Comparison of Physiological Changes, Aquatic Relationships and Acuoporin Gene Expressions under salinity, Drought, Flooding and heat Stresses in sweet Pepper (Capsicum annuum L. var. Ps301)

Document Type : Research Paper

Authors
Zeinab Masoumi 1
Maryam Haghighi 2
Seyed Amir Hossein Jalali 3
1 Former MSc student, Department of Horticulture, College of Agriculture, Isfahan University of Technology
2 Associate Professor, Department of Horticulture, College of Agriculture, Isfahan University of Technology
3 Department of Natural Resources, Research Institute for Biotechnology & Bioengineering, Isfahan University of Technology
10.22034/jpr.2025.2271
Abstract
Stress means changing the optimal growing conditions of the plant, which reduces growth and development. Plants are exposed to various environmental stresses. Environmental stress is one of the most important factors in reducing the yield of agricultural products, so drought, flooding, salinity and heat stress were considered as the most important abiotic stresses. Therefore, in this study, physiological, water changes and expression of aquapurine gene under drought, flood, salinity, and heat stress on the bell pepper (301Ps) were investigated. Stresses included drought stress (5-bar) by polyethylene, glycol- 6000 flooding stress by aeration and salinity stress (300 mmol) by NaCl salt and heat stress (38 C). The results showed that the highest relative water content was obtained in flood stress, the highest negative water potential was in salinity stress, and the highest expression level of aquapurine gene was in drought stress. Also, due to the applied stresses, the highest pigmented carotenoid surface was obtained in drought stress. Salinity stress also increased the amount of acetic acid in bell peppers. The results showed that in drought and flooding stress, the expression of aquapurine gene had an increasing trend. Receptor cell receptor receptors prevent cell transpiration and dehydration.

Keywords

Subjects

مقایسه تغییرات فیزیولوژیک، روابط آبی و بیان ژن آکواپورین در اثر تنش­های شوری، خشکی، غرقابی و دمایی در فلفل دلمه‌ای(Capsicum annuum L. var. Ps301)

زینب معصومی1، مریم حقیقی1 و سیدامیرحسین جلالی2

1 ایران، اصفهان، دانشگاه صنعتی اصفهان، دانشکده کشاورزی، گروه باغبانی

2 ایران، اصفهان، دانشگاه صنعتی اصفهان، دانشکده منابع طبیعی، پژوهشکده زیست فناوری و مهندسی زیستی

تاریخ دریافت: 17/03/1399          تاریخ پذیرش: 08/09/1400

چکیده

تنش به مفهوم تغییر شرایط بهینه رشدی گیاه است که موجب کاهش رشد و نمو می‌گردد.گیاهان در معرض تنش­های محیطی مختلفی قرار می‌گیرند. تنش­های محیطی یکی از مهم­ترین عوامل کاهش­دهنده عملکرد محصولات کشاورزی است بنابراین تنش‌های خشکی، غرقابی، شوری و گرما بعنوان مهم­ترین تنش­های غیر زستی مورد بررسی قرار گرفت. بنابراین در این مطالعه تغییرات فیزیولوژیکیو بیان ژن آکواپورین تحت تنش­های خشکی، غرقابی، شوری و گرما بر گیاه فلفل دلمه­ای رقم (301Ps) با شرایط غیر تنش مورد بررسی قرار گرفت. تنش‌های اعمال شده شامل تنش خشکی (5- بار) به‌وسـیله پلـی­اتـیلن گلایکـول 6000، تنش غرقابی بدون هوادهی و شوری (300 میلی­مولار) به وسیله نمک  NaClو تنش گرما ( 38 درجه سانتی­گراد) بوده است. نتایج نشان داد بیشترین میزان محتوای نسبی آب در تنش غرقابی، منفی‌ترین پتانسیل آب درتنش شوری و بیشترین سطح بیان ژن آکواپورین در تنش خشکی بدست آمد. از سوی دیگر، در اثر تنش‌های اعمال شده بیشترین سطح رنگریزه کاروتنوئید درتنش خشکی حاصل شد. همچنین تنش شوری موجب افزایش میزان اسیدآبسیزیک در گیاه فلفل دلمه­ای گردید. نتایج نشان داد که در تنش خشکی و غرقابی میزان بیان ژن آکواپورین روند افزایشی داشته است که از طریق عبور آب بیشتر از این کانال­های آبی به درون سلول موجب حفظ آب سلول شد و به نظر می رسد در تنش شوری و گرما با افزایش هورمون اسیدآبسیزیک و اتصال به گیرنده­های سلول­های محافظ روزنه از تعرق و کاهش آب سلول جلوگیری کند.

واژه های کلیدی: پتانسیل آب، فلفل دلمه‌ای، محتوای نسبی آب، ژن آکواپورین

* نویسنده مسئول، پست الکترونیکی: mhaghighi@cc.iut.ac.ir

مقدمه

 

