القاء نوساقه ‏زایی درون شیشه ‏ای در خربزه (Cucumis melo L.)

فرضی فرد کامبلاش, ولی; معینی, احمد; کریمی آشتیانی, راحله; ثابت, محمد صادق

القاء نوساقه ‏زایی درون شیشه ‏ای در خربزه (Cucumis melo L.)

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

ولی فرضی فرد کامبلاش ¹

احمد معینی ²

راحله کریمی آشتیانی ³

محمد صادق ثابت ⁴

¹ دانشگاه تربیت مدرس

² هیئت علمی/داشگاه تربیت مدرس

³ ایران، تهران، دانشگاه تربیت مدرس، پردیس کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی

⁴ ایران، تهران، ، دانشگاه تربیت مدرس، پردیس کشاورزی، گروه ژنتیک و به&rlm; نژادی گیاهی

چکیده

توانایی باززایی گیاه یکی از مراحل اصلی دستورزی‏های ژنتیکی گیاهان است، به طوری که تولید گیاهان تراریخت بدون داشتن یک دستورالعمل مناسب باززایی امکان‏پذیر نیست. در این تحقیق، اثرات سن ریزنمونه (لپه‏ای) و ترکیب هورمونی روی باززایی نوساقه در خربزه رقم Minoo 095p بررسی شدند. برای این منظور، ابتدا بذرهای بدون پوسته سترون شده و سپس در محیط کشت جامد ½ MS رشد داده شدند. از لپه دانه رست‏های دو، چهار و هشت روزه برای تهیه ریزنمونه استفاده شد. همه ریزنمونه‌ها در ترکیب هورمونی مبتنی بر BAP (6- بنزیل آمینو پورین) با چهار سطح (0، 25/0، 50/0 و mg l-1 1) و IAA (ایندول-۳-استیک اسید) با دو سطح (0 و mg l-1 01/0) کشت شدند. صفات تعداد پریموردیوم نوساقه و تعداد نوساقه بعد از شش هفته بررسی شدند. نتایج نشان داد که اثر متقابل سن لپه و ترکیب هورمونی، تاثیر معنی‏داری روی صفات تعداد پرریموردیوم نوساقه و تعداد نوساقه داشت. همچنین مقایسه میانگین نشان داد که ترکیب تیماری K3 (کشت ریزنمونه دو روزه در ترکیب هورمورنیBAP mg l-1 5/0 و IAA mg l-1 01/0) بهترین نتیجه را برای صفات تعداد پریموردیوم نوساقه (2/6 پریموردیوم در هر ریزنمونه) و تعداد نوساقه (87/3 نوساقه در هر ریزنمونه) داشت. نتایج به دست آمده از این پژوهش می‏تواند گام موثری در راستای دست‏ورزی ژنتیکی خربزه رقم Minoo 095p باشد.

کلیدواژه‌ها

باززایی گیاه

ریزنمونه لپه&‌‌rlm

ای

پریموردیوم نوساقه

6- بنزیل آمینو پورین

ایندول-۳-استیک اسید

موضوعات

کشت بافت

عنوان مقاله English

In Vitro Shoot Induction in Persian melon (Cucumis melo L.)

نویسندگان English

Vali Farzifard-Kambelash ¹

Ahmad Moieni ²

Raheleh Karimi-Ashtiyani ³

Mohammad Sadegh Sabet ⁴

¹ Tarbiay Modares University

² Department of Plant Genetics and Breeding, College of Agriculture, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran

³ Department of Plant Biotechnology, College of Agriculture, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran

⁴ Department of Plant Genetics and Breeding, College of Agriculture, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran

چکیده English

Plant regeneration is one of the main stages of genetic manipulation, so that the production of transgenic plant is impossible without optimizing shoot regeneration protocol . In the present survey, the effects of the explant age (cotyledon) and hormone combination on shoot regeneration in Cucumis melo subsp. melo group inodorus var. Minoo 095p were investigated. For this purpose, decoated seeds were surface sterilized and cultured in half strength of MS medium. Two-, four- and eight-days old cotyledons were used for explant preparation. All cotyledonary explants were cultured in hormonal combinations of BAP (6-benzylaminopurine) with four levels (0, 0.25, 0.50, and 1.00 mg l-1) and IAA (indole-3-acetic acid) with two levels (0 and 0.01 mg l-1). The number of shoot primordia and shoots was evaluated after 6 weeks. The results showed that, the interaction of cotyledon age and hormone combination was significant on the number of shoot primordia and shoots . Besides, the mean comparison showed that, the combination treatment K3 (two-days old cotyledonary explants cultured in a hormone combination of 0.5 mg l-1 BAP and 0.01 mg l-1 IAA) was the most effective treatment for shoot primordium (6.2 primordia per explant) and shoot regeneration (3.87 shoots per explant). The obtained results can be used in the genetic manipulation programs of Persian melon.

کلیدواژه‌ها English

plant regeneration

cotyledonary explant

shoot primordium

6-Benzylaminopurine

and Indole-3-acetic acid

القاء نوساقه‏زایی درون شیشه‏ای در خربزه (Cucumis melo L.)

