Improvement of thymol and carvacrol production in thyme plant medicinal through the synergistic effect of UV-B radiation and salicylic acid hormone

Document Type : Research Paper

Author
Mohammad Abyari
Department of Science, Farhanghiyan University, Tehran, Iran
10.22034/jpr.2025.2244
Abstract
Thyme has attracted the attention of researchers because of its antioxidant, antimicrobial, and anticancer properties, which are due to some active compounds such as thymol and carvacrol. Elicitors are recognized as a potential tool for increasing valuable secondary metabolites. Therefore, this study was carried out to determining the effect of UV-B and salicylic acid on the biosynthesis pathway of thymol and carvacrol, and to understanding its molecular mechanism. To perform the experiment, thyme seeds were planted in plastic pots under greenhouse conditions in a completely randomized design with three replications. Seedlings were simultaneously sprayed by 1 mM salicylic acid and irradiated by UV-B. The results showed that the expressions of DXR, GTS, CYP178, and CYP180 genes were significantly increased after 24 h of treatment. This increase was greater in the simultaneous use of both elicitors, indicating the combined effect of salicylic acid and UV-B. After 48 and 72 h of treatment, the expressions of genes involved in the biosynthesis of thymol and carvacrol were decreased, indicating the plant's use of defense mechanisms to alleviate the symptoms of stress caused by the salicylic acid signaling pathway. Assay of thymol and carvacrol metabolites supported the results of gene expression. In general, it can be concluded that the highest expression levels of thymol and carvacrol biosynthetic genes and their metabolic content in thyme can be achieved 24 h after simultaneous treatment by salicylic acid and UV-B.

Keywords

Subjects

بهبود تولید تیمول و کارواکرول در گیاه داروئی آویشن از طریق تاثیر هم­افزائی
اشعه UV-B و هورمون سالیسیلیک اسید

محمّد آبیاری*

ایران، تهران، دانشگاه فرهنگیان، گروه علوم پایه

تاریخ دریافت: 26/02/1401          تاریخ پذیرش: 28/09/1401

چکیده

آویشن بدلیل خواصی نظیر آنتی‌اکسیدان، ضدمیکروب و ضدسرطان که ریشه در وجود ترکیباتی فعالی مثل تیمول و کارواکرول دارد، در کانون توجه محققان قرار گرفته است. الیسیتورها بعنوان ابزاری بالقوه جهت افزایش متابولیت­های ثانویه باارزش شناخته شده­اند. بنابراین، این مطالعه با هدف تعیین تاثیر اشعه UV-B و سالیسیلیک­اسید بر مسیر بیوسنتز تیمول و کارواکرول و شناخت سازوکار مولکولی آن انجام شد. جهت اجرای آزمایش، بذور آویشن در گلدان­های پلاستیکی تحت شرایط گلخانه­ای و در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار کاشته شدند. گیاهچه­های مرحله پنج­برگی با سالیسیلیک­اسید 1 میلی‌مولار محلول پاشی و به طور همزمان با UV-B پرتودهی فرابنفش شدند. نتایج نشان داد که بیان ژن­های DXR، GTS، CYP178 و CYP180 بعد از گذشت 24 ساعت از اعمال تیمارها با افزایش معنی­داری همراه بود و این افزایش در کاربرد همزمان هر دو الیسیتور بیشتر بود که گویای اثر هم­افزائی سالیسیلیک­اسید و UV-B است. بعد از گذشت 48 و 72 ساعت از اعمال تیمارها، بیان ژن­های درگیر بیوسنتز تیمول و کارواکرول با کاهش همراه بود که گویای استفاده گیاه از سازوکارهای دفاعی برای تخفیف علائم تنش ناشی از مسیر پیام­رسان سالیسیلیک­اسید است. سنجش متابولیت­های تیمول و کارواکرول از نتایج بیان ژن حمایت کرد. در کل، اینگونه می­توان نتیجه گرفت که با استفاده از تیمار توام سالیسیلیک­اسید و UV-B در 24 ساعت بعد از تیمار به بیشترین سطح بیان ژن­های بیوسنتز تیمول و کارواکرول و متعاقبا محتوی متابولیتی آنها در آویشن دست یافت.

واژه های کلیدی: آویشن، سالیسیلیک­اسید، UV-B، کارواکرول، تیمول

* نویسنده مسئول، تلفن:                ، پست الکترونیکی: m.abyari@cfu.ir.

مقدمه

 

آویشن (Thymus vulgaris) یکی از گیاهان دارویی مهم تیره نعناعیان به شمار می­آید که در نواحی مدیترانه­ای یافت می‌شود (16). در صنعت غذا، این گیاه دارویی به عنوان طعم­دهنده غذا مورد توجه قرار گرفته است و در صنعت دارو، به شکل عصاره، روغن و پودر برای مصارف ضدمیکروبی، ضدروماتیسم، ضدتومور، ضداسپاسم، ضد دیابت و آنتی‌اکسیدان مورد استفاده قرار می­گیرد (28). چنین خواص مهمی به حضور برخی متابولیت­های ثانویه موجود در بافت­های آویشن نسبت داده شده است (16).

در میان ترکیبات فعال آویشن، تیمول و کارواکرول بخاطر خصوصیات درمانی متنوع خود بیشتر از سایرین مورد توجه قرار گرفته­اند (27). تیمول یک ترکیب فنولی با ساختار 5-ایزوپروپیل-2-متیل فنول می­باشد که تفاوت آن با کارواکرول در جایگاه یک گروه هیدروکسیل است. در واقع، تیمول ایزومر کارواکرول است و بویی شبیه به کارواکرول از خود نشان می­دهد (2). یافته­های حاصل از نتایج آزمایشات بالینی حاکی از آن است که تیمول و کارواکرول از خصوصیات متنوع بیولوژیکی مانند اسپاسمولیتیک، ضد التهاب، ضد سرطان، ضد قارچ، ضد باکتری و آنتی‌اکسیدان برخودار هستند (8). درنتیجه، مطالعات روز افزونی به سمت فهم جنبه­های مولکولی مختلف این دو ترکیب، از شناسایی دقیق مسیر بیوسنتز و تنظیم آن تا تعیین مکانیسم­های اثرگذاری درمانی، هدف­گذاری می­شوند.

