مطالعه‌ی تبارزایی، ساختار و تظاهر خانواده ژنی OASTL-Like در گستره ژنوم آرابیدوپسیس و برنج با رویکرد in silico

مطالعه‌ی تبارزایی، ساختار و تظاهر خانواده ژنی OASTL-Like در گستره ژنوم آرابیدوپسیس و برنج با رویکرد in silico

مریم رجبی فرشمی، رضا شیرزادیان خرم‌آباد^*، امین عابدی و محمدحسین رضادوست

ایران، رشت، دانشگاه گیلان، دانشکده علوم کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی

تاریخ دریافت: 07/03/1401          تاریخ پذیرش: 20/06/1401

چکیده

سیستئین یک ترکیب آلی گوگرد دار و پیش‌ساز ترکیبات دفاعی است که سنتز آن در گیاهان دو مرحله‌ای بوده و آنزیم سیستئین‌سنتاز (OASTL; EC 2.5.1.47) در مرحله‌ی آخر آن نقش دارد که برای فعالیت به کوفاکتور (Pyridoxal-Phosphate) PLP نیاز دارد. یافتن ژن‌های دارای دمین عملکردی (Pyridoxal-Phosphate dependent enzyme) PALP در ژنوم آرابیدوپسیس و برنج موجب شناسایی  20 و 19 ژن OASTL-Like در این گیاهان شد. در این تحقیق ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی، فیلوژنی، ساختار ژنی، موتیف‌های حفاظت شده، عناصر تنظیمی سیس، تنظیم تظاهر پس از رونویسی و پروفایل تظاهر ژن‌های خانواده OASTL-Like در آرابیدوپسیس و برنج بررسی شد. ژن‌های OASTL-Like به دو دسته اصلی و چندین زیرگروه تقسیم شدند. ساختار اگزون اینترونی و ترکیب و توزیع موتیف‌های شناسایی شده، گروه‌بندی تبارزایی را تایید کرد که نشان‌دهنده حفاظت‌شدگی و اختصاصی بودن مسیر تکاملی این ژن‌ها بود. ارزیابی ناحیه پروموتری ژن‌های OASTL-Like در آرابیدوپسیس و برنج بترتیب موجب شناسایی 47 و 48 نوع عنصر تنظیمی شد که پس از G-box بترتیب ARE و ABRE دارای بیشترین فراوانی می‌باشند. این ژن‌ها در آرابیدوپسیس و برنج بترتیب هدف 87 و 105 نوع مولکول miRNA قرار می‌گیرند که نشان‌دهنده‌ی اهمیت تنظیم تظاهر پس از رونویسی می‌باشد. پروفایل تظاهر ژن‌های OASTL-Like حاکی از کارکرد بسیار متنوع این ژن‌ها در مراحل مختلف نموی، پاسخ به تنش‌های غیر زیستی و هورمون‌ها می‌باشد. این مطالعه با شناسایی و کاوش اعضای خانواده OASTL-Like، نتایج قابل توجهی را در مورد این ژن‌ها ارایه می‌کند که در پژوهش‌های مهندسی ژنتیک با هدف بهبود مقاومت گیاهان به تنش‌های محیطی می‌تواند مورد توجه باشند.

واژه های کلیدی: بیوانفورماتیک، پایگاه داده، پروموتر، تظاهر ژن، سیستئین سنتاز

* نویسنده مسئول، تلفن: 09117061208 ، پست الکترونیکی: r.shirzadian@guilan.ac.ir

مقدمه

گوگرد یا سولفور چهارمین ماده غذایی مهم برای رشد و  نمو گیاهان پس از نیتروژن، فسفر و پتاسیم است. سیستئین اولین مولکول شناسایی شده در متابولیسم گیاه است که حاوی گوگرد و نیتروژن می‌باشد. در گیاهان بیوسنتز سیستئین نقش اصلی را در تثبیت گوگرد معدنی از محیط دارد. سیستئین پیش‌ساز ترکیبات حاوی گوگرد مانند متیونین و مشتقات آن، گلوتاتیون، فیتوکلاتین، کوفاکتورها، ویتامین‌ها و متابولیت‌های ثانویه متعدد می‌باشد (22). سیستئین یک اسیدآمینه‌ی ضروری برای تمام سلول‌های زنده می‌باشد و سنتز آن در تمام بخش‌های دارای بیوسنتز مستقل پروتئین (سیتوزول، میتوکندری و کلروپلاست) مورد نیاز است (14).

آنزیم سیستئین سنتاز یا (O-acetylserin (Thiol) lyase) OASTL که به نام‌های O-acetylserine sulfhydrylase و cysteine synthase (CSase) نیز شناخته می‌شود، ادغام سولفید به O-acetylserine و تولید سیستئین را کاتالیز می‌کند (28). سیستئین سنتاز جزو پروتئین‌های حفاظت شده در پروکاریوت‌ها و یوکاریوت‌ها می‌باشد. در گیاهان اولین گام در سنتز سیستئین تولید (O-acetyl serin) OAS از سرین (Serin) و استیل‌کو آ(acetyl-Coa) است که بواسطه‌ی فعالیت کمپلکس هتروالیگومریک سیستئین سنتاز (Cysteine Synthase Complex (CSC)) که متشکل از آنزیم‌های فعال (Serin acetyl transferase (SERAT=SAT)) SAT و آنزیم‌های غیرفعال OASTL می‌باشد، انجام می‌شود. در گام بعدی OAS بوسیله دایمر فعال OASTL با سولفید ترکیب شده و سیستئین تولید می‌شود (36). آنزیم OASTL برای فعالیت به کوفاکتور (Pyridoxal-Phosphate) PLP وابسته است و در زیر خانواده‌ی ژنی نه عضوی (β-Substituted Alanine Synthase) BSAS قرار می‌گیرند. این زیر خانواده عضو خانواده ژنی آنزیم‌های وابسته به PLP می‌باشد (36). تمامی اعضای این خانواده آنزیم‌هایی هستند که دارای دمین عملکردی(Pyridoxal-Phosphate dependent enzyme)  PALP  بوده و برای فعالیت به کوفاکتور (Pyridoxal-Phosphate)PLP نیاز دارند (29).

