بررسی تاثیر کیتوزان بر بیان ژن ZmPIP گیاه کلزا (.Brassica napus L) تحت تنش شوری

مختاری, حدیث; رنجبر, منیره; احدی, علی محمد

doi:10.22034/jpr.2023.2172

بررسی تاثیر کیتوزان بر بیان ژن ZmPIP گیاه کلزا (.Brassica napus L) تحت تنش شوری

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

حدیث مختاری ¹

منیره رنجبر ²

علی محمد احدی ³

¹ گروه زیست شناسی دانشگاه آزاد واحد فلاورجان

² گروه علوم زیستی دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان اصفهان ایران

³ گروه ژنتیک دانشگاه شهرکرد

10.22034/jpr.2023.2172

چکیده

هدف از این مطالعه بررسی تاثیر کیتوزان روی بیان ژن ZmPIP، پارامترهای رشدی و ویژگی های فیزیولوژیکی گیاه کلزا تحت تنش شوری بود که در آزمایشی به صورت فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار انجام شد. بدین منظورگیاهچه های کلزا تحت تیمار های شوری (0، 50، 100و 150 میلی مولار)، سطوح مختلف کیتوزان (0، 5 و 10 میلی گرم در لیتر) قرار گرفتند. بیان ژن ZmPIP با استفاده از روش Real Time PCR، درصد و سرعت جوانه زنی، طول و وزن تر و خشک ریشه و بخش هوایی، محتوای نسبی آب برگ، نشت الکترولیت ها و میزان عناصر سدیم و پتاسیم مورد بررسی قرار گرفت.در تنش شوری، تیمار با کیتوزان باعث افزایش بیان ژن ZmPIP شده بطوری که بیشترین میزان بیان ژن در غلظت 50 و 100 میلی مولار شوری همراه با 5 میلی گرم در لیتر کیتوزان دیده شد. درصد و سرعت جوانه زنی، طول و وزن تر و خشک ریشه و بخش هوایی، محتوای نسبی آب برگ و میزان عنصر پتاسیم در گیاهان تحت تیمار شوری بخصوص در غلظتهای 100 و 150 میلی مولار همراه با کیتوزان نسبت به تیمار شوری در همان غلظت افزایش یافته و نشت الکترولیت و محتوای نسبی اب و میزان سدیم کاهش یافت. احتمال می رود کیتوزان از طریق حفظ محتوای نسبی آب برگ، افزایش پتاسیم و رشد بخش هوایی و ریشه شرایط زیست گیاه را تحت تنش شوری بهبود بخشیده و اثرات منفی تنش در گیاه کلزا را کاهش داده و باعث افزایش مقاومت گیاه شود.

کلیدواژه‌ها

: بیان ژن

جوانه زنی

کلزا

محتوای آب

نشت الکترولیت

موضوعات

بیوتکنولوژی

عنوان مقاله English

The effect of chitosan on the expression of ZmPIP gene of rapeseed (Brassica napus L.) Under salinity stress

نویسندگان English

hadishadis mokhtari ¹

monireh ranjbar ²

ali mohhamad ahadi ³

¹ Department of biology,,Islamic Azad University

² biology department, islamic azad university, isfahan, iran

³ Department of Genetic, Shar e kord University

چکیده English

The aim of this study was to investigate the effect of chitosan on ZmPIP gene expression, growth parameters and physiological characteristics of rapeseed under salinity stress which was performed in a factorial experiment based on a completely randomized design with 3 replications. For this purpose, rapeseed seedlings was treated with different concentrations of salinity (0, 50, 100, 150 mM) and chitosan (0, 5, 10 mg/L). ZmPIP gene expression was evaluated using Real Time PCR, germination percentage and speed, length, fresh and dry weight of root and shoot, relative leaf water content, electrolyte leakage and sodium and potassium contents. In salinity stress, treatment with chitosan increased the expression of ZmPIP gene so that the highest gene expression was at 50 and 100 mM salinity with 5 mg / l chitosan. In treared plants with salinity increased percentage and germination rate, fresh and dry length and weight of root and shoot, relative leaf water content and potassium content especially at concentrations of 100 and 150 mM with chitosan compared to salinity at the same concentration and electrolyte leakage and relative water content and sodium content reduced. It is likely that chitosan has increased plant tolerance under salinity stress by maintaining the relative leaf water content, increasing potassium and growth of shoot and root and reduce the negative effects of stress on rapeseed and increase plant resistance