ولی فرضی‏فرد کامبلاش¹، احمد معینی^1*، راحله کریمی آشتیانی^2*و محمد صادق ثابت¹

¹ ایران، تهران، دانشگاه تربیت مدرس، پردیس کشاورزی، گروه ژنتیک و به‏نژادی گیاهی

² ایران، تهران، دانشگاه تربیت مدرس، پردیس کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی

تاریخ دریافت: 28/04/1402 تاریخ پذیرش: 28/06/1402

چکیده

توانایی باززایی گیاه یکی از مراحل اصلی دستورزی‏های ژنتیکی گیاهان است، به طوری که تولید گیاهان تراریخت بدون داشتن یک دستورالعمل مناسب باززایی امکان‏پذیر نیست. در این تحقیق، اثرات سن ریزنمونه (لپه‏ای) و ترکیب هورمونی روی باززایی نوساقه در خربزه رقم Minoo 095p بررسی شدند. برای این منظور، ابتدا بذرهای بدون پوسته سترون شده و سپس در محیط کشت جامد ½ MS رشد داده شدند. از لپه دانه رست‏های دو، چهار و هشت روزه برای تهیه ریزنمونه استفاده شد. همه ریزنمونه‌ها در ترکیب هورمونی مبتنی بر BAP (6- بنزیل آمینو پورین) با چهار سطح (0، 25/0، 50/0 و mg l^-1 1) و IAA (ایندول-۳-استیک اسید) با دو سطح (0 و mg l^-1 01/0) کشت شدند. صفات تعداد پریموردیوم نوساقه و تعداد نوساقه بعد از شش هفته بررسی شدند. نتایج نشان داد که اثر متقابل سن لپه و ترکیب هورمونی، تاثیر معنی‏داری روی صفات تعداد پرریموردیوم نوساقه و تعداد نوساقه داشت. همچنین مقایسه میانگین نشان داد که ترکیب تیماری K3 (کشت ریزنمونه دو روزه در ترکیب هورمورنیBAP mg l^-1 5/0 و IAA mg l^-1 01/0) بهترین نتیجه را برای صفات تعداد پریموردیوم نوساقه (2/6 پریموردیوم در هر ریزنمونه) و تعداد نوساقه (87/3 نوساقه در هر ریزنمونه) داشت. نتایج به دست آمده از این پژوهش می‏تواند گام موثری در راستای دست‏ورزی ژنتیکی خربزه رقم Minoo 095p باشد.

واژه‏های کلیدی: 6-بنزیل آمینو پورین، ایندول-۳-استیک اسید، باززایی گیاه، پریموردیوم نوساقه، ریزنمونه لپه‏ای

* نویسندگان مسئول، پست الکترونیکی: moieni_a@modares.ac.ir و r.karimi@modares.ac.ir

مقدمه

کدوییان (Cucurbitaceae) شامل 118 جنس و 825 گونه است که عمدتاً در مناطق گرمسیری و نیمه‌گرمسیری پراکنده می‏باشند (14 و 25). گیاهان تیره مذکور از نظر ریخت‌شناسی مشابه یکدیگر بوده که می‏تواند بیانگر قرابت‏های ژنتیکی بین گیاهان این تیره باشد (18). برخی از با ارزش‏ترین محصولات جهان از جمله ملون (Cucumis melo L.)، خیار (Cucumis sativus L.)، هندوانه (Citrullus lanatus Thunb) و انواع کدوها (zucchini) به این تیره تعلق دارند.

ملون (خربزه، طالبی، گرمک، دستنبو) گیاهی یک‌ساله،

دگرگشن (Cross-pollinated) و دیپلویید بوده و دارای 27427 ژن می‏باشد (10). این گونه داری دو زیرگونه melo (Cucumis melo subsp. melo) و agrestis (Cucumis melo subsp. agrestis) و شامل 19 گروه است (21). بیشتر ارقام تجاری ملون‏ در ایران به دو گروه Inodorus و Cantalupensis تعلق دارند (19). ملون دارای سه نوع گل شامل گل نر، گل ماده و گل کامل بوده که هر سه نوع ممکن است روی یک گیاه وجود داشته باشند. ملون‏های ایرانی به نوع andromonoecious تعلق داشته به این معنی که در آن‌ها گل نر و گل کامل روی یک بوته قرار دارند.. منشأ ملون‏ آفریقا است و امروزه اجداد وحشی این گیاه هنوز در همان قاره حضور دارند (15). ترکیه، آسیای جنوب غربی و استرالیا مراکز تنوع ثانویه این گیاه هستند (24). در سال 1399، سطح زیر کشت ملون و میزان تولید آن در ایران به ترتیب برابر با 70000 هکتار و 71/1 میلیون تن بوده است (3).