در گیاه آرابیدوپسیس، 9 ژن OASTL شناسایی و بعنوان زیر خانواده ژنی BSAS معرفی شد (13). مطالعات نشان داد که تنها 3 ایزوفرم BSAS در سنتز بخش عمده سیستئین سلولی مشارکت دارد که شامل سیتوسولی (OASTL-A1) ، پلاستیدی (OASTL-B) و میتوکندریایی (OASTL-C) می‌باشد. سایر OASTL ها یا فعالیت سیستئین سنتازی بسیار کمی دارند و یا در طول تکامل عملکرد‌های دیگری کسب کرده‌اند (14-36). در گیاه اسفناج سه cDNA به نام‌های SoCSaseA، SoCSaseB و SoCSaseC یافت شد که بترتیب OASTL های سیتوسولی، پلاستیدی و میتوکندریایی را کد می‌کنند (30).  AtOASTL سیتوزولی و بدنبال آن ایزوفرم پلاستیدی AtOASTL، بیشترین نقش را در سنتز سیستئین در ریشه و برگ آرابیدوپسیس دارند (35). OASTL سیتوسولی ایزوفرم اصلی OASTL در برگ (44 درصد از کل فعالیت OASTL) و ریشه‌ی (80 درصد از کل فعالیت OASTL) آرابیدوپسیس است (14). دو ایزوفرم سیتوزولی و پلاستیدی در کنار هم 95 درصد از کل فعالیت OASTL در برگ‌ها را بر عهده دارند (14). AtOASTL میتوکندیایی که نقش مهمی در سنتز سیستئین در ریشه دارد تنها 5 درصد از کل فعالیت OASTL را تشکیل می‌دهد (14-35). مشخص شده است که چند عضو از خانواده ژنی OASTL در مقاومت گیاهان در برابر فلزات سنگین و تنش اکسیداتیو نقش دارند. سرکوب AtOASTL سیتوزولی باعث کاهش میزان سیستئین و گلوتاتیون درون سلولی و افزایش حساسیت به کادمیوم شد (26-33). در آرابیدوپسیس بترتیب 5 ژن SAT و 9 ژن OASTL شناسایی شده است. ایزوفرم‌های آنزیم SAT و OASTL که در سیتوپلاسم، پلاستیدها و میتوکندری توزیع شده‌است و کمپلکس سنتز سیستئین نقش مهمی در کنترل بیوسنتز سیستئین دارند (36). سیستئین در روند دفاعی گیاهان در مقابله با تنش نقش تعیین کننده‌ای دارد، سیستئین عامل اصلی کنترل بیوسنتز گلوتاتیون و فیتوکلاتین‌ها می‌باشد. گلوتاتیون و سایر ترکیبات گوگرد دار ثانویه در مهار رادیکال‌های آزاد و لذا در پاسخ گیاهان به تنش‌ها نقش دارند (9-27).

در این مطالعه دمین عملکردی PALP بمنظور شناسایی و کاوش ژن‌های دارای این دمین در ژنوم آرابیدوپسیس و برنج مورد توجه قرار گرفت. ژن‌های شناسایی شده بعنوان خانواده ژنی OASTL-Like شناخته شدند. جایگاه سلولی، مشخصات کلی پروتئین‌ها، روابط تبارزایی طبق درخت رسم شده بر مبنای هم‌ردیف سازی طول کامل پروتئین‌ها، ساختار اگزون-اینترونی، موتیف‌های حفاظت شده، عناصر تنظیمی سیس ناحیه پروموتری، سازوکار تنظیم تظاهر پس از رونویسی از طریق مولکول‌های miRNA و الگوی تظاهر ژن‌ها در مراحل مختلف نموی، پاسخ به هورمون‌های مختلف و تنش‌های غیر زیستی در ریشه و ساقه با استفاده از ابزارها و روش‌های بیوانفورماتیکی مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها

شناسایی اعضای خانواده ژنی OASTL-Like در گیاه آرابیدوپسیس و برنج: پروفایلHMM  (Hidden Markov Model) دمین (PF00291) PALP از پایگاه داده‌ی Pfam دریافت شد (29) و سپس با استفاده از ابزار HMMSearch (12)، جستجوی پروتئین‌های OASTL-Like آرابیدوپسیس و برنج در پایگاه داده Ensemble Plant (8) با پارامتر‌های پیش فرض (E.value 0.01) صورت گرفت. پس از دریافت تمام توالی‌ها، با استفاده از پایگاه داده Pfam و HmmScan وجود دمین کارکردی PALP در توالی‌های پروتئینی غیر تکراری تائید شد (11). توالی‌های دارای این دمین بعنوان پروتئین‌های OASTL-Like در آرابیدوپسیس و برنج تعیین شدند. جهت نامگذاری ژن‌ها در آرابیدوپسیس پیشوند At از Arabidopsis thaliana  و در برنج پیشوند Os از Oriza sativa و سپس OASTL در نظر گرفته شد و در نهایت شماره‌گذاری ژن‌ها بر اساس جایگاه کروموزومی آن‌ها انجام شد. ویژگی‌های عمومی پروتئین‌های OASTL-Like مانند وزن مولکولی، طول و نقطه ایزو الکتریک از طریق ابزار ProtParam سایت  Expasy (5) بررسی و برای شناسایی جایگاه سلولی پروتئین‌ها از سرور CELLO استفاده شد (38).

هم‌ردیف سازی و تجزیه و تحلیل تبارزایی خانواده OASTL-Like: بمنظور تهیه درخت تبارزایی، هم‌ردیف سازی طول کامل پروتئین‌های OASTL-Like  بر اساس پارامتر‌های پیش فرض با استفاده از نرم افزارClustal X 2.1  انجام (23) و سپس نتیجه هم‌ردیف سازی در فرمت Fasta برای رسم درخت تبارزایی به نرم افزار MEGA7 ارائه شد (21). رسم درخت تبارزایی بر اساس الگوریتم بیشینه درست نمایی (Maximum likelihood) انجام و از آزمون بوت استرپ (Boot Strap) با 1500 تکرار برای ارزیابی صحت درخت رسم شده استفاده شد.