مسیر بیوسنتز تیمول و کارواکرول متشمل بر هفت واکنش آنزیمی است (9). در این مسیر، نخست پیروات و دی­گلسیر آلدهید 3-­فسفات با یکدیگر ترکیب می­شوند و پس از پشت­سرگذاری واکنش­های بیوشیمایی لازم، ترکیب دی­اکسی زایلوز 5-­فسفات (DXP) به وجود می­آید که بعنوان پیش­ماده ترپنوئیدها تلقی می­شود. این ترکیب نیز به واسطه فعالیت آنزیمی 1 دی­اکسی زایلوز 5-فسفات ردکتوایزومراز (DXR)، 2 سی متیل اریتریتول 4-فسفات (MEP) را تولید می­کند. بعد از پشت­سرگذاری واکنش­های بیوشیمایی، MEP تبدیل به ژرانیل 2-فسفات (GP) می­شود که این ترکیب نیز به نوبه خود توسط گاماترپینن سنتاز (TPS) سبب تولید گاماترپینن می­شود که پیش­ماده تیمول و کارواکرول به شمار می­آید. در گام آخر، سیتوکروم­های P450 موجبات تولید تیمول و کارواکرول از پیش­ماده گاماترپینن را فراهم می­کنند (شکل1) (9).

 

 

شکل 1- مسیر بیوسنتز تیمول و کارواکرول (8).

 

 

با شناخت مسیر متابولیکی تیمول و کارواکرول و مکانیسم­های تنظیمی آن‏، تلاش­های محققان معطوف بهینه­سازی و افزایش تولید این ترکیبات از طریق تکنیک­های مهندسی متابولیت، کشت­بافت و ریشه موئین شده است (15). در پلت­فرم­های کشت­بافت، بهینه­سازی محیط کشت، افزودن پیش­سازها و استفاده از الیسیتورها از جمله تلاش­هایی هستند که توسط بیوتکنولوژیست­ها به منظور افزایش بازدهی تولید آزمایشگاهی متابولیت­ها اتخاذ می­شوند (19). الیسیتورها عوامل زیستی (مثل فیتوپلاسما) و غیرزیستی (مثل ترکیبات شیمیایی) متنوعی را شامل می­شوند که باعث بروز تغییرات قابل­توجهی در فرایندهای فیزیولوژیکی و متابولسیم متابولیت­های ثانویه گیاهان می­شوند (6 و 26). تغییر بیوسنتز و تجزیه متابولیت­های ثانویه بر اثر تیمار الیسیتورها بدان دلیل است که این ترکیبات نقش دفاعی در گیاهان بر عهده دارند و لذا سطح آن‌ها در اثر اعمال تنش‏های زیستی و غیرزیستی (منجمله الیسیتورها) با تغییر مواجه می­شود.

با توجه به نقش سالیسیلیک­اسید در تحریک واکنش‌های دفاعی گیاهان (22)، این ترکیب از پتانسیل قابل­توجهی برای افزایش تولید متابولیت‎های ثانویه در گیاهان دارویی برخودار است (1). در پژوهشی، Capite و همکاران (2016) نشان دادند که کاربرد خارجی سالیسیلیک­اسید منجر به افزایش دو برابری محتوی گلیکوزیدهای ترپنوئید در گیاه دارویی Actaea racemosa می­شود (3). علاوه بر ترکیبات شیمیایی، مطالعات اخیر حاکی از نقش اشعه فرابنفش در تنظیم متابولیسم ترکیبات فعال گیاهان است (23). در تحقیقی، Ramani و همکاران (2007) مدارکی آزمایشی دال بر این امر ارائه دادند که استفاده از لامپ­های UV-B باعث افزایش سه برابری کاتارانتین در گیاه دارویی Catharanthus roseus می­شود (20). هرچند تاثیرات این الیسیتور سالیسیلیک­اسید و UV-B به طور مجزا بر تجمع متابولیت‎های ثانویه در گیاهان داروئی مورد بررسی قرار گرفته است، با اینحال نحوه پاسخ هم­افزائی گیاهان به حضور هر دو الیسیتور شیمیایی و اشعه­ای هنوز به شکل سوال در پیکره منابع علمی باقی مانده است.

با توجه به اهمیت ترکیبات تیمول و کارواکرول در آویشن و نقش ژن‌های کلیدی DXR، GTS، CYP178 و CYP180 در تولید این دو ترکیب باارزش، این مطالعه با هدف بررسی اثر هم­افزائی اشعه UV-B و سالیسیلیک­اسید بر بیوسنتز تیمول و کارواکرول انجام شد.

