نوع مقاله : مقاله پژوهشی
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله English
نویسندگان English
Lilium ledebeourii (Baker) Boiss is one of the most unique ornamental species, and the breeding program of this plant is very important. As this flower is a wild species, breeding efforts are rare. The goal of this study was to investigate the effects of different plant growth regulator combinations on the embryogenesis and regeneration of Lilium ledebeourii (baker) Boiss by ovary culture. This research was carried out as a factorial arrangement based on a completely randomized design with 5 replications. The treatments for callus production was 0.5 mg/l BA plus 0.5mg/l NAA and various concentrations of picloram (0,0.5,1,2,mg/l) and tidiazoron (0,0.5,1,2,mg/l) were used for embryogenesis. The B5 medium without hormones was used for induction of regeneration. The measured traits in this research included the embryo number, embryogenesis percentage, embryo diameter, embryo length, embryo fresh weight and callus fresh weight. The results showed that the interaction effect of picloram and tidiazoron significantly (P
کلیدواژهها English
بررسی جنینزایی سوسن چلچراغ Lilium ledebourii (Baker) boiss از طریق کشت تخمدان تحت شرایط درون شیشهای
تاریخ دریافت: 31/01/1401 تاریخ پذیرش: 04/07/1401
چکیده
سوسن چلچراغ یکی از گونههای زینتی بینظیر است که اصلاح آن اهمیت زیادی دارد. هدف از این پژوهش بررسی تأثیر ترکیب تنظیم کنندههای رشد(پیکلرام و تیدیازورون) بر جنینزایی و باززایی گیاه سوسن چلچراغ از طریق کشت تخمدان بود. این آزمایش بهصورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با پنج تکرار انجام شد. برای کالوسزایی از محیط کشت B5 با تیمارهای هورمونی ۵/۰ میلیگرم درلیتر بنزیلآدنین (BA) و ۵/۰ میلیگرم درلیتر نفتالیناستیکاسید (NAA) و دو ترکیب پیکلرام (Pic) (0، 5/0، 1و 2 میلیگرم درلیتر) و تیدیازورون (TDZ) (0، 5/0، 1و 2 میلیگرم درلیتر) برای جنینزایی در محیط کشت B5 مورد استفاده قرار گرفت. محیط B5 جامد بدون هورمون نیز برای القای باززایی مورد استفاده قرار گرفت. کالوسهای بدست آمده از تیمار مذکور برای تولید جنین به محیط جنینزایی تحت تیمار تاریکی انتقال داده شدند. شاخصهایی از قبیل تعداد جنین، درصد جنینزایی ، قطرجنین، طول جنین، وزن تر جنین و وزنتر کالوس اندازهگیری شدند. نتایج حاصل از تجزیه واریانس دادهها نشان داد که اثر متقابل هورمون TDZ و Pic بر تعداد جنین و قطر جنین در سطح احتمال یک درصد و بر وزن کالوس در سطح احتمال پنج درصد معنیدار بود، همچنین اثر اصلی هورمون تیدیازرون بر وزنتر جنین و اثر اصلی هورمون پیکلرام نیز بر درصد جنینزایی معنیدار شد. بیشترین وزن تر جنین در تیمار یک میلیگرم در لیتر TDZ حاصل شد و بیشترین قطر جنین (06/4 میلیمتر) از تیمار 5/0 میلیگرم در لیتر TDZ + یک میلیگرم در لیتر Pic بدست آمد. بیشترین درصد ریشهزایی (35/86 %) گیاهچه های باززایی شده نیز در تیمار 5/0 میلیگرم در لیتر TDZ مشاهده شد.
واژه های کلیدی: پیکلرام، تخمدان، جنینزایی، سوسن چلچراغ، کالوس.
* نویسنده مسئول، پست الکترونیکی: younes_ph62@uma.ac.ir
مقدمه
سرزمین ایران با داشتن 8000 گونه گیاهی از مراکز اصلی گونههای بومی در جهان است. یکی از این گیاهان خودرو، گل سوسن چلچراغ است. سوسن چلچراغ یا سوسن سفید با نام علمی Lilium ledebourii (Baker) boiss متعلق به تیره سوسنیان (Liliaceae) و یکی از مهمترین گلهای پیازی در سراسر جهان است که گلهای بزرگ معطر و چند رنگ با ماندگاری بالایی دارد (7 و 10). سوسن جزء گیاهان پیازدار، تکلپهای و دائمی (9) و یک گیاه زینتی چندساله با ارزش زینتی، دارویی و خوراکی است (19). انتشار جغرافیایی آن منطقه داماش عمارلو و درفک در شهرستان رودبار، کلاردشت مازندران، منطقه لنکران آذربایجان و منطقه خانقاه در استان اردبیل است (6).
