نوع مقاله : مقاله پژوهشی
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله English
نویسندگان English
Recently, melatonin was proved to be a candidate hormone that could increase the cold and heat stress of the plant. Cold stress is important abiotic stress for plants in nature. In this study, in order to investigate the effect of exogenous application of melatonin on some physiological traits related to cold stress on the strawberry cultivar ‘Paros’ a pot experiment with three replications was performed in a completely randomized design. Strawberry plants pre-treated with 100 μM melatonin were subjected to freezing stress treatment (-9◦C for 3 h without cold acclimation) after two weeks some physiological traits (proline, carbohydrate, total flavonoid, chlorophyll content, ion leakage, hydrogen peroxide, content of water, malondialdehyde, and total phenol) related to cold stress in plant leaves were measured. The results showed that melatonin treatment has a significant effect on some physiological traits (proline, carbohydrate, total flavonoid, chlorophyll content, ion leakage, and hydrogen peroxide) in the strawberry plant under freezing stress. Proline, carbohydrate, total flavonoid, and chlorophyll content were significantly enhanced, and a significant reduction was observed in ion leakage and hydrogen peroxide in melatonin-pre-treated plants. In this experiment, melatonin treatment had no significant effect on the relative water content, malondialdehyde, and total phenol. According to the results of our study, exogenous application of melatonin may be effective to improve freezing tolerance in strawberry plants after two weeks of application.
کلیدواژهها English
بررسی تأثیر ملاتونین بر برخی ویژگیهای فیزیولوژیکی گیاه توتفرنگی (Fragaria×ananassa) رقم پاروس تحت تنش یخزدگی
ساناز یوسفی، منصور غلامی* و حسن ساریخانی
ایران، همدان، دانشگاه بوعلیسینا، دانشکده کشاورزی، گروه باغبانی
تاریخ دریافت: 06/10/1400 تاریخ پذیرش: 10/01/1401
چکیده
تنش سرما یکی از تنشهای غیرزیستی بسیار مهم در کاهش عملکرد بسیاری از گیاهان است. دراین رابطه اخیراً یک هورمون گیاهی به نام ملاتونین در زمینه کاهش آسیبهای ناشی از تنشهای زیستی و غیرزیستی مختلف توجه پژوهشگران را به خود جلب کرده است. در پژوهش حاضر بمنظور بررسی و ارزیابی تأثیر ملاتونین بر برخی صفات فیزیولوژیکی توتفرنگی رقم پاروس تحت تنش سرما، آزمایشی گلدانی با سه تکرار در قالب طرح کاملاً تصادفی به اجرا در آمد. ابتدا گیاهان توتفرنگی با غلظتهای صفر و 100 میکرومولار هورمون ملاتونین از طریق محلولپاشی تیمار شدند و دو هفته پس از محلولپاشی، گیاهان به مدت 3 ساعت تحت تنش یخزدگی در دمای 9- درجه سانتیگراد قرار گرفتند. نتایج نشان داد تأثیر تیمار ملاتونین بر تغییر ویژگیهای فیزیولوژیکی شامل پرولین، کربوهیدرات محلول، فلاونوئید کل، نشت یونی، میزان شاخص کلروفیل و پراکسید هیدروژن در شرایط تنش یخزدگی معنیدار بود. تیمار ملاتونین باعث افزایش معنیدار در میزان پرولین، کربوهیدراتهای محلول، فلاونوئید کل و میزان شاخص کلروفیل و همچنین کاهش معنیدار در میزان نشت یونی و پراکسیدهیدروژن در گیاهان تحت تنش یخزدگی شد. در این آزمایش تیمار ملاتونین تأثیر معنیداری بر میزان محتوای نسبی آب، مالوندیآلدئید و فنل کل نداشت. باتوجه به نتایج این پژوهش، احتمالاً تیمار ملاتونین میتواند به عنوان راهکاری اثرگذار جهت افزایش تحمل گیاهان در مقابله با تنش سرما و کاهش آسیبهای ناشی از آن مورد استفاده قرار گیرد.
واژه های کلیدی: اسمولیتها، تنش سرما، نشت یونی، ملاتونین
* نویسنده مسئول، تلفن: 08138273952 ، پست الکترونیکی: mgholami@basu.ac.ir
مقدمه
تنشهای زیستی و غیرزیستی باعث تأخیر در رشد، کاهش عملکرد، پیری و حتی مرگ گیاه میشوند. در مناطق معتدله، دمای پایین یکی از اصلیترین تنشهای محیطی است که بسیاری از گیاهان در طول چرخه زندگی خود با آن روبهرو میشوند و بر رشد و نمو، عملکرد، کیفیت محصول، عمر پس از برداشت محصول و توزیع جغرافیایی گیاهان تأثیر زیادی دارد. تنش سرما را میتوان به تنشهای سرمازدگی (0 تا 15 درجه سانتیگراد) (Chilling) و یخزدگی (Freezing)(کمتر از صفر درجه سانتیگراد) تقسیمبندی کرد (53). تنش سرما یکی از مهمترین تنشهای غیرزیستی است که بسیاری از گیاهان در طول حیات خود با آن مواجه میشوند، بهویژه گیاهان کشت شده در ارتفاعات بالاتر و این میتواند موجب آسیبهای جدی اقتصادی در محصولات شود (44). پیامد اولیه تنش در دمای پایین تجمع بیش از حد گونههای فعال اکسیژن (ROS) مانند پراکسیدهیدروژن (H2O2) رادیکالهای آنیون سوپراکسید (O2•-) و رادیکالهای هیدروکسیل (OH) میباشد که به دلیل وقوع اختلال در زنجیره انتقال الکترون در کلروپلاستها تشکیل میشوند (19). کلروپلاستها محل اصلی تولید گونههای فعال اکسیژن در گیاهان هستند (7). تجمع بیش از حد گونههای فعال اکسیژن برای اسیدهای نوکلئیک، پروتئینها و لیپیدها آسیبزا است و در نهایت باعث اختلال در عملکرد سلولی میشود (19). تولید بیش از حد گونههای فعال اکسیژن باعث غیرفعال شدن آنزیمهای چرخه کلوین، سرکوب تثبیت کربن و نهایتاً کاهش فتوسنتز میشود (74). در واکنش به افزایش سطح گونههای فعال اکسیژن، گیاهان یک شبکه سمزدایی کارآمد را ایجاد میکنند که شامل آنتیاکسیدانهای آنزیمی و غیرآنزیمی میشود. آنتیاکسیدانهای آنزیمی معروف عبارتند از سوپراکسیددیسموتاز(SOD) ، کاتالاز(CAT) ، پراکسیداز (POD) و آسکورباتپراکسیداز(APX) ، در حالی که آنتیاکسیدانهای غیرآنزیمی شامل گلوتاتیون، اسیدآسکوربیک، پرولین و غیره