مواد و روشها

مواد گیاهی و تیمار آزمایشی: بذور آویشن از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی ایران تهیه و سپس جهت ضدعفونی، به‌مدت 30 ثانیه در الکل 70%، 3 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم 3% و 3 بار با آب مقطر شستشو شدند. بذور ضدعفونی­شده در گلدان­های پلاستیکی حاوی خاک­برگ پوسیده، خاک باغچه، ماسه گلخانه­ای با نسبت 1:2:3 تحت شرایط گل‏خانه (دمای 25 درجه­سانتی­گراد روز، دمای 20 درجه­سانتی­گراد روز، فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی، رطوبت نسبی 60 درصد) به شکل طرح کاملا تصادفی با سه تکرار کشت شدند. در مرحله پنج­برگی، سالیسیلیک­اسید (SA) با غلظت 1 میلی‌مولار در سه نوبت با فاصله 5 روز یکبار بر روی برگ‌ گیاهان آویشن محلول­پاشی شد (5). همزمان با تیمار سالیسیلیک­اسید، اشعه فرابنفش از طریق در معرض قراردادن گیاهیچه­ها با لامپ­های UV-B (280 تا 320 نانومتر) در پنج نوبت 1 ساعته با فاصله 3 روز یکبار اعمال شد (23). در کل، تیمارهای آزمایشی عبارت بودنداز: کنترل پیش­تیمار (قبل از اعمال تیمارها)، کنترل پس­تیمار برای 24، 48 و 72 ساعت بعد از اتمام اعمال تیمارها، سالیسیلیک­اسید 1 میلی­مولار، اشعه UV-B و تیمار ترکیبی سالیسیلیک­اسید و UV-B. نمونه‌گیری 24 ساعت بعد از اتمام اعمال تیمارها انجام گرفت. از ورقه­های پلاستیکی ضدفرابنفش برای جداسازی بخش­ها و ممانعت از عبور نور بین آنها استفاده شد. لامپ­های فرابنفش در فاصله 30 سانتی­متری بالای گلدان­ها قرار گرفتند. برگ گیاهان شاهد نیز با آب مقطر استریل تحت محلول­پاشی و با تابش نور معمولی تحت تیمار قرار گفتند. تا زمان انجام آنالیز بیان ژن، نمونه‌های گیاهی در دمای80– درجه سانتی‏گراد در فریزر نگه‏داری شدند.

استخراج DNA، طراحی آغازگرها و RT-PCR: نخست،  RNAاز نمونه­های برگی آویشن با استفاده از روش ترایزول استخراج شد (12). به طور خلاصه، 1 میلی‌لیتر ترایزول به ازای 1/0 گرم بافت تازه بکار رفت. نمونه‏های RNA با آنزیم DNase1 تیمار شدند تا ‏ RNA خالص و عاری از DNA بدست آید. غلظت  RNAبا دستگاه نانودراپ در طول موج‏های 280 و 260 نانومتر و کیفیت RNA نیز بر روی ژل آگارز 2/1 درصد بررسی شد. سنتز DNA مکمل (cDNA) با استفاده از کیت سنتز cDNA شرکت سیناژن مطابق دستورالعمل شرکت استفاده شد.

طراحی آغازگرهای مرتبط با ژن­های DXR، GTS، CYP178 و CYP180، با استفاده از اطلاعات ژنی NCBI و نرم‌افزار Primer3 انجام شد (جدول 1). در اینجا، سه تکرار بیولوژیکی (تعداد تکرار برای هر تیمار) و سه تکرار تکنیکی (تعداد تکرار برای هر نمونه) درنظرگرفته شد. واکنش Real-time PCR شامل 2 میکرولیتر cDNA (1 μg/μl)، 3 میکرولیتر SYBR (5X)، 1 میکرولیتر Primer F (10 pmol/μl)، 1 میکرولیتر Primer R (10 pmol/μl) و 15 میکرولیتر ddH2O بود که بعد از تهیه و رقیق­سازی به 100 میکرولیتر، از 5 میکرولیتر بعنوان الگو برای اجرای واکنش با رنگ SYBR Green (شرکت اینویتروژن) استفاده گردید. جهت اندازه­گیری بیان این ژن‏ها از 18s-rRNA به‏عنوان ژن مرجع استفاده شد.

 

جدول 1- نام، توالی و دمای اتصال آغازگرهای مورداستفاده در این مطالعه.

دمای اتصال

توالی آغازگر (3→ 5)

نام آغازگر

59~

TGGCCTTTGGAAGCGTCG

F-CYP178

TCAGGCTCATTCCAATAGAGG

R-CYP178

60~

GGTAAACTGGCGGACTTGGT

F-CYP180

CGAACGGGATTAACTCGAAA

R-CYP180

61~

CTCTTGGATTCAGACTCCTCAG

F-GTS

GAGGGAGAGCCAAAGAATG

R-GTS

61~

GCCTTTTGTCCTTCCTCTTG

F-DXR

TCCGCTCGATGCTTGTCGC

R-DXR

60~

ATGTTTAGAAGGGTGAGTGAGCAGTTTAC

18s-F

GCCTCATCATCATACTCTTCCTCATCATC

18s-R

 

 

 

 

اندازه­گیری محتوی تیمول و کارواکرول: جهت تعیین غلظت تیمول و کارواکرول در برگ­های آویشن، کروماتوگرافی مایع با کار آیی بالا HPLC انجام شد. جهت آماده­سازی برای عصاره­گیری، نخست نمونه­ها در دمای 25 درجه سانتی­گراد و تاریکی خشک شده و سپس 5/0 گرم بافت خشک خردشده با  25 میلی­لیتر اتانول 80 درصد ترکیب شد. بعد از فرایند استخراج در دمای  25 درجه سانتی­گراد به مدت  2 ساعت بر روی شیکر، محلول بدست­آمده با کاغذ صافی واتمن فیلتر شد. بعد از سانتریفیوژ با دور 400 rpm به مدت 5 دقیقه، محلول کاملاً شفاف توسط دستگاه تبخیرکننده چرخان خشک شد. از هر نمونه، محلول استوک (1000پی پی ام) توسط حلال متانول تهیه شد که این محلول­ها برای سنجش غلظت تیمول و کارواکرول بکار گرفته شدند. در ادامه، 50 میکرولیتر از عصاره به دستگاه  HPLC (مجهز به آشکارساز UV و ستون C18 با اندازه ذرات 5 میکرومتر، قطر  4 میلی­متر و طول250 میلی­متر) تزریق شد. سنجش کارواکرول و تیمول در طول موج 280نانومتر صورت گرفت. برای آنالیز کمی ترکیبات، بعد از تزریق محلول­های استاندارد با غلظت­های مشخص و به حصول سطح زیر پیک هر کدام، منحنی کالیبراسیون هر ترکیب رسم شد و توسط معادله خطی منحنی کالیبراسیون، مقدار هر ترکیب در عصاره­های آویشن برآورد شد (9).

