتور در محیط‌کشت سوسپانسیون سلولی و یا رقابت با سایر مسیرهای تولید متابولیت‌های موجود در سوسپانسیون هدف باشد. بنابراین پیشنهاد می‌گردد از غلظت‌های دیگر سدیم هیدروژن‌سولفید و القاکننده‌های دیگر جهت تولید آن‌ آلکالوئیدها در سوسپانسیون سلولی گیاه شاهدانه استفاده‌گردد.

1.                   آرمند، ن.، مروتی، ح.1401. ارزیابی فعالیت آنتی باکتریال، آنتی‌قارچی، آنتی‌اکسیدانی و شناسایی ترکیبات شیمیایی اسانس گیاه داروئی  Narcissus tazetta L.بومی بهبهان. مجله پژوهش‌های گیاهی (مجله زیست‌شناسی ایران).جلد 35، شماره 4، 1401.           
2.                   آروین، پ.، فیروزه، ر. 1402. بررسی فیتوشیمیایی و فعالیت آنتی اکسیدانی ریشه، برگ و میوه گیاه کور (Capparis spinosa L.) در دو رویشگاه در استان خراسان شمالی. مجله پژوهش‌های گیاهی (مجله زیست‌شناسی ایران).جلد 36، شماره 4، 1402.
3.                   ایرانبخش، ع.، اوراقی اردبیلی، ز.، 1393. اصول، مفاهیم و روش‌های آزمایشگاهی در زیست‌شناسی گیاهی.
4.                   موحدی، م.، قاسمی عمران، و.، ترابی، س.، 1395. کالوس‌زایی و اندام‌زایی گیاه دارویی شاهدانه (Cannabis sativa L.) در شرایط درون شیشه‌ای. دو ماهنامه علمی-پژوهشی تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، جلد32 شماره 5، ص 769- 758.
 
5.     Abedini, M., Iranbakhsh, A., Saadatmand, S., Ebadi, M., Oraghi Ardebili, Z. 2024 Low UV radiation influenced DNA methylation, gene regulation, cell proliferation, viability, and biochemical differentiation in the cell suspension cultures of Cannabis indica Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, Volume 254,2024,112902, ISSN 1011-1344.
6.     Abeles FB. and Biles CL., 1991, Characterization of Peroxidases in Lignifying Peach Fruit Endocarp,Plant Physiol. (1991) 95, 269-273, DOI: 10.1104/pp.95.1.269.
7.     Arif, Y., Hayat, Sh., Yusuf, M., Bajguz, A. 2021. Hydrogen sulfide: A versatile gaseous molecule in plants, Plant Physiology and Biochemistry, Volume 158, 2021, Pages 372-384, ISSN 0981-9428.
8.     Arya, S.S., Rookes, J.E., Cahill, D.M., Lenka, S.K. 2020. Next-generation metabolic engineering approaches towards development of plant cell suspension cultures as specialized metabolite producing biofactories. Biotechnol. Adv. 2020, 45, 107635.
9.     Bates LS., Walrow, RP. and Teare ID., 1973, Rapid determination of free proline for water stress studies. Plant Soil 39:205-208.
10.  Beaudoin-Eagan LD, Thorpe, TA. 1985. Tyrosine and Phenylalanine Ammonia Lyase Activities during Shoot Initiation in Tobacco Callus Cultures. Plant Physiol. 1985 Jul;78(3):438-41. doi: 10.1104/pp.78.3.438. PMID: 16664262; PMCID: PMC1064755.
11.  Darigh, F., Iranbakhsh, A., Ardebili, Z.O., Ebadi, M. 2022. Non‑thermal plasma improved callogenesis performance and elicited the production of cannabinoids by modifying DNA methylome, expression of WRKY1 and ERF1B transcription factors, and expression of genes that contributed to the biosynthesis of cannabinoids.
12.  Dhindsa, RS., Dhindsa, PP., Thorpe TA.1981. Leaf Senescence: Correlated with Increased Levels of Membrane Permeability and Lipid Peroxidation, and Decreased Levels of Superoxide Dismutase and Catalase, Journal of Experimental Botany, Volume 32, Issue 1, February 1981, Pages 93–101.