هستند. علاوه بر این، تعداد زیادی متابولیت، از جمله کربوهیدراتها و اسیدهای آمینه، برای محافظت از گیاهان در برابر آسیبهای ناشی از سرما در سطح سلولی تولید میشوند (38). علاوه بر بهنژادی، روشهای مختلفی برای افزایش مقاومت به دمای پایین در گیاهان مورد بررسی قرار گرفته است. در این بین کاربرد بیرونی هورمونهای گیاهی مانند جاسمونیکاسید (49) و ملاتونین (17و 63) به عنوان ترکیبهای طبیعی و سالم مود توجه پژوهشگران قرار گرفته است. یکی از مهمترین اثرات ملاتونین که مورد مطالعه قرارگرفته است، نقش آن به عنوان محرک زیستی در شرایط تنشهای زیستی و غیرزیستی است (51و 52). ملاتونین با از بین بردن گونههای فعال اکسیژن و چندین گونه نیتروژن فعال (RNS)، مقدار بیش از حد این مواد خطرناک را تنظیم کرده و تعادل اکسیداسیون-احیاء را تضمین میکند (6). ملاتونین همچنین بیان چندین آنزیم مسئول سمزدایی H2O2 اضافی، مانند کاتالازها، پراکسیدازها، گلوتاتیون/آسکوربات ردوکتازها و پراکسیردوکسینها را القاء میکند، بنابراین میتواند سطوح گونههای فعال اکسیژن را کنترل کند و مقدار اضافی آنها را کاهش دهد (57). همچنین عناصر چرخهAsA-GSH توسط ملاتونین تنظیم میشوند (59). آسکوربات (AsA) و گلوتاتیون (GSH) دو آنتیاکسیدان غیرآنزیمی آبدوست هستند که در چرخه مهم آسکوربات-گلوتاتیون (AsA-GSH) شرکت میکنند، که نقش مهمی در از بین بردن H2O2 و بازیافت اشکال کاهش یافته آسکوربات و گلوتاتیون ایفا میکند (25). براساس نتایج پژوهشهای مختلف ثابت شده است که ملاتونین میتواند یک هورمون کاندید جهت افزایش تحمل تنش سرما و گرما در گیاهان باشد. در این راستا، علاوه بر افزایش طبیعی ملاتونین در مواجهه با تنش سرما، تیمار بیرونی ملاتونین نیز سبب افزایش مقاومت در برابر تنش سرما شده است (64، 65 و 76). تورک و همکاران (64) با کاربرد ملاتونین روی دانهالهای گندم مشاهده کردند که ملاتونین سبب افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی و سطوح محافظهای اسمزی بالاتری شده و با مهار گونههای فعال اکسیژن و تنظیم تعادل اکسایش-کاهش، سبب افزایش مقاومت به سرما شد. اوچندو و همکاران (65) با تیمار ملاتونین در گیاه نارون آمریکایی در شرایط فروانجماد، بازیابی کامل رشد را در نوک شاخهها و جوانههای خفته گزارش کردند. در گیاه برموداگراس، تیمار ملاتونین بیرونی سبب تغییر در غلظت متابولیتهای مختلف و بهبود فعالیت فتوسیستم 2 شد و بنابراین، تحمل به سرمای گیاه به طور معنیداری افزایش یافت (16، 26و 58). برای حفظ ژرمپلاسم در معرض خطر انقراض با استفاده از روش فروانجماد، میزان بقای کالوس گیاهRhodiola crenulata در فرآیند یخزدگی، با تیمار ملاتونین به طور معنیداری افزایش یافت (76). توتفرنگی تجاری (Fragaria × ananassa Duch) به دلیل مزیتهای نسبی فراوان، از مهمترین میوههای دانه ریز در جهان به شمار میرود. در ایران مجموع سطح زیر کشت گیاه توتفرنگی در سال 1398، 6051 هکتار با عملکرد 5993 کیلوگرم در هکتار بوده است که بخش عمده تولید این محصول در مناطق معتدله کشور و به صورت مزرعهای میباشد (آمارنامه کشاورزی، وزارت جهاد کشاورزی، 1398). آسیب یخزدگی در زمستان و سرمازدگی بهاره در گیاه توتفرنگی یکی از مهمترین عوامل کاهشدهنده میزان محصول و کیفیت در مناطق معتدله است و بقای توتفرنگی را به شدت محدود میکند (32و 56). در پژوهش حاضر تلاش شده است که تاثیر هورمون ملاتونین بر مقاومت به تنش یخزدگی و کاهش اثرات زیانبار این تنش در گیاه توتفرنگی رقم پاروس به عنوان رقمی روزکوتاه، غالباً مرزعهای با ویژگی نیمهحساس به دمای پایین مورد بررسی قرارگیرد.
مواد و روشها
پژوهش حاضر در سال 1399 در گلخانه گروه علوم باغبانی دانشگاه بوعلیسینا، به صورت گلدانی اجرا شد. برای انجام پژوهش، بوتههای توتفرنگی رقم پاروس (Paros) از ساقههای رونده سال جاری تهیه و در گلدانهای پلاستیکی یک کیلویی حاوی مخلوط خاک باغچه و ماسه به نسبت 1:1 کشت و بوتهها در شرایط یکسان در گلخانه تا زمان محلولپاشی (چهار تا شش برگی) نگهداری شدند. ملاتونین به غلظت 100 میکرومولار جهت محلولپاشی روی برگها تهیه شد. ابتدا ملاتونین در اتانول حل و سپس با آب مقطر به حجم مورد نظر رسانده شد. برای جلوگیری از تجزیه نوری ملاتونین، محلولپاشی پس از غروب آفتاب انجام شد. محلولپاشی بترتیبی صورت گرفت که هر دو طرف برگها کاملاً به محلول آغشته شود. این پژوهش در 3 تکرار و در قالب طرح کاملاً تصادفی اجرا شد. دو هفته پس از انجام محلولپاشی، گیاهان تیمار شده با ملاتونین 100 و صفر میکرومولار (شاهد)، به اتاقک سرماساز جهت اعمال تیمار دمایی منتقل شدند. دما در اتاقک سرماساز به میزان 2 درجه سانتیگراد در هر ساعت کاهش یافت و پس از رسیدن به دمای 9- درجه سانتیگراد، گیاهان به مدت 3 ساعت در این دما نگهداری شدند و سپس دما مجدداً با میزان افزایش 2 درجه سانتیگراد در هر ساعت، افزایش یافت. پس از اعمال تیمار دمایی گیاهان از اتاقک سرماساز خارج شده و پس از گذشت 24 ساعت ویژگیهای مورد نظر در آنها مورد بررسی قرار گرفت و مقایسه بین گیاهان تیمار شده با ملاتونین و شاهد تحت تنش سرما صورت گرفت.
نشت یونی: بررسی درصد نشت یونی با روش لوتوس و همکاران (45) صورت گرفت. پس از اعمال تیمارهای دمایی، 5 عدد دیسک به قطر نیم سانتیمتر از برگها جدا شده و در ظرفهایی شبیه به قوطی فیلم، حاوی 50 میلیلیتر آب دو بار تقطیر به مدت 24 ساعت روی شیکر قرار داده شد. سپس هدایت الکتریکی اولیه محلولها (EC1) با استفاده از دستگاه هدایتسنج (مدل CC-501 WTW، آلمان) قرائت شد. پس از آن ظرفها به مدت 20 دقیقه در اتوکلاو با دمای 121 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. بعد از خارج کردن لولهها از اتوکلاو و همدما شدن با محیط، هدایت الکتریکی محلولها (EC2) مجدداً قرائت شد و در نهایت درصد نشت یونی برگها با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد.