یکی از متغیرهای آب و هوا، تنش آبی می­باشد که به­صورت افزایش یا کاهش آب بر رشد و نمو گیاهان تاثیر می­گذارد(14). فلفل­ گیاهی حساس به شوری است و آستانه تحمل به شوری آن بین 1 تا 5/1 دسی­زیمنس بر متر است و با افزایش سطح شوری به بالاتر از سطح آستانه منجر به کاهش عملکرد در گیاه می‌شود (1). به عنوان یک محصول فصل گرم، بالاترین دمای قابل تحمل برای آن دمای 35 درجه­سانتی­گراد می‌باشد. میزان آب مورد نیاز برای رشد مطلوب فلفل 300-400 لیتر در هر متر مربع می‌باشد بنابراین بروز تغییر در این شرایط موجب ایجاد اختلال در فرآیندهای مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی در این گیاه می­گردد (12). فلفل دلمه با نام علمی (Capsicum annum L.)  یکی از سبزیجات مهم تیره سیب­زمینی از اصلی­ترین گیاهانی است که در شرایط گلخانه کشت می­شود و نه تنها به­خاطر ارزش اقتصادی بلکه به­خاطر ارزش میوه­های آن و همچنین منبع عالی رنگ­های طبیعی و ترکیبات آنتی­اکسیدانی بسیار مورد توجه قرار گرفته است،   (2). مطالعات نشان داده است که وجود هریک از تنش­های شوری و خشکی، جذب آب را کاهش می­دهند و وجود هر دو باهم این کاهش را تشدید می­کند (14). با توجه به کمبود اکسیژن در شرایط تنش غرقابی تنفس به صورت بی‌هوازی  می­شود در نتیجه اکسیداسیون نهـایی تـنفس در چنین شرایطی انجام نمی‌شود و این عمل منجر به تجمـع اسـتالدئید و اتـانول می­گرددکه کاهش جذب را منجر می­شود (2). محتوای نسبی آب گیاه، یکی از صفات مهمی است که رابطه مستقیم با محتوای آب خاک دارد و نشان­دهنده وضعیت آبی خاک است. محتوای نسبی آب یکی از چندین روش اندازه­گیری وضعیت آبی بافت است که رابطه نزدیکی با پتانسیل آبی برگ دارد. شاخص مهم در تنش خشکی در برگ­ها گزارش شده است که می­تواند توانایی گیاه را برای در امان بودن از شدت تنش تحت تاثیر قرار دهد و در نتیجه بر عملکرد و پایداری آن موثر باشد (13).

کاروتنوئیدها شامل بتاکاروتن، گزانتوفیل­ها، آنتی­اکسیدان­های چربی­دوست با وزن مولکولی کم در کلروپلاست هستند که غشاهای کلروپلاستی را در مقابل تنش اکسیداتیو محافظت می­کنند. کاروتنوئیدها علاوه بر نقش ساختمانی و جذب نور می­توانند مستقیم اکسیژن آزاد را غیرفعال کنند به این صورت که انرژی را از مولکول­های تهییج شده و آزاد اکسیژن گرفته و به انرژی گرمایی تبدیل می­کنند و از این طریق مانع شروع پراکسیداسیون لیپیدی در دستگاه فتوسنتزی می­گردد. همچنین به‌عنوان پیش‌ساز هورمون اسیدآبسیزیک باعث تولید این هورمون در شرایط تنش می‌شود (27). اسیدآبسیزیک یکی از مهمترین هورمون‌های گیاهی است که براثر اعمال تنش جهت کاهش تعرق و حفظ آب تولید می‌شود و به‌عنوان یک واسطه موجب کاهش حساسیت گیاه به تنش می‌­گردد و در هنگام تنش، با افزایش هورمون اسیدآبسیزیک در سلول­های نگهبان روزنه، روزنه­ها بسته می­شود و بدین صورت آب درون سلولی حفظ می­شود (26). هنگامی که دما، در یک بازه­ی زمانی از سطح آستانه گیاه فراتر رود باعث آسیب­های غیرقابل بازگشت در رشد و نمو گیاه می­شود. تغییرات در دمای محیط سریع‌تر از تغییرات در سایر تنش­ها همچون خشکی، شوری رخ می­دهد (26). آکواپورین­ها پروتئین­های غشایی هستند که شامل پروتئین­های ذاتی غشای پلاسما(PIPs)، پروتئین­های درونی تونوپلاست(TIPs)، پروتئین­های غشایی شبه نودولین26(NIPs)، پروتئین­های بازی کوچک (SIPs) می­شوند.  این چهار گروه ذکرشده براساس توالی DNA به زیر گروه­های کوچکتری تقسیم بندی می­گردند و وظیفه انتقال آب، اوره، گلیسرول و دی­اکسیدکربن را در فضای سیمپلاستی به عهده دارند. آکوپورین­ها همچنین مسئول تنظیم دقیق حرکات آب می­باشند در نتیجه به عنوان یکی از مولکول­های اصلی برای مقابله با تنش­ها به خصوص تنش شوری و خشکی عمل می­کنند (24). پس با توجه به مطالب ذکر شده فلفل دلمه­ای در معرض کلیه تنش­های شوری، خشکی، غرقابی و دمایی قرار دارد. اما درصد تاثیر و مقایسه تغییرات صفات فیزیولوژیک آن تحت این تنش­ها نامعلوم است. در تحقیقاتی در گلخانه­های پژوهشی دانشکده کشاورزی دانشگاه صنعتی اصفهان در سال 1397 تاثیر جداگانه هریک از تنش‌های شوری، خشکی، غرقابی و دمایی بر خصوصیات فیزیولوژیکی فلفل دلمه‌ای مورد بررسی قرار گرفته است. اما تا به حال تحقیق جامعی بر مقایسه اثر این تنش­ها بر خصوصیات فیزیولوژیک گیاه فلفل دلمه‌ای انجام نشده است. بنابراین، با توجه به تغییرات اقلیمی ایجاد شده در ایران و اهمیت غذایی فلفل و اثرات تنش­ها بر تغییرات فیزیولوژیکی و عملکردی آن تحقیقی جهت بررسی تاثیر تنش‌های شوری، خشکی، غرقابی و دمایی و مقایسه اثرات این تنش­ها بر فلفل انجام شد.

