نوع مقاله : مقاله پژوهشی
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله English
نویسندگان English
Extensive and unlimited use of nanoparticles has attracted the attention of researchers to study their environmental effects. In this study, the effects of nano and bulk nickel oxide treatments on nutrients accumulation and gene expression of fennel were investigated. Nanoparticle sizer was used to measure particle size and zeta potential, XRD for the crystal structure and AFM for particle size. After planting the plants in greenhouse conditions and treatment with nano and bulk NiO, the content of different nutrients in the roots and leaves of the plant and antioxidant enzymes gene expression by Real-Time PCR, were investigated. The results showed that in the control the highest accumulation of elements occurred and tha applied treatments, especially 20 ppm nano,did not prevent the movement of elements to the leaf and at this concentration the displacement of elements except Ca and Na to the leaf was significant. Bulk NiO showed a greater decreasing effect on element uptake. Increased expression of ndhH gene was observed in all nano and bulk concentrations in comparison with the control and the highest increase was related to 800 ppm. In relation to ndhD gene, a decrease in gene expression was observed in different concentrations of nano and bulk NiO compared to the control, which is probably due to the involvement of other detoxification pathways against stress. According to the mentioned cases, it seems that fennel plant is resistant to nano and bulk NiO.
کلیدواژهها English
پاسخ انباشت عناصر و بیان ژن آنزیمهای آنتی اکسیدان گیاه رازیانه (Foeniculum vulgare Mill.) به اکسید نیکل نانو و توده ای
هیلدا بشارت1، رمضانعلی خاوری نژاد1، هما محمودزاده2* و خدیجه نژاد شاهرخ آبادی2
1 ایران، تهران، دانشگاه آزاداسلامی واحد علوم و تحقیقات، گروه زیست شناسی
2ایران، مشهد، دانشگاه آزاداسلامی واحد مشهد، گروه زیست شناسی
تاریخ پذیرش: 15/07/1400 تاریخ دریافت: 10/01/1401
چکیده
استفاده گسترده و نامحدود از نانوذرات توجه محققان را به بررسی آثار محیطی آنها جلب کرده است. در این پژوهش اثر اکسید نیکل نانو و تودهای بر انباشت عناصر و بیان ژن گیاه رازیانه بررسی شد. پس از کاشت گیاهان در شرایط گلخانه ای و تیماردهی با اکسید نیکل نانو و تودهای (ppm 0، 20، 100، 400 و 800 )، میزان عناصر مختلف در ریشه و برگ گیاه و بیان ژن زیر واحدهای آنزیم NADH-دهیدروژناز (ndhH, ndhD) با روش Real-Time PCR بررسی شد. نتایج نشان داد بیشترین انباشت عناصر در گیاهان شاهد اتفاق افتاده و تیمارهای اعمال شده به خصوص ppm 20 نانو از حرکت عناصر به برگ ممانعت نکرده و در این غلظت جابجایی عناصر به جز کلسیم و سدیم به برگ قابل توجه بود. همچنین اکسید نیکل تودهای اثر کاهشی بیشتری بر جذب عناصر نشان داد. افزایش بیان ژن ndhH در تمامی غلظتهای نانو و تودهای در مقایسه با گروه شاهد مشاهده شد و بیشترین افزایش مربوط به ppm 800 بود. در رابطه با ژن ndh D کاهش بیان ژن، در غلظتهای مختلف نانو و تودهای نسبت به شاهد مشاهده گردید که احتمالاً بدلیل دخالت مسیرهای سمزدائی دیگری در مقابل تنش ایجاد شده است. با توجه به موارد ذکر شده به نظر میرسد گیاه رازیانه پتانسیل مقاومت به اکسید نیکل نانو و تودهای را دارا می باشد.
واژه های کلیدی: اکسید نیکل نانو، اکسید نیکل تودهای، Real-Time PCR، Foeniculum vulgare
* نویسنده مسئول، تلفن:05138435050 ، پست الکترونیکی: h.mahmoodzadeh@mshdiau.ac.ir
مقدمه
موضوع اصلی که کشاورزی در جهان با آن مواجه میباشد، فقدان زمین حاصلخیز بدلیل آلودگی، بیابانزایی و تغییرات اقلیمی است. با توجه به ویژگیهای فیزیکو-شیمیایی مواد نانو، تعجب آور نیست که تلاش برای بهبود کشاورزی، با استفاده از فناوری نانو و مواد نانو رو به گسترش است (29). هدف ویژه استفاده از انواع مختلف مواد نانو ساخته شده از اکسیدهای فلزی، سرامیکها، سیلیکاتها، مواد مغناطیسی، دندریمرها و امولسیونها (22) کاهش مقدار کاربرد محصولات محافظت از گیاه، به حداقل رساندن از دست دادن مواد مغذی در طول باروری و افزایش بازده بواسطه مدیریت بهینه مواد غذایی در کشاورزی است (26). نانو ذرات با ورود و تجمع در توده زیستی گیاه، در محیط زیست انتقال می یابند، همچنین ممکن است به ریشههای گیاهان بچسبند و موجب سمیت فیزیکی و شیمیایی در گیاهان گردند(5و13).
غلظت بالای نیکل در محیط کشت گیاه با جذب بسیاری از مواد غذایی ضروری کم مصرف و پرمصرف مداخله میکند. هنگامی که گیاهان تحت تنش نیکل قرار میگیرند، ممکن است جذب مقادیر N، P، K و S را کاهش دهند. چنین کمبود مواد غذایی انتخابی میتواند فرآیندهای متابولیکی را متوقف کند و در نهایت باعث ایجاد سمیت نیکل در گیاهان شود (12). همچنین گزارش دادند که تنش نیکل میتواند به طور قابل توجهی جذب و انتقال کاتیون Na را در بافت گیاه کاهش دهد. علاوه بر این، نیکل به طور رقابتی یونهای کلسیم را از جایگاه اتصال آن در کمپلکس اکسیژن حذف کرده و جایگزین یون Mg در رنگدانه کلروفیل میشود(18).
