نوع مقاله : مقاله پژوهشی
عنوان مقاله English
نویسنده English
Buxus hyrcana Pojark is one of the endangered trees in the Hyrcanian forests of Iran, which has been faced by pests and diseases in recent years. Due to the importance of this species and the need to its tissue culture, finding a suitable method for sterilization of explants of this forest species is essential. Therefore, the aim of this study was to investigate the effects of Percidine, Aqua Percidine, Percidine Plus and Super Percidine in reducing pollution from the culture medium in forest boxwood tissue culture contamination from culture medium used in Buxus hyrcana tissue culture. The experiment was performed in a completely randomized design with 3 replications (n=45). First, for pre-treatment, explants (twigs and seeds) were washed with ordinary water and a few drops of dishwashing liquid for 5 minutes to remove surface contaminants. Then, they were placed in benomyl fungicide (1%) for 10 minutes. After washing, under sterile hood, sterilization of explants was performed through usual method (using ethanol 96% and sodium hypochlorite (1:3 mixed with water) and washing with distilled water three times for 10 minutes). Experimental treatments included disinfectant (Percidine 15%, Aqua Percidine, Super Percidine, Percidine Plus (at concentrations of 200, 400 and 600 μl) in combination with the culture medium. After sterilization of explants, plant materials were cultured on Murashige and Skoog media in combination with disinfectants. To measure contamination, cultures were examined under growing conditions at 25± 1 °C with a light intensity of 1000 to 1500 lux, 16 hours of light
کلیدواژه‌ها English
اثرات پرسیدین، آکوا پرسیدین، پرسیدین پلاس و سوپر پرسیدین در کاهش آلودگی از محیط کشت مورد استفاده در کشت بافت شمشاد هیرکانی
اکرم احمدی*
ایران، گرگان، آموزش و ترویج کشاورزی، سازمان تحقیقات، مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان گلستان، بخش تحقیقات منابع طبیعی
تاریخ دریافت: 15/06/1401 تاریخ پذیرش: 13/10/1401
چکیده
شمشاد هیرکانی (Buxus hyrcana Pojark) از جمله درختان رو به انقراض در جنگل‌های هیرکانی ایران است که در سالیان اخیر دستخوش آفت و بیماری در سطح گسترده شده است. با توجه به اهمیت این گونه و نیاز به کشت بافت آن یافتن روشی مناسب برای استریلیزاسیون ریزنمونههای این گونه جنگلی از ضروریات است. لذا، پژوهش حاضر با هدف بررسی اثرات پرسیدین15%، آکوا پرسیدین، پرسیدین پلاس و سوپر پرسیدین در کاهش آلودگی از محیط کشت در کشت بافت شمشاد جنگلی انجام پذیرفت. آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی در 3 تکرار انجام گرفت (45=n). ابتدا به منظور اعمال پیش تیمار، ریزنمونهها (سرشاخه و بذر) با آب معمولی و چند قطره مایع ظرفشویی به مدت 5 دقیقه به منظور حذف آلودگیهای سطحی مورد شستشوی اولیه قرار گرفتند. سپس، به مدت 10 دقیقه در قارچکش بنومیل (1%) قرار داده شدند. بعد از آبشویی، در زیر هود استریل، استریلیزاسیون ریزنمونهها به روش معمول (استفاده از اتانول 96 درصد و هیپوکلریت سدیم (3:1 مخلوط با آب) و شستشو با آب مقطر سه بار به مدت 10 دقیقه) انجام گرفت. تیمارهای آزمایشی شامل ماده ضدعفونی کننده (پرسیدین 15%، پرسیدین آکوا، سوپر پرسیدین، پرسیدین پلاس (در حجمهای 200، 400 و 600 میکرولیتر) در ترکیب با محیط کشت بودند. بعد از استریلیزاسیون ریزنمونهها، مواد گیاهی بر روی محیط کشت موراشی و اسکوگ در ترکیب با ضدعفونیکنندهها قرارگرفتند. برای اندازهگیری آلودگی، کشتها در شرایط رشدی با دمای 1±25 درجه سانتیگراد با شدت نور 1000 تا 1500 لوکس 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج استعمال مواد ضدعفونی کننده در محیط کشت نشان داد که بدون توجه به نوع ریزنمونه میزان آلودگی بدین صورت بود: پرسیدین 15%>پرسیدین پلاس> آکوا پرسیدین> سوپر پرسیدین. همچنین، نتایج نشان داد که میزان آلودگی در ریزنمونه سرشاخه بیشتر از ریزنمونه بذر بود. نتایج مقایسات حجمهای مختلف ضدعفونی کنندههای مختلف در ریزنمونه سرشاخه و بذر نشان داد که در هر دو در حجم صفر یا تیمار شاهد، بیشترین میزان آلودگی مشاهده شد و کمترین آلودگی در حجمهای مختلف سوپر پرسیدین اتفاق افتاد که میزان 400 و 600 میکرولیتر کمترین میزان آلودگی بود ولی در 600 میکرولیتر سوختگی نهال و خشکیدگی یا سوختگی بذر اتفاق افتاد. در خصوص استعمال مواد ضدعفونی کننده در مهار آلودگی از محیط کشت بافت شمشاد هیرکانی (هر دو ریزنمونه سرشاخه و بذر) سوپرپرسیدین میتواند گزینه مناسبی باشد.