مواد و روشها

این آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی در شرایط متوسط دمای روزانه/شبانه 2± 25/18 درجه سلسیوس و رطوبت نسبی 60 درصد در گلخانه­های تحقیقاتی دانشکده کشاورزی، دانشگاه صنعتی اصفهان بر فلفل دلمه­ای (Capsicum annuum, L. var. Ps301) با تیمار شاهد بدون تنش، تیمارهای تنش خشکی (5- بار)، تنش غرقابی (بدون هوادهی) و تنش شوری 300میلی‌مولار به وسیله کلریدسدیم و تنش گرمایی 38 درجه­سانتی­گراد انجام گرفت که در ادامه به تفصیل آمده است (15). جهت آماده­سازی نشاهای مورد استفاده ابتدا بذرهای فلفل دلمه­ای رقم Ps301  در سینی نشا حاوی بستر پرلایت و ورمی کولایت با نسبت حجمی دو به یک کشت شد. سپس با ظهور 3-4 برگ حقیقی و شستشوی کامل ریشه با آب مقطر به ظروف پلاستیکی به قطر 16 و ارتفاع 13 سانتی‌متر و حجم 1 لیتر حاوی محلول غذایی جانسون انتقال یافت (17). تنش خشکی به‌وسـیله پلـی­اتـیلن­گلایکـول 6000 مطابق با روش میچل و کافمن در دمای 25 درجه­سانتی­گراد در گلخانه‌­ی آموزشی-پژوهشی دانشکده کشاورزی دانشگاه صنعتی اصفهان اعمال گردید (23). جهت اعمال تنش غرقابی در ابتدا برای حذف اکسیژن محلول در محلول غذایی به مدت یک هفته محلول غذایی در ظروف کاملا بسته و بدون اکسیژن نگهداری گردید. سپس گیاه به ظروف منتقل شد  و در آن در محل طوقه کاملاپوشانده شد و در محیط کشت هیدروپونیک بدون هوادهی جهت ایجاد شرایط غرقابی اعمال شد (18). تنش شوری در چهار سطح50، 100، 200، 300 میلی­مولار به وسیله نمک کلریدسدیم (29) و تنش گرما در چهار دمای 32، 34، 36، 38  درجه سانتی­گراد در انکوبارتور(GC-400، IRAN) اعمال گردید (15). سطوح تنش‌ها به مدت 10 روز به‌صورت تدریجی اعمال شد و در کلیه تنش ها خشکی، غرقابی، شوری و گرما ، بصورت جداگانه و همزمان اعمال تنش از پایین­ترین سطح آغاز و هر 48 ساعت کلیه سطح تیمارها تغییر و به سطح بالاتر منتقل ‌شد. پس اتمام دوره 10 روزه اعمال تنش، نمونه­برداری انجام شد.

جهت اندازه‌گیری وزن تر و خشک ریشه پس از خارج کردن گیاهان از ظروف پلاستیکی ریشه آن‌ها شسته با کمک چاقوی تیز از محل طوقه بخش هوایی و ریشه از هم جدا شد و هرکدام به کمک ترازوی دیجیتال توزین شدند. سپس ریشه­ها به صورت جداگانه داخل پاکت­های کاغذی قرار گرفتند و به مدت 48 ساعت در آون 70 درجه سانتی‌گراد خشک گردید و سپس با ترازوی دیجیتال توزین شدند.

رنگیزه­ها توسط حلال استون%100 استخراج گردید و به کمک دستگاه اسپکتوفتومتر مدل UV-600A میزان جذب نور در سه طول‌موج663، 645 و 470 نانومتر به ترتیب برای کلروفیل a، کلروفیل b و کاروتنوئید قرائت گردید (4).

به منظور اندازه­گیری محتوای نسبی آب 10 عدد از دیسک­های برگی به قطر 1 سانتی متر از برگ سوم جدا شد. سپس وزن‌تر دیسک­های برگی به دست آمد. بلافاصله دیسک­های برگی در پتری­دیش حاوی آب مقطر به مدت 24 ساعت در محیطی تاریکی نگهداری شد. آب سطحی برگ‌ها با استفاده از دستمال خشک گرفته و وزن اشباع دیسک­های برگی توزین شدند سپس به به مدت 48 ساعت دیسک­های برگی در آون 85 درجه سلیسیوس قرار داده و وزن خشک دیسک­های برگی اندازه‌گیری شد. در نهایت محتوای نسبی آب برگ از رابطه زیر محاسبه گردید (5).

=FWوزن تر، =DWوزن خشک و =TWوزن اشباع دیسک های برگی

برای اندازه­گیری پتانسیل آب، برگ ­های بالغ جدا گردید و با استفاده از دستگاه بمب فشار میزان پتانسیل آب برگ قرائت گردید.