برخی از فلزات مثل Fe، Cu، Zn، و Mn به متالوآنزیمهای خاصی نظیر سوپراکسید دیسموتاز (SOD) و کاتالاز (CAT) متصل هستند. بنابراین رقابت نیکل با عناصر دیگر ممکن است موجب کاهش بیوسنتز آنها شود (3و28). نیکل بعنوان یک فلز غیر فعال احیایی شناخته شده است. بنابراین، نمیتواند به طور مستقیم ROS تولید کند (12). با این حال، فعالیت بسیاری از آنتیاکسیدانهای غیرآنزیمی مانند گلوتاتیون و آنتیاکسیدانهای آنزیمی نظیر سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز(CAT)، آسکوربات پراکسیداز(APX) و گلوتاتیون S-ترانسفراز (GST)، توسط تنش نیکل افزایش یافته است. در پژوهشی مشاهده شد کاهش فعالیت در آنزیمهای آنتیاکسیدانی مانند SOD و CAT ناشی از تنش نیکل ایجاد شد و افزایش معنیداری در فعالیت APX و POD در همان شرایط مشاهده شد. با این حال، پراکسیداسیون لیپید در غشای سلولهای برگ پس از اعمال نیکل تغییر نیافت. این نشان میدهد که APX و POD ممکن است ROS را به طور موثری از بین ببرند، در نتیجه مانع از پراکسیداسیون لیپید غشاهای زیستی شوند. نتایج حاصل از تحقیقات فوق روشن میسازد که سیستم آنزیمی آنتیاکسیدانی تحت تنش نیکل تحریک میشود و در شرایط سطوح بالای نیکل، نقش مهمی در کمک به گیاهان زراعی ایفا میکند (1و6). پروفایلهای بیان ژن پس از قرار گرفتن در معرض نانوذرات و دیگر تنشهای محیطی کمتر مقایسه شدهاند و اثرشان بر دفاع گیاهی اغلب بررسی نشده است (9و14) .
در سال 2020 چهاردولی و همکاران اثر نانوذرات اکسید نیکل را بر سیستم آنتی اکسیدانی سیاهدانه(Nigella arvensis ) بررسی کردند و دریافتند با افزایش غلظت این ماده تا 100 میلی گرم در لیتر، فعالیت آنتی اکسیدانی گیاه کاهش می یابد(8). در تحقیقی دیگر بررسی تاثیر نانوذرات اکسید نیکل و اکسید نیکل توده ای بر دو گیاه Lemna minor وSpirodela polyrhiza نشان داد اثرات منفی نانو ذرات نیکل به ویژه در غلظت های بالا در هر دو گیاه بیشتر از ماده توده ای است(31). Chung و همکاران(2019) در بررسی اثر نانو ذرات نیکل بر ویژگی های فیزیولوژیکی و تغییرات در سطح مولکولی گیاه Brassica rapa مشاهده کردند فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدان و بیان ژن های مرتبط با این آنزیم ها در غلظت های مختلف این نانو ذره افزایش یافت(9).
رازیانه (Foeniculum vulgaree Mill.) یک گیاه دارویی بسیار مهم میباشد. این گیاه متعلق به خانواده چتریان (Apiaceae) است. رازیانه به طور موثر در کنترل بسیاری از بیماری های عفونی، باکتریایی، قارچی، ویروسی، مایکوباکتریوم و پروتوزوا موثر است (8). در سالهای اخیر علاقه به کاشت رازیانه، به دلیل خاصیت دارویی و اسانس های آن، در مقیاس وسیع افزایش یافته است.به دلیل بررسی تاثیر نانوذرات بر ویژگی های گیاهان دارویی و از آنجایی که تاکنون مطالعات زیادی در ارتباط با تاثیر نانوذرات نیکل و اکسید نیکل توده ای بر این گیاهان انجام نشده است در این پژوهش آثار نانوذرات اکسید نیکل و اکسید نیکل تودهای بر تجمع عناصر و بیان ژن های انزیم های آنتی اکسیدان گیاه رازیانه مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
مواد گیاهی: بذرهای گیاه رازیانه(کد PBF-64) از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه شد. نانوذره NiO (کد US3355 ) از شرکت US Research Nanomaterials و NiO تودهای از شرکت Merck (کد 112277) تهیه گردید.
تعیین مشخصات نانوذرات اکسید نیکل و اکسید نیکل توده ای: دستگاه انالیز اندازه ذرات جهت بررسی اندازه ذرات، پتانسیل زتا و وزن ملکولی مورد استفاده قرار گرفت. پراش پرتو (XRD) X، برای مطالعه ساختار بلوری ذرات و میکروسکوپ نیروی اتمی(AFM) جهت بررسی ابعاد ذره مورد استفاده قرار گرفت. مراحل مختلف این آزمایش ها، در آزمایشگاه مرکزی دانشگاه فردوسی مشهد انجام شد.