ملون علاوه بر اهمیت کشاورزی، به دلیل مدت زمان کوتاه تولید و تنوع فنوتیپی بسیار بالا به ویژه در خصوصیات میوه (از جمله اندازه، رنگ، شکل، طعم و بافت)، یک گونه مناسب برای مطالعات ژنتیکی و مولکولی محسوب می‌شود (9 و 30). از طرف دیگر، افزایش تقاضا برای این محصول مستلزم بهبود ویژگی‏هایی از جمله مقاومت به آفات و بیماری‏های گیاهی، رسیدگی هم‏زمان میوه، زودرسی و درصد قند بالا در میوه است. دستیابی به صفات مذکور از طریق روش‏های مختلف اصلاحی مانند روش‏های کلاسیک اصلاح نباتات و همچنین مهندسی ژنتیک امکان‌پذیر است. استفاده از تلاقی‏های بین‏گونه‏ای و بین‏جنسی به منظور افزایش تنوع ژنتیکی و بهره‏وری از آن در اصلاح کلاسیک ملون، محدودیت‏های زیادی دارد (20). مهندسی ژنتیک می‏تواند برای تولید سریع و کارآمد ویژگی‏های ذکر شده مورد استفاده قرار گیرد. بهره‏برداری از روش‏های دستورزی ژنتیکی نیازمند توانایی باززایی گیاهان از ریزنمونه‏های تلقیح شده که این مهم با استفاده از فنون کشت بافت امکان‏پذیر است.

یکی از موانع استفاده از ملون به عنوان گیاه مدل برای مطالعات ژنتیکی، فقدان روش‏های باززایی کارآمد و پایدار گیاه است (27). کارایی باززایی در ملون به میزان زیادی تحت تاثیر عوامل مختلفی از جمله ژنوتیپ، منبع ریزنمونه، عامل ژلی محیط کشت، نوع هورمون و غلظت آن‌ها است (28). با افزودن تنظیم کننده‏های رشد گیاهی، سلول‏های سوماتیک دوباره برنامه‏ریزی کرده و بافت‏ها و اندام‏های جدید را به وجود می‏آورند. تغییر نسبت سیتوکینین به اکسین خارجی می‏تواند به نفع یک الگوی رشدی (ریشه‏زایی، نوساقه‏زایی و کالوس‏زایی) باشد. هورمون سیتوکینین BAP (6-benzylaminopurine) و اکسین IAA (Indole-3-acetic acid) رایج‌ترین ترکیب هورمونی مورد استفاده در باززایی ملون بوده‏اند (8 و 12). در این بررسی‌ها، سطح بهینه نوساقه‏زایی در حضور BAP mg l^-1 5/0 و IAA mg l^-1 01/0 به‏دست آمد. باززایی نوساقه از ریزنمونه‏های لپه، هیپوکوتیل، پروتوپلاست و ریشه یا برگ در طیف وسیعی از گونه‏های ملون گزارش شده است (2، 6، 7، 12، 15، 27 و 33). معمولاً در مطالعات باززایی و انتقال ژن در ملون از ریزنمونه‏های‏ لپه‏ای استفاده می‏کنند (8 و 12). با این حال، نرخ باززایی نوساقه در ملون پایین بوده که نیازمند بهینه‏سازی است. علاوه بر نرخ پایین باززایی نوساقه، ایجاد گیاهان تتراپلویید از باززایی ریزنمونه‏های دیپلویید، باززایی گیاهان غیرتراریخت به دلیل پدیده فرار و ایجاد تنوع سوماکلونال از مهم‌ترین عوامل محدودکننده دستورزی ژنتیکی ملون هستند (5، 11، 21 و 23). جهت بهینه‏سازی باززایی در ملون، استفاده از ریزنمونه لپه‏ای (ترجیحا قسمت پایین لپه) در سنین پایین و ترکیب هورمونی BAP و IAA پیشنهاد شده است (5، 8 و 12). پژوهش حاضر، با هدف بررسی اثرات سن ریزنمونه لپه‏ای و ترکیب هورمونی روی بهینه‏سازی نوساقه‏زایی در گیاه خربزه رقم Minoo 095p، انجام شد.

مواد و روشها

مواد گیاهی و تهیه ریزنمونه: در این تحقیق، از بذور خربزه رقم Minoo 095p (Cucumis melo subsp. melo Group inodorus var. Minoo 095p) تهیه شده از شرکت زیست فناور سبز، استفاده شد (شکل 1، A). ابتدا پوسته بذر حذف شده (شکل 1، B) و سپس بذور بدون پوسته در شرایط لامینار ایرفلو سترون شدند. برای سترون کردن، ابتدا از الکل 70% به مدت 30 ثانیه و سه مرحله آبشویی با آب مقطر سترون و سپس از محلول وایتکس (هیپوکلریت سدیم) 20% (حجمی/حجمی) به مدت 10 دقیقه و چهار مرتبه آبشویی استفاده شد (شکل 1، C). بذور بدون پوسته در محیط کشت MS ½ (16) حاوی g l^-1 15 شکر و g l^-1 7 آگار-آگار کشت شدند (شکل 1، D). تمام محیط‏های کشت در دمای 121 درجه سلسیوس با فشار 2/1 بار به مدت 20 دقیقه اتوکلاو شدند. pH محیط‏های کشت قبل از اتوکلاو، روی 7/5 تنظیم شد. کشت‏ها در اتاق رشد کنترل شده با دمای 25 درجه سلسیوس و در شرایط تاریکی به مدت 48 ساعت نگهداری شدند. سپس کشت‏ها تا روز هشتم به شرایط 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی منتقل شدند.