برای استخراج محتوای اسیدآبسیزیک بافت، برگ تازه با متانول 80 % و پلی­وینیل پیرولیدون (PVPP) در چهار درجه سلیسیوس هموژن گردید. بعد از آن به مدت 15 دقیقه در دور 4000 سانتریفوژ و محلول رویی جدا شد و اسیدیته آن به هشت رسید. توسط خلا، متانول تبخیرو سپس آب دیونیزه به آن اضافه گردید. این عمل دو بار دیگر تکرار شد و در نهایت به آن اتیل­استات اضافه گردید و تبخیر در شرایط خلا مجددا تکرار شد. بر رسوب حاصل محلول حاوی سه درصد متانول و 1/0 مول اسیداستیک  به نسبت 1:2 اضافه شد. سپس از صافی 45/0 میلی‌متر عبور داده شد و جهت تعیین غلظت نمونه‌ها به ستون فازمعکوس ((Diamonsic, C18 به طول 25 سانتی‌متر و قطر 6/4 میلی‌متر در دستگاه HPLC (Unicam-Crystal-200, UK) تزریق گردید. برای فاز متحرک گرادیان متانول-اسیداستیک (3-97%) با سرعت چهار میلی‌لیتر در دقیقه از دتکتور استفاده شد. از استاندارد اسیدآبسیزیک با خلوص97/99% ساخت کارخانه Sigma استفاده شد. براساس سطح زیر منحنی حاصل از پیک خروجی با کالیبراسیون و موقعیت آن در پیک‌های خروجی مقدار نمونه مجهول استخراجی تعیین شد (10). وضعیت سلول‌های روزنه پشت اپیدرم تحتانی برگ را با میکروسکوپ الکترونی (مدل hp-PI20، آلمان) با بزرگنماییx 40 و عکس­برداری با دوربین( مدل Canon-DS126271، ژاپن) بررسی شد. جهت استخراج RNA و سنتز cDNA بافت گیاهی همراه با پودرPVPP  و بافر استخراج RNA کیت ایرایزول (شرکت زیست فن­آوران RNA) به خوبی ساییده شد. ترکیب حاصل به میکروتیوب استریل شده انتقال و به مدت 2 دقیقه در g 14000 سانتریفوژ شد. سپس فاز رویی (شفاف) جدا شد و به میکروتیوب استریل جدید انتقال یافت. به میزان 500 میکرولیتر کلروفرم و 1/0 حجم مایع جدا شده، سدیم استات 3 مولار با pH، 2/5 به محلول اضافه شود سپس 30 ثانیه ورتکس و به مدت 8 دقیقه در g 14000 سانتریفوژ گردید. سپس فاز رویی جدا شد و به میکروتیوب جدید منتقل و به میزان یک سوم حجم فاز رویی جدا شده لیتیم­کلراید 2 مولار و همچنین ایزوپروپانول سرد (°C20-) هم حجم نمونه اضافه شد. ترکیب حاصل در دمای 20- درجه سانتی‌گراد به مدت 20 دقیقه نگهداری شد. نمونه به مدت 20 دقیقه در g 14000 سانتریفوژ شد. بعد از حذف محلول رویی ایجاد شده به میزان 1000 میکرولیتر اتانول 70% اضافه شد. نمونه در دور g 14000 به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شد. الکل اضافه شده خارج و جهت خشک شدن سروته شد. پس از خشک شدن پلت به میزان 50-30 میکرولیتر آب عاری از RNAse اضافه شد و در نهایت به مدت 5 دقیقه در ترمومیکس در دمای 65 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت و در دمای 80- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. واکنش Real-Time بدین صورت انجام شد که جهت از بین بردن آلودگی حاصل از DNA با DNaseI (Thermoscientific, USA) در دمای 37 درجه سانتی­گراد به مدت 15 دقیقه نمونه‌ها تیمار شد. برای تعیین غلظت RNA  استخراج شده از دستگاه نانودراپ (Pico200, Picodrop, UK) استفاده شد. 1 میکروگرم از RNA کل استخراج­شده با استفاده ازRevertAid M-MuLV reverse transcriptase  با توجه به دستورالعمل کیت (Thermo Scientific, USA)، جهت سنتزرشتهcDNA استفاده شد. جفت پرایمر مورد استفاده برای بیان ژن آکواپورین (JX402929.1) و ژن مرجع اکتین (GQ339766.1) به عنوان استاندارد داخلی برای تجزیه و تحلیل زمان واقعی  PCR استفاده شد. مخلوط واکنش 10 میلی­لیتر، که شامل 5 میکرولیترSYBRGreen (Gent Bio. PRK) ، 8/1 میکرولیتر آب DEPC ، 1 میکرولیتر از هر آغازگر و 2/0 واحد از ROX  با شرایط PCR به شرح: 95 درجه سانتی­گراد به مدت 10 دقیقه، به دنبال آن 40 دور، 95 درجه سانتی­گراد به مدت 30 ثانیه، 55 درجه سانتی­گراد به مدت 30 ثانیه و 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه بوده است. واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز در زمان واقعی با استفاده از روش Comparative Ct (ΔΔCt) انجام شد و مقایسه دوره از رابطه ctΔΔ 2–برای بررسی بیان ژن محاسبه شد (19). داده‌ها بااستفاده از نرم­افزار اکسل طبقه­بندی و با برنامه آماری Statestix 8 آنالیز شدند و مقایسه میانگین داده­ها به کمک آزمونLSD ، در سطح احتمال 5 درصد محاسبه شد.

نتایج

نتایج حاصل از تجزیه واریانس داده­ها نشان داد که اثر تیمار بر کلیه تنش های خشکی، غرقابی، شوری و گرما بر میزان وزن خشک ریشه، کاروتنوئید، محتوای نسبی آب، پتانسیل آب برگ، اسیدآبسیزیک و بیان ژن آکواپورین در سطح احتمال 1% معنی­دار بود در حالیکه بر وزن تر ریشه تاثیر معنی­داری نداشت (جدول1).

 

 

جدول1- تجزیه واریانس اثر تنش بر میزان وزن تر و خشک ریشه، کاروتنوئید، محتوای نسبی آب، پتانسیل آب، اسید آبسیزیک و بیان ژن آکواپورین

بیان ژن آکواپورین

محتوای اسیدآبسیزیک (نانوگرم گرم وزن خشک)

پتانسیل آب برگ

(مگاپاسکال)

محتوای نسبی آب (درصد)

کاروتنوئید

 (میلی گرم بر گرم وزن خشک)

وزن خشک ریشه (گرم)

وزن‌تر ریشه (گرم)

درجه آزادی

منابع تغییرات

45/6**

94/612**

10/43**

85/902**

75/86*

005/0**

12/0 ns

4

تیمار

22/0

01/0

7/1

34/16

88/7

0007/0

05/0

10

خطا

67/25

32/0

68/6

74/5

70/21

91/30

80/20

14

ضریب تغییرات

n.s غیر معنی­دار، * و ** به ترتیب معنی­دار در سطح احتمال پنج و یک درصد.