آزمایش های کاشت و تیماردهی: این آزمایش در شرایط گلخانه ای بصورت طرح کاملا تصادفی با 5 غلظت از نانوذرات اکسید نیکل و اکسید نیکل توده ای (0، 20، 100، 400 و 800 ppm ) انجام شد. هر غلظت شامل 5 گلدان 5 کیلویی حاوی خاک لوم رسی و هر گلدان حاوی 10 عدد بذر رازیانه بود که در عمق یک سانتیمتری خاک کاشته شدند. دمای گلخانه حدود 25 تا 30 درجه سانتی گراد متغیر بود و فتوپریود شامل 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی بود. پس از یک ماه و نیم از کاشت، اسپری برگی انجام شد. برای گروه شاهد از آب مقطر استفاده گردید. اسپری برگی بصورت هفتگی انجام شد. طول دوره آزمایش 82 روز و در مجموع 5 مرحله اسپری برگی انجام شد.
سنجش غلظت عناصر منگنز، مس، آهن، روی، سدیم، پتاسیم، منیزیم و کلسیم در برگ و ریشه: برای سنجش انباشتگی عناصر در ریشه و برگ، ابتدا نمونه های ریشه و برگ شاهد و کلیه تیمارها در آون 70 درجه سانتی گراد به مدت 72 ساعت قرار گرفته و پس از خشک شدن کامل، با آسیاب پودر شدند. به 100 میلی گرم پودر ریشه و 500 میلی گرم از پودر برگ، بصورت جداگانه 5 میلیلیتر اسید نیتریک غلیظ افزوده شد و تا هضم کامل بافت ها در ارلن های درب بسته، به مدت یک شب قرار گرفتند. پس از این مدت، ارلن ها به مدت یک ساعت در آون 90 درجه سانتی گراد قرار گرفتند تا به شدت هضم بافت ها افزوده گردد. پس از سرد شدن یک میلیلیتر محلول پراکسید هیدروژن (H2O2) 30% به مخلوط واکنش افزوده شد. جهت هضم کامل بافت ها، ارلن ها روی اجاق برقی قرار داده شدند و حرارت دهی تا خشک شدن تقریبی ادامه یافت. در انتها، با استفاده از آب دیونیزه حجم اندک محلول باقی مانده برای نمونه های ریشه به 100 میلیلیتر و برای نمونه های برگ به 25 میلیلیتر رسانده شد و در نهایت خاکستر تر گیاهی بدست آمد (10). محتوای عناصر منگنز، مس، آهن، روی، کلسیم و منیزیم با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر جذب اتمی (Hitachi Z2000 Atomic Absorption Spectrophotometer) و محتوای عناصر سدیم و پتاسیم با دستگاه نشر اتمی (JENWAY PFP7 Flame Photometer) اندازه گیری شد.
محاسبه فاکتور انتقال عناصر از ریشه به برگ: پس از سنجش میزان عناصر در ریشه و برگ، فاکتور انتقال عناصر از ریشه به برگ گیاهان شاهد و تیمار با فرمول زیر محاسبه شد:
میزان عناصر ریشه / میزان عناصر برگ TF=
1- مطالعات بیان ژن: در این پژوهش اثر غلظتهای مختلف نانو و تودهای اکسید نیکل بر بیان دو ژن ndh H و ndh D که ایزوآنزیمهای آنزیم پلی فنل اکسیداز و گایاکول پراکسیداز هستند، مورد بررسی قرار گرفت. انتخاب ژن ها بر اساس دسترسی به توالی ژن و تایید و سنتز پرایمرها برای بیان مناسب بود.
بعد از برداشت نمونه های گلدانی، شستشو و جدا کردن ریشه ها از بخش هوایی، نمونه ها در پاکت های پلاستیکی به طور جداگانه بسته بندی و در فریزر 20- درجه قرار داده شد. بعد از چهار روز، 100 میلیگرم از بافت برگ برای هر تیمار با ترازو اندازه گیری و جهت استخراج RNA استفاده گردید.
استخـراج RNA از بافت برگ: جهت استخـراج از کیت
استخراج RNA (plant tissue RNA isolation kit (50)) )کمپانی Favorgen تایوان ) استفاده شد. با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر مدل Epoch از کمیّت RNA استخراج شده و صحیح بودن آن اطمینان حاصل شد. بررسی کیفیت RNA استخراج شده( الکتروفورز بر روی ژل آگارز): جهت سنجش کیفیت RNA های استخراج شده از بافت برگ، الکتروفورز بر روی ژل آگاروز انجام شد.
سنتز cDNA: ، سنتز cDNA توسط کیت سنتز cDNA شرکت پارس توس انجام شد. پرایمرهای اختصاصی ژن ndh D و ndh H و ژن RPL 20 بعنوان ژن خانه دار با استفاده از نرم افزار الیگو 7 طراحی و توسط برنامه BLAST در NCBI مورد تأیید قرار گرفت. ویژگی های کامل پرایمرهای طراحی شده در جدول 1 آمده است.
جدول 1- توالی پرایمر مورد استفاده برای بررسی بیان ژن
|
Tm |
Primer Sequence |
Gene Name |
|
53 |
Forward: 5´-GAAACGTCTTTACTCGGCTA -3´ Reverse: 5´-AACCATATAAACCGACACC -3´ |
ndh D |
|
54 |
Forward: 5´-TTTATCGGGACCAATGCTAC -3´ Reverse: 5´-TCCCCAATCAAATTCATCGT-3´ |
ndh H |
|
50 |
Forward: 5´-GCAAAAGAGAAATTTTCGC -3´ Reverse: 5´-CTATTTCCCGAATTACTGC -3´ |
RPL20 |
Real-Time PCR: جهت انجام آزمایش ریل تایم (مدلBio Rad) به هر یک از میکروتیوپ ها، 10 میکرولیتر محلول سایبرگرین، 2 میکرولیتر نمونه cDNA، 1 میکرولیتر پرایمر Forward و 1 میکرولیتر پرایمر Reverse، 6 میکرولیتر آب مقطر اضافه شد. حجم محلول در مجموع به 20 میکرولیتر رسید. 48 خانه اول برای ژن H، 48 خانه برای ژن خانه نگهدار، 48 خانه برای ژن D، در دستگاه قرار گرفتند. تمامی نمونه ها بصورت دوتایی (دوپلیکیت) قرار داده شد.