شناسایی ساختار ژنی و موتیف های حفاظت شده ژن‌های OASTL-Like: ساختار ژنی (تعداد و طول اگزون/اینترون) و فاز پیرایش خانواده ژنی OASTL-Like، بر اساس مقایسه توالی DNA ژنومی و کد کننده (CDS)، با استفاده از سرور GSDS2.0 ارزیابی و بصورت گرافیکی رسم شد (16). موتیف‌های اختصاصی توالی‌های پروتئینی این خانواده توسط سرور MEME با پارامتر‌های مورد استفاده شامل شناسایی 20 موتیف و حداقل و حداکثر طول موتیف‌ها بترتیب 15 و 50 اسید آمینه شناسایی شد (6). سپس برای بررسی کارکرد موتیف‌های شناسایی شده از پایگاه داده Pfam استفاده شد (11).

کاوش پروموتر و شناسایی miRNA های درگیر با ژن‌های OASTL-Like: ناحیه 1500 جفت باز بالا دست کدون شروع ژن‌های OASTL-Like بعنوان ناحیه پروموتری با هدف شناسایی Cis element ها در PlantCare مورد ارزیابی قرارگرفت (24). سپس عناصر تنظیمی شناسایی شده بر اساس کارکرد گروه‌بندی و فراوانی هر عنصر تنظیمی شمارش و ارائه شد. پیش بینی miRNA هایی که در تنظیم تظاهر پس از رونویسی ژن‌های OASTL-Like نقش دارند با استفاده از سرور PsRNATarget و امتیاز مورد انتظار بالای 3.5 انجام شد (10). ارتباط بین ژن‌ها و مولکول‌های miRNA شناسایی شده با نرم افزار Cytoscape رسم شد (32).

بررسی تظاهر ژن‌های OASTL-Like : بمنظور بررسی پروفایل تظاهر ژن‌های AtOASTL-Like در واکنش به تنش‌های غیر زیستی (شامل سرما، خشکی، گرما، اسمزی، اکسیداتیو، شوری، زخم، UV-B و Genotoxic)، هورمون‌ها (شامل آبسیزیک اسید، ایندول استیک اسید، زآتین، جیبرلین، متیل جاسمونات و اتیلن ) و مراحل نموی (شامل 46 مرحله نموی متفاوت مربوط به 16 اندام آرابیدوپسیس شامل بذر خشک، بذر مرطوب، گره اول، برگ اولیه، لپه، ریشه، گل، برگ، محور زیر لپه، برگ روزت، برگ پیر، ساقه، شاخه، گرده بالغ، بذر و روزت رویشی)، اطلاعات از پایگاه داده efp Browser دریافت شد (15). از نرم افزار Mev4 برای خوشه‌بندی (Clustering) داده‌های تظاهر بر اساس روش اقلیدسی (Euclidean) و الگوریتم بیشترین فاصله (Complete Linkage) و نیز رسم نقشه حرارتی (Heat map) استفاده شد (31).

نتایج

شناسایی اعضای خانواده ژنی OASTL-Like: جستجوی ژنوم آرابیدوپسیس و برنج برای یافتن ژن‌های دارای دمین عملکردی PALP  موجب شناسایی بترتیب 20 و 19 ژن OASTL-Like در این گیاهان شد که بدلیل داشتن دمین عملکردی PALP و رابطه تکاملی نزدیک بعنوان خانواده ژنی AtOASTL-Like و OsOASTL-Like در نظر گرفته شدند. دمین PALP در پایگاه داده Pfam بعنوان دمین حفاظت شده خانواده PALP معرفی شده است (29). تمامی اعضای این خانواده آنزیم‌هایی هستند که برای فعالیت به کوفاکتور پیریدوکسال‌ فسفات (PLP) نیاز دارند. این ژن‌ها بر اساس جایگاه کروموزومی در آرابیدوپسیس از AtOASTL1 تا AtOASTL20  و در برنج از OsOASTL1 تا OsOASTL19 نامگذاری شدند (جدول1). اطلاعات مربوط به جایگاه فیزیکی این ژن‌ها از پایگاه داده Ensemble Plant دریافت و مشخص شد که توزیع ژن‌های  OASTL-Likeدر ژنوم آرابیدوپسیس و برنج یکنواخت نمی‌باشد. در آرابیدوپسیس بترتیب 3، 1، 7، 4 و 5 ژن روی کروموزوم‌های 1، 2، 3، 4 و 5  و در برنج 3، 2، 3، 2، 1، 6، 1 و 1 ژن بترتیب روی کروموزوم‌های 1، 2، 3، 4، 5، 6، 8 و 12 قرار دارند (جدول1).

مطالعات فیزیکوشیمیایی خانواده ژنی OASTL-Like نشان داد که این ژن‌ها از نظر تعداد اسیدهای آمینه، وزن مولکولی و  pIبا هم تفاوت دارند. در آرابیدوپسیس طول پروتئین‌های این خانواده از 250 اسیدآمینه در AtOASTL8 (وزن مولکولی 46/26 کیلودالتون) تا 592 اسیدآمینه در AtOASTL7 (وزن مولکولی 63/64 کیلودالتون) متغیر است، دامنه نقطه ایزوالکتریک پروتئین‌ها نیز از 23/5 (AtOASTL6) تا 9 (AtOASTL5) متفاوت است. در برنج طول پروتئین‌های خانواده OASTL-Like از 112 اسیدآمینه در OsOASTL4 (وزن مولکولی 9/11 کیلودالتون) تا 602 اسیدآمینه در OsOASTL7 (وزن مولکولی 5/65 کیلودالتون) متغیر است. دامنه نقطه ایزوالکتریک پروتئین‌ها نیز از 93/4 (OsOASTL15) تا 9/8 (OsOASTL4) متفاوت است (جدول1). پیش‌بینی جایگاه سلولی این پروتئین‌ها در هر دو گیاه نشان داد که اعضای این خانواده در سیتوپلاسم، کلروپلاست و میتوکندری توزیع شده‌است (جدول1). در آرابیدوپسیس بدلیل وجود سازوکار پیرایش متناوب 20 ژن AtOASTL-Like  توانایی کد کردن 49 پروتئین را دارند و در برنج با احتساب نسخه‌های پیرایش متناوب 19 ژن OsOASTL-Like توانایی کد کردن 25 پروتئین را دارند.