ریز ازدیادی در گیاهان پیازی بهعنوان مؤثرترین روش برای تکثیر رویشی مورد استفاده قرارگرفته است (8). مطالعات متعددی روی باززایی درون شیشهای پیازچهها در سوسن با استفاده از ریزنمونههای مختلف انجام گرفته است. بهمنظور تکثیر سوسنها، اگر چه از اندامهای مختلف مثل فلس پیاز، برگ، ساقه، گلبرگ و دمگل میتوان بهعنوان ریزنمونه برای کشت بافت استفاده کرد (2 و 14) ولی مطالعات کمی در رابطه با جنین زایی و باززایی این گیاه از اندام های زایشی صورت گرفته است. در مطالعهای برای بررسی جوانههای جانبی و تشکیل جنین در گل ژربرا از کشت تخمک استفاده شده است (21). هان و همکاران (17) اظهار کردند که در بین انواع سیتوکنینهای آزمایش شده، محیط حاوی ۲/۲ ماکرومول BA در افزایش رشد شاخههای گرفته شده از فلسهای لیلیوم Oriental hybrid رقم Casaltlanca، بسیار مؤثر بوده است. کی و همکاران (24) برای القاء کالوسهای رویانزا اثر پیکلرام را به تنهایی و یا با NAA و TDZ روی ریز نمونههای L.oriental×trumpet Robina را مورد مطالعه قرار دادند آنها نشان دادند که ترکیب ۲/۲ میلیگرم NAA و ۱/۰ میلیگرم TDZ، بهترین عملکرد را در میزان القاء کالوسها از محور ساقه داشت. تهامی و همکاران (4) در تحقیقات خود در مورد بررسی تأثیر تنظیم کنندههای رشدگیاهی بر کالوسزایی سوسن چلچراغ در شرایط درون شیشهای نشان دادند که در آزمایش اول محیط کشت MS حاوی 5/2 میلیگرم بر لیتر 2,4-D به همراه 1 میلیگرم بر لیتر BA و محیط کشت MS حاوی 5/2 میلیگرم بر لیتر 2,4-D به تنهایی و در آزمایش دوم نیز محیط کشت MS حاوی ۱ میلیگرم بر لیتر 2,4-D به همراه یک میلیگرم بر لیتر NAA بهترین ترکیب تیماری برای کالوسزایی بود. همچنین پوربیرامی هیر و همکاران (3) به منظور بررسی امکان باززایی گیاهان هاپلوئید و دابل هاپلوئید در گیاه سوسن چلچراغ ، نشان دادند که غلظت 1 میلیگرم در لیتر پیکلرام بهترین غلظت برای تولید کالوس از بساک و مادگی و غلظت 5/0 میلیگرم در لیتر بنزیلآدنین و نیز غلظت 1/0 میلیگرم در لیتر نفتالن استیک اسید، بیشترین میزان جنینزایی را از مادگی داشتند.
گیاهان پیازی از لحاظ ارزش تجاری جزء گیاهان با ارزش محسوب میشوند. در صنعت گل این گیاهان جایگاه ویژهای داشته و در اغلب فصول قابل عرضه میباشند. در کشور ما تکثیر عموم گیاهان به روش سنتی صورت میگیرد و این روش در گیاهان اهلی نشده به دلیل احتمال انقراض روش نامناسبی میباشد همچنین از بزرگترین معایب ازدیاد سنتی سوسن بازده کمتر این روش ازدیاد میباشد بطوریکه با احتساب تلفات پیازچههای تولید شده و همچنین با در نظرگرفتن این مسأله که در اغلب روشهای ازدیاد سنتی پیاز مادری نیز از بین میرود، به نظر میرسد تعداد پیازچههای تولید شده از هر پیاز بالغ، رقم قابل توجهی نباشد. در حالت کلی روند تکثیر در گیاهان پیازی، مخصوصا گیاهان تیره سوسنیان کند میباشد، از این رو روشهای نوین ازدیاد برای چنین گیاهان با ارزشی روز به روز در حال گسترش میباشند.