Time PCR Quantitative Real- تکنیک بکار رفته در این پژوهش بود که با این تکنیک میزان بیان ژن های مورد نظر با روش کمی نسبی و با استفاده از رنگ Syber Greenارزیابی گردید و میزان تکثیر در چرخه ای که بیان ژن ها قابل ردیابی بود، تحت عنوان Ct نامیده و Ctهای حاصل نسبت به Ctمربوط به بیان ژن RPL 20 مورد ارزیابی قرار گرفت. از روش -∆∆ct 2 برای بررسی تفاوت بیان ژنها استفاده گردید و از ژن RPL 20 به عنوان ژن شاهد استفاده شد (30).
روش های آماری: تجزیه و تحلیل داده ها توسط نرم افزار SPSS انجام گرفت. مقایسه میانگین ها براساس آزمون ANOVA و تست Duncan صورت گرفت و رسم نمودارها به کمک نرم افزار Excel انجام شد.
نتایج
نتایج آنالیز اندازه ذرات: این نتایج در جدول 1 آمده است.
جدول 1-مشخصات نانوذره اکسید نیکل و اکسید نیکل توده ای
|
نوع ماده |
ثابت دی الکتریک |
میانگین حرکت ذرات µM/s/V/cm)) |
میانگین زتا (mV) |
قطر هیدرودینامیکی (nm) |
شاخص پراکندگی |
قطر ذره (nm) |
|
نانوذره اکسید نیکل |
58/79 |
58/0 |
37/9 |
68/189 |
38/0 |
36/47 |
|
اکسید نیکل توده ای |
44/79 |
86/1- |
10/25- |
29/359 |
155/0 |
92/220 |
جذب، انباشته شدن و انتقال عناصر: نتایج نشان داد محتوای انباشت عناصر مس، پتاسیم و کلسیم در برگ گیاهان رازیانه تیمارشده با غلظتهای مختلف اکسید نیکل نانو کاهش معنی داری در مقایسه با گروه شاهد داشتند، همچنین محتوای عناصر آهن و روی در غلظت 20 نانو کاهش معنی دار نسبت به محتوای این عناصر در گیاهان گروه شاهد داشتند، محتوای سدیم در همه غلظتهای نانو افزایش معنی دار در مقایسه با گروه شاهد داشت ، اما محتوای منگنز در گیاهان تیمارشده با گروه شاهد اختلاف معنی داری نشان نداد بجز غلظت 100 که افزایش معنی دار داشت و منیزیم در غلظتهای مختلف نانو فاقد اختلاف معنی دار با شاهد بود(جدول 2).
در غلظتهای مختلف اکسید نیکل توده ای، عناصر مس، سدیم و کلسیم برگ کاهش معنی دار نشان دادند، عناصر منگنز، آهن و روی در غلظت 20 توده ای کاهش معنی دار داشتند و پتاسیم در غلظت های کمتر از 400 توده ای فاقد اختلاف معنی دار با شاهد بود(جدول 2).
جدول 2- اثر نانوذرات اکسید نیکل و اکسید نیکل توده ای بر میزان جذب و انباشت عناصر در بخش هوایی گیاه رازیانه. داده ﻫﺎ ﻣﻴﺎﻧﮕﻴﻦ ﺳﻪ ﺗﻜﺮار± اﻧﺤﺮاف ﻣﻌﻴﺎر هستند. آﻧﺎﻟﻴﺰﻫﺎ ﺑﺮاﺳﺎس آﻧﻮای ﻳﻚ ﻃﺮﻓﻪ ﻫﻤﺮاه ﺑﺎ آزﻣﻮن داﻧﻜﻦ اﻧﺠﺎم شده اﻧﺪ . ﺣﺮوف ﻣﺘﻔﺎوت ﻧﺸﺎن دﻫﻨﺪه ی وﺟﻮد اﺧﺘﻼف معنی دار اﺳﺖ (P≤0.05).