 

آنالیز داده­ها

داده­ها با استفاده از تجزیه واریانس و مقایسه میانگین به روش دانکن در نرم­افزارSAS  نسخه 9.4 در سطح 5 درصد آنالیز شدند. بعد از آنالیز داده­ها و تعیین اختلاف معنی­داری مابین نمونه­ها، نمودار­های حاصل از آنالیز بیان ژن به کمک Excel 2010 ترسیم شدند. از روش کمی‌سازی نسبی DDCT نیز برای بررسی تغییرات کمی بین نمونه­ها استفاده شد (18).

نتایج

بیان ژن DXR تحت تاثیر اشعه UV-B و هورمون اسیدسالیسیلیک: بیان ژن رمزگردان آنزیم 1 دی­اکسی زایلوز 5-فسفات ردکتوایزومراز (DXR) به طور معنی­داری (در سطح 1 درصد) بر اثر تیمارهای سالیسیلیک­اسید و UV-B افزایش یافت. مابین شاهد پیش­تیمار با شاهد 24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمارها اختلاف معنی­داری وجود نداشت لذا اثر هر تیمار با شاهد همتراز از نظر زمانی مقایسه شد. در دوره زمانی 24 ساعت، بیان ژن DXR در تیمار سالیسیلیک­اسید، UV-B و تیمار ترکیبی آنها به ترتیب 65، 83 و 186 درصد نسبت به کنترل افزایش یافت. اما بعد از گذشت 48 ساعت، بیان این ژن در تیمار سالیسیلیک­اسید، UV-B و تیمار ترکیبی آنها کاهش یافت. بعد از 72 ساعت نیز، سطح بیان DXR تقریبا معادل با 48 ساعت بعد از تیمار بود (شکل 2).

 

شکل 2- بیان ژن DXR پس از اعمال اشعه UV-B و هورمون سالیسیلیک­اسید در روش RT-PCR. حروف یکسان گویای عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون دانکن است. اختصارات: pre-treats، قبل از اعمال تیمارها؛ 24h post-treats، 24 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ 48h post-treats، 48 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ 72h post-treats، 72 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ Co کنترل؛ SA، تیمار سالیسیلیک­اسید 1 میلی­مولار؛UV-B ، تیمار اشعه UV-B؛SA+UV ، تیمار ترکیبی سالیسیلیک­اسید و اشعه UV-B.

 

 

بیان ژن GTS تحت تاثیر اشعه UV-B و هورمون اسیدسالیسیلیک: بیان ژن گاماترپینن سنتاز (TPS) به طور معنی­داری (در سطح 1 درصد) بر اثر اعمال محلول­پاشی سالیسیلیک­اسید و تابش اشعه UV-B افزایش یافت. در 24 ساعت پس از اتمام اعمال تیمارها، بیان این ژن توسط سالیسیلیک­اسید، UV-B و تیمار ترکیبی آنها به ترتیب 125، 42 و 218 درصد نسبت به کنترل افزایش یافت. اما بعد از گذشت 48 ساعت، بیان ژن TPS توسط سالیسیلیک­اسید و تیمار ترکیبی آنها کاهش یافت. بعد از 72 ساعت نیز، سطح بیان TPS تقریبا معادل با 48 ساعت بعد از تیمار بود (شکل 3).

 

 

شکل 3- بیان ژن GTS پس از اعمال اشعه UV-B و هورمون سالیسیلیک­اسید در روش RT-PCR. حروف یکسان گویای عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون دانکن است. اختصارات: pre-treats، قبل از اعمال تیمارها؛ 24h post-treats، 24 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ 48h post-treats، 48 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ 72h post-treats، 72 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ Co کنترل؛ SA، تیمار سالیسیلیک­اسید 1 میلی­مولار؛UV-B ، تیمار اشعه UV-B؛SA+UV ، تیمار ترکیبی سالیسیلیک­اسید و اشعه UV-B.

 

 

بیان ژن CYP178 تحت تاثیر اشعه UV-B و هورمون اسیدسالیسیلیک: سطح رونوشت ژن CYP178 به طور معنی­داری (در سطح 5 درصد) بر اثر تیمارهای سالیسیلیک­اسید و UV-B با افزایش همراه بود. در دوره زمانی 24 ساعت، بیان ژن CYP178 در تیمار سالیسیلیک­اسید، UV-B و تیمار ترکیبی آنها به ترتیب 51، 69 و 150 درصد نسبت به کنترل افزایش یافت. با اینحال، بیان این ژن در تیمار سالیسیلیک­اسید، UV-B و تیمار ترکیبی آنها بعد از گذشت 48 ساعت نسبت به دوره زمانی 24 ساعت کاهش یافت. بعد از 72 ساعت نیز، سطح بیان CYP178 تقریبا معادل با 48 ساعت بعد از تیمار بود (شکل 4).

 

 

شکل 4- بیان ژن CYP178 پس از اعمال اشعه UV-B و هورمون سالیسیلیک­اسید در روش RT-PCR. حروف یکسان گویای عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون دانکن است. اختصارات: pre-treats، قبل از اعمال تیمارها؛ 24h post-treats، 24 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ 48h post-treats، 48 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ 72h post-treats، 72 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ Co کنترل؛ SA، تیمار سالیسیلیک­اسید 1 میلی­مولار؛UV-B ، تیمار اشعه UV-B؛SA+UV ، تیمار ترکیبی سالیسیلیک­اسید و اشعه UV-B.