شکل 1. مراحل آماده‏سازی بذور، سترون کردن و رشد در محیط کشت MS ½ جهت تهیه ریزنمونه لپه‏ای. A) بذر کامل، B) بذر بدون پوسته، C) ضدعفونی کردن بذور بدون پوسته، D) کشت بذرها در محیط کشت MS ½

کشت ریزنمونه‏ها: در مرحله اول آزمایش، از ریزنمونه‏های لپه‏ای دو روزه، در مرحله دوم از لپه‏هایی با سن چهار روز و در مرحله سوم از لپه‏هایی با سن هشت روز استفاده شد (شکل 2، A-C). برای تهیه ریزنمونه‏های لپه‏ای، ابتدا اطراف لپه‏ها با استفاده از تیغ مخصوص (اسکالپل) بریده و سپس یک سوم ابتدای برگ لپه‏ای (بخش I) به عنوان ریزنمونه استفاده شد. در هر سه سن لپه، لپه‏ها از هم جدا بوده و از هر بذر دو ریزنمونه از یک سوم بخش ابتدای هر لپه تهیه شد. ریزنمونه‏ها در 12 ترکیب تیماری (جدول 1) در محیط کشت پایه MS حاوی g l^-1 30 شکر، g l^-17 آگار-آگار با 7/5= pH کشت شده و سپس در اتاق رشد با دمای 25 درجه سلسیوس و دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی نگهداری شدند. زیرکشت کردن ریزنمونه‏ها به فواصل هر دو هفته در محیط کشت جدید با همان ترکیب تیماری انجام شد. در هر ظرف شیشه مربا (به حجم 300 میلی‏لیتر، با قطر 9 و ارتفاع 11 سانتی‏متر) و حاوی 50 میلی‏لیتر محیط کشت، پنج ریزنمونه‏ کشت شدند.

صفات مورد مطالعه: بعد از شش هفته از زمان کشت، داده‏برداری برای دو صفت تعداد پریموردیوم نوساقه و تعداد نوساقه‏ها در هر ریزنمونه انجام شد. پریموردیوم، گروهی از سلول‌ها با سازمان خاصی که قادر به تولید کل اندام می‏باشد. منشاء پریموردیوم نوساقه از مریستم انتهای ساقه بوده و اندازه آن 3-1 میلی‏متر است (17). نوساقه‏هایی که در اندازه 5 میلی‏متر و بیشتر بودند، از ریزنمونه مادری جدا شده و در محیط کشت جامد E20A (27) جهت تکثیر و ریشه‏دار شدن کشت شدند (شکل 2، G). برای سازگاری گیاهان ریشه‏دار شده، پس از شستشو و حذف آگار اضافی از روی ریشه، آنها را به گلدان‏های پلاستیکی شماره 10 حاوی پرلیت-پیت ماس (1:1) انتقال داده و جهت حفظ رطوبت با پلاستیک شفاف پوشانده شدند. رطوبت گیاهچه‏ها به تدریج در طی دو هفته به شرایط محیطی رسانده شد. (شکل 2، I).

تجزیه و تحلیل آماری داده‏ها: تجزیه واریانس داده‏ها (ANOVA) حاصل از بررسی نوساقه‏زایی مستقیم در آزمایش فاکتوریل با دو فاکتور سن ریزنمونه در سه سطح (دو، چهار و هشت روزه) و ترکیب هورمونی BAP و IAA در چهار سطح در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی در سه تکرار انجام شد. هر ظرف کشت (شیشه مربا) حاوی پنج عدد ریزنمونه به عنوان یک تکرار در نظر گرفته شد. تجزیه داده‏ها با استفاده از نرم افزار SASانجام شد و میانگین‏ها با استفاده از آزمـون LSD در سطح احتمال معنی داری 1% مقایسه شدند.

نتایج

کشت ریزنمونه و نوساقه‏زایی: در این تحقیق اثر ترکیب هورمونی مبتنی بر BAP و IAA روی نوساقه‏زایی ریزنمونه‏های لپه‏ای دو، چهار و هشت روزه بررسی شد (جدول 1، شکل 2). ظهور پریموردیوم‏های نوساقه از هفته سوم تا چهارم صورت گرفت (شکل 1، D). نوساقه‏ها بعد از چهار هفته از زمان کشت در محیط باززایی القاء شدند (شکل 2، E و F).

نوساقه‏های القاء شده جهت تکثیر و ریشه‏دار شدن از ریزنمونه مادری با کمک اسکالپل جدا شده و در محیط کشت E20A کشت شدند (شکل 2، F و G). بعد از دو هفته از زمان کشت در محیط E20A، نوساقه‏ها ریشه دار شدند (شکل 2، H) و سازگاری گیاهچه ها در بستر پرلیت-پیت‏ماس (1:1) به طور موفقیت‏آمیزی انجام شد (شکل 1، I).