جدول 1- مشخصات عمومی ژن‌های OASTL-Like شناسایی شده در ژنوم آرابیدوپسیس و برنج

بررسی رابطه تکاملی ژن‌های OASTL-Like: از آنجایی که ژن‌های خویشاوند نزدیک عموماً عملکرد مشابه دارند. تحلیل تبارزایی می‌تواند برای پیش‌بینی عملکرد ژن‌ها مورد استفاده قرار بگیرد (34). بر اساس آزمون بوت استرپ با 1500 تکرار ، ژن‌های OASTL-Like در آرابیدوپسیس دو لپه و برنج تک لپه به دو دسته‌ی عمده تقسیم شدند (شکل1). ژن‌های زیر خانواده ژنی 9 عضوی BSAS آرابیدوپسیس بهمراه 11 عضو از ژن‌های OASTL-Like برنج در یک دسته جداگانه 20 عضوی قرار گرفتند. طبق بررسی منابع مشخص شد که تمامی این ژن‌ها دارای فعالیت سیستئین سنتازی و یا مرتبط به آن می‌باشند. دسته دوم  شامل 11 عضو از AtOASTL-Like و 8 عضو از OsOASTL-Like می‌باشد. اعضاء این دسته دارای عملکردهایی چون تریپتوفان سنتاز، د- سیستئین دسولفیدراز، ترئونین سنتاز و ترئونین دهیدراتاز می‌باشند.

شکل 1- درخت تبارزایی خانواده   OASTL-Likeدر آرابیدوپسیس و برنج. هم‌ردیف سازی توالی‌ها بر اساس طول کامل پروتئین انجام و رسم درخت با استفاده از نرم‌افزار MEGA7 و بر اساس الگوریتم بیشینه درست‌نمایی انجام و برای تائید صحت درخت رسم شده از آزمون بوت استرپ با 1500 تکرار استفاده شد. پروتئین‌های OASTL-Like در آرابیدوپسیس با رنگ سبز و در برنج با رنگ صورتی مشخص شده است.

شناسایی ساختار ژنی و موتیف‌های حفاظت شده ژن‌های OASTL-Like: بررسی ساختار ژنی می‌تواند شواهد ارزشمندی جهت تأیید درخت فیلوژنتیکی و روابط تکاملی درون خانواده‌های ژنی ارائه نماید (2). بررسی ساختار اگزون اینترونی خانواده ژنی OASTL-Like در آرابیدوپسیس و برنج نشان دهنده‌ی تنوع ساختاری بالای ژن‌های این خانواده می‌باشد. این ژن‌ها از 0 تا 10 اینترون و 1 تا 11 اگزون داشته و هر سه فاز پیرایش در آن‌ها مشاهده می‌شود. نوع فاز اینترونی رابطه مستقیمی با میزان حفاظت شدگی توالی در جایگاه پیرایش دارد. بیشترین میزان حفاظت شدگی بترتیب برای فاز صفر، یک و دو است (37). فاز صفر بالاترین میزان حفاظت شدگی را داشته و اینترون‌های این خانواده ژنی (بجز OsOASTL17, OsOASTL10 و AtOASTL12 که فاقد فاز صفر می‌باشند) دارای یک و بیش از یک فاز پیرایش صفر می‌باشند (شکل2). نتایج نشان داد بجز ژن‌های AtOASTL15 ، OsOASTL1 و OsOASTL11 که فاقد اینترون و AtOASTL3 که تنها دارای یک اینترون می‌باشد، سایر ژن‌ها بیش از یک اینترون دارند. این 4 ژن در بررسی موتیفی کاملاً مشابه با هم دیده شدند (شکل3). بلندترین اینترون بترتیب مربوط به OsOASTL3 و AtOASTL18  می‌باشد که طویل‌ترین ژن در DNA نیز می‌باشند (شکل2).

برای شناسایی موتیف‌های حفاظت شده توالی‌های پروتئینی خانواده OASTL-Like آرابیدوپسیس و برنج با استفاده از سرور MEME بررسی شد. در این بررسی 20 موتیف حفاظت شده  شناسایی شد که بصورت Motif 1 تا Motif 20 مشخص شده است. ارزیابی کارکرد موتیف‌ها با Pfam نشان داد که نیمی از موتیف‌های شناسایی شده نشانگر بخشی از دمین عملکردی PALP می‌باشند (جدول2). تمامی ژن‌ها حداقل دارای یک موتیف کارکردی می‌باشند (شکل3). موتیف‌های شناسایی شده دارای 11 تا 50 آمینواسید می‌باشند (جدول2). در نتیجه‌ی این بررسی مشخص شد که موتیف کارکردی شماره 5 دارای بالاترین فروانی (24عدد) در خانواده OASTL-Like می‌باشد که نشان‌دهنده حفاظت‌شدگی بالای آن در طی تکامل می‌باشد (شکل3). در نتیجه‌ی کاوش موتیف مشخص شد که ترتیب و ترکیب موتیف‌های حفاظت شده در 15 عضو از کلاستر اول دارای تشابه (3-6-5-16-1-4-2-7) می‌باشد که از این بین موتیف‌های شماره 1، 2، 3، 4 و 5 دارای عملکرد PALP می‌باشند (جدول2). AtOASTL9 تنها دارای دو عدد موتیف عملکردی شماره 8 می‌باشد (شکل3).

شکل2- ساختار اگزون-اینترونی خانواده‌ژنی OASTL-Like در آرابیدوپسیس و برنج که با استفاده از سرور GSDS2.0 رسم شده‌است. اگزون، اینترون و UTR ها بترتیب با رنگ بنفش، مشکی و آبی مشخص شده‌است. اعداد صفر، 1 و 2 نشان‌دهنده فاز پیرایش می‌باشند.