 

 

بیان ژن CYP180 تحت تاثیر اشعه UV-B و هورمون اسیدسالیسیلیک: سطح رونوشت ژن CYP180 به طور معنی­داری (در سطح 5 درصد) بر اثر سالیسیلیک­اسید و UV-B افزایش یافت. بیان این ژن در تیمار سالیسیلیک­اسید، UV-B و تیمار ترکیبی آنها در دوره زمانی 24 ساعت به ترتیب 78، 52 و 142 درصد نسبت به کنترل افزایش یافت. با اینحال، بیان CYP180 در تیمار سالیسیلیک­اسید، UV-B و تیمار ترکیبی آنها بعد از گذشت 48 ساعت کاهش یافت. بعد از 72 ساعت نیز، سطح بیان CYP180 معادل با 48 ساعت بعد از تیمار بود که نشان از تثیبت نوسانات بیان ژن CYP180 دارد (شکل 5).

 

 

شکل 5- بیان ژن CYP180 پس از اعمال اشعه UV-B و هورمون سالیسیلیک­اسید در روش RT-PCR. حروف یکسان گویای عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون دانکن است. اختصارات: pre-treats، قبل از اعمال تیمارها؛ 24h post-treats، 24 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ 48h post-treats، 48 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ 72h post-treats، 72 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ Co کنترل؛ SA، تیمار سالیسیلیک­اسید 1 میلی­مولار؛UV-B ، تیمار اشعه UV-B؛SA+UV ، تیمار ترکیبی سالیسیلیک­اسید و اشعه UV-B.

 

سطح متابولیت­های تیمول و کارواکرول تحت تاثیر اشعه UV-B و هورمون اسیدسالیسیلیک: مابین شاهد پیش­تیمار با شاهد 24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمارها اختلاف معنی­داری وجود نداشت لذا اثر هر تیمار با شاهد همتراز از نظر زمانی مقایسه شد. همانگونه که در شکل 6 و 7 مشاهده می­شود، سطح تیمول و کارواکرول در 24 ساعت بعد از اعمال تیمارها، افزایش چشمگیری نسبت به شاهد داشت اما بعد از 48 و 72 ساعت، محتوی هر دو متابولیت مونوترپپن فنولی افت محسوسی داشت. در بین انواع تیمارها، اعمال همزمان اشعه UV-B و اسیدسالیسیلیک و سنجش محتوی آنها 24 ساعت بعد از اعمال تیمار توانست به طور معنی­داری (در سطح 1 درصد) سطح تیمول و کارواکرول را در مقایسه با تیمارهای جداگانه در گیاهچه­های آویشن به ترتیب تا حدود 100 و 70 درصد افزایش دهد (شکل 6 و 7).

 

 

شکل 6- سطح تیمول پس از اعمال اشعه UV-B و هورمون سالیسیلیک­اسید در روش RT-PCR. حروف یکسان گویای عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون دانکن است. اختصارات: pre-treats، قبل از اعمال تیمارها؛ 24h post-treats، 24 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ 48h post-treats، 48 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ 72h post-treats، 72 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ Co کنترل؛ SA، تیمار سالیسیلیک­اسید 1 میلی­مولار؛UV-B ، تیمار اشعه UV-B؛SA+UV ، تیمار ترکیبی سالیسیلیک­اسید و اشعه UV-B.

 

شکل 7- سطح کارواکرول پس از اعمال اشعه UV-B و هورمون سالیسیلیک­اسید در روش RT-PCR. حروف یکسان گویای عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون دانکن است. اختصارات: pre-treats، قبل از اعمال تیمارها؛ 24h post-treats، 24 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ 48h post-treats، 48 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ 72h post-treats، 72 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ Co کنترل؛ SA، تیمار سالیسیلیک­اسید 1 میلی­مولار؛UV-B ، تیمار اشعه UV-B؛SA+UV ، تیمار ترکیبی سالیسیلیک­اسید و اشعه UV-B.

 

 

بحث

با توجه به تقاضای روز افزون برای تیمول و کارواکرول، شناسایی عوامل موثر بر بیان ژن­ها و فعالیت آنزیم­های مسیر بیوسنتزی و مکانیسم­های عمل آنها می­تواند گره­گشای مشکل صنعت گیاهان داروئی در تامین این دو ترکیب مهم باشد. بنابراین، مطالعه پیش­رو متمرکز استفاده از اشعه UV-B و هورمون سالیسیلیک­اسید و ردیابی اثر آنها بر ژن­های کلیدی درگیر در مسیر بیوسنتز تیمول و کارواکرول یعنی DXR، GTS، CYP178 و CYP180 بهمراه سنجش محتوی این دو ترکیب شد.