 

 

میزان وزن تر ریشه در تنش خشکی 30%، تنش گرما و شوری 20% افزایش و در تنش غرقابی 25% کاهش داشت. بیشترین وزن خشک ریشه در گیاهان تحت تنش خشکی و کمترین در گیاهان تحت تنش گرما بدست آمد (شکل 1 الف وب).

نتایج نشان داد که میزان کاروتنوئید در تنش خشکی به میزان 76 % نسبت به شاهد افزایش یافت و در تنش شوری و غرقابی به میزان 15% و در تنش گرما به میزان 46% کاهش داشت )شکل2).

نتایج حاصل از مقایسه میانگین نشان داد بیشترین میزان محتوای نسبی آب برگ در تیمار شاهد و تنش غرقابی می‌باشد (شکل3 الف).  

 

 

 

 شکل 1- اثر تنش خشکی، غرقابی، شوری و گرما در گیاه فلفل ‌دلمه‌ای رقمPs301 بر وزن تر ریشه(الف)، وزن خشک ریشه (ب) حروف متفاوت روی ستونها، از نظرآماری در سطح 5  درصد آزمون LSD معنی دار هستند.

 

شکل 2- اثر تنش خشکی، غرقابی، شوری و گرما در گیاه فلفل ‌دلمه‌ای رقمPs301 بر میزان کاروتنوئید

 حروف متفاوت روی ستون­ها، از نظرآماری در سطح 5  درصد آزمون LSD معنی دار هستند

 

شکل 3- اثر تنش خشکی، غرقابی، شوری و گرما در گیاه فلفل ‌دلمه‌ای رقمPs301   بر میزان محتوای نسبی آب (الف) و پتانسیل آب برگ (ب). حروف متفاوت روی ستون­ها، از نظرآماری در سطح 5  درصد آزمون LSD معنی دار هستند

 

براساس نتایج حاصل از این پژوهش (شکل4 الف) بیشترین میزان هورمون اسیدآبسیزیک در تنش شوری مشاهده گردید. همچنین در اثر تنش­های اعمال شده میزان این هورمون نسبت به شاهد افزایش یافت. بیان ژن آکواپورین در تنش خشکی و غرقابی به میزان 5/2 برابر نسبت به شاهد افزایش نشان داد و در تنش شوری به میزان 3% و در تنش گرما 41% کاهش نشان داد (شکل4 ب).

 

 

ر
 

د
 

شکل 4- اثر تنش خشکی، غرقابی، شوری و گرما در گیاه فلفل ‌دلمه‌ای رقم Ps301 بر میزان محتوای اسید آبسیزیک(الف) و بیان ژن آکواپورین(ب). حروف متفاوت روی ستون­ها، از نظرآماری در سطح 5  درصد آزمون LSD معنی دار هستند

 

 

اسیدآبسیزیک یکی از هورمون­هایی است که نقش مهمی در بسیاری از فرآیندهای مهم فیزیولوژیکی، نموی و همچنین عکس­العمل­های سازگاری گیاه به محیط های تنشی را تنظیم می‌نماید (شکل 5). براساس تصویر حاصل از وضعیت روزنه سلول‌های اپیدرمی پشت برگ گیاه فلفل دلمه‌ای میزان گشودگی روزنه­ها در نمونه شاهد 54%، تنش خشکی 25%، تنش غرقابی 28%، تنش شوری72% و تنش گرما 44% می­باشد. با توجه به نتایج حاصل بیشترین تاثیر روزنه­ها تحت تاثیر تنش‌های اعمال شده در تنش خشکی مشاهده شد (شکل 5). طی مسیر بسته شده روزنه در تنش خشکی میزان کاروتنوئید و محتوای اسیدآبسیزیک نیز افزایش داشت. در تنش شوری کمترین بسته شدن روزنه­ها مشاهده شد که با توجه به کاهش میزان کاروتنوئید و همچنین افزایش محتوای اسیدآبسیزیک در مقابل تنش تعداد کمتری از روزنه­ها بسته شدند (شکل 5).

بحث

براساس نتایج این پژوهش شکل 6 که طراحی شده است و  نشان می­دهد که گیاه فلفل ، از طریق دو مسیر در جهت حفظ آب سلول برای مقابله با تنش­های اعمال شده عمل می‌کند. در شرایط تنش خشکی میزان بیان ژن آکواپورین در برگ افزایش می­یابد و با توجه به نقش اختصاصی این کانال در عبور آب به داخل سلول با افزایش بیان این ژن میزان آب بیشتری وارد سلول شده در نتیجه پتانسیل و محتوای نسبی آب نسبت به شاهد در اثر تنش خشکی کاهش یافت و در نهایت گیاه برای کاهش تعرق حفظ آب اقدام به بستن روزنه­ها کرد (مسیر-1). در تنش غرقابی میزان بیان ژن آکواپورین افزایش یافت همچنین میزانی محتوای نسبی آب و پتانسیل آب نسیت به شاهد تغییری نشان نداد و میزان 72% از روزنه ها جهت حفظ آب و کاهش تعرق بسته شدند (مسیر-1). با توجه به نتایج حاصل در مسیر 1 میزان بیان ژن آکواپورین در تنش خشکی و غرقابی به میزان 5/2 برابر نسبت به شاهد افزایش و تنش شوری به میزان 3% و تنش گرما به میزان 41% نسبت به شاهد کاهش نشان داد. میزان پتانسیل آب در تنش خشکی 16% و در تنش گرما % 19 نسبت به شاهد کاهش و در تنش غرقابی 10% و تنش شوری 24% نسبت به شاهد افزایش داشته است. در مسیر شماره 2 میزان کاروتنوئید در تنش خشکی 76% و تنش گرما 46% نسبت به شاهد و همچنین میزان هورمون اسیدآبسیزیک در تنش خشکی 33%، تنش غرقابی 5/1 برابر، در تنش شوری 8/1 برابر ودر تنش گرما 77% نسبت به شاهد افزایش داشت. میزان تغییرات روزنه نسبت به شاهد در تنش خشکی 25%، تنش غرقابی 28%، تنش شوری 72% و تنش گرما 44% افزایش نشان داد که بیانگر این نکته است که در تنش خشکی و غرقابی با افزایش میزان بیان ژن آکواپورین به عنوان یک کانال اختصاصی انتقال آب، میزان عبور آب در سطح غشاء پلاسمایی افزایش داشته است و این امر موجب تغییرات پتانسیل آب و افزایش محتوای نسبی آب می­شود و درنهایت برای حفظ آب و کاهش تعرق روزنه­ها بسته می­شود اما در تنش شوری و گرما با افزایش میزان کاروتنوئید و تولید بیشتر هورمون اسیدآبسیزیک و اتصال این هورمون به گیرنده­های سلول­های محافظ روزنه، روزنه­ها بسته می‍شود.