جدول 2- توالی و کارکرد موتیف‌های حفاظت شده در پروتئین‌های OASTL-Like آرابیدوپسیس و برنج

شکل 3- موتیف‌های حفاظت شده در پروتئین‌های OASTL-Like در آرابیدوپسیس و برنج که با استفاده از سرور MEME شناسایی شده‌است.

شناسایی عناصر تنظیمی سیس موجود در ناحیه پروموتری ژن‌های OASTL-Like: تظاهر و کارکرد ژن‌ها بر اساس عناصر تنظیمی cis ناحیه پروموتری آن‌ها تعیین می‌شود و تنوع در فراوانی و توزیع این عناصر تنظیمی می‌تواند نشان‌دهنده‌ی تفاوت تنظیمی و کارکردی آن ژن‌ها باشد (19). در ارزیابی پروموتر ژن‌های خانوادهOASTL-Like  در آرابیدوپسیس 47 نوع عنصر تنظیمی با فراوانی 423 و در برنج  48 نوع عنصر تنظیمی با فراوانی 391 عدد شناسایی شد که مربوط به شش گروه کارکردی پاسخ به نور، هورمون، تنش، اختصاصی بافت، عمومی و Circadian می‌باشند. در آرابیدوپسیس و برنج بترتیب 21 و 21 نوع عنصر تنظیمی پاسخ به نور با فراوانی 194 و 151 عدد، 9 و 9 نوع عنصر تنظیمی پاسخ به هورمون با فراوانی 122 و 135 عدد، 4 و 6 نوع عنصر تنظیمی پاسخ به تنش با فراوانی 67 و 49 عدد، 7 و 5 نوع عنصر تنظیمی عمومی با فراوانی 17 و 25 عدد، 5 و 6 نوع عنصر تنظیمی اختصاصی بافت با فراوانی 16 و 26 عدد و عنصر تنظیمی circadian با فراوانی 7 و 5 عدد یافت شد. فراوانی این عناصر در ناحیه تنظیمی هر یک از این ژن‌ها و نیز فراوانی کلی آن‌ها بسیار متنوع می‌باشد (جدول3).

 در آرابیدوپسیس پروموتر ژن AtOASTL18 (شکل4) و در برنج پروموتر ژن OsOASTL7 (شکل5) دارای بیشترین تعداد عناصر تنظیمی (بترتیب 37 و 35 عدد) می‌باشد. بیشترین فراوانی کل عناصر تنظیمی در آرابیدوپسیس مربوط به G-box (43 عدد)، ARE (41 عدد) و ABRE (35 عدد) می‌باشد که بترتیب در پاسخ به نور، پاسخ به تنش و پاسخ به هورمون نقش دارند (جدول3) و در برنج بیشترین فراوانی مربوط به G-box (50 عدد) و ABRE (49 عدد) می‌باشد (جدول3). عنصر تنظیمی ARE بر روی پروموتر تمامی ژن‌های خانواده AtOASTL-Like حضور داشته و بر این اساس عمومی‌ترین عنصر تنظیمی پروموتر این خانواده می‌باشد (شکل4). در برنج عمومی‌ترین عنصر تنظیمی G-box می‌باشد که تنها برروی پروموتر ژن OsOASTL8 حضور ندارد (شکل5).

جدول 3- فراوانی و کارکرد عناصر تنظیمی شناسایی شده در ناحیه پروموتری ژن‌های OASTL-Like در آرابیدوپسیس و برنج

شکل 4- فراوانی عناصر تنظیمی شناسایی شده در ناحیه پروموتری ژن‌های AtOASTL-Like

شکل 5- فراوانی عناصر تنظیمی شناسایی شده در ناحیه پروموتری ژن‌های OsOASTL-Like

شناسایی مولکول‌های miRNA واکنش‌گر به ژن‌هایOASTL-Like  : ریز  RNAها جزء RNA های کوتاه (24-19 نوکلئوتید) غیر رمز آور پروتئین هستند که بوسیله‌ی برش یا ممانعت از ترجمه تظاهر ژن را در سطوح پس از رونویسی تنظیم می‌کنند و نقش مهمی در تنظیم رشد گیاه، متابولیسم و پاسخ به تنش دارند (25). در نتیجه بررسی توالی mRNA ژن‌های خانواده OASTL-Like در آرابیدوپسیس و برنج مشاهده شد که تمام ژن‌های مورد مطالعه تحت تاثیر تنظیم تظاهر پس از رونویسی قرار می‌گیرند. در آرابیدوپسیس 119 و در برنج 138 عدد miRNA یافت شد که بدون احتساب miRNA های تکراری بترتیب 87 و 105 نوع miRNA توانایی تاثیر گذاری بر روی ژن‌های OASTL-Like را دارند.

در آرابیدوپسیس 71 مورد و در برنج 79 مورد با برش mRNA و سایر مولکول‌های miRNA با جلوگیری از ترجمه mRNA ، توانایی تنظیم تظاهر20 ژن AtOASTL-Like و 19 ژن OsOASTL-Like را پس از رونویسی دارند (شکل 6 و 7). در آرابیدوپسیس AtOASTL10  و در برنج OsOASTL5 در معرض بیشترین تعداد miRNA (بترتیب 12 و 16 نوع) قرار داشته که در AtOASTL10 9 مورد از طریق برش و 3 مورد از طریق ممانعت از ترجمه و در OsOASTL5 15 مورد از طریق برش و یک مورد از طریق ممانعت از ترجمه موجب سرکوب تظاهر این ژن‌ها می‌شوند (شکل 6 و 7). در آرابیدوپسیس ژن‌های AtOASTL5 و AtOASTL14 و در برنج ژن‌های OsOASTL2 و OsOASTL12 در معرض کمترین تعداد miRNA(بترتیب 2 و 1 نوع) قرار می‌گیرند (شکل 6 و 7).

شکل 6- پیش‌بینی miRNA هایی که در تنظیم تظاهر پس از رونویسی ژن‌های AtOASTL-Like نقش دارند توسط سرور   PsRNATargetانجام و ارتباط بین ژن‌ها و مولکول‌های miRNA با نرم افزار Cytoscape رسم شد.