کلیدواژه‌ها English

Electrolyte leakage

Gene expression

Germination

Rapeseed

Water content

بررسی تأثیر کیتوزان بر بیان ژن PIP گیاه کلزا (.Brassica napus L)

تحت تنش شوری

حدیث مختاری¹، منیره رنجبر^1* و علی محمد احدی²

¹ ایران، اصفهان، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد فلاورجان، گروه زیست شناسی

² ایران، شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، دانشکده علوم، گروه ژنتیک

تاریخ دریافت: 03/07/1400 تاریخ پذیرش: 17/11/1400

چکیده

با توجه به افزایش املاح در خاکهای کشاورزی، گیاهان زراعی با تنش شوری مواجه می شوند. از طرفی کلزا گیاهی مهم از نظر صنایع روغن می باشد. لذا استفاده از موادی که بتوانند به گیاه جهت تحمل محیطهایی با املاح بالا کمک کنند ضروری بنظر می رسد. هدف از این مطالعه بررسی تأثیر کیتوزان روی بیان ژن PIP، پارامترهای رشدی و ویژگی های فیزیولوژیکی گیاه کلزا تحت تنش شوری بود که در آزمایشی به صورت فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار انجام شد. بدین منظورگیاهچه های کلزا تحت تیمار های شوری (0، 50، 100و 150 میلی مولار)، سطوح مختلف کیتوزان (0، 5 و 10 میلی گرم در لیتر) قرارگرفتند. بیان ژن PIP با استفاده از روش Real Time PCR تعیین شد. درصد و سرعت جوانه زنی، طول و وزن تر و خشک ریشه و بخش هوایی، محتوای نسبی آب برگ، نشت الکترولیت ها و میزان عناصر سدیم و پتاسیم مورد بررسی قرارگرفت .در تنش شوری، تیمار با کیتوزان باعث افزایش بیان ژن PIP شده بطوری که بیشترین میزان بیان ژن در غلظت 50 و 100 میلی مولار شوری همراه با 5 میلی گرم در لیتر کیتوزان دیده شد. اثر تیمار شوری توام با کیتوزان بر درصد و سرعت جوانه زنی در سطح یک درصد معنی دار بود. کیتوزان در تنش شوری باعث افزایش طول و وزن تر و خشک ریشه و بخش هوایی، محتوای نسبی آب برگ و میزان عنصر پتاسیم شد. بخصوص در غلظتهای 100 و 150 میلی مولار نمک همراه با کیتوزان نسبت به تیمار شوری در همان غلظت تأثیر مشخص تر بود. دراین تیمارها نشت الکترولیت و میزان سدیم کاهش یافت. احتمال می رود کیتوزان تحت تنش شوری و با تغییر بیان ژنها، از طریق حفظ محتوای نسبی آب برگ، افزایش پتاسیم و رشد بخش هوایی و ریشه شرایط زیست گیاه را بهبود بخشیده و باعث افزایش تحمل گیاه شده است.