ازآنجائیکه سوسن چلچراغ یکی از گونههای زینتی بینظیری بوده و جزء آثار ملی کشور محسوب میشود و با توجه به اهمیت این گیاه و سازگاری بسیار مناسب آن با آب و هوای کشور، دارا بودن منبع ژنی غنی از جمله صفات مقاومت به سرما و بیماری و همچنین با توجه به اینکه این گل در منطقه خانقاه اردبیل به صورت خودرو رشد میکند، تحقیق در زمینه اصلاح این گیاه از اهمیت زیادی برخوردار است. لذا پژوهش حاضر نیز در همین راستا از طریق کشت اندام زایشی صورت گرفته که در این راستا اولین قدم باززایی گیاه از مادگی سوسن میباشد. کشت مادگی روشی است که میتوان با استفاده از آن علاوه بر حذف موانع موجود در مسیر گردهافشانی، گیاهان هاپلوئید را نیز از طریق القاء تخمکهای موجود در آن بدست آورد. در این تحقیق، تاثیر ترکیب تنظیم کنندههای رشد، بر کالوسزایی، جنینزایی و باززایی گیاه سوسن چلچراغ از طریق کشت مادگی (تخمدان) مورد بررسی قرار گرفته است.
مواد و روشها
منبع گیاهی: برای انجام این پژوهش، غنچههای گل سوسن چلچراغ از رویشگاه طبیعی خود در منطقه خانقاه اردبیل در مورخه پنجم خرداد ماه سال 1398 جمع آوری شد و در داخل جعبه یونولیتی حاوی یخ به آزمایشگاه انتقال داده شدند و سپس غنچهها در داخل محلول ساکارز ۳۰٪ به مدت ۴۸ ساعت در تیمار سرمایی در دمای oc۴ قرار گرفتند.
ضدعفونی ریزنمونهها: برای ضدعفونی ریزنمونهها، ابتدا قسمت دمگل و برگهای متصل به آن حذف شدند. پس از این مرحله غنچههای جدا شده در داخل بشر حاوی توری قرار داده شدند و همراه با چند قطره مایع ظرفشویی به مدت 30 دقیقه زیر آب جاری قرار گرفتند. سپس جهت ضدعفونی سطحی، ریزنمونهها به مدت 45 ثانیه در اتانول 70 درصد و سپس به مدت 20 دقیقه در هیپوکلریت سدیم تجاری 2 درصد ضدعفونی شدند. ریزنمونهها با آب مقطر استریل در سه نوبت به مدت 5،1و15 دقیقه شستشو داده شدند. پس از این مرحله نمونهها به یک پتریدیش استریل منتقل شدند تا عمل برش بر روی آنها انجام گیرد.
کشت ریزنمونهها جهت کالوسزایی، جنینزایی و باززایی: ابتدا کلاله و خامه از تخمدان جدا شدند و سپس هر تخمدان به صورت عرضی به ده قسمت مساوی تقسیم و بر روی محیط کشت B5 (5) جامد حاوی ۵/۰ میلیگرم در لیتر BA و ۵/۰ میلیگرم در لیتر NAA همراه با 20 گرم در لیتر ساکارز و 5.6 گرم در لیتر آگار جهت کالوسزایی کشت شدند نمونهها در دمای ۲± 25 درجه سانتیگراد و در تاریکی نگهداری شدند. ریزنمونهها بعد از گذشت یک ماه از کشت، واکشت شده و در طی حدود هفت ماه و پنج بار واکشت کالوس تولیدکردند. کالوسهای بدست آمده برای تولید جنین به محیط جنینزایی در شرایط تاریکی انتقال داده شدند.