 

 

شکل5- تصاویر وضعیت روزنه فلفل دلمه­ای رقم Ps301 الف) شاهد ب) تنش خشکی ج) تنش غرقابی ر) شوری د)گرما

شکل 6- مسیرهای تاثیر گذار بر تغییرات وضعیت روزنه

 

زمانی که گیاه در معرض خشکی قرار می­گیرد، قبل از هر گونه کاهش در فشار تورژسانس، ابتدا انعطاف­پذیری دیواره سلول­های در حال رشد برگ­ها و ساقه­ها کم می­شود در نتیجه توسعه سلول و در نهایت رشد اندام­ها کاهش می­یابد در حالیکه به نظر می­رسد دیواره سلولی ریشه به تنش خشکی کمتر حساس بوده به­طوری­که ممکن است زمانی که رشد اندام هوایی متوقف شده رشد ریشه به منظور جذب آب بیشتر و حفظ رطوبت گیاه برای مقابله با شرایط تنش همچنان ادامه داشته باشد. در شرایط تنش غرقابی بدلیل قرار گرفتن ریشه در شرایط بی‌هوازی، کمبود اکسیژن و افزایش تخمیر میزان رشد ریشه کاهش می­یابد (22). میزان وزن خشک ریشه در تنش شوری و گرما به دلیل کمبود آب و کاهش پتانسیل اسمزی محلول غذایی و کاهش جذب آب و عناصر کاهش یافت. در تنش غرقابی میزان وزن خشک ریشه نسبت به شاهد تغییری نشان نداد ولی میزان آن در تنش خشکی به دلیل اشباع شدن برگ از عدم انتقال مواد فتوسنتری افزایش یافت. با توجه به این­که کاروتنوئید پیش­ساز هورمون اسیدآبسیزیک می‌باشد میزان تغییرات این رنگریزه به عنوان گیرنده نوری مکمل، طول موج­هایی را جذب می­کنند که توسط کلروفیل­ها جذب نمی­شود. مهم­ترین نقش کاروتنوئیدها، توانایی در رفع سمیت­ شکل­های مختلفی از اکسیژن فعال شده می­باشد که در نتیجه برانگیختگی ترکیب­های فتوسنتزی به­وسیله نور تولید می­شوند و همچنین به ساخت هورمون اسید آبسیزیک در زمان تنش کمک می­کند (21). میزان محتوای نسبی آب در تنش خشکی به میزان 40% و در تنش شوری و گرما به میزان 32% کاهش نشان داد و در تنش غرقابی نسبت به شاهد تفاوتی مشاهده نشد. میزان محتوای نسبی آب در تنش‌های اعمال شده نسبت به شاهد کاهش یافت که بیانگر این می­باشد که بر اثر تنش­های اعمال شده آب سلول­ها رو به زوال رفته که نشان­دهنده­ی عدم جذب و حفظ تورژسانس می‌باشد. بدون تغییر میزان محتوای نسبی آب در تنش غرقابی نشان­دهنده این موضوع است که گیاه تحت تنش غرقابی توانسته میزان محتوای نسبی آب و تورژسانس سلول را حفظ و ریشه آب بیشتری را جذب کند. در پژوهشی مشاهده شد که در تنش غرقابی میزان رطوبت نسبی نسبت به شاهد در گیاه پرتقال تغییری نداشت (16). با افزایش سطح تنش، گیاهان تحت تنش به طور چشمگیری پتانسیل آب برگ­های خود را کاهش و مقاومت انتشار روزنه­ها را افزایش می­دهند لیکن بدنبال کاهش آب سلول­های برگ، رشد سلول­های برگ و جریان دی­اکسیدکربن کاهش یافته تا ازاین طریق تعرق گیاه کاهش یابد (28). حفظ محتوای نسبی آب نسبتا بالا در طی اعمال تنش نشان دهنده تحمل گیاه نسبت به تنش می‌باشد در حالیکه بررسی تنش­های مختلف در گونه­های گیاهی گوناگون نشان داده است که با افزایش دوره و شدت تنش، میزان آب نسبی گیاهان کاهش می­یابد (9). طبق نتایج حاصل از این پژوهش، منفی­ترین پتانسیل آب متعلق به تنش شوری می‌باشد (شکل3 ب) که در اثر تجمع نمک در بستر رشد گیاه، توان جذب آب توسط گیاه کاهش می­یابد، بنابراین افت محتوای آب برگ و پتانسیل آب برگ را به دنبال دارد. تطـابق اسمزی بالا، نسبت بالای ریشه به شاخه و همچنین راندمان تعرق یـا کـارایی مـصرف آب بـالا از راهکارهـای تحمـل و سازگاری این گیاهان به تنش است. با ایـن شـرایط گیـاه قادر خواهد بود تا با وجود کمبود آب، پتانسیل آبـی خـود را بالا نگه داشته و آن را قـادر می­سـازد تـا تورژسـانس سـلولی و رشد را حفظ نموده و از اثرات بعـدی تنش­های اعمال شده دوری گزینـد. تطبیق اسمزی یک فرایند سازگاری است کـه گیـاه را قادر می‌سازد تا علیرغم پایین بـودن پتانـسیل اسـمزی، تورژسانس خود را حفـظ نمایـد (20). طی مطالعاتی که بر روی برگ گیاه انگور انجام شده است تنش خشکی میزان پتانسیل آب برگ منفی‌تر را موجب می­گردد (11). براساس داده­های حاصل از این پژوهش می‌توان به این نکته پی برد که تنش­های اعمال شده برگیاه باعث تغییر در وضعیت آب گیاه شده است که این تغییرات برای مقابله با پیری و مرگ سلول روی داده است (22). تحت تنش­های محیطی سیستم هورمونی گیاهان تحت تاثیر قرار می‌گیرد و با افزایش یا کاهش سطح هورمون­ها موجب پاسخ­های متفاوت و سازگاری گیاه به شرایط تنش می­شود (8). محتوای اسیدآبسیزیک در گیاهان با افزایش شدت تنش افزایش می­یابد. از سوی دیگر ذکر این نکته بسیارحائز اهمیت می­باشد که در اثر تنش اعمال شده گیاه برای حفظ آب این هورمون را در جهت بسته شدن روزنه­ها برای جلوگیری از تعرق افزایش می­دهد. شواهد معتبری وجود دارد که افزایش محتوای اسیدآبسیزیک بافت برگ، خروج آب از گیاه را از طریق کاهش گشودگی روزنه هاکاهش می­دهد (شکل 3) و عمل بسته­شدن روزنه­ها بسیار سریع انجام می‌شود (8). آکوپورین­ها مسئول تنظیم دقیق حرکات آب هستند، در نتیجه نقش مهمی در تحمل تنش خشکی ایفا می‌کنند. میزان بیان آکوپورین­ها تحت تاثیرگونه گیاهی، شدت تنش، طول مدت تنش و مرحله رشدی قرار می‌گیرد (7). اثر منفی تنش خشکی بر روی هدایت هیدرولیکی ریشه و انتقال آب سلول به سلول در پاسخ به تنش در ریشه­ها به شدت کاهش می‌دهد، این پدیده نشان می دهد که کانال­های آب می­تواند به طور مستقیم درگیر تنش شود. نتایج نشان می دهد که احتمالاآکواپورین می­تواند نقش ویژه­ای را برای جذب آب باقی مانده تحت تنش خشکی بازی کند (6).

