نوع مقاله : مقاله پژوهشی
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله English
نویسندگان English
Citrus sinensis cv Thomson Navel and Citrus limon cv Lisbon are known as relatively resistant and cold-sensitive garden products. Thus, in the present study attempts are made to investigate the vulnerability of Thomson oranges and Lisbon lemons to cold stress under controlled environmental conditions compared to treatment temperatures (4, -4 and -8 °C). This factorial experiment was conducted according to a completely randomized design. The ANOVA results showed that the temperature/cultivar interaction can significantly affect some traits such as lipid peroxidation, superoxide dismutase, ascorbate peroxidase, total flavonoids, ion leakage, chlorophyll a, carotenoids, total chlorophyll and LT50 (P> 0.001). However, the catalase/chlorophyll b interaction was found to be significant at p= 5%. The highest levels of ion leakage (59.65%), lipid peroxidation reaction (0.77 µg g−1 FW MDA) in lemon and catalase and superoxide dismutase (33.43 µmol•g−1 FW and 160.3.3 μmol g −1FW min respectively) in orange was recorded at -8 °C. In contrast, the highest levels of ascorbate peroxidase (39.7 µg g−1 FW) was recorded in lemon and total flavonoids (32.48 mg g−1 FW of catechin) was recorded in oranges at 4 °C. in the present study, different reactions were also observed at different temperatures. Oranges showed higher resistance to cold compared to lemons. As for the measured traits, however, oranges were mostly ranked higher than lemons. Exposure of genotypes to cold stress led to an increase in malondialdehyde.
کلیدواژهها English
مقایسه پاسخهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی پرتقال تامسون و لیموی
لیسبون در مواجهه با تنش سرما
علی صالحی ساردویی1*، مهدی شریفانی1، مصطفی خوشحال سرمست1 و محمود قاسم نژاد2
1 ایران، گرگان، دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، دانشکده تولید گیاهی، گروه علوم باغبانی
2 ایران، رشت، دانشگاه گیلان، دانشکده کشاورزی، گروه علوم باغبانی
تاریخ دریافت: 20/01/1401 تاریخ پذیرش: 10/07/1401
چکیده
پرتقال تامسون (Citrus sinensis cv Thomson Navel) و لیموی لیسبون (Citrus limon cv Lisbon) جهت مطالعه میزان آسیبپذیری به تنش سرما در سطوح تیمار دمایی (4، 4- و 8- درجه سلسیوس) مورد بررسی قرارگرفتند. تست دمایی با دستگاه تست چمبر انجام شد. پژوهش بر مبنای آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار انجام شد. قبل از شروع تیمارهای دمایی به منظور سازگاری گیاه به کاهش دما، نهالها به درون گلخانه معتدله با شرایط دمایی 15 درجه سانتیگراد به مدت 3 الی 5 روز انتقال یافتند. شروع کاهش دمای دستگاه تست چمبر از دمای 4+ درجه سلسیوس بود. کاهش دمای دستگاه یک و نیم درجه سلسیوس به ازای هر ساعت بود که پس از رسیدن به هر تیمار دمایی، نمونهها به مدت 10 ساعت در دماهای ذکر شده نگهداری و پس از اتمام این دوره زمانی نمونهبرداری برگ برای اندازهگیری صفات انجام گردید. نتایج حاصل از تجزیه واریانس دادهها بیانگر آن بود که بیشترین مقدار نشت یونی برگ (65/59 درصد)، محتوای مالون دیآلدئید (77/0 میکروگرم در گرم در وزن تر برگ) در لیمو و فعالیت آنزیم کاتالاز و سوپر اکسید دیسموتاز برگ (بهترتیب با میانگین 43/۳۳ میکرومول درگرم وزن تازه در دقیقه و 3/160 میکرومول در گرم وزن تازه) در پرتقال در دمای 8- درجه سیلسیوس بود. در مقابل، بیشترین مقدار فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز برگ (7/39 واحد آنزیمی در میلیگرم وزن تازه در دقیقه) در لیمو و فلاونوئید کل (48/32 میلیگرم کوئرستین در گرم بافت تازه برگ) نیز در پرتقال در دمای 4- درجه سلسیوس ثبت گردید. در بین دماهای مورد بررسی دراین پژوهش نیز واکنشهای متفاوتی مشاهده شد. با کاهش دما به 4- و 8- درجه سلسیوس بین سطوح تیماری اختلاف معنیداری مشاهده شد. به طوری که در سطح دمای 8- درجه سلسیوس تاثیر منفی بالایی بر کلروفیل، کارتنوئیدها محتوای رطوبت نسبی برگ در هر دو رقم مشاهده گردید که در رقم لیمو میزان آنها بیشتر بود. و در بین دماها، دمای 8- درجه سلسیوس، میزان تنزل آن در مقایسه با 4- و 4+ درجه سلسیوس بیشتر بود.
واژه های کلیدی: آنزیمهای آنتی آکسیدانی، پراکسیداسیون لیپید، مرکبات، فلاونوئید، سبزینگی برگ
* نویسنده مسئول، پست الکترونیکی: alisalehisardoei1987@gau.ac.ir
مقدمه
مرکبات یکی از مهمترین محصولات باغبانی در دنیا محسوب میشوند (42)، که در ایران نیز کشت و پرورش آن، جایگاه ویژهای دارد. در بین استانهای تولید کننده مرکبات در کشور، مازندران با عملکرد 1/88 میلیون تن، رتبه اول تولید را به خود اختصاص داده است (2). مرکبات جز محصولات مناطق نیمهگرمسیری و متعلق به خانواده روتاسه (Rutaceae) بوده که اغلب گیاهان تجاری موجود دراین خانواده به دلیل همیشه سبز بودن، نسبتاً حساس به تنش دمای پایین هستند (51).
تنش سرما جز تنشهای غیرزیستی است که از اثرات منفی آن بر گیاهان میتوان به اختلال در فتوسنتز، تجمع رادیکالهای آزاد اکسیژن، آسیب به غشاء سلولی، تخریب رنگدانههای گیاهی و اسیدهای نوکلوئیک اشاره کرد (46). یکی از اثرات منفی تنش سرما، اختلال در فرایند انتقال الکترون در عرض غشاء تیلاکوئید بوده که منجر به تجمع رادیکالهای آزاد اکسیژن شده که میتواند، تخریب کلروفیلهای گیاهی و پراکسیداسیون لیپید غشایی را به همراه داشته باشد (24و 56).