واژه های کلیدی: بیان ژن، جوانه زنی، کلزا، محتوای آب، نشت الکترولیت

* نویسنده مسئول، پست الکترونیکی: ranjbar@iaufala.ac.ir

مقدمه

شوری یکی از مهمترین تنشهای غیرزیستی است که رشد گیاهان را تحت تأثیر قرار می‌دهد (27). تغییرات در رشد گیاه نتیجه تأثیر زیان‌آور شوری بر فرایندهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه می‌باشد که شامل سمیت یونی، تنش اسمزی و تنش اکسیداتیو می‌باشند. شوری باعث کاهش رشد ریشه، جوانه و کاهش عملکرد و در نهایت منجر به مرگ گیاه می‌شود. مهمترین واکنش گیاه به افزایش شوری خاک، توقف رشد رویشی گیاه و توسعه برگ می‌باشد (12). تنش شوری باعث یک سری تغییرات فیزیولوژیکی بیوشیمیایی در دانه می‌شود که می‌تواند جوانه‌زنی بذر را از طریق تنش اسمزی، سمیت یونی و تنش اکسیداتیو تحت تأثیر قرار دهد (41). تنش شوری رشد گیاه را از طریق سمیت یونی ناشی از تجمع نمک در برگ ها تحت تأثیر قرار می‌دهد. تعادل و تناسب درون سلولی یون های⁺K و ⁺Na برای فعالیت بسیاری از آنزیم‌های سیتوسولی، حفاظت از پتانسیل غشایی و نیز به‌عنوان یک تنظیم کننده اسمزی مناسب برای تنظیم حجم سلول بسیار مهم هستند (21). اثرات منفی شوری بر روی رشد گیاهان از طریق کاهش دسترسی گیاه به آب (تنش اسمزی یا خشکی)، کاهش جذب عناصر ضروری (عدم تعادل تغذیه‌ای) و تجمع بیش از حد یون‌ها ایجاد می‌شود (28). دانه‌های روغنی پس از غلات، دومین ذخایر غذایی جهان را تشکیل می‌دهند.کلزا یکی از مهمترین گیاهان دانه روغنی است که در سال‌های اخیر در ایران مورد توجه ویژه قرار گرفته است (33). کلزا با نام علمی Brassica napus L. ، گیاهی از خانواده تیره شب بو یا چلیپائیان (Brassicaceae) است. ویژگی‌های که کلزا را نسبت به سایر دانه‌های روغنی متمایز می‌کند صفات مطلوب زراعی (کیفیت بالای روغن دانه، مقادیر زیاد اسیدهای چرب اشباع نشده به خصوص اسید اولئیک و لنیولئیک)، تحمل به تنش‌های محیطی (سرما، کمبود آب، شوری)، عملکرد بیشتر در واحد سطح نسبت به دانه‌های روغنی مورد کشت در کشور است (3). یکی از روشهای کاهش اثرات منفی تنش‌ها استفاده از محرک‌ها با منشأ زیستی و غیرزیستی است که منجر به تغییرات فیزیولوژیکی در گیاهان شده و عملکرد و کیفیت آن‌ها را افزایش داده و باعث افزایش تحمل به عوامل نامساعد محیطی می‌شوند (41). از محرک‌های قارچی می‌توان به کیتین و کیتوزان اشاره کرد. مهدوی در سال 2013 به بررسی اثر کیتوزان و شوری بر جوانه‌زنی گیاه (Plantago ovata Forsk) پرداخت نتایج نشان داد شوری باعث کاهش درصد جوانه‌زنی، سرعت جوانه‌زنی در گیاه شده در حالی که کیتوزان درصد جوانه زنی و سرعت جوانه زنی افزایش داده است (30). تیمار گوجه فرنگی با کیتوزان طول ساقه، وزن خشک ساقه و محتوی نسبی آب را افزایش داده و در شرایط تنش شوری، تیمار کیتوزان موجب افزایش طول ریشه، وزن خشک ریشه شده است (44). همچنین تیمار کیتوزان موجب افزایش میزان پتاسیم و کاهش میزان سدیم ساقه هم در شرایط بدون تنش و هم تنش شده و میزان پتاسیم ریشه در گیاهان باقلا تیمار شده با کیتوزان نسبت به گیاهان شاهد افزایش یافته است (42). مطالعات موسی پور و همکاران (1395) در تأثیر کیتوزان بر روی گیاه شنبلیله (Trigonella foenum-graecum L.) تحت تنش شوری نشان داد که افزایش شدت تنش شوری باعث کاهش خصوصیات رشد، محتوای نسبی آب برگ شد. در حالی که کاربرد 5/0 گرم در لیتر کیتوزان موجب افزایش وزن خشک گیاه، طول ساقه و ریشه و محتوای نسبی آب برگ در شرایط تنش شوری، نسبت به شاهد گردید (4). Zhu و همکاران (2005) در بررسی های خود نشان دادند که شوری در غلظت 100 میلی مولار باعث القاء بیان ژن ZmPIP و درغلظتهای 150و 200 میلی مولار منجر به کاهش بیان ژن در ریشه های ذرت شده است (51). Zhangو همکاران (2018) بیان کردند که بیان بالای ATLOS5 میتواند رونوشت های (Zm) PIP1:1، (Zm)PIP1:5 و (Zm)PIP2:4 را تنظیم و هدایت هیدرولیک ریشه، شار یونی ریشه، جذب آب و حفظ میزان بالایی از سدیم و پتاسیم در گیاهان تراریخته تحت تنش شوری را بهبود بخشد. از آن جایی که کلزا یکی از دانه‌ های روغنی پرمصرف بوده و بیشتر خاک‌های مناطق مختلف ایران شور است بنابراین احتمال دارد استفاده از ترکیباتی همچون کیتوزان با تأثیر بر بیان برخی ژنها از جمله PIPبتواند اثرات شوری را کاهش داده و از کاهش محصول آن جلوگیری نماید (49). هدف از این تحقیق بررسی نقش حفاظتی کیتوزان بر جوانه زنی، رشد، روابط آبی و تعادل یونهای سدیم و پتاسیم در گیاه کلزا در محیطهایی با غلظت نمک بالا است.