میزان رنگیزه کاروتنوئید به عنوان پیش­ساز ساخت هورمون اسیدآبسیزیک در اثر عمال تنش شوری و گرما کاهش یافت و در نهایت میزان هورمون اسیدآبسیزیک به عنوان عاملی جهت اتصال به گیرنده­های سطح سلول نگهبان روزنه افزایش یافت و در جهت حفظ رطوبت اقدام به بستن روزنه­ها شد (3و 28) که موید نتایج حاصله از این تحقیق است.

نتیجه گیری کلی

به‌طور کلی می‌توان گفت که در تنش‌های خشکی، غرقابی، شوری و گرمای اعمال شده بر گیاه فلفل دلمه‌ای، مکانیزم خشکی به این صورت است که  با افزایش میزان کاروتنوئید بعنوان پیش‌ساز ساخت هورمون اسیدآبسیزیک و افزایش تولید این هورمون در جهت بستن روزنه­ها برای جلوگیری از تعرق و کاهش میزان آب وارد عمل می­شود. در بین تنش­های اعمال شده بیشترین آسیب در اثر تنش گرما به گیاه وارد شد و گیاهان تحت تنش خشکی با افزایش میزان بیان ژن آکواپورین و همچنین تولید هورمون اسیدآبسیزیک سازگاری بیشتری با تنش  نشان دادند.

سپاسگزاری

از همکاران و مسئولین زیست فناوری و مهندسی زیستی دانشگاه صنعتی اصفهان که نویسندگان را در انجام این تحقیق یاری رساندند تشکر می‌شود.

1. فرخی، ا. و گالشی، س. 1384. بررسی تأثیر شوری، اندازه بذر و اثرات متقابل آن‌ها برتندش، کارایی تبدیل ذخایر بذرو رشد گیاهچه سویا. مجله علوم کشاورزی ایران 1239:5 –1233.
2. غلامی، ر. و غلامی، ح. 1397. اثر تنش آبی بر برخی ویژگی­های رشدی و فیزیولوژیکی ژنوتیپ­های برتر زیتون در شرایط گلدان. مجله تولیدات گیاهی. 41 (4): 28-15.
 