شکل 7- پیش‌بینی miRNA هایی که در تنظیم تظاهر پس از رونویسی ژن‌های OsOASTL-Like نقش دارند توسط سرور PsRNATarget انجام و ارتباط بین ژن‌ها و مولکول‌های miRNA با نرم افزار Cytoscape رسم شد.

بررسی الگوی تظاهر ژن‌های OASTL-Like : مطالعه الگوی تظاهر اعضای خانواده ژنی در پیش‌بینی نقش زیست‌شناختی آن‌ها می‌تواند مفید باشد. در نقشه حرارتی تظاهر ژن‌های AtOASTL-Like در مراحل نموی مختلف، بیشترین افزایش تظاهر مربوط به ژن AtOASTL17 بمیزان 4.65 در مرحله 12 گل، کاسبرگ (Flower Stage 12, Sepals ) و بیشترین کاهش تظاهر مربوط به ژن AtOASTL19 بمیزان 5.77- در مرحله 15 گل، پرچم (Flower Stage 15, Stamen ) گزارش شد. در مرحله نموی دانه گرده بالغ، تظاهر ژن‌های AtOASTL14 و AtOASTL20  بمیزان 3.6 برابر افزایش و تظاهر سایر ژن‌ها کاهش یافت (شکل8). در بررسی تغییرات تظاهر ژن‌های AtOASTL-Like در پاسخ به هورمون‌های مختلف، بیشترین افزایش و کاهش تظاهر بترتیب در ژن AtOASTL10 (بمیزان 63/1) و AtOASTL17 (بمیزان 58/2-) 3 ساعت پس از قرار گرفتن در معرض هورمون متیل جاسمونات مشاهده شد. تظاهر ژن AtOASTL17 در معرض هورمون‌های مختلف عموماً سرکوب شده‌است (شکل9).

مطالعه تنش غیر زیستی در ریشه نشان داد که بیشترین افزایش تظاهر مربوط به ژن‌های AtOASTL14 و AtOASTL20 بمیزان 1.84 پس از 6 ساعت تنش شوری و بیشترین کاهش تظاهر مربوط به ژن AtOASTL17 بمیزان 1.9- پس از 12 ساعت تنش خشکی می‌باشد. در ریشه میزان تظاهر ژن AtOASTL17 در معرض تنش‌های غیرزیستی مختلف غالباً کاهش می‌یابد (شکل10). AtOASTL8 یا همان AtOASTL-A2 با اینکه طبق منابع پروتئین عملکردی تولید نمی‌کند (15)، ولی در نقشه‌های حرارتی افزایش و کاهش تظاهر نشان می‌دهد و در ریشه‌ی در معرض تنش غیر زیستی غالباً افزایش تظاهر می‌یابد (شکل10). در ساقه‌ی در معرض تنش‌های غیر زیستی، بیشترین میزان افزایش تظاهر مربوط به ژن‌های AtOASTL14 و AtOASTL20 (بمیزان 12/2) و بیشترین کاهش تظاهر مربوط به ژن AtOASTL2 (بمیزان 56/3-) بترتیب پس از 3 و 24 ساعت تنش اسمزی می‌باشد(شکل10).

شکل 8- پروفایل تظاهر ژن‌های AtOASTL-Like در 46 مرحله نموی متفاوت مربوط به 16 اندام آرابیدوپسیس. ارزش سیگنال به صورت نوار رنگی در کنار نقشه حرارتی ارائه شده است که در آن رنگ سبز نشان‌دهنده سرکوب تظاهر، رنگ سیاه نشان‌دهنده‌ی عدم تغییر تظاهر و رنگ قرمز نشان‌دهنده‌ی افزایش تظاهر است.

شکل 9- پروفایل تظاهر ژن‌های ATOASTL-Like در معرض هورمون‌های مختلف شامل آبسیزیک اسید، اندول استیک اسید، زآتین، جیبرلین، متیل جاسمونات و اتیلن.

شکل 10- پروفایل تظاهر ژن‌های AtOASTL-Like در پاسخ به تنش‌های غیر زیستی (سرما، خشکی، گرما، اسمزی، اکسیداتیو، شوری، زخم، UV و Genotoxic) در ریشه (A) و ساقه (B).

بحث و نتیجه گیری

مطالعه‌ تکاملی و ساختاری  ژن‌های OASTL-Like: مطالعه درخت تبارزایی نشان داد که در دسته اول، ژن‌های AtOASTL17 (DES1), AtOASTL6 (CYS D1) و AtOASTL16 (CYS D2)در کنار هم قرار دارند که CYS D1 و CYS D2 دارای فعالیت سیستئین سنتازی (سنتز سیستئین از OAS و سولفید) و DES1 دارای فعالیت L-Cysteine Desulfhydrase 1 می‌باشد که سیستئین را به سولفید، پیروات و آمونیاک تجزیه می‌کند (3). ژن‌های AtOASTL8، AtOASTL13(OASTL-A1)، OsOASTL19، OsOASTL8، AtOASTL4 (OASTL-B)، AtOASTL10 (OASTL-C)  و  OsOASTL3 که بترتیب در کنار هم در یک زیر گروه قرار دارند، همگی دارای فعالیت سیستئین سنتازی می‌باشند (شکل1). AtOASTL11 (CYS C1) در کنار OsOASTL9 و AtOASTL5 (CS26) در کنار OsOASTL2 قرار دارد، آنزیم CYS C1 دارای فعالیت β-cyanoalanine Synthase C1 می‌باشد که β-cyanoalanine را از سیانید و سیستئین سنتز می‌کند (13) و آنزیم CS26 دارای فعالیت S-Sulfocysteine Synthase می‌باشد که S-Sulfocysteine را از Thiosulfate و OAS سنتز می‌کند (7). 6 عضو دیگر کلاستر اول که در کنار هم گروه شده‌اند OsOASTL های دارای فعالیت سیستئین سنتاز می‌باشند (شکل1).