مواد و روشها

کشت و تیماردهی: بذر هیبرید آلمان رقم روهان از شرکت آرمان سبز آدینه اصفهان تهیه شد و در گلدان‌های حاوی کوکویت و پرلیت به نسبت مساوی در شرایط کنترل شده در 4 غلظت شوری (50،0، 100 و 150 میلی مولار ) بعلاوه 3 غلظت کیتوزان (0، 5 و 10 میلی گرم در لیتر) در سه تکرار کشت شد. با رشد گیاه و رسیدن به مرحله سه برگچه‌ای تیمار‌دهی به صورت یک روز در میان با محلول کلرید سدیم و کیتوزان تا زمان برداشت، آغاز شد. بعد از گذشت 4 هفته اندام‌های هوایی (48 ساعت پس از آخرین تیمار) به‌منظور ارزیابی بیان ژن PIP، وزن تر و خشک و طول ساقه و ریشه، محتوای نسبی آب، نشت الکترولیت و عناصر سدیم و پتاسیم جدا شده و مورد بررسی قرارگرفتند. درصد و سرعت جوانه زنی، نیز در پلیت طی هشت روز اندازه گیری شد.

درصد و سرعت جوانه زنی بذور: پانزده عدد بذر سالم داخل پلیت 8 سانتیمتری تیمارشده و به مدت 8 روز در دمای ثابت 1±25 درجه سانتیگراد در دستگاه ژرمیناتور نگهداری شد. برای سنجش درصد و سرعت جوانه زنی از رابطه زیر استفاده شد (43).

رابطه 1: ΣG /N = درصد جوانه زنی

رابطه 2: ΣNi /D = سرعت جوانه زنی

G= تعداد بذر جوانه زده N= تعداد کل بذرها Ni= تعداد کل بذر های جوانه زده D= تعداد روز شمار تا n ام (مدت زمانی که شمارش بذرهای جوانه زده انجام شده است)

طول و وزن تر و خشک ریشه و ساقه: پس از اتمام تیمار‌دهی، به طور تصادفی میانگین طول 10 گیاه تعیین شد. پس از تعیین وزن تر، نمونه‌ها داخل آون با دمای 50 درجه سانتی‌گراد به مدت 72 ساعت خشک و وزن آنها تعیین شد (5).

محتوای نسبی آب برگ (RWC): اندازه‌گیری این شاخص به روش Wheatherley (1973) انجام گرفت (47). از دو برگ 3 دیسک با قطر 1 سانتی متر وزن گردید (FW). سپس دیسک‌ها در پتری حاوی آب مقطر به مدت 4-5 ساعت غوطه ور شد. دیسک‌ها پس از این مدت از پتری خارج و با استفاده از کاغذ صافی خشک و دوباره وزن گردید تا وزن حالت تورژسانس کامل (TW) به دست آید. برای محاسبه وزن خشک (DW)، دیسک‌ها درون فویلی آلومینیوم پیچیده و به مدت 24 ساعت در دمای 70 درجه سانتی‌گراد در آون قرارگرفت و سپس وزن شد. محتوای نسبی آب برگ از رابطه زیر محاسبه شد:

رابطه 4: RWC (%) = ((FW-DW)/(TW-DW))ₓ100

FW وزن تر DW وزن خشک TW وزن تورژسانس کامل

سنجش نشت الکترولیت‌ها: ابتدا قسمتی از بافت تازه گیاه برداشته و 15 عدد دیسک تهیه و داخل ظروف دربدار گذاشته شد. سپس به میزان10 میلی لیتر آب مقطربه آنها اضافه گردید و به مدت 24 ساعت در دمای محیط 25 درجه سانتی‌گراد قرارگرفت. سپس هدایت الکتریکی محلول توسط هدایت سنج الکتریکی(Inob1, Japon) اندازه گیری شد. نمونهها به حمام آب جوش با دمای 95 درجه سانتی‌گراد منتقل و به مدت15 دقیقه در این دما قرار گرفتند. پس از این مدت نمونه‌ها از حمام آب جوش خارج در دمای اتاق خنک شدند. در این زمان مجددا هدایت الکتریکی نمونه‌ها اندازه گیری شد و از رابطه زیر نشت‌پذیری غشاء سلولی محاسبه شد (37).