پراکسیداسیون غشاهای زیستی یکی از سریعترین واکنشهایی است که اغلب در سلولها مخصوصاً در گیاهان حساس به تنشهای محیطی و در حضور رادیکالهای فعال اکسیژن اتفاق میافتد (20و 27). رادیکالهای فعال اکسیژن میتوانند با گروههای متیل اسیدهای چرب غیراشباع وارد واکنش شده و رادیکالهای فعال اسید چرب تولید نمایند. رادیکالهای شکل گرفته بسیار واکنشگر بوده که قادر به شروع واکنشهای زنجیرهای پراکسیداسیون لیپید میباشد (25). تداوم این وضعیت موجب از هم گسیختگی ساختار غشاء و خروج آب و یونها از سلول میشود (30). مطالعه انجام گرفته بر روی برخی از ارقام تاک (7) و انار (6) مشخص کرد که با تنش سرما، پراکسیداسیون غشاء و نشت یونی افزایش می یابد.
در مواجهه با تنش سرما گیاهان سعی میکند تا از طریق تغییراتی در فرایندهای فیزیولوژیکی و بکارگیری سیستم آنتی اکسیدانی، بقاء خویش را حفظ کنند (3). یکی از مسائل مطرح سازگاری در زمان وقوع تنش یخبندان، حفظ محتوی آب و جلوگیری از انجماد سیتوپلاست بوده که عموماً گیاهان از طریق افزایش اسمولیتها در مقابله با چالش ذکر شده مقابله مینمایند (8). مقدار آنزیمهای آنتیاکسیدانی در بسیاری از گیاهان در واکنش به تنشهای محیطی مانند تنش سرما افزایش مییابد و این واکنش فیزیولوژیک میتواند بر مقاومت ماده گیاهی تحت تنش تأثیرگذار باشد. نقش عمده آنزیمهای آنتی اکسیدانی در پایداری گیاهان تحت تنش به تأثیر بر پتانسیل اسمزی مرتبط بوده، افزایش مقاومت به سرما با مقدار اسمولیتها نیز در ارتباط است (1). همچنین در مدیریت کم آبیاری انگور (56) عنوان شده است که کم آبیاری با تأثیرگذاری بر افزایش تولید ترکیبات موثر بر پتانسیل اسمزی توانسته بر سازگاری بیشتر گیاه نسبت به تنش سرما، تجمع آنزیمهای آنتی اکسیدانی و ترکیبات فلاونوئیدی به سبب تغلیظ شیره سلولی، دمای انجماد را کاهش داده و باعث حفظ محتوای آب گیاهی و افزایش مقاومت به دمای پایین میشوند. سازگاری به سرما موجب تجمع ترکیبات فلاونوئیدی میشود که این ترکیبات به طور مثبت با ظرفیت آنتیاکسیدانی گیاه ارتباط دارند (7).
علاوه بر شاخصهای فیزیولوژیکی ذکر شده، برخی صفات مورفولوژیکی نیز میتوانند در ارزیابی میزان آسیبپذیری گیاهان تحت تنش سرما، مورد استفاده قرار گیرند (8). از جمله این صفات در مرکبات میتوان به سبزینگی برگ در زمان تنزل دما و با تغییر رنگ این اندام بعد از وقوع تنش اشاره داشت (3).
استفاده از ارقام مناسب یکی از راهکارهای منطقی و کمهزینه برای تولید پایدار در هر منطقه است، که انتخاب رقم متحمل و انجام فعالیتهای بهزراعی مناسب، میتواند در تعدیل این آسیب موثر واقع گردد. باتوجه به شرایط کشور، هدف از اجرای این پژوهش، مقایسه نحوه واکنش رقم پرتقال تامسون (نیمهحساس) و لیموی لیسبون (حساس) به تنش سرما در شمال کشور است.
مواد و روشها
این آزمایش طی سال 1400در آزمایشگاه باغبانی، دانشگاه گیلان با هدف تعیین میزان تحمل به تنش سرما ارقام پرتقال تامسون و لیموی لیسبون بر پایه نارنج در 3 سطح دمایی (4، 4-، 8-) اجرا شد. پژوهش بر مبنای آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار انجام شد. نخست نهالهای دو ساله یکنواخت انتخاب شدند و در داخل گلدانهای 10 کیلویی از خاک منطقه (بافت لومی سیلتی) قرار داده شدند (3).
قبل از شروع تیمار دمای پایین و به منظور سازگاری دمایی، نهالهای پیوندی ابتدا در گلخانه معتدله (41) با شرایط دمایی 15 درجه سلسیوس به مدت 5 روز نگهداری شدند. پس از آن نهالها به دمای 4+ درجه سلسیوس و رطوبت نسبی 5 ± 65 درصد منتقل شدند. قبل از انتقال به دستگاه تست چمبر (Test Chamber) و اعمال تیمار یخزدگی و به منظور جلوگیری از آسیب دیدگی ریشهها، قسمت ریشه گلدانها با لایهای ضخیم از پشم شیشه یه طور کامل پوشانیده شد و سپس برگ نهالها با آب مقطر اسپری شدند. دمای دستگاه به تدریج به میزان 5/1 درجه سلسیوس در هر ساعت تا 4- درجه سلسیوس و سپس 8- درجه سلسیوس کاهش داده شد. نمونههای از برگ پس از 10 ساعت قرار گرفتن در دمای 4- و 8- درجه سلسیوس جهت انجام آزمونهای بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی جدا گردید. همچنین نمونههای برگی نهالها بعد از 10 ساعت نگهداری در دمای 4 درجه سلسیوس به عنوان شاهد استفاده شد. رطوبت نسبی درون دستگاه تست چمبر، 45 درصد و شرایط فاقد نور بوده است (26). به دلیل محدود بودن فضای داخلی دستگاه تست چمبر در هر مرحله تیمار دمایی تنها از یک رقم استفاده شد. در مجموع، 9 نهال پیوندی برای هر رقم با سه تیمار دمایی (4، 4-، 8- درجه سلسیوس) در سه تکرار استفاده شد.
جهت اندازهگیری خصوصیات بیوشیمیایی نمونههای برگی جدا شده با نیتروژن مایع منجمد و سپس در فریزر منفی ۸۰ تا قبل از شروع آزمایش نگهداری شدند. اما برای صفاتی همچون نشت الکترولیت و محتوای رطوبت نسبی برگ بلافاصله از نمونه برگی تازه استفاده شد.
اندازهگیری مقدار کلروفیل و کارتنوئیدها برگ: برای تعیین غلظت کلروفیل و کارتنوئید از روش بارنس و همکاران (12) استفاده شد. ابتدا نیم گرم نمونه برگی تازه از هر تیمار آزمایشی در 10 میلیلیتر دیمتیلسولفوکسید (DMSO) به مدت سه ساعت در دمای 70 درجه سانتیگراد در آون قرار داده شد تا رنگیزهها استخراج و بافت برگی کاملاً بیرنگ گردید. از نمونه حاصل 250 میکرولیتر برداشته و مجدداً دو میلیلیتر DMSO به آن اضافه شد. نمونهها بهوسیله دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت گردید و از DMSO خالص بهعنوان شاهد استفاده شد. اندازهگیری کلروفیل a، b، کلروفیل کل و کارتنوئید به ترتیب در طولموج 645، 623، 480 و 510 نانومتر انجام گردید. و اعداد بهدستآمده در رابطههای (1)، (2)، (3) و (4) جایگذاری شدند.