|
|
منگنز |
روی |
مس |
آهن |
منیزیم |
کلسیم |
پتاسیم |
سدیم |
|
نانوذره اکسید نیکل(ppm) |
||||||||
|
0 |
011/0± 992/0bc |
813/0 ± 99/5a |
14/0 ± 145/0a |
069/0 ± 02/4a |
62/5 870±ab |
05/2 ± 76/67a |
18/18 ± 68/1405a |
047/0 ± 483/1c |
|
20 |
048/0 ± 939/0c |
005/0 ± 09/4bc |
005/0 ± 176/0b |
057/0 ± 52/3bc |
22/10 ± 39/866ab |
87/1 ± 49/53cd |
78/31 ± 1083d |
239/0 ± 722/1a |
|
100 |
035/0 ± 156/1a |
437/0 ± 41/5ab |
001/0 ± 135/0b |
149/0 ± 07/4a |
09/12 ± 31/924a |
94/2 ± 35/61ab |
15/18 ± 1196c |
071/0 ± 626/1b |
|
400 |
044/0 ± 099/1ab |
905/0 ± 81/5a |
013/0 ± 139/0b |
271/0 ± 96/3ab |
31/12 ± 58/880ab |
04/3 ± 58/49d |
0 ± 1242b |
0 ± 483/1c |
|
800 |
0 ± 925/0c |
755/1 ± 132/6a |
021/0 ± 117/0b |
0 ± 81/3abc |
0 ± 87/846ab |
78/1 ± 52/48d |
18/18 ± 1178c |
0 ± 387/1d |
|
اکسید نیکل توده ای(ppm) |
||||||||
|
0 |
011/0 992± /0bc |
813/0 ± 99/5a |
14/0 ± 145/0a |
069/0 ± 02/4a |
62/5 870±ab |
05/2 ± 76/67a |
18/18 ± 68/1405a |
047/0 ± 483/1c |
|
20 |
142/0 ± 705/0d |
441/1 ± 567/3c |
038/0 ± 165/0b |
371/0 ± 36/3c |
28/140 ± 045/937a |
87/0 ± 06/35e |
68/22 ± 1056d |
0 ± 363/1d |
|
100 |
142/0 ± 981/0bc |
293/0 ± 06/6a |
0 ± 141/0b |
604/0 ± 718/3abc |
53/12 ± 125/930a |
21/3 ± 54/47d |
90/9 ± 1069d |
0478/0 ± 220/1f |
|
400 |
0 ± 923/0c |
0 ± 271/5ab |
0 ± 121/0b |
0 ± 34/3c |
0 ± 62/821a |
0 ± 14/58bc |
15/18 ± 1178c |
0478/0 ± 291/1e |
|
800 |
0 ± 892/0c |
0 ± 781/4abc |
062/0 ± 159/0b |
0 ± 87/3ab |
0 ± 37/940a |
0 ± 53/57bc |
0 1060±d |
0 ± 244/1ef |
عناصر منگنز، مس، روی، منیزیم و کلسیم در ریشه گیاهان رازیانه در غلظت های مختلف نانو اکسید نیکل اختلاف معنی داری با شاهد نشان ندادند، آهن در غلظت 20 نانو کاهش معنی دار داشت، در مورد سدیم همه غلظتهای نانو موجب کاهش معنی دار در مقایسه با شاهد شدند(جدول 3).
در رابطه با غلظت های اکسید نیکل توده ای، عنصر مس در ریشه فاقد اختلاف معنی دار در تمامی غلظت ها بود(شکل7)، عناصر منگنز، آهن و کلسیم کاهش معنی دار در غلظت های 20 و 400 توده ای در مقایسه با شاهد و عناصر روی، پتاسیم و منیزیم افزایش معنی دار در غلظت های بالاتر یعنی 400 و 800 نشان دادند و سدیم در همه غلظت های توده ای کاهش معنی دار در مقایسه با شاهد داشت( جدول 3).
جدول 3- اثر نانوذرات اکسید نیکل و اکسید نیکل توده ای بر میزان جذب و انباشت عناصر در ریشه گیاه رازیانه. داده ﻫﺎ ﻣﻴﺎﻧﮕﻴﻦ ﺳﻪ ﺗﻜﺮار± اﻧﺤﺮاف ﻣﻌﻴﺎر هستند. آﻧﺎﻟﻴﺰﻫﺎ ﺑﺮاﺳﺎس آﻧﻮای ﻳﻚ ﻃﺮﻓﻪ ﻫﻤﺮاه ﺑﺎ آزﻣﻮن داﻧﻜﻦ اﻧﺠﺎم شده اﻧﺪ . ﺣﺮوف ﻣﺘﻔﺎوت ﻧﺸﺎن دﻫﻨﺪه ی وﺟﻮد اﺧﺘﻼف معنی دار اﺳﺖ (P≤0.05).
|
|
منگنز |
روی |
مس |
آهن |
منیزیم |
کلسیم |
پتاسیم |
سدیم |
|
نانوذره اکسید نیکل(ppm) |
||||||||
|
0 |
0006/0 ± 229/0ab |
118/0 ± 129b |
043/±0 111/0a |
035/0 ± 889/1a |
87/1 04±/42a |
53/1 89±/4ab |
18/0 87±/41ef |
023/0 31±/1a |
|
20 |
002/0 ± 228/0ab |
363/0 ± 375/0ab |
032/0 111±/0a |
005/0 ± 814/1b |
004/±0 62/42a |
99/0 16±/4bc |
36/0 96±/48a |
047/0 24±/1b |
|
100 |
005/0 ± 229/0ab |
242/0 ± 347/0ab |
0006/±0 081/0a |
083/0 ± 833/1bc |
78/±2 78/41a |
1/0 87±/3bc |
54/0 32±/47ab |
023/0 17±/1c |
|
400 |
002/0 ± 230/0ab |
075/0 ± 107/0b |
005/0 ± 083/0a |
012/0 ± 844/1ab |
37/3 24±/37ab |
24/0 49±/3c |
9/0 05±/48a |
0 19±/1c |
|
800 |
001/0 ± 231/0a |
004/0 ± 263/0ab |
001/0 ± 083/0a |
01/0 ± 841/1ab |
02/0 71±/35ab |
045/0 94±/5a |
45/1 69±/45bc |
0 1±/1d |
|
اکسید نیکل توده ای(ppm) |
||||||||
|
0 |
0006/0 ± 229/0ab |
118/0 ± 129/0b |
043/0 111/0a |
039/0 ± 889/1a |
87/1 ± 04/42a |
53/1 89±/4ab |
18/±0 87/41ef |
023/0 31±/1a |
|
20 |
0006/0 ± 221/0cd |
212/0 314±/0ab |