واژه های کلیدی: شمشاد هیرکانی، استریلیزاسیون، محیط کشت، ریزنمونه، سوپر پرسیدین
* نویسنده مسئول، تلفن: اکرم احمدی، 09113708525، پست الکترونیکی: Ahmadi.1870@gmail.com
مقدمه
شمشاد خزری، شمشاد جنگلی یا شمشاد هیرکانی گونهای پهن برگ و همیشه سبز است که در جنگل‌های شمال رویش دارد و بازمانده دوران سوم زمین شناسی است. برگهای آن به رنگ سبز تیره و براق است. شمشاد هیرکانی درختچهای است که در جنگل‌های شمال و مناطق مناسب به 5 – 6 متر ارتفاع و گاه تا 15 متر نیز میرسد. از جمله ذخیرهگاههای شمشاد میتوان به نمک آبرود، گرداب، خیبوس، جیسا و چشمه بلبل (بندرگز) و چند منطقه کوچک دیگر اشاره نمود. شمشاد هیرکانی در جامعه بلوط شمشادستان (Querco Buxetum) قرار دارد که با گونههای افرا، توسکا، لرگ، داغداغان، راش، لیلکی، خرمندی، شب خسب و .... همراه است. از پوشش گیاهی کف هم میتوان به گونههای علفی نظیر سرخس و گرامینه و تعدادی از گونههای خزههای خاکزی یا دارچسب اشاره نمود (3، 8 و 9).
گونه شمشاد کاربردهای دارویی و صنعتی بسیاری دارد (9) که متاسفانه در سالیان اخیر بیماری بلایت و همچنین آفت شب پره شمشاد سبب آسیب جدی به این گونه باارزش و کمیاب شدهاند (3).
از جمله روشهای بسیار متداول در تکثیر تجاری گونهها استفاده از روش ریزازدیادی است که مزایای بسیاری نسبت به روشهای معمول کشت بخصوص برای گونههای رو به انقراض دارد. لازم است در ریزازدیادی با استفاده از کشت درون شیشهای، شرایط استریل برای کشت ریزنمونه ها فراهم گردد تا با به حداقل رساندن آلودگی، صرفهجویی در زمان و هزینهها صورت گیرد (6).
وجود آلودگیها در محیط کشت بر رشد گیاه در شرایط آزمایشگاهی تأثیر میگذارد. کشت بافت گیاهی روشی پرهزینه است، بنابراین برای کسب سود مطلوب باید کشت‌های عاری از آلودگی ایجاد شود (20). استفاده از ضدعفونی کنندهها درضدعفونی کردن سطح مهمترین مرحله در آماده سازی ریزنمونه در کشت درون شیشهای است که در کنترل باکتریها و قارچها موثر هستند (17).