13.  Ferreira, I. 2018. Studies on the development of callus cultures of Cannabis sativa L. regardin. Instituto Superior Técnico, Lisboa, Portugal.
14.  Francisco, J. Corpas José, M. Palma. 2020. H2S signaling in plants and applications in agriculture.Journal of Advanced Research 24 (2020) 131–137.
15.  Fu, X., Liu, Sh., van Velzen, R., Stull, G., Tian, Q., Li, Y., Ryan A., Robert F., Guralnick, Heather R., Jian‐Jun Jin, K., Li, ZH., Soltis, D., Soltis, P., g Yi, T. 2023. Phylogenomic analysis of the hemp family (Cannabaceae) reveals deep cyto‐nuclear discordance and provides new insights into generic relationships. 2 Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences. Month 2022 | Volume 00 | Issue 00 | 1–21.
16.  Gandra, J., Patel, H.K., Kumar, S.A., Doma, M., Deepthi, Y., Bhalothia, P., Jalaja, N., Chimakurthy, J., Polavarapu, R., Katam, R. 2020. Metabolomic and proteomic signature of Gloriosa superba leaves treated with mercuric chloride and phenylalanine, a precursor of colchicine alkaloid. Ind. Crops Prod. 2022, 178, 114557. 
17.  Gabotti, D., Locatelli, F., Cusano, E., Baldoni, E., Genga, A., Pucci, L., Consonni, R., Mattana, M. 2019. Cell Suspensions of Cannabis sativa (var. Futura): Effect of Elicitation on Metabolite Content and Antioxidant Activity. Molecules 2019, 24, 4056.
18.  Güner, B.Ç.2024. Genome Engineering in Medicinal Plants for Improved Therapeutics. In Applications of Genome Engineering in Plants, S.K. Upadhyay (Ed.).
19.   Hall, W., Hoch, E., Lorenzetti, V. 2019. Cannabis use and mental health: risks and benefits. European Archives of Psychiatry and Clinical Neuroscience (2019) 269:1.
20.  Hu, K. D., Wang, Q., Hu, L. Y., Gao, S. P., Wu, J., Li, Y. H., 2014. Hydrogen sulfide prolongs postharvest storage of fresh-cut pears (Pyrus pyrifolia) by alleviation of oxidative damage and inhibition of fungal growth. PLoS One 9: e85524.
21.  Iranbakhsh, A., Ardebili, Z. Ardebili, N., Ghoranneviss, M., Safari, N. 2018. Cold plasma relieved toxicity signs of nano zinc oxide in Capsicum annuum cayenne via modifying gowth, differentiation, and physiology. Acta Physiologiae Plantarum, 40(8):154.
22.  Jin, J‐J., Yang, M‐Q., Fritsch PW., van Velzen R., Li D‐Z., Yi T‐S. 2020. Born migrators: Historical biogeography of the cosmopolitan family Cannabaceae. Journal of Systematics and Evolution 58: 461–473.
23.  Khodamoradi, S., Sagharyan, M., Samari, E., Sharifi, M., Changes in phenolic compounds production as a defensive mechanism against hydrogesulfide pollution in Scrophularia striata, Plant Physiology and Biochemistry, Volume 177, 2022, Pages 23-31.
24.  Li, Zh., Gong, M., Xie, H., Yang, L., Li, J. 2011. Hydrogen sulfide donor sodium hydrosulfide-induced heat tolerance in tobacco (Nicotiana tabacum L) suspension cultured cells and involvement of Ca2+ and calmodulin, Plant Science,Volumes 185–186, 2012, Pages 185-189.
25.  Lin, D., Xiao, M., Zhao, J., Li, Z., Xing, B., Li, X., Kong, M., Li, L., Zhang, Q., Liu, Y., Chen, H., Qin, W., Wu, H., Chen, S. 2016. An Overview of Plant Phenolic Compounds and Their Importance in Human Nutrition and Management of Type 2 Diabetes. Molecules. 2016 Oct 15;21(10):1374.
26.  Lin, C., Hsu, C., Yang, L., Lee, L., Fu, J., Cheng, Q., Wu, F., Hsiao, H.C., Zhang, Y., Zhang, R. 2018. Application of protoplast technology to CRISPR/Cas9 mutagenesis: from single‐cell mutation detection to mutant plant regeneration. Plant Biotechnology Journal 16, 1295-1310.