سالیسیلیک اسید نقش بسزائی در القاء واکنش‌های دفاعی گیاه در مواجه با تنش­های زیستی و غیرزیستی محیطی ایفا می‌کند (4). افزایش سطح این هورمون سبب القاء مسیرهای پیام­رسانی می­شود که به نوبه خود بیان دسته ‏بخصوصی از ژن‏های دفاعی و ژن­های درگیر در مسیرهای بیوسنتزی متابولیت­های ثانویه را افزایش می­دهند (25). در این مطالعه، بیان ژن­های DXR، GTS، CYP178 و CYP180 بعد از 24 ساعت از گذشت اعمال تیمار هورمونی افزایش یافت؛ اما با گذشت زمان (48 ساعت بعد از تیمار)، بیان آنها روند کاهشی در پیش گرفت تا اینکه در 72 ساعت بعد از تیمار تقریبا ثابت شد. با توجه به رابطه مستقیم بین بیان ژن‌های کلیدی و فرآورده­های حاصل از آنها یعنی تیمول و کارواکرول، به‏نظر می‏رسد که زمان مناسب تیمار سالیسیلیک­اسید در جهت افزایش تولید دو ترکیب یادشده یک روز بعد از اتمام اعمال تیمار هورمونی ‌باشد. همراستا با یافته­های ما، Buraphaka و Putalun (2020) نشان دادند که اثر محلول­پاشی 2 میلی­مولار سالیسیلیک­اسید بر گیاه دارویی Centella asiatica گویای این واقعیت است که سطح ترپنوئیدها در ساعت اولیه بعد از تیمار با افزایش همراه بود و بعد از آن یک روند کاهشی را دنبال کرد (2). به‏طور کلی، مشاهدات ما در کنار سایر نتایج حاصل از پژوهش­های گذشته (24 و 29) نشان می‌دهد که محلول­پاشی سالیسیلیک­اسید قادر است تا به‌عنوان یک تقویت­کننده تولید تیمول و کارواکرول در آویشن مورد استفاده قرار گیرد.

افزایش محتوی مونوترپن­های تیمول و کارواکرول بعد از تیمار اسید­سالیسیلیک (به خصوص 24 ساعت بعد از اعمال تیمار) احتمالا به این دلیل است که اسید­سالیسیلیک به عنوان یک محرک خارجی باعث انتقال سیگنال از غشاء پلاسمایی به سوی اندامکی مثل کلروپلاست و متعاقبا تولید گونه­های فعال اکسیژن می­شود. این رادیکال­های آزاد نیز به نوبه خود مجموعه­ای از پاسخ­های دفاعی را فعال می­کنند که در دل آنها، تولید متابولیت­های ثانویه جای دارد (11). افزایش بیان و یا فعالیت آنزیم­های درگیر در مسیرهای بیوسنتز متابولیت­های ثانویه منجر به افزایش محتوی مونوترپن­های تیمول و کارواکرول می­شود که گیاه را در مقابله با محرک­های محیطی یاری می­دهند (13).

اشعه فرابنفش خورشید تاثیرات متنوعی بر فرایندهای مختلف فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی سلول دارد (7، 17 و 21) به طوری که ترکیب و میزان متابولیت‏های ثانویه تحت تاثیر اشعه‏های فرابنفش و به‏ویژه UV-B قرار می­گیرند (14). درواقع، اشعه UV-B به عنوان یک تنظیم­کننده بالقوه در بیوسنتز ترکیبات فعال گیاهی مثل ترکیبات فنلی، کاروتنوئیدها وگلوکوزینولات‏ها شناخته شده است (25). در تحقیق اخیر، اثر اشعه UV-B بر بیان ژن‌های DXR، GTS، CYP178 و CYP180 مورد بررسی قرار گرفت و نتایج حاکی از این بود که سطح رونوشت آنها به طور چشمگیری تحت تاثیر UV-B قرار گرفت. یک روز بعد از اعمال تیمار، بیان آنها افزایش چشمگیری نسبت به شاهد داشت و در ادامه (48 و 72 ساعت بعد از اتمام اعمال تیمار) با کاهش همراه شد. روی هم­رفته، مشاهدات ما حاکی از نقش بالقوه اشعه UV-B در افزایش تولید تیمول و کارواکرول می­باشد.

در توجیه افزایش تیمول و کارواکرول توسط UV-B (به خصوص 24 ساعت بعد از اعمال تیمار) می­توان اینگونه استنباط کرد که اشعه UV-B نخست از طریق مسیر پیام­رسان وابسته به UVR8 (میانکنش­کننده­ با COP1) درک می­شود و سپس این سیگنال از طریق سازوکارهای وابسته به فاکتورهای رونویسی سبب تغییر در بیان ژن­های درگیر در بیوسنتز متابولیت­های ثانویه می­شود. تغییر ترانس­کریپتوم گیاه نیز به نوبه خود منجر به سه واکنش جداگانه و همپوشان شامل القاء سازگاری به محرک، تحریک واکنش­های آنزیمی و تعدیل متابولوم گیاه می­شود (14). 

تاکنون، گزارشی از تاثیر همزمان سالیسیلیک­اسید و UV-B بر ژن­های بیوسنتز متابولیت­های ثانویه گزارش نشده است. تاثیر هم­افزائی سالیسیلیک­اسید و UV-B بر بیان ژن­های رمزگردان آنزیم­های DXR، GTS، CYP178 و CYP180 در این مطالعه را می­توان به اثر افزایشی آنها در پیام­رسانی سلولی طی زمان مقابله با علائم تنش (در اینجا، الیسیتور) و متعاقبا افزایش فعالیت فاکتورهای رونویسی درگیر در رونویسی ژن­های یادشده نسبت داد. همچنین، از آنجایکه مسیر بیوسنتز سالیسیلیک‌اسید با سایر فنل­ها مشترک می­باشد لذا سالیسیلیک‌اسید می­تواند منجر به افزایش بیوسنتز ترکیبات مسیر فنیل‏پروپانوئیدی همچون تیمول و کارواکرول شود. بنابراین، با مقایسه نتایج این مطالعه با گزارشات گذشته می­توان پیشنهاد کرد که الیسیتورهای سالیسیلیک­اسید و UV-B به واسطه نقش خود در مسیرهای پیام­رسانی القاءشونده با تنش­های محیطی، موجبات افزایش متابولیت­های ثانویه را فراهم می­کنند تا از این طریق گیاه را برای تخفیف علائم تنش یاری نمایند.