جدول 1. ترکیب‏های تیماری مورد استفاده در بررسی نوساقه‏زایی در ریزنمونه لپه‏ای خربزه رقم Minoo 095p
کد	سن لپه (روز)	BAP (mg l^-1)	IAA (mg l^-1)
K1	2	00/ 0	00/0
K2		25/0	01/0
K3		50/0	01/0
K4		00/1	01/0
K5	4	00/ 0	00/0
K6		25/0	01/0
K7		50/0	01/0
K8		00/1	01/0
K9	8	00/ 0	00/0
K10		25/0	01/0
K11		50/0	01/0
K12		00/1	01/0

تجزیه آماری داده‏ها: نتایج تجزیه واریانس داده‏ها نشان داد که اثر متقابل سن ریزنمونه لپه‏ای و ترکیب هورمونی، تاثیر معنی‏داری (در سطح 1%) روی صفات تعداد پریموردیوم نوساقه و تعداد نوساقه داشت (جدول 2).

نتایج مقایسه میانگین تعداد پریموردیوم نوساقه نشان داد که ترکیب تیماری K3 (اثر ترکیب هورمونی BAP mg l^-1 5/0 و IAA mg l^-1 01/0 با ریزنمونه لپه‏ای دو روزه) بیشترین تعداد پریموردیوم نوساقه (2/6 پریموردیوم در هر ریزنمونه) را القاء کرد و اختلاف معنی‌داری با سایر ترکیب‏های تیماری مورد بررسی نشان داد (شکل 3). کمترین تعداد پریموردیوم نوساقه مربوط به ترکیب‏های تیماری K1، K5 و K9 بود که هیچگونه پریموردیوم نوساقه تولید نکردند (شکل 3).

شکل 2. مراحل تهیه و کشت ریزنمونه لپه‏ای در 12 ترکیب تیماری تا سازگاری گیاه‏چه‏های به دست آمده در خربزه رقم Minoo 095p. A) لپه دو روزه، B) لپه چهار روزه، C) لپه هشت روزه، D) ظهور پریموردیوم نوساقه (چهار هفته بعد از کشت)، E) رشد پریموردیوم نوساقه و باززایی نوساقه (شش هفته بعد از کشت)، F) نوساقه‏های بدست آمده (شش هفته بعد از کشت)، G) کشت نوساقه‏ها در محیط کشت E20A جامد (هفت هفته بعد از کشت)، H) نوساقه ریشه‏دار (هشت هفته بعد از کشت) و I) گیاهچه‏های درون شیشه‏ای سازگار شده (ده هفته بعد از کشت).

جدول 2. تجزیه واریانس برای صفات تعداد پریموردیوم نوساقه و تعداد نوساقه‏ها در بررسی نوساقه‏زایی مستقیم در خربزه رقم Minoo 095p
میانگین مربعات		درجه آزادی	منابع تغییرات
تعداد نوساقه	تعداد پریموردیوم نوساقه	درجه آزادی	منابع تغییرات
^**65/2	^**88/6	2	سن ریززنمونه لپه‏ای (A)
^**05/14	^**81/34	3	ترکیب هورمونی (B)
^**54/0	^**32/1	6	اثر متقابل (AB)
35/0	07/0	24	خطا
45/11	74/9	-	C.V. (%)
^{** .}معنی‏داری در سطح احتمال 1%

بیش‌ترین تعداد پریموردیوم نوساقه در همه سنین ریزنمونه در حضور BAP mg l^-1 5/0 و IAA mg l^-1 01/0 به دست آمد و با کاهش و افزایش غلظت ترکیب هورمونی، این تعداد کاهش یافت. همچنین، با افزایش سن لپه، تعداد پریموردیوم نوساقه کاهش یافت (شکل 3).

شکل 3. نمودار مقایسه میانگین صفت تعداد پریموردیوم نوساقه در هر ریزنمونه در بررسی نوساقه‏زایی مستقیم در خربزه رقم Minoo 095p.- میانگین‏های دارای حروف مشترک اختلاف معنی‏داری در سطح احتمال 1% همان ستون ندارند.

نتایج مقایسه میانگین تعداد نوساقه نیز نشان داد که ترکیب تیماری K3 (اثر ترکیب هورمونی BAP mg l^-1 5/0 و IAA mg l^-1 01/0 با ریزنمونه لپه‏ای دو روزه) بیشترین تعداد نوساقه (87/3 نوساقه در هر ریزنمونه) را القاء کرد و اختلاف معنی‌داری با سایر ترکیب‏های تیماری مورد بررسی داشت (شکل 4). همچنین، بیشترین تعداد نوساقه در حضور BAP mg l^-1 5/0 و IAA mg l^-1 01/0 به دست آمد و با کاهش و افزایش غلظت ترکیب هورمونی، تعداد نوساقه کاهش یافت. از طرف دیگر، با افزایش سن ریزنمونه لپه‏ای تعداد نوساقه کاهش یافت (شکل 4). کم ترین تعداد نوساقه مربوط به ترکیب‏های تیماری K1، K5 و K9 بود که هیچگونه نوساقه‏ای تولید نکردند (شکل 4).