رابطه 5: 100× (E1 / E2)= نشت پذیری

E1: هدایت الکتریکی محلول قبل از جوشاندن E2: هدایت الکتریکی محلول بعد از جوشاندن

اندازه گیری عناصر معدنی: برای اندازه‌گیری مقدار عناصر در گیاهان از روش Reeves و Smith (2009) استفاده شد (38). ابتدا بخش های هوایی از قسمت طوقه از ریشه جدا و 3 بار با آب مقطر شستشو شدند. نمونه‌ها در داخل آون به مدت 48 ساعت در دمای^C^°40 خشک شد سپس حدود 1/0 گرم از ماده خشک هر نمونه را وزن و با 2 میلی لیتر اسید نیتریک سائیده و به مدت 14 ساعت در کوره الکتریکی در دمای ^C^°160 قرار داده شد. به خاکستر حاصل پس از سرد شدن 3-4 میلی لیتر آب مقطر اضافه نموده محلول حاصل را صاف و جذب توسط دستگاه طیف سنجی جذب اتمی Agilent 240 FSAA تعیین شد.

جداسازی RNAو سنتز cDNA: استخراج RNA کل با استفاده از روش لیتیوم کلراید انجام گرفت (31). صد میلی گرم از بافت در هاون چینی استریل سرد مستقیماً با بافر لیز و یک میلی لیتر از بافر استخراجی لیتیم کلراید به هر نمونه اضافه شد. 800 میکرولیتر از مخلوط فنل اشباع شده با بافر تریس به اضافه کلروفروم و ایزوآمیل الکل به ترتیب به نسبت 1:24:25 به هر نمونه اضافه شد. مخلوط حاضر به مدت یک دقیقه ورتکس و به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد با سرعت 14000 دور سانتریفیوژ گردید. مایع رویی را به میکروتیوب جدید منتقل کرده و هم حجم آن لیتیم کلراید M4 اضافه شد. نمونه ها به مدت 4 ساعت در درمای 20- درجه سلسیوس قرارگرفت. سپس در دمای 4 درجه و در دوره 14000 دور به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. رسوب حاصل را در 400 میکرولیتر آب مقطر استریل حل نموده به آن 2 حجم اتانول سرد (800 میکرولیتر) و 40 میکرولیتر استات سدیم M3 (4/5 = pH) اضافه شد. دوباره میکروتیوب ها در 14000 دور به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتریفیو‍‍ژ شدند. رسوب حاصل را با اتانول 70 درصد شستشو داده و بعد از خشک شدن میکروتیوب ها، رسوب در 50 میکرولیتر آب مقطر استریل حل گردید. RNA در دمای 20-درجه به مدت کوتاه و در دمای 80- درجه به مدت طولانی قابل نگهداری است. کیفیت RNA از طریق اسپکتروفتومتری و الکتروفورز ژل آگار تعیین شد.