عموما در بسیاری از مطالعات جهت به حداقل رساندن آلودگی از روش استریلیزاسیون قبل از کشت بر روی ریزنمونههای گیاهی استفاده میشود و مطالعات چندانی در خصوص استفاده از ضدعفونی کنندهها در داخل محیط کشت به چشم نمیخورد. حتی، در خصوص استریلیزاسیون ریز نمونههای شمشاد نیز مطالعه ای یافت نشد اما مروری بر مطالعات انجام گرفته در خصوص استریلیزاسیون با انواع محصولات پرسیدین، به شرح ذیل میباشد: میرعباسی لسکوکلایه و همکاران (1392) از ضدعفونی کننده پرسیدین در ضدعفونی جوانههای جانبی ملج Ulmus glabra استفاده کردند تا مقایسه اثر سطوح مختلف هورمون توپولین بر روی پرآوری ملج را مورد بررسی قرار دهند (4). میرعباسی لسکوکلایه و همکاران (1391) مطالعه دیگری بر روی بهینه سازی کشت بافت ملج انجام دادند. ایشان در مرحله ضدعفونی ریزنمونه جوانههای جانبی و انتهایی از پرسیدین 1/0 درصد استفاده کردند که نتیجه تحقیقات ایشان نشان داد آلودگی به 9 درصد کاهش یافت (5).
نیک نژاد و همکاران (2011) ارزیابی درون شیشهای ترکیبات با فعالیت ضد قارچی پراکسی استیک اسید (پرسیدین) بر روی یک گروه از قارچها انجام دادند. ایشان اثر غلظتهای مختلف پراکسید استیک اسید (PAA) به عنوان پرسیدین و پرسیدین 513 را بر روی میکروسپوروم گچ، کاندیدا آلبیکنس و آسپرژیلوس نیجر بررسی نمودند. سویههای استاندارد (PTCC) با 1، 3، 5، 10 و 20 درصد پرسیدین در 3، 5، 10، 20، 30 دقیقه و 2/0 درصد پرسیدین 513 در 3، 5، 15، 30، 45 و 60 دقیقه تیمار قرار گرفتند. نتایج ایشان نشان داد که برای C. albicans و M. gypseum نتایج رضایت بخش با استفاده از 1 و 3 درصد پرسیدین پس از 10 دقیقه بدست آمد. با این حال با بکارگیری پرسیدین 5%، هدف پس از 3 دقیقه به دست آمد. از طرف دیگر، در مورد A. niger، نتایج قابل قبولی پس از 20 دقیقه برای پرسیدین 3٪، 10 دقیقه برای پرسیدین 5 و 10٪ و در نهایت 5 دقیقه برای پرسیدین 20٪ بدست آمد (18). طبق پروتکل 6986 ISIR موسسه استانداردها و تحقیقات صنعتی ایران پراکسی استیک اسید (PAA) به دلیل قدرت بالای آن در کاهش شدت جمعیت میکروبی خصوصاً در مهمترین گونههای قارچ میتواند به عنوان یک ضد عفونی کننده قابل اطمینان برای استفاده در کاربردهای عمومی در نظر گرفته شود.
با توجه به اهمیت موضوع در خصوص استعمال مواد ضدعفونی کننده در محیط کشت بافت ریزنمونههای شمشاد هیرکانی و همچنین، اندک بودن مطالعات در خصوص محصولات پرسیدین، سوپر پرسیدین و پرسیدین آکوا ساخت شرکت بهبان شیمی مطالعه حاضر با هدف بررسی اثرات پرسیدین، آکوا پرسیدین، پرسیدین پلاس و سوپر پرسیدین در کاهش آلودگی از محیط کشت مورد استفاده در کشت بافت شمشاد هیرکانی انجام گرفت.
مواد و روشها
نمونهبرداری از گونه شمشاد از ذخیرهگاه شمشاد هیرکانی چشمه بلبل، بندرگز انجام گرفت (شکل 1). این ذخیرهگاه جنگلی حدود 420 هکتار وسعت دارد که در 15 کیلومتری جنوب غربی بندرگز و 10 کیلومتری جنوب شرقی گلوگاه در منطقه روستای چشمه بلبل و لیوان (طول جغرافیایی ́53 °53 تا ́20 °54 شرقی و عرض جغرافیایی ́́36 °45 تا ́36 °47 شمالی) واقع شده است. نمونهها پس از نمونهگیری، به آزمایشگاه کشت بافت گیاهی انتقال یافت.