شکل 4. مقایسه میانگین صفت تعداد نوساقه در هر ریزنمونه در بررسی نوساقه‏زایی مستقیم در خربزه رقم Minoo 095p.- میانگین‏های دارای حروف مشترک اختلاف معنی‏داری در سطح احتمال 1% همان ستون ندارند.

بحث و نتیجه‏گیری

همراه با تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی، عوامل مختلف کشت بافتی از جمله محیط کشت پایه، سن گیاه مادری، موقعیت منبع ریزنمونه روی گیاه، جهت قرار گرفتن ریزنمونه روی محیط کشت، تراکم ریزنمونه در هر ظرف کشت نقش مهمی در توانایی باززایی نوساقه دارند. با این حال، تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی مهم‌ترین عامل موثر بر ظرفیت باززایی نوساقه در ریزنمونه‌های مختلف بوده و تمایززدایی و تمایززایی را در مطالعات کشت بافت گیاهی کنترل می‏کنند (13). براساس نتایج به دست آمده از آزمایش‏های مقدماتی نویسندگان، ترکیب هورمونی BAP با IAA موثرترین ترکیب هورمونی قابل استفاده جهت باززایی مستقیم نوساقه در ملون بود (نتایج نشان داده نشده‏اند). این ترکیب هورمونی، در گزارش های قبلی در خصوص باززایی ملون استفاده شده است (2، 8 و 12). لذا براساس نتایج آزمایش‏های مقدماتی و نیز بررسی منابع، در این تحقیق از سطوح مختلف ترکیب هورمون‌های مذکور در سه سن لپه استفاده گردید. نتایج نشان داد که ترکیب هورمونی K3، بیشترین تعداد پریموردیوم نوساقه و تعداد نوساقه را القاء کرده است که با نتایج سایر پژوهشگران تطابق داشت (8 و 12). با این وجود، در آزمایشی، Zhang و همکاران (2011) دستیابی به بالاترین میزان القاء نوساقه در ملون را با استفاده از BAP mg l^-1 5/1 و IAA mg l^-1 1/0 گزارش کردند (34). کارایی نوساقه‏زایی به ژنوتیپ وابسته است، چنانچه نتایج آزمایش بررسی ‏نوساقه‏زایی از ریزنمونه لپه‏ای، در ارقام طالبی سمسوری و ملون جانا، نشان داد که سطح غلظت بهینه هورمون BAP برای ارقام مذکور به ترتیب mg l^-1 1 و mg l^-1 5/0 بود (نتایج نشان داده نشده‏ است). در تحقیقی، اثرات سه نوع محیط کشت A (mg l^-1 BAP 1 و IAA mg l^-1 01/0)، B (BAP mg l^-1 2/1 و IAA mg l^-1 012/0 ) و C (mg l^-1 BAP 3/1 و IAA mg l^-1 013/0) روی نوساقه‏زایی لپه‏های شش روزه سه رقم (Charenteis-T، Vedrantais و Isabelle) و سه لاین دابلد هاپلویید (NAD، DH-L2 و DH-L6) در ملون بررسی شد (28). این نتایج نیز نشان داد که نرخ باززایی بین ژنوتیپ های مختلف ملون متفاوت بوده ، به طوری که رقم Charentais-T بیشترین تعداد نوساقه در هر ریزنمونه را در محیط کشت‏های B و A (به ترتیب 4/4 و 1/4) تولید کرده، درحالی که رقم Vedrantais بیشترین تعداد نوساقه در هر ریزنمونه (4/2) را در محیط کشت C تولید کرده است که قابل مقایسه با نتایج حاصل از این تحقیق (87/3 نوساقه در هر ریزنمونه) بود. به طور کلی، نرخ باززایی در گروه inodorus و Cantalupensis نسب به سایر گروه‏های ملون از جمله reticulatus پایین‏تر گزارش شده است (4 و 20).

علاوه بر ژنوتیپ، دو عامل نوع و سن ریزنمونه‌ نیز در کارایی باززایی نوساقه در ملون تأثیر می‌گذارد. در آزمایش مقدماتی انجام گرفته در پژوهش حاضر (نتایج نشان داده نشده‏اند)، اثرات قسمت‏های مختلف لپه و برگ و نیز سن آن‏ها روی باززایی مستقیم نوساقه بررسی شدند. نتایج نشان داد که ریزنمونه لپه‏ای در سنین پایین‏تر (6-1 روزه)، بیشترین تعداد نوساقه را القاء می‏کند. ریزنمونه‏های برگی قدرت باززایی مستقیم کمی دارند و می‏توان از روش غیر مستقیم اقدام به باززایی گیاه در آن ها کرد، اگرچه در بررسی‏‏های انجام شده، باززایی غیرمستقیم نوساقه باعث ایجاد گیاهان تتراپلویید از ریزنمونه دیپلویید شده است (1، 5، 12، 20 و 23). در تحقیق دیگری، Almodóvar و همکاران (2017)، سطح بهینه نوساقه‏زایی را از ریزنمونه‏های لپه‏ای دو و سه روزه در ملون به دست آوردند (8). همچنین در گزارشی که توسط Souza و همکاران (2006) منتشر شده، اثرات ریزنمونه‏های مختلف و سن ریزنمونه در ملون مورد بررسی قرار گرفت که نتایج این مطالعه نیز نشان داد ریزنمونه لپه‏ای در سن هفت روزه بیش ترین پاسخ به اندام‏زایی را در مقایسه با سنین 1، 3 و 5 روزه داشته است که مخالف با یافته‏های تحقیق حاضر است، اگرچه غلظت ترکیب هورمونی مورد استفاده در این تحقیق (BAP mg l^-1 1 و IAA mg l^-1 5/1) متفاوت بود. همچنین، این محققین گزارش کردند که ریزنمونه‏های لپه‏ای قدرت باززایی بیشتری نسبت به ریزنمونه های برگی دارند (29). اثر نوع برش ریزنمونه (طولی یا عرضی) در ملون در تحقیقات و آزمایش‏های مقدماتی نویسندگان (تحقیق حاضر) نیز مورد بررسی قرار گرفته بود و مشخص شد که برش عرضی ریزنمونه لپه منجر به القای بیشترین نرخ باززایی نوساقه شده است (بخش I در شکل 1، A-C) که در تطابق با یافته‏های سایر محققین (5، 8، 29 و 31) بود. دلیل استفاده از قسمت پایین لپه به عنوان ریزنمونه، پتانسیل بالای نوساقه‏زایی این قسمت از لپه است. این بخش از لپه دارای بیشترین میزان اکسین داخلی می‏باشد (32).