سنتز cDNA از mRNA تام با استفاده از کیت شرکت Addbio و مراحل بر پروتکل شرکت انجام گرفت ابتدا 5/2 RNA، 5/0 mix dNTP، 5/0 oligo dT، 5/0 random hexamer در یک ویال 2/0 مخلوط و در دستگاه PCR در دمای C˚70 به مدت 5 دقیقه قرار داده شدند.. سپس ویال از دستگاه خارج شده و به مدت 2 دقیقه در یخ قرارگرفت. در نهایت به هر ویال 5/0 آنزیم ریورس ترانسکریپتاز، 5 بافر2X و 5/0 Rnasin اضافه شد و ویال در دستگاه قرار داده شد و در دماهای C˚25 به مدت 10 دقیقه، C˚42 به مدت 50 دقیقه، C˚80 به مدت 1 دقیقه و در نهایت10 دقیقه به مدت 1 دقیقه انکوبه انجام شد..تمام cDNAها در دمای C˚20- نگهداری شدند. روش Real-time RT-PCR که به نامRT-qPCR نیز نامیده می‌شود، به طور گسترده در بررسی‌های کمی بیان ژن به کار می‌رود. ویژگی کلیدی Real-time RT-PCR ، فراهم شدن امکان بررسی تکثیر قطعات DNA همزمان با انجام گرفتن آزمایش و با استفاده از گزارشگرهای فلوئورسنت می‌باشد. مکانیسم واکنش مشابه PCR معمولی است به گونه ای که در هر سیکل تعداد نسخههای تکثیر شده دو برابر می شود. تفاوت PCR معمولی با روش Real-time RT-PCR در این است که در سیستم Real-time با به کار بردن رنگهای فلئورسنت، پیگیری آنها در خلال واکنش و مشاهده تغییرات جذب فلئورسنت میتوان پیشرفت واکنش را لحظه به لحظه کنترل کرد؛ در حالی که در واکنش PCR معمولی نتایج تنها بعد از اتمام واکنش، به وسیله انتقال نمونه ها بر بروی ژل قابل مشاهده است. پس از پایان واکنش Real time PCR، عددی به نام سیکل آستانه Ct به دست می‌آید. Ct نشان دهنده سیکلی از واکنش است که در آن میزان فلورسنسی به آستانه تشخیص دستگاه رسیده است. واضح است که هرچه میزان الگوهای آغازگر بیشتر باشند، سریع‌تر به آستانه خواهیم رسید و بنابراین CT و سیکل آستانه نیز کمتر خواهد شد. بعـد از رسـم خـط تـری شـولد، مقادیـر( Ct Cycle hreshold) حاصــل از نمودارهای تکثیــر از نــرم افــزار gene Rotor بــه محیـط Excel انتقـال داده شـد و پـس از مرتـب سـازی در محیـط Gen Ex، داده هـا بـراسـاس تغییـرات بیـان ژن خانـه دار(کنترل داخلـی) آکوپورین ذرت و مطابـق فرمـول زیر محاسبه شد و سپس با استفاده از نرم افزار آماریSPSS مورد مقایسات آماری و رسم نمودار قرارگرفت (16).

طراحی پرایمر: دراین پژوهش برای انجام روش Real-time RT-PCR بر روی ژن PIPطراحی پرایمر انجام شد. بدین منظور توالی mRNA ژنهای مذکور با مراجعه به پایگاه اطلاعات ژنی NCBI گرفته شد. در مرحله بعد با کمک نرم افزار Generunner پرایمرهایی با ویژگیهای مناسب از نظر دمایی و درصد GC وبرخی پارامترهای دیگر طراحی شد. در این تحقیق از ژنRibosomal 16s RNA به عنوان ژن مرجع استفاده شد (جدول1).

جدول 1- توالی جفت آغازگرهای استفاده شده برای RT-PCR

Genes	Primer Sequence
BnPIP1,2-FWD	5´-CCGGTATCTCTGGTGGTCAC-3´
BnPIP1,2-REV	5´-CCCAACTCCACATATCGCAC-3´
GAPDH-FWD	5´-GTATGGTCGCAAGGCTGAAAC-3´
GAPDH-REV	5´-GAGCTCTCAGTCTGTCAATCC-3´

تجزیه و تحلیل آماری: آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح کامل تصادفی در سه تکرار طراحی گردید. نتایج حاصله با استفاده از نرم افزار آماری SPSS22 مورد تجزیه و تحلیل قرارگرفتند.تجزیه واریانس با روش ANOVA و آزمونGLM (univariate) صورت گرفت. مقایسه میانگین‌ها با آزمون دانکن انجام شد.

نتایج

نتایج تجزیه واریانس در جدولهای 2 و 3 آمده است. اثر تیمار توام شوری و کیتوزان بر بیان ژن،وزن تر بخش هوایی، وزن خشک بخش هوایی،طول ساقه، محتوی نسبی آب برگ، وزن تر ریشه در سطح پنج درصد و بر درصد جوانه زنی، سرعت جوانه زنی،وزن خشک و طول ریشه، غلظت سدیم و پتاسیم در سطح یک درصد معنی دار است. این تیمار بر نشت الکترولیتها اثر معنی دار نداشته است.