= درصد نشت یونی(EC1/EC2) × 100
محتوای نسبی آب: سنجش محتوای نسبی آب برگها با استفاده از روش بار و واترلی (8)، صورت گرفت. برای هر نمونه 5 عدد دیسک نیم سانتیمتری از برگها با ترازو (با دقت 001/0 گرم) توزین شده و وزن تر (FW) بدست آمد. سپس نمونههای برگ در قوطی فیلمهای حاوی 50 میلیلیتر آب دو بار تقطیر قرار گرفته و به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد در تاریکی قرار داده شدند. سپس مجدداً توزین شدند و وزن اشباع (TW) بدست آمد. پس از اندازهگیری وزن اشباع، برگها به مدت 48 ساعت در دمای 72 درجه سانتیگراد در آون جهت اندازهگیری وزن خشک نگهداری و سپس مجدداً توزین و وزن خشک (DW) بدست آمد. در نهایت محتوای نسبی آب برگها با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد.
= محتوای نسبی آب (FW-DW) / (TW-DW) × 100
محتوای مالوندیآلدئید: جهت سنجش محتوای مالوندیآلدئید (MDA) (Malondialdehayde) از روش استوارت و بیولی (61)، استفاده شد. در این روش 2/0 گرم نمونه برگ گیاهی با استفاده از تریکلرواستیک 1/0 با نیتروژن مایع در هاون کوبیده شد. سپس نمونهها به مدت 30 دقیقه با سرعت 12000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. پس از سانتریفیوژ یک میلیلیتر از مایع رویی برداشته شد و به آن یک میلیلیتر محلول 5/0 درصد اسیدتیوباربیتیوریک (Thiobarbituric acid) حاوی اسید تریکلرواستیک 20 درصد اضافه گردید. سپس نمونهها به مدت 30 دقیقه در بنماری با دمای 95 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. بمنظور توقف واکنش بلافاصله پس از خارج نمودن از بنماری، نمونهها به مدت 10 دقیقه در آب یخ قرارگرفتند. سپس میزان جذب نمونهها با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (یووی- 1280، شیمادزو، ژاپن) در دو طول موج 532 نانومتر و 600 نانومتر اندازهگیری شد. جذب در طول موج 600 نانومتر از جذب در طول موج نخست کسر گردید. محاسبه غلظت مالوندیآلدئید براساس رابطه زیر و با در نظر گرفتن فاکتور رقت، قطر کووت و ضریب خاموشی انجام شد.
دراین فرمول مقدار مالوندیآلدئید برحسب نانومول بر گرم وزن تر برگ محاسبه میشود. قطر کووت معمولاً یک سانتیمتر و ضریب خاموشی 155 میلیمول بر سانتیمتر میباشد. مقدار محاسبه شده نهایی باتوجه به وزن و حجم عصاره استفاده شده تبدیل به میکرومول بر گرم میگردد.
پراکسیدهیدروژن: غلظت پراکسیدهیدروژن براساس واکنش با یدیدپتاسیم و با استفاده از روش آلکسیوا و همکاران (4)، اندازهگیری شد. در این روش 1/0 گرم بافت تازه گیاه در تریکلرواستیکاسید 1/0 درصد کوبیده شد. عصاره حاصل به مدت 15 دقیقه در 12000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس به 500 میکرولیتر از عصاره صاف شده، 500 میکرولیتر فسفاتپتاسیم 100 میلیمولار و 2 میلیلیتر یدیدپتاسیم 1 مولار اضافه گردید. مخلوط حاصل به مدت یک ساعت در تاریکی و دمای اتاق نگهداری و پس از آن جذب در طول موج 390 نانومتر قرائت شد. با استفاده از منحنی استاندارد، غلظت پراکسیدهیدروژن بر اساس نانومول بر گرم وزن تر محاسبه شد.
شاخص کلروفیل برگ: میزان کلروفیل برگ با استفاده از دستگاه کلروفیلمتر (SPAD-502, Minolta, Japan) اندازهگیری شد.
کربوهیدرات کل: اندازهگیری کربوهیدرات کل بر اساس روش پاکوین و لچاستر (54)، انجام شد. برای این منظور، 5/0 گرم از بافت تازه برگ با 5 میلیلیتر اتانول 95 درصد در هاون چینی کوبیده شد. سپس قسمت بالایی محلول جدا و 5 میلیلیتر متانول 70 درصد به رسوبات به جا مانده از مرحله قبل افزوده شد. این عمل دو بار تکرار شد و عصاره استخراج شده با سرعت 3500 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. میزان 1/0 میلیلیتر از قسمت رویی عصاره برداشته شد و 3 میلیلیتر آنترون (300 میلیگرم آنترون + 150 میلیلیتر سولفوریکاسید 72 درصد) به آن اضافه شد. نمونهها پس از گذاشتن در بنماری 100 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه و تشکیل ماده رنگی، بلافاصله به داخل یخ منتقل شدند. با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 625 نانومتر، میزان جذب نمونهها اندازهگیری شد و با مقایسه با منحنی جذب استاندارد گلوکز، غلظت کربوهیدرتهای محلول کل نمونهها برحسب میلیگرم بر گرم بیان گردید.
پرولین: جهت اندازهگیری پرولین از روش بیتس و همکاران (9) استفاده شد. در این روش، 5/0 گرم از نمونه برگ در 10 میلیلیتر سولفوسالیسیکاسید 3 درصد کوبیده شد. نمونهها به مدت 10 دقیقه با سرعت 3500 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. پس از سانتریفیوژ مقدار 2 میلیلیتر از عصاره بالایی جدا و به داخل لوله آزمایش منتقل و سپس 2 میلیلیتر گلایسیالاستیکاسید و 2 میلیلیتر ناینهیدرین تازه (5/2 گرم ناینهیدرین + 60 میلیلیتر گلایسیالاستیکاسید + 40 میلیلیتر فسفریکاسید 6 مولار) به آن افزوده شد. نمونهها به مدت 1 ساعت در بنماری 100 درجه سانتیگراد قرارگرفتند و بلافاصله به مدت 10 دقیقه در یخ قرار داده شدند تا واکنش خاتمه یابد. به هر یک از نمونهها 4 میلیلیتر تولوئن اضافه شد و به مدت 30 ثانیه تکان داده شدند تا پرولین وارد فاز تولوئن گردد. محلول صورتی رنگ قسمت بالایی برای قرائت جذب نمونهها در طول موج 520 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر مورد استفاده قرار گرفت و با مقایسه جذب نمونهها با منحنی جذب استاندارد پرولین، غلضت پرولین نمونهها بر حسب میکرومول بر گرم وزن تر محاسبه گردید.