به طور کلی، اثر متقابل ترکیب هورمونی BAP mg l^-1 5/0 و IAA mg l^-1 01/0 با سن ریزنمونه لپه‏ای دو روزه، بیشترین نرخ باززایی نوساقه را در مقایسه با سایر غلظت‏های ترکیب هورمونی در سنین متفاوت ریزنمونه لپه‏ای مورد بررسی داشت. از دستورالعمل نوساقه‏زایی حاصل از این پژوهش می توان در برنامه‏های انتقال ژن در خربزه رقمMinoo 095p بهره برد.

سپاسگزاری

این پژوهش در قالب طرح پژوهشی مصوب دانشگاه تربیت مدرس تهران در پردیس کشاورزی و حمایت‏های مالی آن انجام شده است. همچنین از تمام افرادی که در انجام این پژوهش همکاری نموده‏اند، قدردانی می‏گردد.

1- شفائی، م.، مختاری، آ.، و ابراهیمی، .، م، 1399. بررسی تأثیر نوع اکسین، جهت استقرار ریزنمونه و نور بر کالوس‌زایی و تشکیل ریشه مویین گیاه دارویی ‏خربزه تلخ(Momordica charantia)، مجله پژوهش‏های گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)، جلد 1 ، جلد، شماره 33، صفحات 106-95.

2- کبیر هاشمی، س، م.، قنبری، ع.، و کاشی، ع.، 1395. اثر تنظیم کننده‌های رشد گیاهی بر باززایی گیاهچه از پینه دو رقم خربزه (Cucumis melo L.) ایرانی به روش درون شیشه‌ای مجله پژوهش‏های گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)، جلد 1، شماره 29، صفحات 168-159.

3- https://www.maj.ir/page-amar/FA/65/form/pId3352

4- Chovelon, V., Restier, V., Giovinazzo, N., Dogimont, C. and Aarrouf, J. 2011. Histological study of organogenesis in Cucumis melo L. after genetic transformation: why is it difficult to obtain transgenic plants? Plant Cell Reports, 30(11): 2001-2011.

5- Curuk, S., Elman, C., Schlarman, E., Sagee, O., Shomer, I., Cetiner, S. and Gaba, V. 2002. A novel pathway for rapid shoot regeneration from the proximal zone of the inpocotyl of melon (Cucumis melo L.). In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant, 38: 260-267.

6- Dirks, R. and van Buggenum, M. 1989. In vitro plant regeneration from leaf and cotyledon explants of Cucumis melo L. Plant Cell Reports, 7: 626-627.

7- Ficcadenti, N. and Rotino, G. L. 1995. Genotype and medium affect shoot regeneration of melon. Plant cell, tissue and organ culture, 40: 293-295.

8- García-Almodóvar, R. C., Gosalvez, B., Aranda, M. A. and Burgos, L. 2017. Production of transgenic diploid Cucumis melo plants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 130: 323-333.

9- Garcia-Mas, J., Benjak, A., Sanseverino, W., Bourgeois, M., Mir, G., González, V. M. and Puigdomènech, P. 2012. The genome of melon (Cucumis melo L.). Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(29): 11872-11877.

10- Guis, M., Amor, M. B., Latché, A., Pech, J. C. and Roustan, J. P. 2000. A reliable system for the transformation of cantaloupe charentais melon (Cucumis melo L. var. cantalupensis) leading to a majority of diploid regenerants. Scientia Horticulturae, 84(1-2): 91-99.

11- Guis, M., Roustan, J. P., Dogimont, C., Pitrat, M. and Pech, J. C. 1998. Melon biotechnology. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 15(1): 289-312.

12- Hooghvorst, I., López-Cristoffanini, C. and Nogués, S. 2019. Efficient knockout of phytoene desaturase gene using CRISPR/Cas9 in melon. Scientific Reports, 9(1): 1-7.