از نظر سازوکارهای مولکولی در سطح بیان ژن، به نظر می­رسد که افزایش بیان ژن­های DXR، GTS، CYP178 و CYP180 و متعاقبا تولید ترکیبات حاصل از فعالیت آنزیم­های آنها (تیمول و کارواکرول) بخاطر برخورداری توالی راه­انداز آنها از جایگاه­های اتصال مشابهی برای فاکتورهای رونویسی القاءشونده با سالیسیلیک­اسید و UV-B باشد که این خود گویای کنترل بیان این ژن­ها توسط فاکتورهای رونویسی مشابه یا یکسان است. چنین فرضیه­ای نیز توسط Kianersi و همکاران (2021) گزارش شده است بطوریکه محققان نشان دادند که تیمار الیستیورهای مختلف باعث افزایش همزمان بیان ژن­های درگیر در بیوسنتز تیمول و کارواکرول می­شود (10).

از نظر سازوکارهای مولکولی در سطح بیان متابولوم، افزایش غلظت تیمول و کارواکرول آویشن ناشی از تیمار انفرادی یا ترکیبی اسید­سالیسیلیک و UV-B احتمالا ریشه در تقویت متابولیسم سلولی، تسهیل جذب مواد غذایی از خاک، تغییر تراکم غده­های تولیدکننده اسانس در سطح برگ و یا تشدید بیوسنتز مونوترپن­ها داشته باشد (5). چنین افزایشی در غلظت تیمول و کارواکرول از نظر کاربردهای دارویی و درمانی حائز اهمیت است چراکه تغییر در مقدار و ترکیب اجزاء اسانس بر کارائی عصاره آویشن در درمان بیماری­ها تحت بسزائی دارد (16).

در رابطه با دامنه نوسان بیان ژن­ها و محتوی متابولیت­ها در پاسخ به تیمارهای سالیسیلیک­اسید و UV-B، گزارشات مشابهی وجود دارد که حاکی از افزایش 2 تا 7 برابری بیان ژن­های درگیر در مسیرهای بیوسنتزی متابولیت­های ثانویه و افزایش 25 تا 125 درصدی محتوی متابولیت­های ثانویه حاصل از بیان آنها است (10). همچنین، روند افزایشی و متعاقبا کاهشی بیان ژن­های DXR، GTS، CYP178 و CYP180 و محتوی تیمول و کارواکرول در پاسخ به الیسیتورهای مختلف نیز آورده شده است که احتمالا به دلیل پاسخ سریع گیاه به محرک (الیسیتور) و متعاقبا سازگاری گیاه به شرایط تنش­زا حاصل از اعمال محرک است (5).

نتیجه­گیری

شناخت عوامل موثر بر مسیر بیوسنتز تیمول و کارواکرول می­تواند راه را برای تولید بیشتر این متابولیت­های بارزش در گیاه دارویی آویشن هموار سازد. بررسی بیان ژن­های DXR، GTS، CYP178 و CYP180 بعد از تیمار اسید­سالیسیلیک و UV-B نشان داد که اعمال همزمان این الیسیتورها (در حدود 24 ساعت بعد از تیمار) می­تواند سطح بیان آنها را به طور چشمگیری نسبت به کاربرد مجزای آنها افزایش دهد. با توجه به این‏که محتوی تیمول و کارواکرول مستقیما تحت تاثیر بیان این ژن‏ها قرار دارد، لذا استفاده توام از الیسیتورهای اسید­سالیسیلیک و UV-B از پتانسیل بالایی در افزایش سطح این ترکیبات برخودار است که لازم است در تحقیقات آینده مورد مطالعه بیشتر قرار گیرد.

تقدیر و تشکر

کمال سپاسگزاری را از دانشگاه فرهنگیان تهران داریم که حمایت مالی این مطالعه را بر عهده داشت.