در دسته دوم، ژن‌های  AtOASTL19 (TSB Type2)، OsOASTL17 و OsOASTL18 و نیز AtOASTL18 (TSB3) ، AtOASTL14 (TSB2)  و   AtOASTL20 (TSB1) که در یک زیر گروه قرار دارند دارای فعالیت Tryptophan Synthase Beta chain می‌باشند، TSB ها آخرین مرحله‌ی بیوسنتز تریپتوفان یعنی تراکم ایندول و سرین را کاتالیز می‌کنند (28). AtOASTL1 و OsOASTL5 که در کنار هم و ما بین ژن‌های دارای فعالیت TSB قرار دارند دارای فعالیت D-Cysteine Desulfhydrase (DCD) می‌باشند که D-Cysteine را به H₂S، پیروات و آمونیاک تجزیه می‌کنند، AtOASTL9 که به دور از این دو قرار دارد نیز دارای چنین فعالیتی می‌باشد (18). ژن‎‌های AtOASTL3 AtOASTL15, OsOASTL1, و OsOASTL11 که در یک زیر گروه قرار دارند دارای فعالیت Threonine Synthase می‌باشند. AtOASTL12 و OsOASTL10 که دارای فعالیت Serine Recemase و AtOASTL7 و OsOASTL7 که دارای فعالیت Threonine dehydratase می‌باشند نیز در کنار هم قرار دارند. برای AtOASTL2 و OsOASTL6 عملکردی شناخته نشده است.

همانگونه که مشاهده می‌شود در زیر گروه‌های درخت تبارزایی رسم شده، ژن‌های پارالوگ و ارتولوگ در کنار هم قرار دارند و اعضای بسیار نزدیک در هر زیر گروه ژنی دارای عملکرد مشابه و یا نزدیک به هم می‌باشند (شکل1). بر اساس نتایج ژنومیکس مقایسه‌ای کارکرد ژن‌های OASTL-Like برنج بر اساس کارکرد ژن‌های همولوگ آن‌ها در آرابیدوپسیس تائید شد. بررسی ساختار ژنی و موتیف‌های حفاظت شده شواهد بیشتری در تائید گروه‌بندی درخت تبارزایی و روابط تکاملی ارائه می‌نماید. همانطور که از نتایج استنباط می‌شود ساختار اگزون اینترونی و ترکیب و توزیع موتیف‌های شناسایی شده مشابه و تایید کننده‌ی گروه‌بندی تبارزایی ژن‌های مورد بررسی می‌باشد (شکل2 و 3). آنالیز ساختارهای ژنی و ترکیب موتیف‌ها نشان داد که این ژن‌ها در هر گروه از حفاظت‌شدگی بالایی برخوردار بوده که حاکی از کارکردهای مشابه اعضای هر گروه می‌باشد (2). در کنار هم قرار گرفتن ژن‌های دارای فعالیت سیستئین سنتازی در یک دسته جداگانه نشان دهنده‌ی مسیر تکاملی متفاوت و حفاظت شده‌ی این ژن‌ها از سایر ژن‌های دارای دمین عملکردی PALP در هر دو گیاه مورد مطالعه می‌باشد (شکل1).

مطالعه مولکول‌های miRNA و عناصر تنظیمی سیس  ژن‌هایOASTL-Like  : ریز  RNAها نقش مهمی در تنظیمات پس از تظاهر ژن در پاسخ به تنش‌های زیستی و غیرزیستی دارند (1). نتایج نشان داد که در آرابیدوپسیس و برنج microRNA های miR156, miR159, miR167 وmiR171 بین خانواده ژنی OASTL-Like این دو گیاه مشترک می‌باشند. miR167 یکی از خانواده‌های miRNA بسیار حفاظت شده در گیاهان است که در تنظیم رشد ریشه‌ها، ساقه‌ها، برگ‌ها، گل‌ها، زمان گلدهی، رشد جنینی، رشد بذر و پاسخ به تنش مشارکت دارد. در برنج 10 عضو از این خانواده مشاهده شد که تمامی آن‌ها ژن OsOASTL14 را به روش ممانعت از ترجمه مورد هدف قرار می‌دهند (25). miR156 که دو ژن AtOASTL18 و OsOASTL18 را مورد هدف قرار می‌دهد جزو تنظیم کننده‌های اصلی رشد و پاسخ به تنش در گیاهان است. مطالعات نشان داد هر گیاهی که miR156 را بیش از حد تظاهر می‌کند تحمل بیشتری نسبت به تنش کادمیوم دارد (40). miR159 که بر روی ژن‌های OsOASTL1, OsOASTL11 و AtOASTL7 از طریق سازوکار برش اثر می‌گذارد در بسیاری از گیاهان شناسایی شده است. سرکوب این ژن در برنج موجب کاهش تظاهر بسیاری از ژن‌های پاسخ دهنده به برازینواستروئید و کاهش وزن و اندازه بذر شده است (41).

اعضاء خانواده ژنی OASTL-Like در هر دو گیاه مورد بررسی هدف تعداد زیادی miRNA متفاوت قرار می‌گیرند که این miRNA ها توانایی بالایی در تنظیم کارکرد اختصاصی این ژن‌ها در شرایط مختلف دارند. علاوه بر این، وجود عناصر تنظیمی سیس مختلف با فراوانی متفاوت شامل پاسخ به نور، پاسخ به هورمون‌، پاسخ به تنش، مختص بافت، عمومی و circadian در این خانواده ژنی نشان دهنده‌ی ضرورت کنترل تظاهر و ایفای نقش ژن‌های OASTL-Like در بسیاری از فرایندهای رشد و نموی و دفاعی در آرابیدوپسیس و برنج می‌باشد. عوامل رونویسی می‌توانند مجموعه‌ای از ژن‌های تحت کنترل خود را از طریق اتصال اختصاصی به عناصر تنظیمی سیس موجود در راه‌انداز ژن‌های هدف، تنظیم کنند (2). در مجموع می‌توان گفت تنوع و فراوانی گسترده عناصر سیس ناحیه پروموتری و نیز miRNA های موثر بر ژن‌های OASTL-Like در هر دو گیاه مورد بررسی حاکی از تنوع کارکردی، پیچیدگی و اهمیت تنظیم تظاهر این ژن‌ها در سطوح رونویسی و پس از رونویسی می‌باشد.