اندازهگیری نشت یونی: برای تعیین پایداری غشاء سلولهای برگی از شاخص نشت الکترولیت استفاده شد. نشت یونی برگها بر مبنای شیوه سولیوان و رز (49) اندازهگیری شد. قطعات برگی یکسان از برگهای جوان گیاهان کاملاً رشد کرده مربوط به هر تیمار، ابتدا با آب مقطر شسته و در لولههای آزمایشی دربدار قرار داده شدند.
رابطه (1) Chl a (mg/g. F.w) = 12.7(A663) -2.69(A645) ×V/1000×W
رابطه (2) Chl b (mg/g. F.w) = 22.7(A645) -4.68(A663) ×V/1000×W
رابطه (3) Chl total (mg/g. F.w) = 20.2(A645) -8.02(A663) ×V/1000×W
رابطه (4) Carotenoids (mg/g. F.w) = 7.6(A480) -1.49(A510) ×V/1000×W
دراین رابطهها، A: طولموج؛ V: حجم نهایی محلول و W: وزن نمونه است.
10 میلیلیتر آب مقطر به آنها اضافه و لولهها به مدت 24 ساعت به کمک دستگاه شیکر قرارگرفتند. هدایت الکتریکی محلول (C1) اندازهگیری و نمونهها به مدت 15 دقیقه در اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتیگراد قرارگرفتند و مجدداً هدایت الکتریکی آنها (C2) اندازهگیری شد. نشت یونی (%) EC بر مبنای رابطه (5) محاسبه شد.
رابطه (5) EC (%) = (C1/C2) ×100
درصد آسیب یخزدگی و آستانه تحمل به یخزدگی هر رقم: با کمک دادههای موجود از اندازهگیری نشت یونی در هر تیمار دمایی، درصد آسیب ایجاد شده در مقایسه با دمای شاهد در نمونههای برگ هر رقم از طریق رابطه 6 محاسبه شد (36). رابطه (6):
%IL (t) - % IL (c) /100 - % IL ( c)] × 100 [= LT50
IL(t): نشت یونی هر تیمار دمایی یخزدگی در نمونهها و IL(c): نشت یونی تیمار شاهد بدون یخزدگی
در نهایت دمای ۵۰ درصد کشندگی نمونهها (LT50) که از آن به عنوان واحد تحمل به یخزدگی یاد میکنند. برای دو رقم مورد آزمایش به کمک تعیین دمایی که در آن ۵۰ درصد آسیب اتفاق میآفتد (36).
اندازهگیری محتوای آب نسبی برگ (RWC): بالاترین (جوانترین) برگ گیاه در هر تکرار برداشت و بلافاصله وزن تر برگها اندازهگیری شد و به مدت 24 ساعت در تاریکی و دمای 4 درجه سانتیگراد در داخل آب مقطر قرار داده شد و پس از اندازهگیری وزن برگها در این شرایط، برگها به مدت 24 ساعت در آون 70 درجه سانتیگراد قرارگرفت و وزن خشک آنها با ترازوی دقیق g 001/0 اندازهگیری شد (44). مقدار RWC از رابطه (7) به دست آمد:
رابطه (7) RWC=[(Wf-Wd)/(Wt-Wd)]×100%
در این رابطه Wf وزن تازه برگ، Wt وزن آماس برگ و Wd وزن خشک برگ است.
اندازهگیری فلاونوئید کل: برای اندازهگیری فلاونوئید کل از روش آلومینیومکلرید استفاده شد. 5/0 میلیلیتر از عصاره متانولی با 5/1 میلیلیتر متانول، 1/0 میلیلیتر آلومینیومکلرید 10 درصد در اتانول، 1/0 میلیلیتر استاتپتاسیم یک مولار و 8/2 میلیلیتر آب مقطر مخلوط شد. برای تهیه شاهد، متانول خالص جایگزین عصاره متانولی گردید. محلول حاصل 30 دقیقه در تاریکی قرار داده شد و سپس در طولموج 415 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد (17). برای رسم منحنی استاندارد از غلظتهای مختلف استاندارد کوئرستین (50، 100، 150، 200، 250 میلیگرم بر لیتر) استفاده شد.
پراکسیداسیون لیپید: محاسبه غلظت مالوندیآلدئید (MDA) به عنوان محصول واکنش پراکسیده شدن اسیدهای چرب غشاء با کمک روش کامپوز و همکاران (15) انجام شد. مراحل انجام آن به شرح زیر است:
تهیه محلولها: محلول تری کلرو استیک اسید (TCA)۲۰ درصد حاوی 5/0 درصد تیوباربیتوریک اسید(TBA) به صورت زیر تهیه گردید:
1- 5/0 گرم از TBA در ۲۰ میلیلیتر آب مقطر ریخته شد، برای حل شدن بهتر روی هیتر با دمای ۷۰ درجه سانتیگراد قرار گرفت.
2- ۲۰ گرم از TCA در ۳۰ میلیلیتر آب مقطر شد.
3- محلول 1 و 2 با هم مخلوط گردید و با کمک آب مقطر به حجم نهایی ۱۰۰ میلیلیتر رسانده شد. محلول حاصل به عنوان محلول ذخیره استفاده شد.
اندازهگیری MDA: ابتدا 5/0گرم بافت برگ با استفاده از نیتروژن مایع در هاون آسیاب شد و به آن ۵ میلیلیتر محلول تری کلرو استیک اسید (TCA) ۱۰ درصد افزوده شد. عصاره حاصل، به مدت ۱۵ دقیقه، در دمای ۴ درجه سانتیگراد و با 14000 دور در دقیقه (rpm) سانتریفیوژ شد و سپس محلول رویی جدا شد. به ۱۵۰۰ میکرولیتر از محلول رویی، ۱۵۰۰ میکرولیتر TCA ۲۰ درصد حاوی 5/0 درصد TBA اضافه شد. مخلوط حاصل به مدت ۳۰ دقیقه در حمام آب جوش با دمای ۹۵ درجه سانتیگراد قرار داده شد و بلافاصله در یخ سرد گردید. نمونهها مجدد در 10500 دور در دقیقه (rpm) سانتریفیوژ شدند. ماده قرمز رنگ مالوندیآلدئید تیوباربیوتریک اسید (MDA-TBA) تولید شده در طول موج ۵۳۲ نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (PG Instruments ItdT80+UV/VIS) اندازهگیری شد و جذب سایر رنگیزههای گردید اختصاصی در 600 نانومتر مشخص شدند.غلظت MDA از ضریب خاموشی معادل cm-1 155mM-1 بر حسب nmol.gFW-1 طبق رابطه (8) زیر اندازه گیری شد.