جهت جنینزایی از کالوسهایی به قطر پنج میلیمتر و محیط کشت B5 جامد با ترکیب هورمونی تیدیازرون(TDZ) در چهار غلظت (۰، ۵/۰، ۱و ۲ میلیگرم بر لیتر) و پیکلرام (Pic) نیز در چهار غلظت (۰، ۵/۰، ۱و ۲ میلیگرم بر لیتر) استفاده شد. در همه کالوسهای انتقال داده شده به محیط جنینزایی، بعد از 40 روز جنین زایی صورت گرفت و شاخصهایی از قبیل تعداد جنین، درصد جنینزایی، قطر جنین، طول جنین، وزن تر جنین و وزن تر کالوس اندازهگیری شدند. سپس جنینها جهت القای باززایی به محیط B5 بدون هورمون منتقل شدند و پس از گذشت یک ماه صفات تعداد پیازچه، وزن پیازچه، قطر و طول پیازچه، تعداد برگ و ریشه، طول ریشه، درصد ریشه زایی و باززایی مورد اندازه گیری قرار گرفت.
آنالیز آماری دادهها
پژوهش بهصورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با پنج تکرار انجام شد تجزیه و تحلیل دادهها با استفاده از نرم افزار SPSS 16 انجام گردید. قبل از آنالیزهای آماری، آزمون تست نرمال بودن دادهها انجام شد. مقایسهی میانگین دادهها نیز با استفاده از آزمون چند دامنهای دانکن در سطح احتمال 5% و 1% محاسبه گردید.
نتایج
تأثیر هورمون تیدیازرون و پیکلرام بر برخی صفات جنینزایی: در همه کالوسهای انتقال داده شده به محیط جنینزایی، بعد از 40 روز تشکیل جنین صورت گرفت (شکل 1). نتایج حاصل از تجزیه واریانس دادهها نشان داد که اثر متقابل هورمون تیدیازرون و پیکلرام بر تعداد جنین و قطر جنین در سطح احتمال یک درصد معنیدار بوده و بر وزنتر کالوس در سطح احتمال پنج درصد معنیدار میباشد، اثر متقابل نوع هورمون بر درصد جنینزایی و وزنتر جنین معنیدار نبوده اما اثر اصلی هورمون تیدیازرون بر وزنتر جنین در سطح احتمال پنج درصد معنیدار بود. اثر اصلی هورمون پیکلرام نیز بر درصد جنینزایی در سطح احتمال یک درصد معنیدار شد در حالی که اثرات متقابل و اصلی بر طول جنین معنیدار نمیباشد (جدول 1).
هفته سوم هفته دوم هفته اول
هفته ششم هفته پنجم هفته چهارم
شکل 1- جنینزایی در طول هفته اول تا ششم در کشت تخمدان سوسن چلچراغ در محیط کشتB5 (تیمار شاهد) بزرگنمایی 4x
جدول 1- تجزیه واریانس تأثیر هورمون تیدیازرون و پیکلرام بر صفات جنینزایی حاصل از کشت تخمدان سوسن چلچراغ در محیط کشت B5
|
|
|
|
|
میانگین |
مربعات |
|
|
|
منابع تغییرات
|
درجه آزادی
|
تعداد جنین (عدد) |
درصد جنینزایی ( % ) |
وزن تر جنین (گرم) |
طول جنین (میلیمتر) |
قطر جنین (میلیمتر) |
وزن تر کالوس (گرم) |
|
TDZ |
3 |
**925/0 |
ns715/0 |
*009/0 |
ns679/1 |
ns725/0 |
**085/0 |
|
Pic |
3 |
**721/2 |
**586/17 |
ns007/0 |
ns002/3 |
ns135/0 |
**089/0 |
|
TDZ×Pic |
9 |
**465/0 |
ns477/1 |
ns003/0 |
ns686/1 |
**225/2 |
*47/0 |
|
خطا |
64 |
152/0 |
072/1 |
002/0 |
111/1 |
744/2 |
018/0 |
ns، *، **: به ترتیب غیر معنیداری و معنیداری در سطح احتمال 5% و 1%
مقایسه میانگین دادهها نشان داد ریزنمونههای کشت شده در گروه شاهد (محیط کشت B5 بدون هورمون) با 2/9 عدد بیشترین تعداد جنین و در محیط کشت B5 حاوی 1 میلیگرم در لیتر TDZ و2 میلیگرم در لیتر Pic، با 6/1 عدد کمترین تعداد جنین را دارند (شکل 2). همچنین بیشترین درصد جنینزایی (5/87 درصد) در محیط کشت B5 فاقد هورمون و کمترین درصد جنینزایی (5/51 درصد) در محیط حاوی 2 میلیگرم در لیتر پیکلرام، مشاهده شد (شکل 3).