مطالعه الگوی تظاهر ژن‌های OASTL-Like: همانطور که مشاهده می‌شود در نقشه تظاهر ژن‌های AtOASTL-Like در پاسخ به هورمون‌های مختلف، بیشترین افزایش و کاهش تظاهر بترتیب در AtOASTL10 و AtOASTL17  در معرض  تیمار 3 ساعت  هورمون متیل جاسمونات رخ داده است (شکل9). متیل جاسمونات با تاثیر بر تظاهر ژن‌های دفاعی سنتز ترکیبات دفاعی را القا می‌کند (39). AtOASTL10 همان ایزوفرم میتوکندریایی OASTL و AtOASTL17  همان آنزیم DES1 می‌باشد که بترتیب در سنتز و تجزیه سیستئین نقش دارند و سطح سیستئین سلولی را تنظیم می‌کنند. سیستئین پیش‌ساز ترکیبات دفاعی می‌باشد (4). میزان تظاهر ژن AtOASTL17 در معرض هورمون‌های مختلف (شکل9)  و در ریشه‌‌ی در معرض تنش‌های غیرزیستی مختلف (شکل10) غالباً کاهش می‌یابد. ژن AtOASTL17 (DES1)  که تغییرات تظاهر شاخصی را در این خانواده ژنی نشان می‌دهد نقشی متضاد با آنزیم OASTL دارد و در سیتوزول سیستئین را به سولفید، آمونیاک و پیروات تجزیه می‌کند. این آنزیم در تعامل با ایزوفرم‌های اصلی OASTL در حفظ هموستازی سیستئین مشارکت دارد (5).در مطالعات پیشین مشخص شد که در اثر عدم فعالیت آنزیم DES1 (AtOASTL17)  فعالیت گوگرد زدایی سیستئین در برگ‌ها به طور قابل توجهی کاهش می‌یابد و چنین گیاهانی دفاع آنتی اکسیدانی و تحمل بیشتری نسبت به شرایطی که باعث تنش اکسیداتیو می‌شود نشان می‌دهند (4).

 دو ژن AtOASTL14 و AtOASTL20 در مراحل نموی، تنش‌های غیر زیستی و هورمون‌های مختلف همواره دارای میزان تظاهر مشابه‌ای می‌باشند. هم‌پوشانی در تظاهر این دو ژن نشان‌دهنده‌ی همکاری آن‌ها می‌باشد.  AtOASTL14 (TSB2) و AtOASTL20 (TSB1) دارای فعالیت Tryptophan Synthase Beta-subunit می‌باشند. TSB ها آخرین مرحله‌ی بیوسنتز تریپتوفان یعنی تراکم ایندول و سرین را کاتالیز می‌کنند (28). در گیاهان تریپتوفان علاوه بر نقشی که بعنوان یک جزء پروتئینی دارد پیش‌ساز فیتوهورمون ایندول استیک اسید  و تعداد زیادی از ترکیبات دفاعی می‌باشد (20). نتایج بررسی داده‌های ریزآرایه تظاهر ژن‌های AtOASTL-Like حاکی از کارکرد بسیار متنوع این ژن‌ها از نظر زمانی و مکانی و در پاسخ به تنش‌های غیر زیستی و هورمون‌ها می‌باشد.

در این مطالعه بترتیب 20 و 19 ژن OASTL-Like در ژنوم آرابیدوپسیس و برنج شناسایی شد که آنزیم‌هایی را کد می‌کنند که همگی دارای دمین عملکردی PALP  بوده و برای فعالیت به کوفاکتور PLP نیاز دارند. این ژن‌ها از نظر مکان کروموزومی، جایگاه سلولی و ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی دارای تنوع می‌باشند. ژن‌‌های OASTL-Like بر مبنای درخت تبارزایی به دو دسته عمده و چندین زیر گروه در هر دسته تقسیم بندی می‌شوند. در زیر گروه‌های درخت تبارزایی، ژن‌های پارالوگ و ارتولوگ در کنار هم قرار دارند و اعضای بسیار نزدیک در هر زیر گروه ژنی دارای عملکرد مشابه و یا نزدیک به هم می‌باشند. ساختار اگزون اینترونی و موتیف‌های حفاظت شده تایید کننده گروه‌بندی تبارزایی و نشان‌دهنده‌ی اهمیت و حفاظت‌شدگی مسیر تکاملی این ژن‌ها می‌باشد. تنوع و فراوانی گسترده عناصر سیس ناحیه پروموتری و نیز miRNA های موثر بر ژن‌های OASTL-Like در هر دو گیاه مورد بررسی نشان‌دهنده‌ی تنوع کارکردی، پیچیدگی و اهمیت تنظیم تظاهر این ژن‌ها در سطوح رونویسی و پس از رونویسی می‌باشد. ژن‌‌های OASTL-Like در آرابیدوپسیس تغییرات میزان تظاهر گسترده و متنوعی را در مراحل نموی مختلف، تحت تنش‎‌های غیر زیستی و هورمون‌ها نشان می‌دهند که حاکی از نقش عملکردی متنوع و گسترده‌ی این ژن‌ها می‌باشد. نتایج این مطالعه اطلاعات پایه‌ای و ارزشمند تکاملی، ساختاری و کارکردی خانواده ژنی OASTL-Like در آرابیدوپسیس و برنج را فراهم می‌سازد. با توجه به نقش تعیین کننده‌ی سیستئین در سازوکار دفاعی گیاهان، این نتایج در پژوهش‌هایی با اهداف مختلف همچون مطالعه‌ی پاسخ به تنش‌های غیر زیستی و مهندسی ژنتیک می‌تواند مورد استفاده قرار گیرد.

سپاسگزاری

بدین‌وسیله از حمایت مالی دانشگاه گیلان از پایان نامه کارشناسی ارشد خانم مریم رجبی فرشمی و کلیه همکارانی که در انجام بخش‌های مختلف این مقاله و مطالعه و بازبینی متن آن همکاری و مساعدت داشته‌اند قدردانی و تشکر می‌شود.