شکل 1 - محل نمونهبرداری واقع در ذخیرهگاه شمشاد چشمه بلبل، استان گلستان
در این پژوهش گونه مورد مطالعه، شمشاد هیرکانی یا خزری بود (شکل 2). محصولات مورد استفاده در این تحقیق شامل سوپرپرسیدین، پرسیدین 15%، پرسیدین پلاس و پرسیدین آکوا بود. محصول پرسیدین 15% حاوی 15% پراستیک اسید، سوپر پرسیدین حاوی 22% پراستیک اسید و پرسیدین آکوا نیز حاوی 46% آب اکسیژنه و 07/0 درصد نیترات نقره بود که با حجمهای (200، 400 و 600 میکرولیتر در لیتر) در محیط کشت مورد استفاده قرار گرفتند.
نمونهبرداری بصورت سرشاخه و بذر از گونه شمشاد هیرکانی انجام گرفت (شکل 3). نمونهبرداری در اردیبهشت ماه و از سرشاخههای جوان انجام گرفت. برای تهیه ریزنمونه ابتدا بذرها از داخل کپسول جدا شده و سرشاخهها نیز به قطعات 2-3 سانتیمتری برش داده شد. سه پایه درختی بطور تصادفی انتخاب و نمونهگیری از این پایهها انجام گرفت. ابتدا در آزمایشگاه به منظور پیش سترونسازی، ریزنمونهها به مدت 5 دقیقه در آب با چند قطره مایع ظرفشویی مورد شستشوی قرار گرفتند و سپس به مدت 10 دقیقه در قارچکش بنومیل (1%) قرار گرفتند. بعد از آبشویی، در زیر هود استریل، استریلیزاسیون ریزنمونهها با روش معمول شامل استفاده از اتانول 96 درصد و هیپوکلریت سدیم (1، 2 و 4 درصد) و شستشو با آب مقطر سه بار به مدت 10 دقیقه انجام گرفت. بعد از استریلیزاسیون ریزنمونهها، مواد گیاهی بر روی محیط کشت موراشی و اسکوگ قرارگرفتند که حاوی حجمهای مختلفی از محصولات ضدعفونی کننده بودند (200، 400 و 600 میکرولیتر) (جدول 1). در این روش، مواد ضدعفونی کننده پرسیدین 15%، پرسیدین آکوا، سوپر پرسیدین و پرسیدین پلاس در دوزهای مختلف به محیط کشت MS بعد از رسیدن به دمای 50 درجه با استفاده از فیلتر 2/0 میکرولیتر افزوده شد و سپس، ریزنمونهها به روش معمول استریل شده و در محیطهای کشت قرار داده شد.
جدول 1- ترکیب انواع حجمهای مختلف ضدعفونی کننده با محیط کشت در کاهش آلودگی از ریزنمونههای شمشاد هیرکانی
|
ردیف |
|
تیمارهای ضدعفونی |
|
|
1 |
محیط کشت MS+ پرسیدین 15% (200، 400 و 600 میکرولیتر) |
||
|
2 |
محیط کشت MS+ پرسیدین آکوا (200، 400 و 600 میکرولیتر) |
||
|
3 |
محیط کشت MS+ سوپر پرسیدین (200، 400 و 600 میکرولیتر) |
||
|
4 |
محیط کشت MS+ پرسیدین پلاس (200، 400 و 600 میکرولیتر) |
||
برای اندازهگیری آلودگی، کشتها در شرایط رشدی با دمای 1±25 درجه سانتیگراد با شدت نور 1000 تا 1500 لوکس 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی قرار داده شدند. بررسی آلودگی (آماربرداری) بصورت هفتگی انجام گرفت و تا یک ماه ادامه داشت. در پایان، آلودگیهای قارچی و باکتریایی مورد شناسایی قرار گرفت.
طرح آزمایشات تحقیق بصورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی است. تجزیه و تحلیلهای آماری توسط نرم افزار SPSS نسخه 16 انجام شد. باقیماندههای مدل، توسط آزمون کولموگروف-اسمیرنوف (برای نرمال بودن دادهها) بررسی گردید. همچنین به منظور انجام آنالیز چند متغیره، متغیرهای نوع ریزنمونه، ماده استریل کننده و حجم استریل کننده در محیط کشت مورد بررسی قرار گرفتند. پارامترهای مورد اندازه گیری شامل درصد آلودگی در ریزنمونه های مختلف (سرشاخه و بذر) همچنین در مواد ضدعفونی کننده مختلف و همچنین در حجمهای مختلف بود.