شکل 2- تأثیر تیمارهای مختلف بر تعداد جنین تولید شده از کالوس حاصل از کشت تخمدان سوسن چلچراغ در محیط کشت B5
شکل 3- تأثیر تیمارهای مختلف بر درصد جنینزایی در کالوس حاصل از کشت تخمدان سوسن چلچراغ در محیط کشت B5
همچنین بیشترین وزنتر جنین(034/0 گرم) در محیط کشت B5 تکمیل شده با 1 میلیگرم در لیتر TDZ، و کمترین وزنتر جنین(016/0 گرم) در محیط کشت حاوی 2 میلیگرم در لیتر TDZ، بدست آمد (شکل 4). بیشترین (06/4 میلیمتر) و کمترین (2/2 میلیمتر) قطر جنین نیز به ترتیب از محیط کشت B5 حاوی 5/0 میلیگرم در لیتر TDZ و 1 میلیگرم در لیتر Pic، و صفر میلیگرم در لیتر TDZ و 1 میلیگرم در لیتر Pic، حاصل شد (شکل 5).
شکل 4- تأثیر تیمارهای مختلف بر وزن تر جنین تولید شده از کالوس حاصل از کشت تخمدان سوسن چلچراغ در محیط کشت B5
شکل 5- تأثیر تیمارهای مختلف بر قطر جنین تولید شده از کالوس حاصل از کشت تخمدان سوسن چلچراغ در محیط کشت B5
بیشترین وزن کالوس(42/0 گرم ) در غلظت 5/0 میلیگرم درلیتر TDZ و 5/0 میلیگرم درلیتر Pic، و کمترین آن(03/0 گرم ) از محیط کشت B5 شاهد (بدون هورمون)، بدست آمد (شکل 6).
شکل 6- تأثیر تیمارهای مختلف بر وزن تر کالوس بعد از جنین زایی در کشت تخمدان سوسن چلچراغ در محیط کشت B5
نتایج حاصل از تجزیه واریانس دادهها نشان داد که اثرات متقابل همهی صفات مورد بررسی به جز قطر پیازچه غیر معنی دار بودند، اما اثرات اصلی در صفات تعداد و طول پیازچه معنی دار بودند.اثر اصلی هورمون تیدیازرون بر درصد ریشهزایی نیز در سطح احتمال 5 درصد معنیدار بود. (جدول 2).
جدول 2- تجزیه واریانس تأثیر هورمون تیدیازرون و پیکلرام بر برخی صفات باززایی در کشت تخمدان سوسن چلچراغ در محیط کشت B5
|
میانگین مربعات |
||||||||||
|
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
تعداد پیازچه (عدد) |
وزن پیازچه (گرم) |
قطر پیازچه (میلیمتر) |
طول پیازچه (میلیمتر) |
تعداد برگ (عدد) |
تعداد ریشه (عدد) |
طول ریشه (میلیمتر) |
درصد ریشه زایی (%) |
درصد بازایی (%) |
|
TDZ |
3 |
**072/1 |
ns045/0 |
ns015/0 |
**822/0 |
ns663/0 |
ns710/0 |
ns816/49 |
**244/82 |
ns142/6 |
|
Pic |
3 |
**427/1 |
ns069/0 |
ns085/1 |
*417/0 |
ns391/0 |
ns419/0 |
ns466/24 |
ns959/11 |
ns877/3 |
|
TDZ×Pic |
9 |
ns266/0 |
ns028/0 |
**042/1 |
ns166/0 |
ns732/0 |
ns321/0 |
ns283/13 |
ns545/3 |
ns656/1 |
|
خطا |
48 |
217/0 |
030/0 |
492/0 |
151/0 |
679/0 |
408/0 |
664/22 |
694/7 |
610/3 |
ns، *، **: به ترتیب غیر معنیداری و معنیداری در سطح احتمال 5% و 1%
نتایج مقایسه میانگین سطوح مختلف تیدیازورون و پیکلرام نشان میدهد که بیشترین (56/3 عدد) تعداد پیازچه در غلظت صفر میلیگرم در لیتر TDZ مشاهده شد که با غلظتهای نیم و یک میلیگرم در لیتر تیدیازورون از لحاظ آماری اختلاف معنیداری با هم ندارند. همچنین بیشترین (61/4 عدد) تعداد پیازچه نیز در غلظت صفر میلیگرم در لیتر تیدیازورون مشاهده شد. بالاترین طول پیازچه (31/6 میلیمتر) در غلظت یک میلیگرم بر لیتر تیدیازورون مشاهده شد که با غلظت های صفر و نیم میلیگرم بر لیتر از لحاظ آماری اختلاف معنی داری باهم ندارند. همچنین بالاترین طول پیازچه (26/6 میلی متر) در غلظت نیم میلیگرم بر لیتر پیکلرام حاصل شد (جدول 3).