عصارهگیری برای اندازهگیری میزان فنل و فلاونوئید کل: جهت سنجش میزان فنل و فلاونوئید کل، ۳/۰ گرم از بافت برگ پس از توزین در ۳ میلیلیتر حلال (۳۵ میلیلیتر استون خالص، ۳۵ میلیلیتر متانول ۸۵ درصد، ۳۰ میلیلیتر آب مقطر و ۱ میلیلیتر اسیدفرمیک یا استیکاسید) کوبیده شد و سپس ۳۰ دقیقه بر روی شیکر ۱۱۰ دور در دقیقه با دمای ۲۵ درجه سانتیگراد در تاریکی قرار گرفت و در انتها عصاره به دست آمده در دمای ۴ درجه سانتیگراد با ۵۰۰۰ دور در دقیقه و به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ گردید.
فنل کل: اندازهگیری غلظت فنل کل با استفاده از روش فولینسیکالتو انجام شد (60). مقدار 5/1 میلیلیتر فولین 10 درصد به 3/0 میلیلیتر عصاره برگ اضافه شد و پس از 5 دقیقه، ۲/۱ میلیلیتر کربناتسدیم ۷ درصد نیز به آن اضافه شد. نمونهها به مدت ۹۰ دقیقه روی شیکر با ۱۱۰ دور در دقیقه در دمای اتاق و در تاریکی قرار گرفتند و در انتها ۶ میلیلیتر آب مقطر به آنها اضافه شد. در نهایت با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر میزان جذب نور نمونهها در طول موج ۷۶۵ نانومتر قرائت گردید. با استفاده از منحنی استاندارد اسیدگالیک، فنل کل به صورت میلیگرم اسیدگالیک در ۱۰۰ گرم وزن تازه بدست آمد.
فلاونوئید کل: برای اندازهگیری غلظت فلاونوئید کل از روش لی و همکاران (42)، استفاده شد. بدینترتیب که جهت اندازهگیری فلاونوئید کل، ۲۷۵/۰ میلیلیتر از عصاره برگ با ۸۲۵ میکرولیتر آب مقطر به حجم ۱/۱ میلیلیتر رسانده شد سپس ۳/۰ میلیلیتر نیتریتسدیم ۵ درصد به محلول اضافه گردید. پس از سپری شدن مدت زمان ۵ دقیقه، ۶/۰ میلیلیتر کلریدآلومینیوم ۱۰ درصد به محلول اضافه شد و بعد از ۶ دقیقه ۲ میلیلیتر هیدروکسیدسدیم (سود) ۱ مولار بهمراه یک میلیلیتر آب مقطر به محلول اضافه گردید و شدت جذب محلول در طول موج ۵۱۰ نانومتر با اسپکتروفتومتر در مقابل بلانک آب مقطر قرائت شد. برای محاسبه غلظت فلاونوئید کل، میزان جذب نمونهها با منحنی جذب استاندارد روتین (کوئرستین ۳-روتینوزید) مقایسه شد و غلظت فلاونوئید کل در برگ بر حسب میکروگرم روتین در ۱۰۰ گرم وزن تر بیان شد.
تجزیه و تحلیل آماری: تجزیه و تحلیل آماری دادهها توسط نرمافزار آماری SAS نسخه 9.1 و مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون چند دامنهای دانکن در سطح 5% صورت پذیرفت.
نتایج
نشت یونی: نتایج پژوهش حاضر نشان داد که تیمار ملاتونین تاثیر معنیداری در سطح 1 درصد بر کاهش نشت یونی در گیاهان توتفرنگی تحت تنش یخزدگی نسبت به گیاهان شاهد داشت (جدول 1). تنش سرما به طور کلی باعث افزایش نشت یونی در گیاه میگردد و تیمار ملاتونین در آزمایش حاضر این نشت را به میزان قابلتوجهی کاهش داد. به طوریکه میانگین آن از 52/36 درصد در گیاهان شاهد به 52/22 درصد در گیاهان تیمار شده با ملاتونین تحت تنش یخزدگی کاهش یافت (جدول 2).
محتوای نسبی آب: در پژوهش حاضر با وجود اینکه محتوای نسبی آب در گیاهان تیمار شده با ملاتونین 75/6 درصد نسبت به گیاهان تیمار نشده تحت تنش یخزدگی بیشتر بود، اما این تفاوت به لحاظ آماری معنیدار نبود (جدولهای 1 و 2).
مالوندیآلدئید: در پژوهش حاضر بین گیاهان تیمار شده با ملاتونین و گیاهان شاهد تحت تنش یخزدگی تفاوت معنیداری به لحاظ آماری در میزان مالوندیآلدئید مشاهده نشد، هرچند میانگین مقدار آن در گیاهان تیمار شده، کاهشی در حدود 6 درصد نشان داد (جدولهای 1 و 2).
پراکسیدهیدروژن: در پژوهش حاضر تاثیر ملاتونین بر میزان پراکسیدهیدروژن در گیاهان تیمار شده نسبت به گیاهان شاهد در شرایط تنش سرما در سطح 5 درصد معنیدار و موجب کاهش میانگین آن در گیاهان تیمار شده با ملاتونین شد (جدول 1). میانگین این مقدار در گیاهان تیمار شده با ملاتونین برابر با 26/62 و در گیاهان شاهد برابر با15/121 میلیگرم بر گرم بود (جدول 2).
پرولین: غلظت پرولین آزاد در دماهای پایین افزایش مییابد و میتواند به عنوان شاخص تنش در گیاهانی که در معرض تنش قرار گرفتهاند، مورد استفاده قرار گیرد. نتایج پژوهش حاضر نشان داد که ملاتونین موجب افزایش میزان پرولین در گیاهان تیمار شده نسبت به گیاهان شاهد، تحت تنش یخزدگی شد و این افزایش در سطح 1 درصد معنیدار بود (جدول 1). میانگین مقدار پرولین از 02/12 میکرومول بر گرم در گیاهان شاهد به 6/23 میکرومول بر گرم در گیاهان تیمار شده با ملاتونین تحت تنش یخزدگی افزایش یافت (جدول 2).
جدول 1- نتایج تجزیه واریانس اثر ملاتونین بر میزان نشت یونی، محتوای نسبی آب، مالوندیآلدئید، پراکسیدهیدروژن و پرولین در شرایط تنش یخزدگی
|
میانگین مربعات |
درجه آزادی |
منابع تغییر |
||||
|
پرولین |
پراکسیدهیدروژن |
مالوندیآلدئید |
محتوای نسبی آب |
نشت یونی |
||
|
**797/200 |
*46/5201 |
013/0ns |
148/46ns |
**86/293 |
1 |
ملاتونین |
|
97/7 |
39/647 |
0147/0 |
27/198 |
83/1 |
4 |
خطای آزمایشی |
|
85/15 |
74/27 |
74/8 |
56/16 |
58/4 |
|
ضریب تغییر (درصد) |
ns، *، و ** بترتیب بیمعنی و معنیدار در سطح 01/0 و 05/0
جدول 2- مقایسه میانگین اثر ملاتونین بر میزان نشت یونی، محتوای نسبی آب، مالوندیآلدئید، پراکسیدهیدروژن و پرولین در شرایط تنش یخزدگی
|
پرولین (μmol/g) |
پراکسیدهیدروژن (nmol/g) |
مالوندیآلدئید (μmol/g) |
محتوای نسبی آب (%) |
نشت یونی (%) |
تیمار |
|
b 7/0 ±026/12 |
a65/15 ±15/121 |
a15/0 ±43/1 |
a78/16 ±22/82 |
a55/1 ±52/36 |
شاهد |
|
a 93/3 ±6/23 |
b4/32 b±26/62 |
a08/0 ±34/1 |
a72/10 ±77/87 |
b11/1 ±52/22 |
ملاتونین |
حروف همسان در هر ستون نشاندهنده نبود اختلاف معنیدار در سطح احتمال 5 درصد بر پایه آزمون چند دامنهای دانکن میباشد.