008/0± 093/0a |
012/0 ± 742/1c |
04/3 ± 19/37ab |
76/0 55±/3c |
08/1 23±/44cd |
049/0 01±/1e |
|
100 |
002/0 ± 225/0bc |
013/0± 159/0b |
001/±0 085/0a |
027/0 ± 798/1bc |
14/±10 82/42a |
04/0 15±/5ab |
9/0 87±/45bc |
023/0 98±/0e |
|
400 |
0 ± 220/0d |
0 ± 413/0ab |
0 090±/0a |
0 ± 747/1c |
0 59±/31b |
0 08±/3c |
81/1 78±/42de |
023/0 885±/0f |
|
800 |
004/0± 230/0ab |
63/0± 767/0a |
005/0 ± 085/0a |
130/0 ± 846/1ab |
05/0 56±/31b |
66/0 19±/6a |
0 97±/ 40f |
023/0 78±/0g |
اثر غلظتهای مختلف نانو و تودهای اکسید نیکل بر میزان فاکتور انتقال عناصر گیاه رازیانه: تیمار ppm 20 نانو، دارای کمترین انباشت عنصر روی، مس، آهن، منیزیم و پتاسیم و تیمار ppm 20 تودهای کمترین انباشت عنصر منگنز، مس و آهن در ریشه نسبت به برگ می باشد. تیمار ppm 100 نانو، دارای بیشترین انباشت عنصر منگنز، آهن، کلسیم و سدیم در ریشه نسبت به برگ می باشد. تیمار ppm 100 تودهای، دارای کمترین انباشت عنصر کلسیم و پتاسیم در ریشه نسبت به برگ می باشد. تیمار ppm 400 تودهای، دارای بیشترین انباشت عنصر کلسیم در ریشه نسبت به برگ می باشد. تیمار ppm 800 نانو دارای کمترین انباشت عنصر منگنز و کلسیم و بیشترین انباشت عنصر منیزیم در ریشه نسبت به برگ می باشد. تیمار ppm 800 تودهای دارای کمترین انباشت عنصر روی و بیشترین انباشت عنصر منیزیم و سدیم در ریشه نسبت به برگ می باشد(جدول4).
جدول 4- فاکتور انتقال عناصر در گیاهان رازیانه تحت تیمار اکسید نیکل نانو و توده ای
|
400 |
100 |
||||||||
|
2506/0 |
2097/0 |
1986/0 |
3221/0 |
2439/0 |
2312/0 |
||||
|
1604/0 |
0453/0 |
0783/0 |
0201/0 |
0264/0 |
0668/0 |
1189/0 |
0917/0 |
0200/0 |
|
|
7090/0 |
6009/0 |
6383/0 |
6153/0 |
5353/0 |
4598/0 |
8207/0 |
7586/0 |
||
|
4759/0 |
4819/0 |
5219/0 |
4663/0 |
4933/0 |
4493/0 |
5224/0 |
5150/0 |
4697/0 |
|
|
0335/0 |
0421/0 |
0384/0 |
0423/0 |
0461/0 |
0451/0 |
0406/0 |
0492/0 |
0473/0 |
|
|
1076/0 |
1225/0 |
0531/0 |
0705/0 |
1088/0 |
0634/0 |
1048/0 |
0776/0 |
0710/0 |
|
|
0386/0 |
0387/0 |
0363/0 |
0386/0 |
0428/0 |
0395/0 |
0419/0 |
0452/0 |
0297/0 |
|
|
6345/0 |
7930/0 |
6851/0 |
8069/0 |
8065/0 |
7212/0 |
7424/0 |
7222/0 |
8880/0 |
|
بیان ژن ndh H به روشRT-PCR در گروه های مورد مطالعه: شکل 1 مقایسه میزان بیان ژن ndh H را در بین گروه های نانو مورد مطالعه نشان می دهد نمودارها با استفاده از نرم افزار BioRad رسم شده است. نتایج ریل تایم نشان داد که افزایش نسبی در همه مقادیر نانو نسبت به شاهد دیده شد. همانطور که انتظار می رود بیشترین میزان افزایش در ppm 800 نانو مشاهده گردید.
بررسی نتایج بیان ژن H نشان داد که افزایش بیان ژن نسبت به شاهد در تمامی نمونه ها دیده شد. بیشترین میزان بیان ژن مربوط به ppm 800 تودهای بود (شکل1).
الف
شکل 1- مقایسه میزان بیان ژن ndh H در بین گروه های نانو (الف) و توده ای (ب) مورد آزمایش. ستون اول شاهد، ستون دوم تا پنجم بترتیب نمونه های نانو و توده ای با غلظت های ppm20، 100، 400 و 800 را نشان می دهد.
در تمامی نمونه ها افزایش بیان ژن نسبت به شاهد مشاهده گردید. در غلظت ppm20 و 400 تفاوت بیان ژن بین غلظتهای نانو و تودهای وجود نداشت. در غلظت ppm 100 و 800 میزان نانو نسبت به تودهای هم غلظت، افزایش بیشتری نشان داد.
مقایسه میزان بیان ژن ndh D در بین گروه های مورد آزمایش: نمودار بیان ژن D در غلظتهای نانو نشان دهنده کاهش تمامی نمونه ها نسبت به شاهد است. تنها غلظتی که نسبت به بقیه بیان بالاتری نشان داد غلظت ppm 400 نانو بود(شکل2). در تمامی نمونه ها کاهش بیان ژن نسبت به شاهد مشاهده شد. در غلظت ppm20، نمونه نانو و تودهای تفاوت مشخصی نداشتند. غلظت ppm 100 و 800 نمونه های نانو نسبت به تودهای کاهش داشتند. غلظت ppm 400 افزایش نانو در مقایسه با تودهای مشاهده گردید(شکل2).