رابطه (8) = (A532 – A600) × 1000 غلظت MDA
155
برای استخراج و محاسبه آنزیمها، نمونههای برگ منجمد شده در حضور نیتروژن مایع در هاون چینی آسیاب شد. نیم گرم از برگ پودر شده به میکروتیوبهای 2میلیلیتری منتقل شد و به آن یک میلیلیتر از بافر استخراج افزوده شد. سپس نمونهها به خوبی ورتکس گردید و به مدت ۱۵ دقیقه با دور14000 دور در دقیقه (rpm) در دمای ۴ درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند. پس از آن عصاره رویی با استفاده از سمپلر برداشته و به میکروتیوبهای 5/1 میلیلیتری منتقل شدند و دوباره به مدت ۵ دقیقه با 14000 دور در دقیقه (rpm) در دمای ۴ درجه سانتیگراد، سانتریفیوژ شدند. عصاره رویی برداشته و به میکروتیوبهای با همان حجم منتقل شدند. از این عصاره برای سنجش آنزیمهای SOD، APX، CAT استفاده شد.
آنزیم SOD: فعالیت آنزیم SOD با استفاده از روش (47) با اندازهگیری توانایی آنزیم در جلوگیری از کاهش فتوشیمیایی نیتروبلو- تترازولیوم (NBT) تعیین شد. برای
اندازه گیری فعالیت این آنزیم نیاز به محلولهای زیر است:
بافر ۱: بافر فسفات ۵۰ میلیمولار، حاوی EDTA (5/1 میلیمولار)، متیونین (200 میلیمولار)، و NBT (12/1 میکرومولار) با pH=7
بافر2: بافر ریبوفلاوین (75 میلیمولار)، ریبوفلاوین به نور حساس است، بنابراین درظرفی با پوشش آلومینیومی نگهداری میشود، هر روز باید ساخته شود.
شیوه آماده سازی نمونههای شاهد، بلانک و آنزیمی به شکل زیر است:
1- نمونه شاهد شامل ۹۳۵ میکرولیتر بافر1، 15 میکرولیتر بافر2، 50 میکرولیتر بافر فسفات ۵۰ میلیمولار بود.
2- نمونه بلانک شامل ۹۳۵ میکرولیت بافر ۱، ۱۵ میکرولیتر بافر2، 50 میکرولیتر بافر فسفات ۵۰ میلیمولار بود.
3- نمونه حاوی عصاره آنزیمی شامل ۹۳۵ بافر ۱، ۱۵ میکرولیتر بافر2 و ۵۰ میکرولیتر عصاره آنزیمی بود.
پس از آماده سازی نمونهها به منظور اندازهگیری فعالیت آنزیمی، نمونه بلانک به مدت ۱۵ دقیقه در تاریکی گذاشته شد و نمونههای کنترل (شاهد) و عصاره آنزیمی، به مدت ۱۵ دقیقه، در شیکر با دمای ۲۵ درجه سانتیگراد و دارای دو عدد لامپ فلورسنت ۴۰ وات با دور ۱۰۰ دور در دقیقه شیک شدند. سپس میزان جذب در طول موج ۵۶۰ نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. یک واحد SOD به مقدار آنزیمی گفته میشود که سبب مهار ۵۰ درصد NBT به فورمازان شود. تفاوت بین جذب هر عصاره در مدت زمان روشنایی ۱۵ دقیقه و جذب عصاره آنزیمی در همان مدت زمان روشنایی در واقع حاکی از بازداشتن واکنش خود بخودی و تشکیل فورمازان توسط SOD است. فعالیت آنزیمی SOD بر اساس رابطه (9) محاسبه گردید و فعالیت آنزیم در نهایت بر حسب µMol/gFW محاسبه شد.
رابطه (9)
= فعالیت آنزیم SOD
(ODControl – ODSampel) × 100
OD Control ] 100- [
50
آنزیم CAT: فعالیت این آنزیم به روش (18) مورد سنجش قرارگرفت. برای سنجش فعالیت این آنزیم نیاز به محلولهای زیر است:
1- محلول بافر فسفات ۵۰ میلی مولار
2- بافر سنجش حاوی بافر پتاسیم فسفات، EDTA 1/0 میلیمولار و پراکسید هیدروژن ۱۵ میلیمولار است.
سنجش فعالیت آنزیم CAT از طریق اندازهگیری تجزیه پراکسید هیدروژن توسط اسپکتروفتومتر در طول موج ۲۴0 نانومتر انجام شد. مخلوط واکنش شامل ۲۶۰۰ میکرولیتر بافر فسفات ۵۰ میلی مولار، ۴۰۰ میکرولیتر بافر پراکسید هیدروژن و ۴۰ میکرولیتر از عصاره آنزیمی بود. پس از بهم زدن مخلوط واکنش (با گذاشتن پارافیلم بر روی کووت یک بار کووت سر و ته شد) سرعت واکنش آنزیمی به صورت تغییرات جذب بر زمان (OD/min) در طول موج ۲۴۰ نانومتر برای 1 دقیقه ثبت شد. فعالیت آنزیمی با کمک فرمول بیر لامبرت و با ضریب خاموشی کاتالاز 40 mM-1c-1m محاسبه و فعالیت آنزیم در نهایت بر مبنای اندازه گیری µMol/gFW.min گردید.
آنزیم APX: فعالیت این آنزیم به روش (16) با اندک تغییرات مورد سنجش قرارگرفت. برای سنجش فعالیت این آنزیم به محلولهای زیر احتیاج دارد:
1- محلول بافر فسفات ۵۰ میلی مولار
2- بافر سنجش حاوی بافر پتاسیم فسفات، EDTA 1/0میلیمولار، آسکوربیک اسید 25/0میلیمولار و پراکسید هیدروژن ۱ میلیمولار است.
سنجش فعالیت آنزیم با اندازهگیری اکسید شدن آسکوربات به وسیله اسپکتروفتومتر در طول موج ۲۹۰ نانومتر برای مدت زمان 1 دقیقه انجام شد. مخلوط واکنش شامل حاوی ۱۰۰ میکرولیتر عصاره آنزیمی، ۲۹۰۰ میکرولیتر از بافر شماره سنجش شماره ۲ بود. پس از بهم زدن سرعت واکنش آنزیمی به شکل تغییرات جذب و زمان (OD/min) در طول موج ۲۹۰ نانومتر برای 1 دقیقه ثبت گردید. یک واحد آنزیمی معادل تجزیه یک میکرومول آسکوربات در مدت زمان یک دقیقه و در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد است (16). فعالیت آنزیمی با استفاده از قانون بیر لامبرت و با ضریب خاموشی 2/8 mM-1c-1Mapx محاسبه و فعالیت آنزیم در نهایت بر مبنای µMol/gFW.min اندازهگیری گردید.