13- Ikeuchi, M., Favero, D. S., Sakamoto, Y., Iwase, A., Coleman, D., Rymen, B., & Sugimoto, K. (2019). Molecular mechanisms of plant regeneration. Annual Review of Plant Biology, 70: 377-406.

14- Jeffrey, C. 1980. A review of the Cucurbitaceae. Botanical Journal of the Linnean society, 81(3): 233-247.

15- Kathal, R., Bhatnagar, S. P. and Bhojwani, S. S. 1994. Plant regeneration from the callus derived from root explants of Cucumis melo L. cv. Pusa sharbati. Plant Science, 96(1-2): 137-142.

16- Kerje, T. and Grum, M. 2000. The origin of melon, Cucumis melo: a review of the literature. In VII Eucarpia Meeting on Cucurbit Genetics and Breeding, 510: 37-44.

17- Mauseth, J. D. 2004. Giant shoot apical meristems in cacti have ordinary leaf primordia but altered phyllotaxy and shoot diameter. Annals of Botany, 94(1): 145-153.

18- Murashige, T. and Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15(3): 473-497.

19- Nimmakayala, P., Saminathan, T., Abburi, V. L., Yadav, L. K., Tomason, Y., Levi, A. and Reddy, U. K. 2017. Comparative genomics of the Cucurbitaceae. Genetics and Genomics of Cucurbitaceae, 229-240.

20- Nunez-Palenius, H. G., Gomez-Lim, M., Ochoa-Alejo, N., Grumet, R., Lester, G. and Cantliffe, D. J. 2008. Melon fruits: genetic diversity, physiology, and biotechnology features. Critical reviews in biotechnology, 28(1): 13-55.

21- Pitrat, M. 2016. Disease resistance in melon and its modification by molecular breeding techniques. Functional Genomics and Biotechnology in Solanaceae and Cucurbitaceae Crops, 175-197.

22- Raghami, M., López-Sesé, A. I., Hasandokht, M. R., Zamani, Z., Moghadam, M. R. F. and Kashi, A. 2014. Genetic diversity among melon accessions from Iran and their relationships with melon germplasm of diverse origins using microsatellite markers. Plant Systematics and Evolution, 300: 139-151.

23- Ren, Y., Bang, H., Gould, J., Rathore, K. S., Patil, B. S. and Crosby, K. M. 2013. Shoot regeneration and ploidy variation in tissue culture of honeydew melon (Cucumis melo L. inodorus). In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant, 49: 223-229.

24- Sari, N. and Solmaz, I. 2005. Fruit characterization of some Turkish melon genotypes. In III International Symposium on Cucurbits 731: 103-109.

25- Sauton, A. and Vaulx, R. D. 1987. Obtention de plantes haploïdes chez le melon (Cucumis melo L.) par gynogenèse induite par du pollen irradié. Agronomie, 7(2): 141-148.

26- Schaefer, H. and Renner, S. S. 2011. Cucurbitaceae. In: Kubitzki K, ed. Families and genera of flowering plants, vol. 10. Berlin, Germany: Springer Verlag, 112–174.

27- Sebastiani, M. S. and Ficcadenti, N. 2013. An efficient protocol for in vitro plant regeneration from cotyledon explants of different melon genotypes (Cucumis melo L. var. cantalupensis). In Abstract book: Young Researches in Life Science (YRLS) conference, Paris, May (pp. 22-24).

28- Sebastiani, M. S. and Ficcadenti, N. 2016. In vitro plant regeneration from cotyledonary explants of Cucumis melo L. var. cantalupensis and genetic stability evaluation using RAPD analysis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 124: 69-79.

29- Souza, F. V. D., Garcia-Sogo, B., Souza, A. D. S., San-Juán, A. P. and Moreno, V. 2006. Morphogenetic response of cotyledon and leaf explants of melon (Cucumis melo L.) cv. Amarillo Oro. Brazilian Archives of Biology and Technology, 49: 21-27.

30- Tekdal, D. and Cetiner, S. 2013. The effects of different combinations and varying concentrations of growth regulators on the regeneration of selected Turkish cultivars of melon. Current Progress in Biological Research. InTech, 257-276.

31- Wu, H. W., Yu, T. A., Raja, J. A., Wang, H. C. and Yeh, S. D. 2009. Generation of transgenic oriental melon resistant to Zucchini yellow mosaic virus by an improved cotyledon-cutting method. Plant Cell Reports, 28: 1053-1064.

32- Xi, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhang, X., Pan, Y. and Guo, H. 2021. IAA3-mediated repression of PIF proteins coordinates light and auxin signaling in Arabidopsis. PLoS Genetics, 17(2): e1009384.

33- Yadav, R. C., Saleh, M. T. and Grumet, R. 1996. High frequency shoot regeneration from leaf explants of muskmelon. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 45: 207-214.

34- Zhang, H., Peng, G. and Feishi, L. 2011. Efficient plant regeneration from cotyledonary node explants of Cucumis melo L. African Journal of Biotechnology, 10(35): 6757-6761.