نتایج
نتایج بررسی نرمالیته دادهها با استفاده از آزمون کولموگروف-اسمیرنوف بر روی باقیماندههای مدل حاکی از نرمال بودن دادهها بود (05/0 P≥). در ابتدا آزمون تی مستقل بر روی دادههای حاصل از دو ریزنمونه سرشاخه و بذر انجام گرفت. نتایج نشان داد که میزان آلودگی در ریزنمونه سرشاخه بیشتر از ریزنمونه بذر بود (T=2.170, P≤0.05) (شکل 2).
شکل 2 - نتایج آزمون تی مستقل بر روی داده های حاصل از دو ریزنمونه سرشاخه و بذر
جدول 2، نتایج آنالیز واریانس دادهها را نشان میدهد. نتایج حاکی از معنیدار بودن پارامترهای نوع ریزنمونه، نوع ضدعفونی کننده و حجم ضدعفونی کنندهها بود (01/0P≤). همچنین، نتایج نشان داد که اثرات متقابل معنیداری بین نوع ریزنمونه × ماده ضدعفونی کننده، بین نوع ریزنمونه × حجم ضدعفونی کننده (01/0P≤) و همچنین، بین نوع ریزنمونه × ماده ضدعفونی کننده × حجم ضدعفونی کننده وجود داشت (05/0P≤).
جدول 2- نتایج آنالیز واریانس کل دادهها در محیط کشت در ترکیب با ضدعفونی کنندههای پرسیدین 15%، سوپر پرسیدین، آکواپرسیدین و پرسیدین پلاس
|
منبع تغییرات |
مجموع مربعات |
درجه آزادی |
میانگین مربعات |
میزان F |
معنی داری |
|
ریزنمونه |
510/110 |
1 |
510/110 |
573/602 |
000/0 |
|
ماده استریل کننده |
781/998 |
3 |
927/332 |
573/203 |
000/0 |
|
حجم ضدعفونی کننده |
448/578 |
3 |
816/192 |
900/117 |
000/0 |
|
ریزنمونه × ماده ضدعفونی کننده |
281/77 |
3 |
760/25 |
752/15 |
000/0 |
|
ریزنمونه× حجم ماده ضدعفونی کنند |
448/30 |
3 |
149/10 |
206/6 |
001/0 |
|
ماده ضدعفونی کننده× حجم ماده ضدعفونی کننده |
094/381 |
9 |
344/42 |
892/25 |
000/0 |
|
ریزنمونه× ماده ضدعفونی کننده× حجم ماده ضدعفونی کننده |
260/36 |
9 |
029/4 |
464/2 |
018/0 |
|
خطا |
667/104 |
64 |
635/1 |
|
|
|
کل |
000/13049 |
96 |
|
|
|
مقایسه میانگین دادهها با استفاده از آزمون چند دامنهای دانکن نشان داد که در ضدعفونی کنندههای مختلف بدون توجه به نوع ریزنمونه بدون احتساب شاهد در هر تیمار، میزان آلودگی بصورت ذیل بود: پرسیدین 15%>پرسیدین پلاس> آکوا پرسیدین> سوپر پرسیدین (شکل 3).
مقایسه اثرات تیمارهای مرکب ماده استریل کننده و حجمهای مختلف آنها در آلودگی ریزنمونه سرشاخه: مقایسه اثرات ضدعفونی کنندههای مختلف در ریز نمونه سرشاخه حاکی از آن بود که پرسیدین 15% بیشترین درصد آلودگی را نشان داد و کمترین میزان آلودگی در ماده استریل کننده سوپرپرسیدین مشاهده شد (شکل 4). میزان آلودگی در شرایط کنترل و رفع آلودگی تحت تیمار سوپر پرسیدین و پرسیدین 15% در ریزنمونه سرشاخه در شکل (5) قابل مشاهده است.
شکل 3- مقایسه میانگین دادهها در استریل کنندههای مختلف بدون توجه به نوع ریزنمونه بدون احتساب شاهد در هر تیمار
شکل 4- مقایسه اثرات ضدعفونی کنندههای مختلف در ریزنمونه سرشاخه
شکل 5- میزان آلودگی تحت تیمارهای مختلف: الف) سوپرپرسیدین، ب) پرسیدین 15% و ج) کنترل
نتایج مقایسات میانگین دانکن نشان داد که در حجم صفر یا تیمار شاهد بیشترین میزان آلودگی مشاهده شد و کمترین آلودگی در حجمهای مختلف سوپر پرسیدین اتفاق افتاد که میزان 400 و 600 میکرولیتر کمترین میزان آلودگی بود اما در 600 میکرولیتر سوختگی نهال اتفاق افتاد (شکل 6).