تجزیه آماری: دادههای حاصل از این پژوهش بر مبنای آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار تجزیه واریانس و سپس میانگینها از طریق آزمون دانکن در سطح ۵ درصد از طریق نرم افزار SAS مقایسه شدند.
نتایج
نتایج حاصل از تجزیه واریانس دادهها (جدول 1) بیانگر آن بود که اثر ارقام و برهمکنش متقابل دما و ارقام در صفت LT50 در سطح آماری 1 درصد معنیدار بوده است. در مورد میزان LT50 نیز مشاهده گردید که پرتقال (LT50= -5.92)، تحملپذیری بیشتری را به خود اختصاص داده بود. در نقطه مقابل میزان تحملپذیری مربوط به لیمو (LT50= - 2.36) کمترین بود (شکل 1).
اثر دو عامل رقم و برهمکنش رقم و دما بر محتوای کلروفیل a در سطح آماری یک درصد معنیدار بود (جدول 1)، مقایسه میانگین محتوای کلروفیل a نشان داد (شکل 2) که کمترین میزان این رنگدانه 17/1 میلیگرم در گرم وزن تر برگ در دمای 8- درجه سانتیگراد در لیمو مشاهده شد. در نقطه مقابل بیشترین میزان کلروفیل a در پرتقال در دمای 4+ درجه سانتیگراد ثبت شد.
شکل 1- اثر ارقام و دما بر LT50 در دو رقم پرتقال تامسون و لیموی لیسبون
شکل 2- اثر دما بر کلروفیل a در دو رقم پرتقال تامسون و لیموی لیسبون
با کاهش دما به 4- و 8- درجه سلسیوس در پرتقال و لیمو، بین سطح تیماری اختلاف معنیداری مشاهده شد. در سطح دمای 8- درجه سلسیوس تأثیر منفی بالایی بر کلروفیل a در هر دو رقم مشاهده گردید (شکل 2).
اثر سه عامل رقم، دما و برهمکنش آنها بر محتوای کلروفیل b در سطح آماری پنج درصد معنیدار بود (جدول 1)، مقایسه میانگین دادهها نشان داد (شکل 3) که کمترین میزان این رنگدانه 3/0 میلیگرم در گرم وزن تر برگ بوده که در دمای 8- درجه سانتیگراد در لیمو مشاهده شد. در نقطه مقابل بیشترین میزان کلروفیل b در پرتقال در دمای 4+ درجه سانتیگراد با مقدار 69/2 میلیگرم در گرم وزن تر برگ ثبت شد (شکل 3). با کاهش دما به 4- و 8- درجه سلسیوس در پرتقال و لیمو، بین سطح تیماری اختلاف معنیداری مشاهده شد. در سطح دمای 8- درجه سلسیوس تأثیر منفی بالایی بر کلروفیل b در هر دو رقم مشاهده گردید (شکل 3).
شکل 3- اثر دما بر محتوای کلروفیل b در دو رقم پرتقال تامسون و لیموی لیسبون
اثر سه عامل رقم، دما و برهمکنش آنها بر محتوای کلروفیل کل در سطح آماری یک درصد معنیدار بود (جدول 1). در مورد میزان کلروفیل کل پرتقال در دمای 4+ درجه سانتیگراد بیشترین مقدار این صفت را به خود اختصاص داده بود. در نقطه مقابل کمترین میزان کلروفیل کل 47/1 میلیگرم در گرم وزن تر برگ بود که در لیمو در دمای 8- درجه سانتیگراد مشاهده شد، در بین ارقام مورد مطالعه نیز ملاحظه کردید که از لحاظ آماری لیمو در رتبه دوم قرارگرفت (شکل 4).
اثر دو عامل رقم و برهمکنش آنها بر میزان کارتنوئید در سطح آماری یک درصد و برای سطح تنش در سطح آماری پنج درصد معنیدار بود (جدول 1).
شکل 4- اثر دما بر کلروفیل کل در دو رقم پرتقال تامسون و لیموی لیسبون
در مورد میزان کارتنوئید نیز مشاهده گردید که پرتقال در دمای 4- درجه سانتیگراد بیشترین مقدار این صفت را به خود اختصاص داده بود. در نقطه مقابل کمترین میزان کارتنوئید 97/0 میلیگرم در گرم وزن تر برگ بود که در لیمو در دمای 8- درجه سانتیگراد مشاهده شد (شکل 5).
شکل 5- اثر دما بر کارتنوئید در دو رقم پرتقال تامسون و لیموی لیسبون
اثر سه عامل رقم، دما و برهمکنش آنها بر میزان نشت یونی در سطح آماری یک درصد معنیدار بود (جدول 1). مقایسه میانگین نشت یونی (شکل 6) نشان داد که با کاهش دما میزان نشت یونی در هر دو رقم افزایش معنی داری یافت و بیشترین میزان این صفت در دمای 8- سانتیگراد مشاهده شد. در دمای 8- درجه سانتی گراد میزان نشت یونی برگ در پرتقال (88/22 درصد) و مقدار نشت یونی برگ لیمو (65/59 درصد) ثبت شد.
اثر سه عامل رقم، دما و برهمکنش آنها بر محتوای رطوبت نسبی در سطح آماری یک درصد معنیدار بود (جدول 1).
شکل 6- اثر دما بر نشت یونی در دو رقم پرتقال تامسون و لیموی لیسبون
لذا مقایسه میانگین دادهها بیانگر آن است که با کاهش دما تا 4- درجه سانتیگراد میزان آن رو به کاهش نهاد و مجددا در دمای 8- درجه سانتیگراد میزان آن قدری تنزل داشت. براین اساس بیشترین محتوای رطوبت نسبی، متعلق به پرتقال (68/64 درصد) در دمای 4+ درجه سانتیگراد بود. در بین دماها، مقدار محتوای رطوبت نسبی لیمو در تمامی نمونهها در پایینترین سطح بود (شکل 7).
شکل 7- اثر دما بر محتوای رطوبت نسبی برگ در دو رقم پرتقال تامسون و لیموی لیسبون
اثر سه عامل رقم، دما و برهمکنش آنها بر فلاونوئید کل در سطح آماری یک درصد معنیدار بود (جدول 1). مقایسه میانگین دادههای حاصل از فلاونوئید کل (شکل 8) بیانگر آن بود که مقدار این صفت باتوجه به نوع ژنوتیپ با تنزل دما افزایش داشت. به طوری که در دمای 8- درجه سانتیگراد کمترین میزان فلاونوئید برگ در لیمو ثبت شد. در بین ارقام مورد مطالعه در دمای 4- درجه سانتی گراد نیز واکنشهای متفاوتی ملاحظه شد، بیشترین مقدار این صفت 48/32 میلیگرم کوئرستین در گرم بافت تازه بود که در رقم پرتقال تامسون ثبت گردید (شکل 8).