اثر تنش شوری و کیتوزان بر روی درصد و سرعت جوانه‌زنی: تجزیه واریانس داده ها (جدول 2) نشان داد که تأثیر شوری و کیتوزان و تیمار توام بر روی درصد جوانه زنی در سطح 1 درصد معنی‌دار بود (01/0>P). نتایج مقایسه میانگین درصد جوانه‌زنی (شکل 1) بیانگر آن است که با افزایش غلظت شوری درصد جوانه‌زنی کاهش یافته است. غلظت 50 میلی‌مولار کاهش زیادی بر روی درصد جوانی‌زنی بذر گیاه کلزا نداشته در حالی که در غلظت 150 میلی‌مولار شوری کاهش قابل توجهی در درصد جوانه زنی مشاهد شد استفاده توام از کیتوزان و شوری سبب افزایش درصد جوانه زنی نسبت به شوری در همان غلظت شوری شد.

سرعت جوانه زنی( جدول4) نشان می‌دهد که با افزایش تعداد روزهای جوانه زنی سرعت جوانه‌زنی افزایش یافته است. با توجه به جدول در غلظت 150 میلی‌مولار تا روز چهارم سرعت جوانه زنی صفر بوده و روز ششم جوانه زنی آغاز شده است. در شوری 50 میلی مولار از روز دوم تا روز ششم جوانه زنی افزایش داشته ولی در روز هشتم کاهش داشت. در غلظت 100 میلی مولار بتریج سرعت جوانه زنی روند افزایشی داشت. در هر سه غلظت شوری به همراه کیتوزان در هر دو غلظت، بتدریج از روز دوم تا هشتم سرعت افزایش داشت.

جدول2- نتایج تجزیه واریانس صفات مورد ارزیابی در گیاه کلزا تحت تأثیر تیمار توام شوری و کیتوزان

	میانگین مربعات
منابع تغییرات	درجه آزادی	بیان ژن PIP	درصد جوانه زنی (%)	سرعت جوانه زنی (Ṝ)	وزن تربخش هوایی (gr)	وزن خشک بخش هوایی (gr)	طول ساقه (cm)	محتوای نسبی آب برگ RWC (%)
شوری	3	^*040/20	^**593/2800	^*141/1	^*001/0	^*000/0	^*733/12	^*301/57
کیتوزان	2	^ns718/5	^**667/1064	^*430/2	^*004/0	^* 001/0	^*058/11	^*288/64
شوریₓ کیتوزان	6	^*001/19	^**089/454	^**175/3	^*001/0	^*000/0	^*314/7	^*549/120
خطا		67/1	23/35	03/0	00/0	00/0	09/0	57/2

** و * به ترتیب وجود تفاوت معنی دار در سطح 01/0 و 05/0 و ns عدم وجود تفاوت معنی دار را نشان می دهد. Ṝ: سرعت جوانه زنی

جدول 3- نتایج تجزیه واریانس صفات مورد ارزیابی در گیاه کلزا تحت تأثیر تیمار توام شوری و کیتوزان

منابع تغییرات		میانگین مربعات
منابع تغییرات	درجه آزادی	وزن تر ریشه (gr)	وزن خشک ریشه (gr)	طول ریشه (cm)	نشت الکترولیتها (%)	غلظت سدیم (mg/kg)	غلظت پتاسیم (mg/kg)
شوری	3	^*008/0	^**001/0	^*523/1	^*859/539	^**216/1805	^**209/208
کیتوزان	2	^*002/0	^**001/0	^**057/5	^*236/3804	^**792/363	^**080/132
شوریₓ کیتوزان	6	^*005/0	^**002/0	^**440/3	^ns757/145	^**577/17	^**783/58
خطا		00/0	00/0	06/0	74/12	39/1	46/8

** و * به ترتیب وجود تفاوت معنی دار در سطح 01/0 و 05/0 و ns عدم وجود تفاوت معنی دار را نشان می دهد.

شکل1- مقایسه برهمکنش غلظت های شوری و غلظت های کیتوزان بر روی درصد جوانه زنی گیاه کلزا در مقایسه با شاهد. داده میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می باشد. میانگین های دارای حروف مشابه از نظر آماری اختلافی ندارند.