شکل 6- مقایسه تیمارهای مرکب ماده استریل کننده در حجمهای مختلف (0، 200، 400 و 600 میکرولیتر) در ریزنمونه سرشاخه
مقایسه اثرات تیمارهای مرکب ماده استریل کننده و حجمهای مختلف آنها در آلودگی ریز نمونه بذر: مقایسه اثرات ضدعفونی کنندههای مختلف در ریز نمونه بذر نتایج حاکی از آن بود که بیشترین درصد آلودگی در پرسیدین 15% و پرسیدین پلاس مشاهده شد و کمترین میزان آلودگی در ماده استریل کننده سوپرپرسیدین مشاهده شد (شکل 7).
نتایج بررسی تیمارهای مرکب نشان داد که در حجم صفر یا تیمار شاهد بیشترین میزان آلودگی مشاهده شد و کمترین آلودگی در حجمهای مختلف سوپر پرسیدین اتفاق افتاد که میزان 400 و 600 میکرولیتر کمترین میزان آلودگی بود (شکل 8) ولی در 600 میکرولیتر سوختگی نهال اتفاق افتاد (شکل 9).
شکل 7- مقایسه اثرات ضدعفونی کنندههای مختلف در ریزنمونه بذر
شکل 8- تیمارهای مرکب انواع استریل کنندههای مورد استفاده در حجمهای مختلف (0، 200، 400 و 600 میکرولیتر) در ریزنمونه بذر
شکل 9- سوختگی نهال در 600 میکرولیتر سوپر پرسیدین در محیط کشت
شناسایی عوامل بیماریزا در محیطهای کشت با ضدعفونی کنندههای مختلف در حجمهای متفاوت: در این آزمایش، تشخیص آلودگیهای قارچی و باکتریایی بصورت مورفولوژیکی و با استفاده از کلیدهای شناسایی انجام گرفت. به طور کلی، منبع اصلی آلودگی در مطالعه حاضر منشا قارچی مشاهده شد (99%) و آلودگی باکتریایی ( 1٪) بود. در آلودگی های حاصله جنسهای Penicillium sp.، Cladosporium sp.، Fusarium sp.، Alternaria sp. و Botrytis sp. شناسایی شدند. تشخیص آلودگیهای باکتریایی انجام گرفته حاکی از شناسایی باکتری جنس Bacillus sp. در محیطهای کشت بود.
بحث و نتیجه گیری
پراستیک اسید (PAA) محصول زیستی قابل تجزیه با خاصیت قارچ کشی و باکتریکشی بسیار موثری است که در برابر طیف گستردهای از میکروارگانیسمها قابل استفاده است (14). پراستیک اسید یک اسید آلی است که از واکنش اسید استیک و پراکسید هیدروژن ایجاد میشود (10). بطورکلی، سالها است که خواص ضدمیکروبی ترکیبات پراکسید هیدروژن شناخته شده است و کاربردهای گوناگونی دارد که به عنوان ضد عفونی کننده (12) و اسپورکش استفاده میشود و براساس گزارشات، پراستیک اسید یکی از موثرترین مواد زیست کش است که هم در محلول آبی و هم به عنوان آئروسل یا بخار استفاده میشود (13). این ماده حتی به عنوان ترکیب آنتی وایرال نیز پیشنهاد شده است (15). در تحقیق حاضر نیز محصولات مختلف پرسیدین، سوپر پرسیدین، آکواپرسیدین و پرسیدین پلاس به عنوان ماده ضدعفونی کننده قابل استفاده در محیط کشت مورد استفاده قرار گرفت. نتایج نشان داد پارامترهای نوع ریزنمونه، نوع ضدعفونی کننده و حجم ضدعفونی کنندهها در کنترل و مهار آلودگیها موثر بودند. اگر چه نوع گونه، نوع ریزنمونه، سن، فصل نمونهبرداری و شرایط آب و هوایی بر آلودگی در ریزنمونهها اثر میگذارد (21) ولی در هر صورت ریزنمونههای جمع آوری شده از اکوسیستمهای طبیعی آلودگیهای سطحی بسیاری دارند و کنترل آلودگیهای آن از جمله چالشهای بزرگ و مهم در کشت بافت گیاهی است که معمولا زمانبر و پرهزینه است (11). همچنین، نتایج نشان داد که میزان آلودگی در ریزنمونه سرشاخه بیشتر از ریزنمونه بذر بود که بر لزوم استریل ریزنمونهها قبل از کشت صحه گذاشت که مشابه نتایج سعیدی حیدری و صفرنژاد (1394) بود (2). از جمله دلایل بروز آلودگی بیشتر در ریزنمونههای سرشاخه در مقایسه با بذر میتوان به بافت ریزنمونه و همچنین، مدت تماس بیشتر ریزنمونهها با محیط اشاره نمود (7). نتایج این پژوهش نشان داد که بذور جمعآوری شده از رویشگاه طبیعی آلوده بودند و قادر به جوانهزنی در شرایط درون شیشهای نبودند. در رویشگاه طبیعی به علت وجود رقابت، شرایط آب و هوایی و رویشگاه و انتخاب طبیعی، زادآوری تحت تاثیر قرار میگیرد بطوریکه سبب در خطر انقراض قرار گرفتن این گونه باارزش جنگلی شده است. مقایسه ضدعفونی کنندههای مختلف بدون توجه به نوع ریزنمونه بدون احتساب شاهد در هر تیمار نشان داد میزان آلودگی بدین صورت بود: پرسیدین 15%>پرسیدین پلاس> آکوا پرسیدین> سوپر پرسیدین.
نتایج مقایسات حجمهای مختلف ضدعفونی کنندههای مختلف در ریزنمونه سرشاخه نشان داد که در حجم صفر یا شاهد، بیشترین میزان آلودگی مشاهده شد و کمترین آلودگی در حجمهای مختلف سوپر پرسیدین اتفاق افتاد که میزان 400 و 600 میکرولیتر کمترین میزان آلودگی بود ولی در 600 میکرولیتر سوختگی نهال اتفاق افتاد که سرشاخه را دچار سوختگی نمود و زندهمانی ریزنمونه را تحت تاثیر قرار داد که احتمالا به دلیل افزایش میزان ماده موثره استریل کننده میباشد. لذا دوز مناسب جهت استعمال در محیط کشت جهت کنترل آلودگی ریزنمونه سرشاخه در گونه شمشاد هیرکانی 400 میکرولیتر معرفی میگردد که مشابه نتیجه ربانی نسب (1400) است که در تحقیق ایشان سوپرپرسیدین 400 میکرولیتر در محیط کشت PDA توانست بطور معنیداری قارچهای Geotrichum candidum و Penicillium digitatum را کنترل کند (1).
مقایسه اثرات ضدعفونی کنندههای مختلف در ریز نمونه بذر نشان داد که بیشترین درصد آلودگی در پرسیدین 15% و پرسیدین پلاس مشاهده شد و کمترین میزان آلودگی در ماده استریل کننده سوپرپرسیدین مشاهده شد. مکانیسم عمل پراستیک اسید به عنوان ماده اصلی استریل کننده در سوپرپرسیدین بدین صورت است که این ماده قادر به تخریب انواع ماکرومولکولها شامل کربوهیدراتها، اسیدهای نوکلئیک، لیپیدها و اسیدهای آمینه بوده و با لیز سلولی باعث مرگ میکروارگانیزمها میشود. پرسیدین از طریق اکسیداسیون غشای خارجی سلولهای رویشی باکتری، اندوسپور، مخمرها و هاگ قارچ ها باعث مرگ عوامل فوق شده و محیط را ضدعفونی می کند. این ماده با واکنش با پروتئینها و آنزیمهای سلولی به روشی مشابه سایر عوامل اکسید کننده عمل میکند (14).