شاخص کلروفیل: در پژوهش حاضر تحت تأثیر تنش یخزدگی تفاوت معنیداری در میزان شاخص کلروفیل بین گیاهان تیمار شده با ملاتونین و گیاهان شاهد مشاهده شد و این تفاوت در سطح 1 درصد معنیدار بود (جدول 3). در گیاهان شاهد، تحت تنش یخزدگی شاخص کلروفیل میانگین 67/46 و در گیاهان تیمار شده با ملاتونین میانگین 03/59 را نشان داد (جدول 4).
کربوهیدرات محلول: در پژوهش حاضر تاثیر ملاتونین بر میزان کربوهیدرات محلول در گیاهان تیمار شده نسبت به گیاهان شاهد در شرایط تنش یخزدگی، در سطح 1 درصد معنیدار بود (جدول 3). تحت تنش سرما مقدار کربوهیدرات محلول در گیاهان تیمار شده با ملاتونین نسبت به گیاهان شاهد افزایش قابل ملاحظهای نشان داد. میانگین این مقدار در گیاهان شاهد برابر با 06/58 و در گیاهان تیمار شده با ملاتونین برابر با 77/84 میلیگرم بر گرم بود (جدول 4).
فنل کل: نتایج پژوهش حاضر نشان داد که ملاتونین تأثیر معنیداری به لحاظ آماری بر میزان فنل کل موجود در گیاهان تحت تنش یخزدگی نداشت هرچند میزان میانگین فنل کل در گیاهان تیمار شده با ملاتونین، 8/25 درصد بیشتر از گیاهان تیمار نشده بود (جدولهای 3 و 4).
فلاونوئید کل: در پژوهش حاضر استفاده از تیمار ملاتونین تأثیری معنیداری بر میزان فلاونوئید کل در برگهای گیاهان در سطح 1 درصد داشت (جدول 3). تحت تأثیر ملاتونین میانگین میزان فلاونوئید کل از 29/0 میلیگرم در گرم در گیاهان شاهد به 54/0 میلیگرم در گرم در گیاهان تیمار شده با ملاتونین افزایش یافت (جدول 4).
جدول 3- نتایج تجزیه واریانس اثر ملاتونین بر میزان شاخص کلروفیل، کربوهیدرات محلول، فنل کل، فلاونوئید کل در شرایط تنش یخزدگی
|
میانگین مربعات |
درجه آزادی |
منابع تغییر |
|||
|
فلاونوئید کل |
فنل کل |
کربوهیدرات محلول |
شاخص کلروفیل |
||
|
**0897/0 |
784/0ns |
**136/1070 |
**4/229 |
1 |
ملاتونین |
|
0014/0 |
3/0 |
75/19 |
75/8 |
4 |
خطای آزمایشی |
|
1/9 |
28/17 |
22/6 |
59/5 |
|
ضریب تغییر(درصد) |
ns، *، و ** بترتیب بیمعنی و معنیدار در سطح 01/0 و 05/0
جدول 4- مقایسه میانگین اثر ملاتونین بر میزان شاخص کلروفیل، کربوهیدرات محلول، فنل کل، فلاونوئید کل در شرایط تنش یخزدگی
|
فلاونوئید کل (mg/g) |
فنل کل (mg/g) |
کربوهیدرات محلول (mg/g) |
شاخص کلروفیل |
تیمار |
|
b04/0 ±29/0 |
a38/0 ±83/2 |
b02/1 ±06/58 |
b2/3 ±67/46 |
شاهد |
|
a03/0 ±54/0 |
a68/0 ±56/3 |
a2/6 ±77/84 |
a68/2 ±03/59 |
ملاتونین |
حروف همسان در هر ستون نشاندهنده نبود اختلاف معنیدار در سطح احتمال 5 درصد بر پایه آزمون چند دامنهای دانکن میباشد.
بحث و نتیجهگیری
تنشهای غیرزیستی به میزان قابلتوجهی از طریق مکانیسمهای مختلف مهار رشد، سبب کاهش عملکرد محصولات میشوند. تنش سرما یکی از مهمترین تنشهای غیرزیستی است که منجر به کاهش رشد گیاهان و اختلال در عملکرد آنها میگردد (44). توتفرنگی تجاری (Fragaria × ananassa Duch) یکی از مهمترین میوههای دانهریز در جهان میباشد که در مناطق معتدله در معرض آسیب یخزدگی در زمستان و سرمازدگی در بهار بوده و این تنشها از عوامل محدودهکننده میزان محصول آن به شمار میروند (32و 56). بنابراین جستجوی روشی موثر برای کاهش خسارت تنش سرما در این گیاه دارای اهمیت میباشد. اخیراً ثابت شده است که ملاتونین میتواند در محافظت از گیاهان در برابر تنشهای غیرزیستی نقش داشته باشد (64، 65 و 76). کاربرد این هورمون در توتفرنگی رقم پاروس تحت تنش سرما و بررسی برخی صفات مرتبط با تنش سرما در برگهای گیاه، نشان داد که کاربرد این هورمون میتواند راهکاری موثر در جهت کاهش آسیبهای ناشی از این تنش و افزایش تحمل سرما در گیاه باشد. این تیمار سبب بهبود صفات مختلفی در گیاه از جمله کاهش میزان نشت یونی شد. محل اولیه آسیب تنش سرما، غشاء سلولی میباشد. میزان آسیب به غشاء را میتوان با اندازهگیری میزان نشت یونی سنجید. به طور کلی تنش سرما باعث افزایش نفوذپذیری غشاء و سپس منجر به نشت یونی به خارج سلول میگردد (28). نفوذپذیری غشاء اغلب به عنوان یک شاخص فیزیولوژیکی مهم برای مقاومت گیاهان به تنش سرما مورد استفاده قرار میگیرد. میزان نشت یونی با تحمل به تنش گیاهان رابطه معکوس دارد (21). در پژوهش حاضر تأثیر تیمار ملاتونین بر نشت یونی به لحاظ آماری در سطح 1 درصد معنیدار بوده (جدول 1) و سبب کاهش نشت یونی در گیاهانی که تحت تنش یخزدگی قرار گرفته بودند به میزان 33/38 درصد شد (جدول 2). نتایج پژوهش حاضر با اثر مشاهده شده ملاتونین بر کاهش نشت یونی پس از تنش سرما در دانهالهای خیار (75)، هندوانه (39) و گوجهفرنگی (13) مطابقت دارد. به نظر میرسد ملاتونین از طریق کاهش تنش اکسیداتیو سبب حفظ یکپارچگی غشاء شده و سبب پایداری آن پس از تنش یخزدگی میگردد (13). از دیگر اثرات تنشهای غیرزیستی از جمله تنش سرما در گیاهان کم آبی سلولها و دهیدراته شدن سلولها میباشد که در نتیجه تشکیل یخ در فضای آپوپلاستی سلولها و متعاقباً انتقال آب داخل سلولها به فضای آپوپلاستی ایجاد میشود (50). تجمع ترکیبهای فعال اسمزی در سلولها، راه اصلی مقاومت در برابر از دست دادن آب و دهیدراته شدن سلولها است. در پژوهش حاضر تفاوت معنیداری در