3. Alexandersson, E., Danielson, J., Rade, A., Moparthi, H., Fontes, J., Kjellbom, V. K. and and Johanson, U. 2010. Transcriptional regulation of aquaporins in accessions of Arabidopsis in response to drought stress. Journal of Plant. 61: 650-660.
4. Arnon, A. N. 1967. Method of extraction of chlorophyll in the plants. Agronomy Journal. 23: 112-124.
5. Barrs, H. D. and Weatherley, P. E. 1962. A Re-Examination of the Relative Turgidity Techniques for Estimating Water Deficits in Leaves. Australian Journal of Biological Sciences. 15: 413-428.
6. Biela, A., Grote, K., Otto, B., Hoth, S. and Hedrich, R. 1999. The Nicotiana tabacum plasma membrane aquaporin NtAQP1 is mercury-insensitive and permeable for glycerol. Journal of Plant. 18: 565-570.
7. Bienert, G. P., Bienert, M. D., Jahn, T. P., Boutry, M. and Chaumont, F. 2011. Solanaceae XIPs are plasma membrane aquaporins that facilitate the transport of many uncharged substrates. Journal of Plant. 66: 306-317.
8. Castonguay, Y., Nadeau, P. and Simard, R. R. 1993. Effects of flooding on carbohydrate and ABA levels in roots and shoots of alfalfa. Plant Cell and Environmental. 16: 695-702.
9. Diallo, A. T., Samb, P. I. and RoyMacauley, H. 2001. water status and stomatal benavioxr of cowpea, Vigna unguiclata (L.) Walp, plauts inoculated with two Glomus species at low soil moisture levels. European Journal of Soil Biology. 37: 187-196.
10. Flexas, J., Ribas-Carbo, M., Hanson, D. T., Bota, J., Otto, B., Cifre, J. McDowell, N., Medrano, H. and Kaldenhoff, R. 2006. Tobacco aquaporin NtAQP1 is involved in mesophyll conductance to CO2 in vivo. Journal of Plant. 48: 427-439.
11. Galmes, J., Pou, A., Alsina, M. M., Tomas, M., Medrano, H. and Flexas J. 2007. Aquaporin expression in response to different water stress intensities and recovery in Richter-110 (Vitis sp.): Relationship with ecophysiological status. Planta. 226: 671-681.
12. Grattan, S. and Grieve, C. 1985. Betaine status in wheat in relation to nitrogen stress and to transient salinity stress. Plant and Soil. 85: 3-9.
13. Heidari, N., Kheyrabi, J., Alaei, M., Farshi, A.A., Kazemi, P., Vaziri, J., Entesari, M.R., Dehghani Sanij, H., Sadat Mirei, M.H. and Mirlatifi, M. 2008. Water Use Efficiency in Greenhouse Production. iranian national committee on irrigation and drainage (IRNCID) press. 180p.
14. Homaee, M., Dirksen, C. and Feddes, R.A. 2002. Simulation of root water uptake . I .Nonuniform transient salinity using different macroscopic reduction functions. Agricultural Water Management. 57: 89-109 .
15. Hu, W. H., Xiao, Y. A., Zeng, J. J. and Hu, X. H. 2010. Photosynthesis, respiration and antioxidant enzymes in pepper leaves under drought and heat stresses. Biologia Plantarum. 54: 761-765.
16. Johanson, U., Karlsson, M., Johansson, I., Gustavsson, S. and Sjovall, S. 2001. The complete set of genes encoding major intrinsic proteins in Arabidopsis provides a framework for a new nomenclature for major intrinsic proteins in plants. Plant Physiology. 126: 1358-1369.
17. Jones, J. B. 2005. Hydroponics: a practical guide for the soilless grower. CRC Press, USA.
18. Kuan, T. L. and Erwin, D. C. 1980. Formae speciales differentiation of Phytophthora megasperma isolates from soybean and alfalfa. Phytopathology. 70: 333-338.
19. Livak, K. J. and Schmittgen, T. D. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods San Diego Calif. 25: 402-408.
20. Maricle, B. R., Cobos, D. R. and Campbell, C. S. 2007. Biophysical and morphological leaf adaptations to drought and salinity in salt marsh grasses. Environmental and Experimental Botany. 60: 458-467.
21. Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M. and VanBreusegem, F. 2004. Reactive oxygen gene network of Plants. Plants Science. 9: 490-491.
22. Mohammadkhani, N. and Heidari. R. 2008. Water stress induced stomatal closure in two maize cultivars. Journal of Biology Science. 3: 750-754.
23. Nahar,  Sh., Sahoo, L.  Tanti, B. 2018.  Screening of drought tolerant rice through morphophysiological and biochemical approaches. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. 15: 150-159.
24. Postaire, O., TournaireRoux, C., Grondin, A., Boursiac, Y. and Morillon, R. 2010. A PIP1 aquaporin contributes to hydrostatic pressure-induced water transport in both the root and rosette of Arabidopsis. Plant Physiology. 152: 1418-1430.
25. Rosales, M. A., Romero, L. and Ruiz, J. M. 2010. Genotypic differences in some physiological parameters symptomatic for oxidative stress under moderate drought in tomato plants. Plant Science. 178: 30-40.
26.  Sanchez Rodrıguez, E., Rubio Wilhelmi, M., Cervilla, L. M., Blasco, B., Rios, J. J., Stiki, R. and Davies, W. J. 2000. Stomatal reactions of two different Maize Lines to osmotically induced drought Stress. Biology Plantarum. 43: 339-405.
27. Seo, M. and Koshiba, T. 2002. Complex regulation of ABA biosynthesis in plants. Plant Science. 7: 41-48.
28. Young-Kwon, M. and Young-Woo, S. 2016. Plants responses to drought and shade Environments. Journal of Biotechnology. 15: 30-33.
29. Zaman Akhtar, M., Azhar, H. Furqan, A. 2017. Screening of Pepper (Capsicum annuum L.) Genotypes Against Salinity Stress. Journal of Environmental and Agricultural Sciences. 11: 51-58.
Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 38, Issue 1
Spring 2025
Pages 1-15

  • Receive Date 06 June 2020
  • Revise Date 18 April 2021
  • Accept Date 29 November 2021