شکل 8- اثر دما بر فلاونوئید کل در دو رقم پرتقال تامسون و لیموی لیسبون
اثر سه عامل رقم، دما و برهمکنش آنها بر پراکسیداسیون لیپید در سطح آماری یک درصد معنیدار بود (جدول 1). پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء از علائم تخریب تنش دمای پایین است که در این پژوهش باتوجه به نوع رقم بیشترین پراکسیداسیون لیپید در دمای 8- درجه سانتیگراد ثبت گردد. از این رو مقایسه میانگین دادههای ژنوتیپهای مورد مطالعه در این دما نشان داد که (شکل 9) کمترین میزان واکنش (با 23/0 میکروگرم مالون آلدئید در گرم در وزن تر برگ) مربوط به پرتقال بود. بیشترین میزان این صفت نیز 77/0 میکروگرم در گرم وزنتر برگ مالون دآلدئید بود که در لیمو ثبت شد.
شکل 9- اثر دما بر پراکسیداسیون لیپید در دو رقم پرتقال تامسون و لیموی لیسبون
اثر سه عامل رقم، دما و برهمکنش آنها بر فعالیت آنزیم اسکورباتپراکسیداز در سطح آماری یک درصد معنیدار بود (جدول 1). مقایسه میانگین اثر متقابل تنش دمای پایین و ژنوتیپ بر آنزیم اسکورباتپراکسیداز (شکل 10) نشان داد که باتوجه به نوع ژنوتیپ، آنزیم اسکورباتپراکسیداز با تنزل دما افزایش یافت، به طوری که روند افزایش این صفت تا دمای 4- درجه سانتیگراد ادامه داشت. از این رو بیشترین میزان فعالیت آنزیم اسکورباتپراکسیداز 7/39 واحد آنزیمی در میلیگرم وزن تازه بود که در لیمو در دمای 4- درجه سانتیگراد ثبت گردید. کمترین میزان فعالیت آنزیم اسکورباتپراکسیداز نیز 16 واحد آنزیمی در میلیگرم وزن تازه در دمای 4- و 8- درجه سلسیوس بود که در پرتقال ثبت شد که نسبت به نمونه لیمو نیز در رتبه آماری پایینتر قرارگرفت.
شکل 10- اثر دما بر آنزیم اسکوربات پراکسیداز در دو رقم پرتقال تامسون و لیموی لیسبون
اثر دو عامل ارقام و تنش بر فعالیت کاتالاز در سطح آماری یک درصد و برای اثر متقابل در سطح آماری پنج درصد معنیدار بود (جدول 1). لذا مقایسه مقایسه میانگین دادهها بیانگر آن بود که بیشترین میزان فعالیت آنزیمی 43/33 میکرومولار بر گرم وزن تازه در دقیقه بود که در پرتقال مشاهده شد. کمترین میزان این صفت نیز 83/26 میکرومولار بر گرم وزن تازه در دقیقه بود که در لیمو ثبت گردید (شکل 11).
شکل 11- اثر ارقام و دما بر آنزیم کاتالاز در دو رقم پرتقال تامسون و لیموی لیسبون
اثر سه عامل رقم، دما و برهمکنش آنها بر فعالیت آنزیم سوپر اکسیددیسموتاز کل در سطح آماری یک درصد معنیدار بود (جدول 1). در پژوهش مذکور فعالیت آنزیم سوپر اکسیددیسموتاز نیز تحت تأثیر اثر ارقام، دمای پایین و متقابل ارقام و دمای پایین بود (شکل 12). لذا مقایسه میانگین دادهها بیانگر آن است که در پرتقال با کاهش دما تا 8- درجه سانتیگراد میزان آن رو به افزایش نهاد و مجددآ در دمای 8- درجه سانتیگراد میزان آن در لیمو تنزل داشت. براین اساس بیشترین فعالیت آنزیم سوپر اکسیددیسموتاز، متعلق به پرتقال (3/160 میکرومول/گرم وزن تازه) در دمای 8- درجه سانتیگراد بود.
شکل 12- اثر دما بر آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز در دو رقم پرتقال تامسون و لیموی لیسبون
بحث
تحمل به یخزدگی (با کاهشLT50 ) برآورد شده در شکل 1 نشان داده شده است. در این پژوهش تحمل به یخزدگی در ارقام مرکبات مورد مطالعه از لحاظ آماری معنیدار و قابل توجهی بالا بود (جدول 1)، که این نتایج بیانگر این است که توقف در رشد گیاه، نیاز قطعی برای سازگاری به سرما نیست، همچنین نتایج نشان میدهد که مرکبات مانند دیگر درختان میوه نسبتاً متحمل قادر است تا حدودی تحمل به سرما را متحمل نماید که این به این معنی است، که دارای مکانیسم اجتناب از یخزدگی است (31). با اینکه درختان مرکبات نسبتاً میزان تحمل به سرما را در بین درختان نیمه گرمسیری دارا است، اما میزان تحمل به یخزدگی بین ارقام مرکبات متفاوت است که این امر میتواند ناشی از تفاوتهای ژنتیکی مرتبط با تحمل به یخزدگی بین آنها باشد (9). پژوهشهای انجام شده بر روی مرکبات نشان داده است که ارقام متحمل به یخزدگی عموماً غشاء سیتوپلاسمی پایدارتر و نشت الکترولیت کمتری نسبت به ارقام حساس دارند (38). کاهش کلروفیل در ارقام مورد نظر میتواند ناشی از اکسیداسیون این رنگدانهها در غشاء تیلاکوئید باشند (51). به عبارت دیگر افزایش پراکسیداسیون لیپید (ناشی از افزایش تجمع رادیکالهای فعال اکسیژن) به موازات کاهش رنگدانههای کلروفیل میتواند توجیهکننده تفسیر فوق باشد، در ارزیابی واکنش لیمو در مواجهه با تنش یخبندان، تخریب رنگدانههای کلروفیل اشاره شده که با نتایج این آزمایش هماهنگی دارد (23). کاهش معنیدار مقدار کلروفیل کل دراین پژوهش میتواند به واسطه کاهش سنتز کلروفیل و تسریع در تخریب ساختمان آن تحت تأثیر رادیکالهای فعال اکسیژن باشد که هم راستا با نتایج فهیمیراد و همکاران (2013) (21) میباشد. در خصوص کاهش کاروتنوئیدها در این آزمایش میتوان این گونه استنباط نمود که احتمالاً کاهش کاروتنوئیدها به علت اکسیده شدن این رنگدانه توسط رادیکال فعال اکسیژن بوده که از این طریق میتواند کلروفیل a را از گزند مولکولهای اکسیژن یکتایی حفاظت کند. لیکن کلروفیل b در مقابل کلروفیل a نسبت به تنش دمای پایین حساسیت بیشتری داشته که به کاهش این رنگدانه در تنش مزبور منجر شده است (43و52).