1-Ali, B. (2021). Salicylic acid: An efficient elicitor of secondary metabolite production in plants. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. 31:101884.
2-Buraphaka, H., and W. Putalun. (2020). Stimulation of health-promoting triterpenoids accumulation in Centella asiatica (L.) Urban leaves triggered by postharvest application of methyl jasmonate and salicylic acid elicitors. Industrial Crops and Products. 146: 112171.
3-Capite, A.D., T. Lancaster, and D. Puthoff. (2016). Salicylic acid treatment increases the levels of triterpene glycosides in Black Cohosh (Actaea racemosa) rhizomes. Journal of Chemical Ecology. 42: 13–16.
4-Dučaiová, Z., V. Petruľová, and R. Repčák. (2013). Salicylic acid regulates secondary metabolites content in leaves of Matricaria chamomilla. Biologia. 68: 904–909.
5-Ghasemi-Pirbalouti, A., M. Rahmani Samani, M. Hashemi, et al. (2014). Salicylic acid affects growth, essential oil and chemical compositions of thyme (Thymus daenensis Celak.) under reduced irrigation. Plant Growth Regulation. 72: 289–301.
6-Gu, X.D., M.Y. Sun, L. Zhang, H.W. Fu, L. Cui, R.Z. Chen, D.W. Zhang, J.K. Tian. (2010). UV-B Induced Changes in the Secondary Metabolites of Morus alba L. Leaves. Molecules. 15(5):2980-2993.
7-Huyskens-Keil, S., I. Eichholz, L.W. Kroh, and S. Rohn. (2007). UV-B induced changes of phenol composition and antioxidant activity in black currant fruit (Ribes nigrum L.). Journal of Applied Botany and Food Quality. 81:140-144.
8-Kaeidi, A., M. Rahmani, and J. Hassanshahi. (2020). The Protective Effect of Carvacrol and Thymol as Main Polyphenolic Compounds of Thyme on Some Biologic Systems in Disease Condition: A Narrative Review. JRUMS. 19 (1): 81-96.
9-Krause, S.T., P. Liao, C. Crocoll, B. Boachon, C. Förster, F. Leidecker, N. Wiese, D. Zhao, J.C. Wood, C.R. Buell, J. Gershenzon, N. Dudareva, and J. Degenhardt. (2021). The biosynthesis of thymol, carvacrol, and thymohydroquinone in Lamiaceae proceeds via cytochrome P450s and a short-chain dehydrogenase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118(52):e2110092118.
10-Kianersi, F, A. Pour-Aboughadareh, M. Majdi, P. Poczai. (2021). Effect of methyl jasmonate on thymol, carvacrol, phytochemical accumulation, and expression of key genes involved in thymol/carvacrol biosynthetic pathway in some Iranian Thyme species. International Journal of Molecular Sciences. 22(20):11124.
11-Khan, M.I.R., P. Poor, T. Janda. (2022). Salicylic Acid: A Versatile Signaling Molecule in Plants. J Plant Growth Regulation. 41: 1887–1890.
12-Kumari, A., and S. Pandey-Rai. (2018). Enhanced arsenic tolerance and secondary metabolism by modulation of gene expression and proteome profile in Artemisia annua L. after application of exogenous salicylic acid. Plant Physiology and Biochemistry. 132: 590–602.
13-Mohammadi, H., F. Amirikia, M. Ghorbanpour, F. Fatehi, H. Hashempour. (2019). Salicylic acid induced changes in physiological traits and essential oil constituents in different ecotypes of Thymus kotschyanus and Thymus vulgaris under well-watered and water stress conditions. Industrial Crops and Products. 129:561-574.
14-Nocchi, N., H.M. Duarte, R.C. Pereira, T.U.P. Konno, and A.R. Soares. (2020). Effects of UV-B radiation on secondary metabolite production, antioxidant activity, photosynthesis and herbivory interactions in Nymphoides humboldtiana (Menyanthaceae). Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 212: 112021.
15-Owolabi, I.O., C.T. Yupanqui, and S. Siripongvutikorn. (2018). Enhancing secondary metabolites (emphasis on phenolics and antioxidants) in plants through elicitation and metabolomics. Pakistan Journal of Nutrition. 17:411–420
16-Patil, S.M., R. Ramu, P.S. Shirahatti, C. Shivamallu, and R.G. Amachawadi. (2021). A systematic review on ethnopharmacology, phytochemistry and pharmacological aspects of Thymus vulgaris Linn. Heliyon. 7(5):e07054.
17-Pandey, N., and S. Pandey-Rai. (2014). Short term UV-B radiation-mediated transcriptional responses and altered secondary metabolism of in vitro propagated plantlets of Artemisia annua (L). Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 116: 371–385
18-Pfaffl, M.W. (2001). A new mathematical model for relative quantification in Real-Time RT–PCR. Nucleic acids research. 29(9): e45-e45.
19-Ramirez-Estrada, K., H. Vidal-Limon, D. Hidalgo, E. Moyano, M. Golenioswki, R.M. Cusidó, and J. Palazon. (2016). Elicitation, an effective strategy for the biotechnological production of bioactive high-added value compounds in plant cell factories. Molecules. 21:182.
20-Ramani, S., J. Chelliah. (2007). UV-B-induced signaling events leading to enhanced-production of catharanthine in Catharanthus roseus cell suspension cultures. BMC Plant Biology. 7:61.
21-Rai, R., R.P. Meena, S.S. Smita, A. Shukla, et al. (2011). UV-B and UV-C pre-treatments induce physiological changes and artemisinin biosynthesis in Artemisia annua L.- An antimalarial plant. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 105(3): 216-225.
22-Rivas-San Vicente, M., and J Plasencia. (2011). Salicylic acid beyond defense: its role in plant growth and development. Journal of Experimental Botany. 62(10): 3321-3338.
23-Schreiner, M., J. Martínez-Abaigar, J. Glaab, and M. Jansen. (2014). UV-B induced secondary plant metabolites. Optik Photonik. 9(2): 34-37.
24-Sivanandhan, G., G.K. Dev, M. Jeyaraj, M. Rajesh, A. Arjunan, M. Muthuselvam, M. Manickavasagam, N. Selvaraj, and A. Ganapathi. (2013). Increased production of withanolide A, withanone, and withaferin a in hairy root cultures of Withania somnifera (L.) Dunal. elicited with methyl jasmonate and salicylic acid. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 114:121–129.
25- Sun, M., X. Gu, H. Fu, L. Zhang, R. Chen, L. Cui, L. Zheng, D. Zhang, and J. Tian. (2010). Change of secondary metabolites in leaves of Ginkgo biloba L. in response to UV-B induction. Innovative Food Science and Emerging Technologies. 11: 672-676,
26-Thakur, M., S. Bhattacharya, P.K. Khosla, and S. Puri. (2019). Improving production of plant secondary metabolites through biotic and abiotic elicitation. Journal of Applied Research on Medicinal and Aromatic Plants. 12:1–12
27- Shahroodi, E., F. Bernard, D. Tehrani, et al. (2020). Stimulatory effect of salicylic acid on Polyamine oxidase activity in Thymus daenensis L. callus. Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology). 33(1):147-157.
28- Talebian, Z., A.O. Jafari, M. Yusefinejad. (2016). Morfometric Studies on the 14 species of Thymus L. (Lamiaceae) in Iran. Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology). 29(1): 96-106.
29- Zare-Hassani, E., R. Motafakkerazad, J. Razeghi, et al. (2019). The effects of methyl jasmonate and salicylic acid on the production of secondary metabolites in organ culture of Ziziphora persica. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 138: 437–444.
Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 37, Issue 4
Winter 2025
Pages 406-421

  • Receive Date 16 May 2022
  • Revise Date 10 October 2022
  • Accept Date 19 December 2022