جدول 3- نتایج مقایسه میانگین سطوح مختلف تیدیاورون و پیکلرام بر تعداد پیازچه و طول پیازچه در کشت تخمدان سوسن چلچراغ در محیط کشت B5
|
غلظتهای هورمونی |
تعداد پیازچه (عدد) |
طول پیازچه (میلیمتر) |
|
0 میلیگرم در لیتر |
a56/3 |
a76/5 |
|
|
5/0 میلیگرم در لیتر |
a31/3 |
a93/5 |
|
|
1 میلیگرم در لیتر |
a3 |
a31/6 |
|
|
2 میلیگرم در لیتر |
b77/1 |
b43/4 |
|
0 میلیگرم در لیتر |
a61/4 |
ab91/5 |
|
|
5/0 میلیگرم در لیتر |
b55/2 |
a26/6 |
|
|
1 میلیگرم در لیتر |
b11/2 |
ab16/5 |
|
|
2 میلیگرم در لیتر |
b22/2 |
b94/4 |
اعداد با حروف مشترک، از لحاظ آماری دارای اختلاف معنیدار نمیباشند
نتایج مقایسه میانگین تیمارهای مختلف هورمونی نشان داد که بیشترین قطر پیازچه (207/17 میلیمتر) در غلظت 2 میلیگرم درلیتر TDZ و 0 میلیگرم درلیتر Pic بدست آمد و بقیه غلظتهای هورمونی از لحاظ آماری اختلاف معنیداری با هم نداشتند (شکل 7). همچنین بیشترین درصد ریشهزایی (36/86 درصد) در تیمار هورمونی نیم میلیگرم بر لیتر تیدیازورون مشاهده شد (شکل8).
شکل 7- تأثیر تیمارهای مختلف بر قطر پیازچه باززایی شده در کشت تخمدان سوسن چلچراغ در محیط کشت B5
شکل 8- تأثیر تیمارهای مختلف بر درصد ریشه زایی
بحث و نتیجه گیری
مهمترین عوامل مؤثر بـر افـزایش کـارآیی ریزازدیـادی درون شیشـهای گیاهـان، ریزنمونـه، ژنوتیپ گیاهی، میزان تنظیمکنندههای رشد، محیط کشـت و عوامـل فیزیکی میباشند. محققان سـعی دارند بـا تغییـر غلظـتهـای مختلف هورمونی روش مناسبی برای باززایی بیشتر این گیاه در کشت بافت دست پیدا کنند. در آزمایشی، تأثیر تنظیمکنندههای رشد NAA و BA بر باززایی پیازچه از ریز نمونههای فلسی نوعی سوسن هیبریـد نیز بررسی و بیشترین پیازچهها در هر ریزنمونه در محیط کشـت LS و در ترکیب 5 میکرومولار BA و یـک میکرومـولار NAA گـزارش گردیـد (24). در همـین راسـتا تـأثیر مثبـت اکسـین هـا بـر افـزایش پیازچهزایی گل سنبل و گل لاله نیز گزارش شده است (23). بررسی تاثیر ترکیبها و غلظتهای مختلف هورمونی و همچنین تاثیر پیشتیمار دمایی و نور بر تغییر مسیر بیولوژیکی و حرکت به سمت کالوسزایی، جنینزایی و باززایی در ریزنمونههای بساک خیار نشان داد که تیمار تاریکی باعث افزایش معنیدار درصد کالوسزایی و ترکیب هورمونی BAP و2,4-D (5/3+1 میلیگرم/لیتر)در هر دو ژنوتیپ باعث بیشترین القای جنینزایی و کالوسزایی شد(5). برای تعیین بهترین ترکیب تنظیم کنندههای رشد گیاهی درطول کالوسزایی ریزنمونهها در باززایی غیرمستقیم فلفل دلمهای اثر غلظتهای متفاوت و ترکیب اکسینهای NAA، IBA و2,4-D و سیتوکینینهای BAPو Kin در محیط کشت MS مورد بررسی قرار گرفت که بهترین نتیجه در محیط کشت MS حاوی 3 میلیگرم در لیتر BAP و 1 میلیگرم در لیتر IBA از کالوس تولید شده، از ریزنمونه کوتیلدون و رشد طولی شاخسارهها نشان داده شد(1). کاربرد تنظیم