در خصوص اثرات کاهش دما در افزایش نشت یونی گزارشهای متعددی ارائه شده که میتوان به مطالعات صورت گرفته روی گیاهچه مکزیکن لایم در مرکبات (23) و درختان زیتون تحت شرایط کنترل شده تنش یخبندان (13) اشاره داشت. در توجیه وقوع نشت یونی میتوان این گونه استدلال داشت که احتمالاً وقوع یخبندان میتواند از طریق افزایش نشت یونی، موجب خروج آب از درون سلول به فضای بیرون شده که در چنین وضعیتی این بروز در برگ نیز قابل ملاحظه خواهد بود. بنابراین افزایش نشت یونی برگ نمونههای مورد مطالعه دراین پژوهش نیز میتواند تأییدکننده این استدلال باشد. غشاهای سلولی اولین نواحی هستند که تحت تأثیر آسیبهای یخزدگی قرار میگیرند. تنش دمای پایین باعث کاهش سیالیت غشاء شده که در کنار پراکسیداسیون لیپیدها موجب تخریب غشاء و در نتیجه افزایش نشت یونی میگردد (23). در پژوهشی روی نهالهای زیتون، تنش یخزدگی موجب تسریع تخریب غشاء و در نتیجه، افزایش نشت یونی شد (11). نشت یونی کمتر در ارقام متحمل میتواند به دلیل پایداری بیشتر ویژگیهای فیزیکی و شیمیایی غشای پلاسمایی باشد که در این پژوهش کاملاً نمایان بود. در بسیاری از تنشها آسیب به بافت با خسارت وارده به غشای پلاسمای برگ یا دیگر بافتها ارتباط دارد (42، 22، 57، 59، 60). مطالعات ایمانی و همکاران (2011) (29) روی مقاومت به سرمای 60 رقم و ژنوتیپ بادام نشان داد که شدت آسیب یخزدگی به ژنوتیپ گیاه بستگی دارد و ژنوتیپهایی که مقاومت بیشتری دارند قطعاً نشت یونی کمتری خواهند داشت. بیشترین آسیب ناشی از تنش یخزدگی درون سلولی است. گیاهان متحمل به یخزدگی، میتوانند یخزدگی برون سلولی را بدون پذیرش خسارت تحمل کنند، اما قادر به تحمل یخزدگی درون سلولی نیستند (55). فرایند سازگاری به سرما و نقش آنها در القای تحمل به یخزدگی در مرکبات طی آزمایشاتی (28و 37) مورد بررسی قرار گرفت، نتایج نشان داد که تنش آب برای فرایند سازگاری به سرما و القای تحمل کامل به یخزدگی در مرکبات و توتفرنگی ضروری است. آنچه مسلم است بین پتانسیل آب گیاه و محتوای نسبی آب برگ رابطه مثبت و بالایی وجود دارد و گیاهانی که در پایان دوره تنش بتوانند محتوای نسبی آب برگ بالاتری را حفظ کنند به لحاظ مقاومت به تنش نیز برتر خواهند بود، که در این آزمایش رقم پرتقال محتوای نسبی آب برگ بالاتری نسبت به لیمو در سطح دمایی داشت. کاهش محتوای آب برگ باعث میشود که هدایت روزنهای، فتوسنتز و آسیمیلاسیون دی اکسید کربن کاهش پیدا کند. اگرچه پایین بودن محتوی آب نسبی برگ در دماهای پایین در ارقام مقاوم میتواند ناشی از شکستن مولکولهای درشت مانند پلیساکاریدها و تولید قندهای سادهتر باشد که منجر به افزایش پتانسیل اسمزی و کاهش محتوی آب نسبی میگردد (4). محتوای نسبی آب برگ یکی از پارامترهای فیزیولوژیکی مهم است که همبستگی خوبی با تحمل به تنش یخزدگی نشان داده است. به طور کلی با افزایش محتوای نسبی آب برگ، فشار درون سلول برای رشد و در نهایت اتساع دیواره سلول افزایش مییابد و همین امر باعث کاهش پایداری غشاء سلولی و افزایش میزان نشت سلولی شد. در همین رابطه محمدرضا خانی و همکاران (39) در پژوهشی روی گونههای مرکبات نشان دادند که افزایش درصد محتوای نسبی آب برگ با کاهش میزان پایداری غشاء همراه بود. علاوه براین آسیب به گیاه با یخ زدن آب بین سلولی و حرکت آب از پروتوپلاسم به فضای بین سلولی و تشکیل کریستالهای یخ در داخل پروتوپلاسم صورت میگیرد. اما اغلب خسارت یخزدگی به دلیل دهیدراسیون ناشی از یخزدگی است (5). بنابراین تحمل به یخزدگی بالای ارقامی که دارای محتوای نسبی آب کمتری هستند هم به دلیل افزایش غلظت شیره سلولی و حفظ تعادل اسمزی و هم به دلیل پیوند محکم آب با ماکرومولکولهای داخل سلول و عدم خروج به فضای بین سلولی است. مطابق با یافتههای این پژوهش، Arias و همکاران (2015) (9) گزارش کردند که برگهای ارقام زیتون سازگار شده به سرما در طی زمستان، دارای محتوای آب آپوپلاستی و LT50و ظرفیت سوپرکولینگ بیشتری بودند.