محتوای نسبی آب بین گیاهان شاهد و گیاهان تیمار شده با ملاتونین تحت تنش یخزدگی مشاهده نشد، گرچه افزایشی 75/6 درصدی در گیاهان تیمار شده نسبت به گیاهان شاهد مشاهده شد (جدولهای 1 و 2). احتمالاً در تنشی دیگر مانند تنش خشکی این نتیجه متفاوت میبود، همانطور که در برخی تحقیقات تاثیر مثبت ملاتونین بر افزایش محتوای نسبی آب در تنش خشکی اثبات شده است (3 و 27). فاکتور دیگری که معمولاً سنجش آن در بررسی میزان آسیبهای ناشی از تنش در گیاهان مد نظر قرار میگیرد میزان مالوندیآلدئید میباشد که محتوای آن در بافتهای گیاهی تحت تأثیر تنش میگیرد. مالوندیآلدئید در اثر پراکسید شدن اسیدهای چرب غیراشباع ایجاد میگردد. پراکسید شدن اسیدهای چرب غیراشباع که در اثر تنشهای مختلف در گیاهان رخ میدهد مالوندیآلدئید را هنگام تجزیه ایجاد میکند و در بسیاری از موارد مالوندیآلدئید فراوانترین محصول حاصل از تجزیه لیپید آلدئید است (14). اسیدهای چرب غیراشباع که اجزاء اصلی غشاءهای زیستی هستند، در پاسخ به تنش اکسیداتیو به راحتی پراکسید میشوند. تعیین مقدار این هیدروپراکسیدهای چربی اولیه به دلیل بیثباتی و واکنشپذیری آنها مشکل است. بنابراین، میزان پراکسیداسیون لیپیدی معمولاً با اندازهگیری غلظت محصولات ثانویه تجزیه حاصل از این هیدروپراکسیدهای اولیه برآورد میشود. مالوندیآلدئید یکی از رایجترین آلدئیدها میباشد که از تخریب اکسیداتیو اسیدهای چرب غیراشباع با بیش از 2 پیوند دوگانه متیلن منقطع، ایجاد میشود (15). اسیدهای چرب غیراشباع سهگانه، موجب سیالیت بالای غشاها شده اما به دلیل حساسیت زیاد به اکسیداسیون به راحتی پراکسید میشوند (47). به طورکلی اعتقاد براین است که محصول اصلی پراکسیداسیون یعنی مالوندیآلدئید، منجر به عوارض جانبی در گیاهان میشود، بنابراین مالوندیآلدئید آزاد به عنوان نشانگری برای تنش اکسیداتیو در گیاهان تحت تنش تعیین شده است (73). در مطالعاتی نشان داده شد که تحت تنشهای خشکی، شوری و سرما، پیشتیمار ملاتونین تأثیر معنیداری بر میزان مالوندیآلدئید در گیاهان برموداگراس (58) و چای (40) داشته و میزان آن در گیاهان تیمار شده با ملاتونین نسبت به گیاهان شاهد کاهش قابل ملاحظهای نشان داده است. گرچه در پژوهش حاضر نیز مقدار مالوندیآلدئید در گیاهان تیمار شده با ملاتونین در تنش یخزدگی، کاهشی 3/6 درصدی نسبت به گیاهانی که تیمار ملاتونین را دریافت نکرده بودند نشان داد اما این کاهش و اختلاف به لحاظ آماری معنیدار نبود (جدولهای 1و 2). پراکسیدهیدروژن شاخصی مهم دیگری در بررسی تنشهای غیرزیستی است (40). پراکسیدهیدروژن محصول کاهش دو الکترون از O2 است و به طور بالقوه اکسیژن فعال است که میتواند نقش دوگانه مفید و مضر را در گیاهان داشته باشد (23). در مقایسه با سوپراکسیداز (O2•-) و مطمئناً در مقایسه با رادیکال هیدروکسیل(OH•) ، H2O2 نسبتاً بیضرر است زیرا در غیاب فلزات واسطه، پراکسیدهیدروژن ثابت و غیرفعال است، حتی در غلظتهای خیلی بیشتر از آنچه یک سیستم بیولوژیکی همیشه تولید میکند. از نظر عملکردی، این مسئله به آن تحرک بیشتری در بین بافتها میبخشد و به طور بالقوه نه تنها به عنوان یک سوبسترا در انواع واکنشها بلکه به عنوان یک مولکول برای سیگنالینگ مربوط به گونههای فعال اکسیژن هم سودمند است. با اینحال پراکسیدهیدروژن به طور بالقوه کاملاً با مولکولهای حاوی Fe2+ یا فلزات واسطه از طریق واکنش فنتون واکنشپذیر است (10). نتیجه این واکنش همولیز H2O2 به 2،•OH بوده و سمیت پراکسیدهیدروژن اغلب با این عمل آن همراه است (29). برخی مطالعات اثبات کردهاند که ملاتونین میتواند تأثیر مثبتی بر کاهش میزان پراکسیدهیدروژن در شرایط تنش داشته باشد. بررسی مقدار پراکسیدهیدروژن در پژوهش حاضر نشان داد که ملاتونین تأثیری معنیدار در سطح 5 درصد بر مقدار پراکسیدهیدروژن در گیاهان تحت تنش یخزدگی داشته است. تیمار ملاتونین سبب کاهش 6/48 درصدی مقدار پراکسیدهیدروژن در گیاهان تحت تنش یخزدگی شد (جدولهای 1 و 2). نتایج حاصل از پژوهش حاضر با نتایج سایر پژوهشگران از جمله لی و همکاران که نشان دادند در گیاه چای ملاتونین بیرونی فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی را افزایش داده و بنابراین مقدار پراکسیدهیدروژن را در طول تنش سرما در گیاه در سطح پایینی نگه میدارد (40)، همچنین دینگ و همکاران که نشان دادند پس از تنش سرما گیاهان گوجهفرنگی تیمار شده با ملاتونین سطح بسیار پایینتری از پراکسیدهیدروژن و آنیون سوپراکسید را در مقایسه با گیاهان بدون تیمار ملاتونین را داشتند (13) مطابقت دارد. همچنین در پژوهشی دیگر نشان داده شد که استفاده از ملاتونین خارجی قبل از تنش سرما، به طور قابلتوجهی از افزایش محتوای پراکسیدهیدروژن در گیاه چای در تنش سرما جلوگیری میکند (41). گیاهان با تجمع پرولین که منجر به تنظیم اسمزی بهتر در سلول ها می شود، از بافت های خود در برابر آسیب دمای پایین محافظت می کنند (28). پرولین یکی از گستردهترین املاح سازگاری است که در شرایط نامساعد محیطی در گیاهان تجمع مییابد و نقش مهمی در مقاومت گیاهان در برابر تنش ایفا میکند. در بسیاری از گیاهان، پرولین آزاد در پاسخ به طیف وسیعی از