کنندههای رشد گیاهی خارجی برای القاء کالوس از تخمدان حیاتی بوده و میزان و نوع آنها بستگی به غلظت درونی هورمونهای گیاهی دارد (11). ضرورت وجود یک نوع اکسین به همراه سایتوکینین برای بهبود القاء کالوس از کشت تخمدان در بسیاری از گونههای گیاهی گزارش شده است (21). اکسینها به تنهایی یا همراه با مقادیر کم و جزئی سایتوکینینها باعث آغازش ریشهها، کالوسزایی، جنینزایی وپرآوری میشوند. اکسینهای NAA، 2,4-D، IBA، IAA و پیکلرام جنینزایی سوماتیکی را در گیاهان مختلف باعث میشوند (27). در پژوهش حاضر، تأثیر دو هورمون تیدیازرون و پیکلرام بر درصد جنینزایی نشان داد که بیشترین درصد جنینزایی مربوط به تیمار شاهد (صفرمیلیگرم پیکلرام) و ۵/۸۷ درصد میباشد که در نتیجه افزایش غلظت پیکلرام درصد جنینزایی کاهش یافته است. این نتایج بیانگر بالا بودن هورمونهای داخلی ریز نمونه کالوس که در محیط کالوسزایی جذب کرده و اثر بازدارندگی بر روی رشد کالوس و جنینزایی در محیط حاوی هورمون دارد .همچنین به نظر می رسد پدیده ی اندام زایی که شامل دو مرحله ی تمایزیابی و طویل شدن است تحت تأثیر هورمون ها قرار می گیرد، ولی فعالیت تمایزیابی حتماً منجر به طویل شدن و رشد سلولی نمی شود، بطوریکه غلظت های مختلف هورمون ها تعداد پیازچه ی متفاوتی تولید می کنند، ولی از نظر وزنی با یکدیگر فرق چندانی نداشته اند (26).
همچنین در تأثیر دو هورمون بر وزن ترجنین، وزن تر در تیمار 1 میلیگرم بر لیتر TDZ افزایش یافته و سپس با افزایش غلظت TDZ، کاهش یافت و با توجه به افزایش تولید جنین در تیمار شاهد وزن کالوس کاهش یافته و در تیمار ۱ میلیگرم TDZ با افزایش غلظت پیکلرام، وزن کالوس افزایش یافته است. در مطالعهای نتایج تاثیر غلظت TDZ بر میزان باززایی در کشت تخمدان خیار نشان داد که با افزایش غلظت TDZ میزان باززایی افزایش یافته بطوریکه بیشترین باززایی در غلظت 0.6 میلیگرم در لیتر بوده است همچنین در محیط کشت بدون هورمون هیچ گیاهی تولید نشده است (13). در جنین های سوماتیکی گیاه کاج Pic و NAA در مقایسه با سایر اکسینها تکثیر، تولید و بلوغ بیشتر جنین های سوماتیکی را کاهش میدهد (18). در تحقیقی که بر روی کشت توأم بساک و تخمدان هندوانه در محیط کشت MS جامد حاوی ۲ میلیگرم در لیتر 2,4-D و ۱ میلیگرم در لیترBAP حاوی بساک و محیط کشت MS مایع حاوی تخمدان انجام شد نتایج نشان دادند که بیشترین درصد کالوسزایی در محیط کشت مایع حاوی تخمدان اتفاق افتاد (12). در مطالعه دیگری، تخمک گل سوسن longiflorum Lilium را در محیط کشت حاوی 2 درصد، 5 درصد و 10 درصد ساکارز، یک میلیگرم در لیتر 2,4-D و یک میلیگرم در لیتر BA کشت کردند و نتایج نشان داد که تشکیل کالوس در محیط کشت حاوی 5 درصد ساکارز بیشتر از غلظتهای دیگر صورت گرفته است (25). در پژوهشی دیگر TDZ درغلظت زیاد (9 میلیگرم) بیشترین تاثیر را در باززایی و تکثیر شاخه