نتایج بررسی تیمارهای مرکب نشان داد که در حجم صفر یا تیمار شاهد بیشترین میزان آلودگی مشاهده شد و کمترین آلودگی در حجمهای مختلف سوپر پرسیدین اتفاق افتاد که میزان 400 و 600 میکرولیتر کمترین میزان آلودگی بود ولی در 600 میکرولیتر اثرات خشکیدگی یا سوختگی بر روی سطح بذر مشاهده شد. مواد موثره در ماده استریل کننده سوپرپرسیدین شامل پراستیک اسید، هیدروژن پراکساید و اسید استیک گلاسیال است. پراستیک اسید با توجه به طیف وسیع فعالیت شیمیایی خود، توانایی از بین بردن کلیه اشکال میکروبی را دارد و مقاومت میکروبی ایجاد نمیکند. طبق ISIR (پروتکل 6986 موسسه استانداردها و تحقیقات صنعتی ایران)، PAA به دلیل قدرت بالایی در کاهش شدت جمعیت میکروبی خصوصاً در مهمترین گونههای قارچی دارد (18). اگرچه در بسیاری از پژوهشها استفاده از پرسیدین (پراکسی استیک اسید) حتی در درصدهای پایین نیز موثر بوده است (4) ولی در خصوص گونه جنگلی شمشاد بدلیل آلودگی بسیار در اکوسیستم جنگلی این استریل کننده کارایی چندانی نداشت ولی سوپرپرسیدین با داشتن مواد موثرهای همچون پراکسی استیک اسید، حاوی هیدروژن پراکساید و اسید استیک گلاسیال کارایی بالاتری را در مهار آلودگیها در محیط نشان داد. اما در استفاده از این ترکیبات توجه به دز مصرفی بسیار مهم است چرا که ممکن است علاوه بر سرکوب عامل بیماریزا سبب آسیب جدی به گیاه شود (19).
در پژوهش حاضر، قارچهای Penicillium sp.، Cladosporium sp.، Fusarium sp.، Alternaria sp. و Botrytis sp. و باکتری Bacillus sp. مشاهده شد که از جمله آلودگیهای معمول در محیط کشتها هستند (18). در مطالعات انجام گرفته، چندین مطالعه فعالیت ضد قارچی ترکیبات حاوی PAA را علیه Penicillium digitatum وBotrytis cinerea Monilinia laxa و Rhizopus stolonifer و بسیاری از عوامل بیماریزا دیگر گزارش کرده است. همچنین قدرت ضدباکتریایی پراستیک اسید بر روی باکتریهای سودوموناس، انتروکوک و استافیلوکوک در زمینه پزشکی گزارش شده است (16). از آنجایی که آلودگیهای قارچی و باکتریایی از جمله چالشهای مهم در کشت بافت گیاهی محسوب میشوند کنترل و مهار آنها میتواند صرفهجویی بسیاری در زمان و هزینههای یک پژوهش به همراه داشته باشد.
یافتن روش و ماده ضدعفونی کننده مناسب برای کشت بافت هر گونه گیاهی قبل از انجام آزمایشات علمی و بویژه ریزازدیادی و تکثیر تجاری آنها از اهمیت بسیاری در دنیا برخوردار است. از آنجایی که عموما مواد استریل کننده قبل از کشت و برروی ریزنمونهها اعمال میشود استفاده از این مواد در محیط کشت نیز میتواند آلودگی را تا حد بسیار زیادی کاهش دهد. در خصوص استعمال مواد ضدعفونی کننده مورد استفاده در این تحقیق، ماده سوپرپرسیدین میتواند به عنوان یک ضدعفونی کننده با عملکرد مناسب در کاهش آلودگیهای قارچی و باکتریایی محیط کشت مورد استفاده برای کشت گونه شمشاد هیرکانی قرار گیرد. پیشنهاد میگردد این ماده برای دیگر گونههای جنگلی نیز مورد آزمون قرار گیرد.
سپاسگزاری
لازم است از مدیریت محترم شرکت بهبان شیمی جناب آقای کرجالیان و همچنین سرکار خانم دکتر کاویان و خانم دکتر حاتم زاده که زمینه انجام این پژوهش را فراهم آوردند، تشکر و قدردانی گردد. همچنین، از زحمات جناب آقای دکتر ابوالفضل فرجی ریاست محترم مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی گلستان و آقای دکتر علیرضا کیانی معاونت محترم سابق مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی گلستان که ما رادر پیشبرد اهداف این پژوهش یاری نمودند، کمال تشکر را داریم.
مجله پژوهش‌های گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)