27.  Lidoy Logoño., J. 2014. In vitro cell culture of Cannabis sativa for production of cannabinoids. Universitat Autonoma de Barcelona.
28.  Lu, Jl., Hu, Yc., Chen, Y. 2024. Hydrogen sulfide promoted cell differentiation, antioxidant ability, and flavonoids accumulation in Ginkgo biloba L. suspension cells. Plant Cell Tiss Organ Cult 156, 36 (2024).
29.  Manaf, H.  Rabie, K., Abd El-Aal, M. 2016. Impact of UV-B radiation on some biochemical changes and growth parameters in Echinacea purpurea callus and suspension culture. Annals of Agricultural Sciences Volume 61, Issue 2, December 2016, Pages 207-216.
30.  Rudo Ngara, N., Ndimba, B. 2011. Mapping and characterisation of the sorghum cell suspension culture secretome. African Journal of Biotechnology Vol. 10 (2), pp. 253-266.
31.  Oraee, A., tehranifar, A. 2022. Effect of sodium hydrosulfide on physiological and morphological traits of Amaranthus tricolor under deficit irrigation. Plant Process and Function
32.  Rahmatullah, J., Asaf, S., Numan Lubna, M., Kim, K. 2021. Plant Secondary Metabolite Biosynthesis and Transcriptional Regulation in Response to Biotic and Abiotic Stress Conditions Agronomy 11, no. 5: 968.
33.  Ribeiro, I. G., Castro, T. C. de., Coelho, M. G. P., Albarello, N. 2021. Effects of different factors on friable callus induction and establishment of cell suspension culture of Hovenia dulcis (Rhamnaceae). Rodriguésia, 72, e00102020.
34.  Solís-Ramos, L.Y., Carballo, L.M., Valdez-Melara, M. 2013. Establishment of cell suspension cultures of two Costa Rican Jatropha species (Euphorbiaceae). Rev. Biol. Trop. 2013, 61, 1095–1107.
35.  Valivand, M., Amooaghaie, R. 2021. Foliar spray with sodium hydrosulfide and calcium chloride advances dynamic of critical elements and efficiency of nitrogen metabolism in Cucurbita pepo L. under nickel stress, Scientia Horticulturae,Volume 283,2021,110052, ISSN 0304-4238.
36.  Verma, T., Bhardwaj, S., Kapoor, D., Singh, J. 2024. Is H2S a lead or supporting player in plant development and growth? ISBN 9780323990356,
37.  Wang, JW., Wu, JY. 2013. Effective elicitors and process strategies for enhancement of secondary metabolite production in hairy root cultures. Adv Biochem Eng Biotechnol. 2013; 134:55-89.
38.  Wardill, H.R., Wooley, L.T., Bellas, O.M. 2023. Supporting gut health with medicinal cannabis in people with advanced cancer: potential benefits and challenges. Br J Cancer.
39.  Wen, D., Guo, Q., Zhao, W. 2023. Effect and mechanism of NaHS on tobacco bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum. Sci Rep 13, 2462 (2023).
40.  Zhang, P., Chao, R., Qiu, L., Ge, W., Liang, J., Wen, P. 2024. ChaWRKY40 Enhances Drought Tolerance of ‘Dawei’ Hazelnuts by Positively Regulating Proline Synthesis. Forests 15, no. 3: 407.
41.  Zhou, M., Zhang, J., Shen, J., Zhou, H., Zhao, D., Gotor, C. 2021. Hydrogen sulfide-linked persulfidation of ABI4 controls ABA responses through the transactivation of MAPKKK18 in arabidopsis. Mol. Plant 14, 921–936.
42.  Ziogas, V., Molassiotis, A., Fotopoulos, V., Tanou, G. 2018. Hydrogen sulfide: a potent tool in postharvest fruit biology and possible mechanism of action. Front Plant Sci 9: 1–9.
Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 39, Issue 2
Spring 2026
Pages 117-133

  • Receive Date 22 June 2024
  • Revise Date 12 January 2025
  • Accept Date 25 January 2025