دراین پژوهش با کاهش دما به 4- درجه سانتیگراد، فلاونوئید روند افزایشی را نسبت به شرایط بدون تنش نشان داد. گزارش مشابهی در خصوص تأثیر تنش یخبندان بر فلاونوئید برگ گیاهچه بذری هلو (35) و ارقام مرکبات (33) ارائه شده که مطابق نتایج این پژوهش است. فلاونوئیدها گروه بزرگی از ترکیبات فنلی موجود در گیاهان هستند که در تنشهای محیطی با افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی تولید آنها افزایش مییابد (40). مطالعات انجام شده نقش اکوفیزیولوژی این ترکیبات را به عنوان یکی از شاخصهای حساس به تغییرات محیطی و همچنین، یکی از نشانگرهای بیوشیمیایی دفاعی گیاه در برابر تنشهای محیطی نشان میدهد (54). خسارت بیشتر ساختار غشاء (افزایش پراکسیداسیون لیپید و نشت یونی) و افزایش فعالیت سه آنزیم SOD، CAT، AXP در طی تنش سرما، نشاندهنده تولید ROS و افزایش خسارت اکسیداتیو در دو تیمار دمای پایین میباشد. با این وجود، کاهش میزان فلاونوئیدها در این دمای 8- ممکن است ناشی از اکسیداسیون آنها توسط ROS ها باشد (53). یکی از واکنشهایی که در شرایط تنش و در حضور اکسیژن فعال سرعت بیشتری پیدا میکند، پراکسیداسیون چربیهای غشایی است که میتواند منجر به پارگی غشا سلولی در گیاهان شود (32). مالون دی آلدهید که محصول تجزیه اسیدهای چرب غیراشباع هیدروپروکسیداز و پراکسیداسیون لیپیدها تحت تأثیر تنشهای اکسیداتیو است، به عنوان یک نشانگر زیستی مناسب برای اکسیداسیون لیپیدها مورد استفاده قرار میگیرد (48). غلظت این ماده در محدوده نانومولار است و فرایندهای شدید پراکسیداسیون لیپید از قبیل تخریب و تغییر غشاء در نتیجه تنش اکسیداتیو یا تغییرات مورفولوژیکی باعث افزایش در غلظت آن میشود (58). مطالعات ولیزاده-کامران و همکاران (2017) (52)، که بروی چند ژنوتیپ جو انجام شده نشان میدهد که با کاهش دما در بازه 20 تا 4- درجه سانتیگراد مقدار مالوندیآلدهید افزایش یافته و در 4- درجه سانتیگراد بالاترین میزان را داشته، همچنین مقدار آن در ژنوتیپهای حساس بیشتر از ژنوتیپهای مقاوم جو بوده است. در پژوهشهای متعددی به ارتباط خسارت تنش دمای پایین و افزایش پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء اشاره شده که دراین زمینه میتوان به پژوهشهای انجام شده روی ارقام انگور (56)، عناب (10) و قهوه (15) اشاره داشت. براساس نتایج به دست آمده دراین پژوهش آنزیمهای سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز در این آزمایش، آنزیمهای مقاومت به تنش می باشند و در نتیجه در پرتقال که نسبتاً مقاوم به دمای پایین میباشد، فعالیت بیشتری در مقایسه با لیمو داشتند. در مقابل آسکوربات پراکسیداز که آنزیم پاسخ به تنش هست و در لیمو که نسبتاً حساس به دمای پایین میباشد، سطح بالاتری داشت. رقم متحمل سریعتر به کاهش دما پاسخ میدهند و با حذف سریعتر گونههای فعال اکسیژن منجر به کاهش آسیبهای ناشی از تنش میشوند، و از آنجاییکه پرتقال بیشتر و سریعتر از لیمو تحت تأثیر تغییر دما قرار میگیرد به نظر میرسد بالا بودن سطح آنزیمهای آنتیاکسیدانی در پرتقال، امری طبیعی باشد. سوپراکسید دیسموتاز به عنوان اولین سد دفاعی در مقابل حمله اکسیژنهای فعال عمل میکند. این آنزیم نقش مرکزی در مکانیسم دفاعی ارگانیسمها در برابر گونههای اکسیژن فعال دارد که در طی تنشهای محیطی تولید میشود و جلوگیری از خسارات ناشی از تنش اکسیداتیو را به عهده دارد (19). نتایج آزمایشی در زمینه ارزیابی تغییر آنزیمهای ضداکسایشی در دو رقم توتفرنگی تحت شرایط دمای پایین، نشان داد فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در شروع تیمار سرما سریعاً افزایش یافت (37). در آزمایشی روی نارنگی نتایج نشان داد با شروع تیمار سرما فعالیت سوپراکسید دیسموتاز در برگها افزایش یافته اما با طولانی شدن مدت سرما کاهش یافته و به سطح ثابتی رسیده است (39). پژوهشهای مختلف نشان دادهاند که بین فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی و تحمل گیاه به تنشهای غیرزنده مانند تنش سرما همبستگی وجود دارد و گیاهانی که دارای سطوح بالاتری از آنتیاکسیدانتها هستند، مقاومت بیشتری را به آسیبهای اکسیداتیو نشان میدهند (50). نتایج آزمایشی دیگر نشان داد که با کاهش دما، فعالیت آنزیم پراکسیداز به منظور جلوگیری از آسیبهای وارده به گیاه ناشی از تنش سرما و تولید هیدروژن پراکسید افزایش مییابد (34). یکی از دلایل تحمل بیشتر رقم پرتقال میتواند، فعالیت بیشتر آنزیمهای سوپراکسیداز و کاتالاز نسبت به رقم حساستر لیمو و در نتیجه حذف کاراتر هیدروژن پراکسید باشد. روسوس و همکاران () دریافتند که در توت فرنگی نیز تیمار سرما موجب افزایش فعالیت پراکسیدازها میشود. مطالعه انجام شده نشان داد با کاهش دما فعالیت آنزیم کاتالاز، در پرتقال تامسون افزایش یافت. مطالعات مختلف روی توتفرنگی (37) هم نشان میدهد که بین فعالیت آنزیمهای ضداکسایشی با تحمل گیاه به تنش سرما همبستگی مثبت وجود دارد. نتایج تحقیقات در زمینه مرکبات نشان دادهاند که فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز تنها در ارقام مقاوم به سرمای این دسته افزایش نشان داده است (31). در پژوهشی در زمینه مقاومت به سرمای چای مشخص شد که سه آنزیم مهم آنتیاکسیدانی شامل کاتالاز، سوپراکسید دیسموتاز و آسکوربات پراکسیداز در اثر کاهش دما فعالیت خود را با هدف خنثی کردن و به حداقل رساندن آسیبهای اکسیداتیو افزایش میدهند (4) که نتایج پژوهش حاضر با آن مطابقت دارد.
نتیجهگیری
دراین پژوهش اثر متقابل دما و ژنوتیپ بر پراکسیداسیون لیپید، آنزیمهای آنتیاکسیدانی SOD، CAT، AXP، نشت یونی، فلاونوئید کل، کلروفیل و کلروفیل کل معنیدار بود. در بین دماهای مورد بررسی دراین پژوهش تحت شرایط دو رقم پرتقال تامسون (متوسط) و لیموی لیسبون (حساس به تنش) دمای پایین نیز واکنشهای متفاوت فیزیولوژیک مشاهد شد. براین اساس لیمو در مقابل کاهش دما تا دمای 4- پایداری مناسبی نشان داد. تنش سرما باعث افزایش نشت الکترولیتها شد و مقادیر کلروفیل گیاه را در مراحل ابتدایی پس از اعمال تنش کاهش داد. نتایج پژوهش حاضر نشان داد که همواره با کاهش دما مقادیر فلاونوئید کل، آنزیمهای آنتی اکسیدانی سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز افزایش یافته و عموماً سطح آنها در پرتقال تامسون بیشتر از لیموی لیسبون بوده است. دراین حالت و احتمالاً به دلیل افزایش فعالیتهای اکسیداتیو تجمع ترکیبات آنتی اکسیدانی مانند سوپراکسیددیسموتاز و کاتالاز افزایش یافت.
سپاسگزاری
این پژوهش با حمایت مالی دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی گرگان انجام شده است.
مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)