داشته است و همچنین در غلظت کم (2.3 میکرومولار) برای باززایی جنین های سوماتیکی موثر بوده است (15 و 16). در گل رز مینیاتوری 2/0 میلیگرم TDZ به همراه یک میلیگرم NAA باعث ایجاد جوانههای نابجا در محیط کشت MS میشوند (22). در باززایی مستقیم شاخه از کشت ریز نمونه برگ سوسن شرقی بیشترین تعداد جوانه در محیط کشت MS حاوی 5/0 میلیگر م بر لیتر TDZ بدست آمده و همچنین باعث تولید کالوس مایل به رنگ زرد شده است (28). در سوسن بیشترین جنینزایی سوماتیکی از ریز نمونه برگ و فلس در محیط کشت MS حاوی یک میلیگرم Pic و یک میلیگرم NAA اتفاق افتاده است (27). در بررسی تأثیر NAA، 2,4-D، Kin، BA و TDZ بر کالوسزایی و باززایی گیاهچه از کشت بساک گیاه Curcuma attenuate گزارش نمودند که کالوسزایی تنها در حضور 4,2-D و کینتین صورت میگیرد و کالوسهای به دست آمده تنها زمانی به گیاهچه باززایی میشوند که در محیط کشت حاوی TDZ، کینتین و NAA قرار بگیرند و حضور TDZ برای باززایی ضروری است (20).
رامسی و گالیتز (2003) تخمک گل سوسن longiflorum Lilium را در محیط کشت حاوی 2 درصد، 5 درصد و 10 درصد ساکارز، یک میلیگرم در لیتر 2,4-D و یک میلیگرم در لیتر BA کشته کرده و نشان دادند که تشکیل کالوس در محیط کشت حاوی 5 درصد ساکارز بیشتر از غلظتهای دیگر صورت گرفت (25). اکسینها به تنهایی یا همراه با مقادیر کم و جزئی سایتوکینینها باعث آغازش ریشهها میشوند. اکسینهای NAA، 2,4-D، IBA، IAA و پیکلرام جنینزایی سوماتیکی را در گیاهان مختلف باعث میشوند (29).
نتیجهگیری کلی
اثر مثبت تیمارNAA و دو ترکیب پیکلرام و تیدیازورون برای جنینزایی در محیط کشت B5 و صفات مربوط به آن نشان میدهد که این تیمارها میتواند تاثیر زیادی برای باززایی این گیاه در شرایط درون شیشهای داشته باشد. با توجه به اینکه بیشترین وزن تر جنین در تیمار یک میلیگرم در لیتر TDZ حاصل شد و بیشترین قطر جنین (06/4 میلیمتر) از تیمار 5/0 میلیگرم در لیتر TDZ + یک میلیگرم در لیتر Pic بدست آمد. بیشترین درصد ریشهزایی (35/86 %) گیاهچه های باززایی شده نیز در تیمار 5/0 میلیگرم در لیتر TDZ مشاهده شد. بنابراین از آنجا که تیمارهای مورد استفاده به طور مستقیم و غیرمستقیم بر میزان هورمونهای درونزا در ریزنمونه تأثیر میگذارد، توصیه میگردد که غلظتهای مورد استفاده تیمارهای این آزمایش در کنار سایر هورمون ها نیز در تکثیر این گیاه با ارزش استفاده کرد و با استفاده از آن میزان باززایی این گیاه را افزایش داد.
سپاسگزاری
این مقاله حاصل کار تحقیقی در آزمایشگاه کشت بافت و بیوتکنولوژی گروه علوم باغبانی و فضای سبز بوده است. نویسندگان بر خود لازم میدانند مراتب تقدیر و تشکر صمیمانه خود را مسئولین محترم دانشگاه محقق اردبیلی به جهت تأمین منابع مالی مورد نیاز برای انجام این پژوهش، اعلام کنند.
مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)