الف
ب
شکل2- مقایسه میزان بیان ژن ndh D در بین گروه های نانو(الف) و توده ای (ب) مورد آزمایش. ستون اول شاهد، ستون دوم تا پنجم بترتیب نمونه های نانو و توده ای با غلظت های ppm20، 100، 400 و 800 را نشان می دهد.
بحث و نتیجه گیری
همانطور که در نتایج پژوهش حاضر مشاهده میشود، تیمار گیاه رازیانه با اکسید نیکل نانو و تودهای دارای آثار معنیدار بر محتوای عناصر مورد مطالعه برگ و ریشه، بود. در پژوهشهایی (15و22) که اثر نیکل بر مقدار عناصر غذایی پر مصرف و کم مصرف در گیاهان انجام شده، این نتایج بدست آمده است : در جو خوراکی(Hordeum vulgare L.)، در بخشهای هوایی، اثر سولفات نیکل موجب کاهش آهن شد که با نتایج بدست آمده در این پژوهش مطابقت داشت. کاربرد کلرید نیکل در بخشهای هوایی و ریشه برنج خوراکی (Oryza sativa L.) موجب کاهش پتاسیم، کلسیم و منیزیم گردید که همسو با پژوهش حاضر بود. تیمار گیاه لوبیای خوراکی(Phaseolus vulgaris L.) با نیترات نیکل موجب افزایش پتاسیم، آهن و مس ریشه شد که افزایش پتاسیم هماهنگ با این تحقیق است، در حالی که در برگها تغییری در جذب پتاسیم، کلسیم، منیزیوم، آهن، منگنز و روی مشاهده نشد که در مورد منیزیم با پژوهش حاضر مطابقت دارد. اثر سولفات نیکل بر برگها و ریشههای گندم خوراکی (Triticum aestivum L.) موجب کاهش پتاسیم شد که کاهش آن در برگ مطابق با پژوهش حاضر است. در گندم خوراکی تیمار برگها با نیکل موجب افزایش کلسیم و منیزیوم شد که مغایر با این پژوهش است ولی کاهش آهن، منگنز و روی همسو با تحقیق حاضر است. تحقیقات کمتری در ارتباط با عناصر بصورت تودهای و نانو و مقایسه آنها روی جذب عناصر دیگر صورت گرفته است. با توجه به دادههای پژوهش حاضر میتوان بطور کلی نتیجه گرفت اکسید نیکل تودهای اثر کاهشی بیشتری بر جذب عناصر در مقایسه با اکسید نیکل نانو داشت. بنابراین استفاده از اکسید نیکل نانو در غلظتهای مشخص شده میتواند راهکار مناسبی برای جذب بهتر عناصر باشد.
در بررسی فاکتور انتقال مشخص شد در شاهد بیشترین انباشت عناصر وجود دارد و تیمارهای اعمال شده مخصوصاً ppm 20 نانو از حرکت عناصر به برگ ممانعت نکرده و در این غلظت جابجایی عناصر به جز کلسیم و سدیم به برگ قابل توجه بوده است. بنابراین با استفاده از تیمارهای کم نانو میتوان حرکت برخی از عناصر از ریشه به برگها را افزایش داد.
نتایج بیان ژن ndh H حاصل از این پژوهش نشان داد، افزایش بیان ژن نسبت به شاهد در تمامی نمونههای نانو و تودهای وجود دارد. با افزایش غلظت تیمارها، بیان ژن نیز بیشتر گردید. بین غلظتهای اعمال شده نانو و توده ای(ppm20، 100، 400 و 800) ، بیشترین بیان ژن مربوط به غلظت ppm800 بود. در کلیه تیمارها، غلظتهای نانو نسبت به تودهای موجب افزایش بیشتری در بیان ژن شدند که این تفاوت در غلظتppm 800 بیشتر بود. بر خلاف ژن H نتایج بیان ژن ndh D در این مطالعه نشان داد که بیان ژن در تمامی نمونههای نانو و تودهای نسبت به شاهد کاهش داشت. در غلظت ppm20 اکسید نیکل نانو و توده ای تقریباً بیان ژن مشابه و درغلظتهایppm 100 و 800 تیمار نانو نسبت به تودهای موجب کاهش بیان ژن و فقط در تیمار ppm400 نانو نسبت به تودهای افزایش بیان این ژن مشاهده گردید.
در پژوهشی که توسط موسا و همکاران (10) انجام گرفت اثر نانوذرات مس، در گیاه خیار (Cucumis sativus) بررسی شد. این گیاه نانوذرات را با مقادیر وابسته به غلظت در بافتهای خود و با بالاترین مقدار در ریشه انباشت کرد. علاوه بر این نانو ذرات مس موجب افزایش بیان ژن سوپراکسید دیسموتاز در گیاه خیار گردیدند. در این تحقیق نیز افزایش بیان ژن اکسیدوردکتاز ndh H در تیمارهای اکسید نیکل نانو و تودهای مشاهده شد.
در تحقیق حاضر گرچه به نظر می رسد هر دو ژن H,Dدر یک مسیر اکسیدوردکتازی فعالیت میکنند، اما نتایج بیان ژن نشان داد که دو ژن بصورت کاملاً متفاوتی نسبت به اکسید نیکل نانو و تودهای پاسخ دادند. تمامی غلظتهای نانو و تودهای اکسید نیکل موجب افزایش بیان ژن H و کاهش بیان ژن D در مقایسه با شاهد شدند. این موضوع مخصوصاً بیانگر تفاوت مسیرهای مولکولی بیان ژن و اثر آن در مسیرهای فیزیولوژیکی است.