تنشهای زیستی و غیرزیستی تجمع مییابد. پرولین علاوه بر این که به عنوان یک اسمولیت عالی عمل میکند، در هنگام تنش نقشهای مهمی مانند کلاتکننده فلز، مولکول دفاعی آنتیاکسیدانی و مولکول سیگنالینگ را ایفا میکند. پرولین با تعدیل عملکردهای میتوکندریایی موجب مقاومت به تنش میشود، تکثیر سلولی را تحت تأثیر قرار میدهد، بیان ژنهای خاص را تحریک و غشاءها را تثبیت میکند، بنابراین از نشت یونی جلوگیری نموده و با قرار دادن غلظت گونههای فعال اکسیژن در محدوده طبیعی منجر به بهبود تحمل تنش میشود (34). همچنین ظرفیت نگهداری آب سلولها و پایداری بیولوژیکی ماکرومولکولها با پرولین افزایش مییابد، بنابراین تجمع پرولین با بهبود مقاومت به سرما همبستگی دارد (28). در پژوهش حاضر تیمار بوتههای توتفرنگی با ملاتونین سبب افزایش معنیدار در سطح 1 درصد در غلظت پرولین شد (جدول 1). نتایج مشابهی نیز پس از تیمار ملاتونین درگوجهفرنگی (13)، برموداگراس (16) و لوبیا (62) گزارش شده است. نتایج پژوهش حاضر نشان میدهد که بمنظور افزایش پرولین در شرایط تنش سرما، تیمار ملاتونین میتواند روشی موثر باشد. دراین پژوهش تیمار ملاتونین سبب افزایش 23/96 درصدی مقدار پرولین در گیاهان تیمار شده با ملاتونین شد (جدول 2). کاهش فتوسنتز ناشی از دمای پایین، پاسخی کاملاً شناخته شده در گیاهان حساس به سرما میباشد. گزارش شده است که کلروفیل a و b در گیاهان، تحت شرایط تنش سرما کاهش مییابند (72). به طور کلی تنش دمای پایین میتواند بر میزان فتوسنتز گیاه تأثیر بگذارد و باعث کاهش استفاده از نور گردد (69). کاهش میزان کلروفیل در شرایط تنش در گیاهان به عنوان شاخص مستقیم آسیب در نظر گرفته میشود و برای تعیین آسیب ناشی از تنش مورد استفاده قرار میگیرد (40). کلروفیل یک مولکول زیستی بسیار مهم و حیاتی در فتوسنتز با عملکرد جذب نور و تبدیل انرژی نور است (71). کلروفیلهای a و b موجود در برگهای گیاهان عالی، رنگدانههای اصلی فتوسنتز در کلروپلاست هستند و عملکرد مهمی در جذب و بهرهبرداری از انرژی نور دارند، در نتیجه بر کارایی فتوسنتز تأثیر میگذارند. هر دو کلروفیل در اثر تنش اکسیداتیو که یکی از پیامدهای ناشی از تنشهای محیطی از جمله تنش سرما است، تخریب میشوند (33). در پژوهشهایی، استفاده از ملاتونین سبب حفظ کلروفیلهای a و b و جلوگیری از کاهش کلروفیل در شرایط تنش دمای پایین در گیاهان چای (40) و برنج (31) شد. نتایج پژوهش حاضر نیز نتایج سایر پژوهشگران را تائید مینماید. در پژوهش حاضر تاثیر ملاتونین بر میزان شاخص کلروفیل در سطح 1 درصد معنیدار بوده (جدول 3) و مشاهده شد که در گیاهانی که تیمار ملاتونین دریافت کرده بودند پس از تنش یخزدگی، میانگین شاخص کلروفیل، 48/26 بیشتر از گیاهانی بود که این تیمار را دریافت نکرده بودند (جدول 4). تجمع ترکیبات فعال اسمزی در سلولها راه اصلی مقاومت در برابر از دست دادن آب است. تجمع اسمولیتها پتانسیل اسمزی سلول را کاهش میدهد، که این امر موجب افزایش ظرفیت تجمع آب میشود و از نگهداری آب در سلول حمایت میکند (70). کربوهیدراتهای غیرساختاری مانند هگزوزها (گلوکز و فروکتوز)، دیساکاریدها (ساکارز، ترهالوز) و الیگوساکاریدها (رافینوز، استاکیوز) از جمله مهمترین اسمولیتهای سازگار هستند (37). تغییر در ترکیب و سیالیت غشاء در اثر سرما، باعث تجمع محافظهای اسمزی مختلف میشود که منجر به کاهش آسیب اکسیداتیو میگردد (11). گزارشهای قبلی نشان دادهاند که دمای پایین باعث افزایش قندهای محلول در برگ گیاهان مختلف میشود (1 و 2). حرکت آب مایع به خارج از سلولها و افزایش غلظت اسمزی داخل سلولها از یخزدگی داخل سلول جلوگیری میکند (5). میزان جذب کربن و نسبت Fv/Fm به طور قابلتوجهی در تنش سرما کاهش مییابد. با این حال نشان داده شده است که این پارامترها هر دو در گیاه گوجهفرنگی با استفاده از تیمار ملاتونین به میزان کمتری کاهش یافتند و در واقع تیمار ملاتونین باعث افزایش ظرفیت فتوسنتزی در گیاهان تحت تنش سرما شد (13). در آزمایشی بر روی گیاه برموداگراس کربوهیدراتهایی مانند فروکتوز، گالاکتوز، گلوکز و ساکارز که از اجزای اساسی برای سازگاری اسمزی در پاسخ به تنشهای غیرزیستی هستند با تیمار ملاتونین نسبت به گیاهان شاهد افزایش نشان دادند (16). این نشان میدهد که ملاتونین ممکن است در تنظیم سنتز این متابولیتها برای بهبود مقاومت به سرما نقش داشته باشد. در پژوهشی دیگر پیشتیمار ملاتونین باعث افزایش تجمع ساکارز در گیاهان گوجهفرنگی تحت تنش سرما شد، با این حال مقدار نشاسته را کمی کاهش داد (13). نتایج پژوهشی دیگر نشان داده است که ملاتونین در شرایط تنش با افزایش فعالیت SBPase که یک آنزیم کلیدی در چرخه کالوین است به افزایش میزان کربن کمک میکند (13). نتایج پژوهش حاضر نیز نتایج سایر پژوهشگران را تایید نموده و نشان میدهد که تیمار ملاتونین میتواند مقدار کربوهیدرات محلول را در گیاهان تیمار شده با ملاتونین افزایش دهد. در رابطه با تاثیر تیمار ملاتونین بر مقدار کربوهیدرات محلول، در پژوهش حاضر مشاهده شد که ملاتونین تاثیری معنیدار در سطح 1 درصد بر مقدار کربوهیدرات داشته است (جدول 3). میانگین مقدار کربوهیدرات محلول در گیاهانی که با ملاتونین تیمار شده بودند 46 درصد نسبت به گیاهانی که این تیمار را دریافت نکرده بودند بیشتر بود (جدول 4). در مواجهه با تنشهای غیرزیستی از جمله تنش سرما، توانایی سنتز ترکیبات فنولی به گیاهان اجازه میدهد تا با چالشهای محیطی که دائماً در حال تغییر هستند کنار بیایند. تنشهای محیطی میتوانند منجر به افزایش تولید رادیکالهای آزاد و سایر گونههای اکسیداتیو در گیاهان شوند. فنولیکهای گیاهی نقشی کلیدی در ترکیبات دفاعی گیاهان دارند. مشاهده شده است که دمای پایین (اما نه یخزدگی) موجب افزایش متابولیسم فنولیکها در گیاهان میشود. تجزیه و تحلیل محتوای اسیدهای فنلی در طول تنش میتواند یکی از راههای تشخیص میزان مقاومت گیاه به یک عامل تنشزا باشد. بسیاری از پژوهشگران گزارش کردهاند که تنشهای غیرزیستی باعث افزایش سنتز ترکیبات فنلی در بافتهای گیاهی میشوند (67). متابولیسم ترکیبات فنلی در دمای پایین بحرانی تحریک میشود، یعنی دمای آستانهای که در آن آسیب ناشی از سرمازدگی نیز ایجاد میشود (30). تنش سرما باعث افزایش تولید ترکیبات فنلی در دیواره سلولی به صورت سوبرین یا لیگنین میشود (20). منصوری و همکاران (48)، نشان دادند که پیشتیمار ملاتونین علاوه بر بهبود کیفیت حسی میوه توتفرنگی، تجمع فنل در میوههای تیمار شده را در مقایسه با میوههای شاهد افزایش میدهد. در مطالعهای نشان داده شده است که گندمهایی که تحت تیمار ملاتونین قرار گرفتهاند قادر به حفظ محتوای ماده فنلی بیشتری در شرایط تنش سرما هستند (64). فنولها گروه بزرگی از ترکیبات را تشکیل میدهند که ممکن است به پنج زیرگروه تقسیم شوند: کومارینها، لیگنینها، فلاونوئیدها، اسیدهای فنولی و تاننها (22). در پژوهش حاضر ما شاهد افزایش 8/25 درصدی مقدار فنل کل در گیاهان تیمار شده با ملاتونین در برابر گیاهان شاهد، تحت تنش یخزدگی بودیم، گرچه این افزایش به لحاظ آماری معنیدار نبود (جدولهای 3 و 4). در این پژوهش از بین اجراء فنلها، میزان فلاونوئید کل مورد بررسی قرار گرفته و مشاهده شد که میزان فلاونوئید کل، افزایش قابلتوجهی در گیاهان تیمار شده با ملاتونین نسبت به گیاهان تیمار نشده، تحت تنش یخزدگی نشان داده است اما همانطور که ذکر شد تغییر معنیداری در میزان فنل کل در این آزمایش مشاهده نشد. در سنتز فنلها مسیرها و اجزای بسیار متنوعی وجود دارد و این احتمال وجود دارد که علیرغم افزایش میزان فلاونوئید، در سایر ترکیبات فنلی کاهش رخ داده باشد و برآیند این کاهش و افزایش موجب عدم تغییر معنیدار در میزان فنل کل شده باشد. میانگین میزان فلاونوئید در پژوهش حاضر افزایشی 2/86 درصدی در گیاهان تیمار شده با ملاتونین نسبت به گیاهان شاهد، تحت تنش یخزدگی نشان داد و این افزایش در سطح 1 درصد معنیدار بود (جدولهای 3 و 4). فلاونوئیدها گروه بزرگی از متابولیتهای ثانویه هستند. شواهدی وجود دارد که نشان میدهد فلاونوئیدها دارای عملکرد آنتیاکسیدانی هستند (24و 55). فلاونوئیدها یکی از مهمترین آنتیاکسیدانهای غیرآنزیمی تولید شده در گیاهان تحت تنش هستند و در جلوگیری از تولید گونههای فعال اکسیژن نقش داشته و باعث کاهش مقدار آنها میشوند (34). بیوسنتز فلاونوئیدهای آنتیاکسیدان در گونههای حساس به تنش بیشتر از گونههای مقاوم افزایش مییابد (68). شرایط تنشی شدید ممکن است آنتیاکسیدانهای آنزیمی را غیرفعال کند، در حالی که بیوسنتز فلاونوئیدها را به میزان بالایی تنظیم کند (18). بنابراین، فعالیت فلاونوئیدها ممکن است یک سیستم آنتیاکسیدانی ثانویه باشد که در نتیجه کاهش فعالیت آنتیاکسیدانهای آنزیمی فعال میشود (18). در شرایط یخزدگی، مقدار زیادی آب از داخل سلول به کریستال یخ بین سلولی منتقل میشود، در این شرایط انتظار میرود که فلاونوئیدها به شدت به فاز لیپیدی غشاء سلولی اختصاص داده شده و موجب تثبیت آنها شوند (36). نشان داده شده است که استفاده از ملاتونین بیرونی بیوسنتز فلاونوئیدها را در گیاهان افزایش میدهد (43). در پژوهش حاضر نیز مشاهده شد که تحت تنش سرما گیاهان تیمار شده با ملاتونین محتوای فلاونوئید بیشتری را نسبت به گیاهان شاهد که تیماری دریافت نکرده بودند، داشتند. بنابراین احتمالاً ملاتونین نقش موثری در افزایش محتوای فلاونوئیدها دارد.
نتیجهگیری کلی
در چند سال گذشته پیشرفتهای چشمگیری در رابطه با اثرات ملاتونین در گیاهان بدست آمده است. این پیشرفتها، دانش وجود، متابولیسم و عملکرد ملاتونین در گیاهان را گسترش داده است. تا به امروز انبوهی از پژوهشها نشان دادهاندکه ملاتونین نقش اساسی در بهبود تحمل گیاهان به تنشهای زیستی و غیرزیستی دارد. غلظت ملاتونین درونزا در گیاهان تحت شرایط تنشی مختلف افزایش مییابد و این بدان معنی است که ملاتونین در تنظیم تحمل تنش در گونههای مختلف گیاهی نقش دارد. نتایج پژوهش حاضر که تاثیر کاربرد خارجی هورمون ملاتونین بر برخی صفات فیزیولوژیکی مرتبط با تنش سرما را در برگهای گیاه توتفرنگی مورد بررسی قرار داد، تایید مینماید که ملاتونین خارجی میتواند تأثیری مثبت بر برخی از این صفات در گیاه داشته باشد و احتمالاً موجب افزایش تحمل گیاهان نسبت به تنش سرما شود.
مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)