در تحقیق دیگر(15) اثر نانولولههای کربن بر بیان ژن در ریشههای گوجه فرنگی و برگهای اولیه آن با تحلیل ریزآرایه ارزیابی گردید. اکثر ژنهای فراتنظیم شده در فرآیندهای مربوط به تنش دخالت داشتند.
شن و همکاران (27) در پژوهشی اثر نانولوله کربن بر بیان ژنهای کدکننده آنزیمهای جاروبکننده H2O2 در آرابیدوپسیس تالیانا را تعیین کردند. مشاهده شد که میزان بالای رونویسی آسکوربات پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز میتوکندریایی بعد از تزریق نانولولههای کربن تکجدارهای در برگها بیان شد.
پاسخهای اولیه به تنشهای غیرزیستی شامل افزایش موقت کلسیم سیتوپلاسمی، افزایش پیامرسانهای ثانویه بین سلولی مثل اینوزیتول پلی فسفات، انواع اکسیژن فعال ROS (مثل یونهای اکسیژن و پراکسید) و آبسیزیک اسید و افزایش مسیرهای پروتئین کیناز فعال شونده با میتوژن (MAPK) هستند (4و3). در سطح بعدی پاسخ به تنش، پروتئینهای تنظیمی هستند که مستقیما در حفاظت از آسیب سلولی و افزایش و کاهش تنظیم ژنهای خاص تنش دخالت دارند (28و9). متابولیتهای ثانویه در گیاهان در پاسخ به تنشهای غیرزیستی نیز اهمیت دارند. این ترکیبات در پایداری ساختارها، حفاظت نوری، حفاظت در برابر آنتیاکسیدانها و آنتیرادیکالها، ترارسانی علامت و تجمع پلیآمینها که برخی پیشساز هورمونهای گیاهی هستند و در ترارسانی علامت هورمونها نقش دارند (21و31).
با وقوع تنشهای زیستی و غیرزیستی، دیواره سلولی اولین لایه درک تنش است و در سازگاری گیاه نقش پویا و مکانیکی دارد. پراکسیدازهای برون سلولی تعدیلکنندههای دیواره سلولی و تولید کننده سوپراکسید و هیدروژن پراکسید هستند که در زمان وقوع تنش، انفجار اکسیداتیو ایجاد میکنند (8و23). انفجار اکسیداتیو، تولید ROS، تجمع آنزیمهای بیوسنتز فنیل پروپانوئید (نوعی متابولیت ثانویه) و تغییر بیان ژن طی پاسخ دفاع گیاه را القا میکند (25و6و8).
نانو ذرات به علت کاربرد وسیع در محیط رها میشوند و اثرات سمی مخصوص به اندازهشان را بر موجودات زنده میگذارند. از آنجائیکه نانوذرات ویژگیهای اصلی ترکیب تودهای خود را حفظ میکنند بنابراین در مطالعه تأثیر متقابل نانوذرات در محیط باید اثر ترکیب تودهای نیز در نظر گرفته شود. در ارتباط با انباشت عناصر، نتایج این تحقیق نشان داد در شاهد بیشترین انباشت عناصر اتفاق افتاده و تیمارهای اعمال شده بخصوص ppm 20 نانو از حرکت عناصر به برگ ممانعت نکرده و در این غلظت جابجایی عناصر بجز کلسیم و سدیم به برگ قابل توجه بوده و اکسید نیکل تودهای اثر کاهشی بیشتری بر جذب عناصر نشان داد.
در تحقیق حاضر ژن ndh H در تمامی غلظتهای بکار رفته نانو و تودهای اکسید نیکل در مقایسه با گروه شاهد افزایش بیان ژن داشت و بیشترین افزایش در گروه نانو و تودهای مربوط به غلظت ppm 800 بود. این نتایج با نتایج حاصل از افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان در شرایط تنشی همسو میباشد. در رابطه با ژن ndh D کاهش در بیان ژن، در غلظتهای مختلف نانو و تودهای نسبت به شاهد مشاهده گردید که احتمالاً بدلیل دخالت مسیرهای سمزدائی دیگری در مقابل تنش ایجاد شده بوده است. از جمله این مسیرها می توان به افزایش آنتی اکسیدان های گیاهی نظیر توکوفرول ها، اسید فولیک، اسید آسکوربیک، رنگیزه های کاروتنوئیدی، فنیل آکریلیک اسیدها و پلی فـــنل ها اشاره کرد که بزرگ ترین گروه فنل های طبیـــعی را شــــامل می شوند. به طــــور کلی این آنتی اکسیدان ها قادرند به اشکال مخـــتلف از جمله پاک سازی رادیکال های آزاد، کـــلات کنندگی، احیاء کنندگی و یا فعال کنندگی آنزیم های آنتی اکسیدانی سلول عمل نموده و موجب کاهش و یا رفع آسیب های ناشی از رادیکال های آزاد در سیستم های زیستی گردند(9). با توجه به مطالعات بیان ژن به نظر می رسد اولین سطح پاسخ گیاه در تولید و تغییر آنزیم ها، واکنش سلولی، پاسخ دفاعی گیاه و عوامل دیگر مربوط به بیان ژن های مربوطه می باشد و در مسیرهای بعدی آبشارهای پیام رسان سلولی بر سطح بیان ژن اثر گذار میباشند.
سپاسگزاری
نویسندگان این مقاله از مسئولین آزمایشگاه مرکزی دانشگاه فردوسی مشهد جهت انجام آزمایشات XRD، زتا سایزر و نانوپارتیکل سایزر و همچنین آزمایشگاه تحقیقاتی دانشکده علوم دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد جهت همکاری برای انجام مراحل مختلف آزمایشات تشکر و قدردانی می نمایند.
مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)