اثر تنش شوری و کیتوزان بر روی طول، وزن تر و خشک ریشه و بخش هوایی: با توجه به جدول تجزیه واریانس 2 اثر شوری، کیتوزان و تیمار توام بر روی طول ریشه، وزن خشک ریشه از نظر آماری در سطح 1 درصد، بر وزن تر ریشه در سطح 5 درصد معنی‌دار بود.

جدول 4- سرعت جوانه زنی در گیاه کلزا تحت تأثیر تیمار توام شوری و کیتوزان

انجراف معیار ± میانگین
روز هشتم	روز ششم	روز چهارم	روز دوم	تیمارها
^e219/0 ± 996/1	^e524/0 ± 430/2	^d381/0 ± 583/2	^a763/0 ± 666/2	شاهد
^b261/0 ± 206/3	^a620/0 ± 363/4	^b181/1 ± 833/3	577/0 ± 666/2^a	شوری 50 میلی مولار
^c144/0 ± 953/2	^c384/0 ± 363/3	^f144/0 ± 083/2	^e288/0 ± 666/0	شوری 100 میلی مولار
^f188/0 ± 456/0	^h170/0 ± 840/0	^f000/0 ± 000/0	^f000/0 ± 000/0	شوری 150 میلی مولار
^c363/0 ± 790/2	^g136/0 ± 353/1	^e181/1 ± 33/2	577/0 ± 833/1^b	کیتوزان 5 میلی گرم در لیتر
^d520/0 ± 453/2	^f509/0 ± 943/1	^f877/0 ± 166/2	577/0 ± 666/1^c	کیتوزان 10 میلی گرم در لیتر
^c315/0 ± 863/2	^d230/0 ± 733/2	^a020/2 ± 333/4	763/0 ± 166/2^ab	شوری 50 میلی مولار همراه با کیتوزان 5 میلی گرم
^e219/0 ± 996/1	^bc472/0 ± 466/3	^c381/0 ± 416/3	577/0 ± 166/1^de	شوری 100 میلی مولار همراه با کیتوزان 5 میلی گرم
^a1543/1 ± 536/3	^b470/0 ± 620/3	^d381/0 ± 666/2	577/0 ± 333/0^f	شوری 150 میلی مولار همراه با کیتوزان 5 میلی گرم
^ab310/0 ± 306/3	^c750/0 ± 340/3	^cd127/1 ± 166/3	040/1 ± 333/1^d	شوری 50 میلی مولار همراه با کیتوزان 10 میلی گرم
^a866/0 ± 500/3	^b285/0 ± 660/3	^cd000/1 ± 250/3	288/0 ± 166/0^f	شوری 100 میلی مولار همراه با کیتوزان 10 میلی گرم
^b575/0 ± 123/3	^d365/0 ± 976/2	^e629/0 ± 333/2	000/0 ± 000/0^f	شوری 150 میلی مولار همراه با کیتوزان 10 میلی گرم

شوری باعث کاهش طول ریشه شده که در غلظت 150 میلی‌مولار بیشترین کاهش مشاهده شد. در استفاده همزمان کیتوزان و شوری طول ریشه در غلظت 150 میلی‌مولار همراه با کیتوزان 10 میلی‌گرم‌در‌لیتر و در شوری 100 میلی‌مولار و کیتوزان 5 میلی‌گرم‌در‌لیتر افزایش داشت. در شرایط شوری میزان وزن تر ریشه در مقایسه با شاهد کاهش یافته است. در تیمار توام در مقایسه با همان غلظت شوری میزان وزن تر ریشه افزایش داشت. استفاده همزمان از کیتوزان بر روی گیاه کلزا تحت تنش شوری میزان وزن خشک ریشه را نسبت به تیمار شوری به تنهایی افزایش داده است. بیشترین افزایش در غلظت 100 میلی‌مولار شوری همراه با کیتوزان 5 میلی‌گرم‌در‌لیتر مشاهده شد. براساس تجزیه واریانس (جدول 2) شوری کیتوزان و تیمار توام شوری و کیتوزان بر روی طول بخش هوایی، وزن تر و خشک بخش هوایی در سطح 5 درصد معنی‌دار بود. شوری با غلظت 50 و 100 میلی‌مولار در مقایسه با شاهد طول بخش هوایی را افزایش داده است در حالی که در غلظت 150 میلی‌مولار کاهش داشت. در غلظت 150 میلی‌مولار همراه با کیتوزان در مقایسه با همان غلظت شوری افزایش داشت. میزان وزن تر بخش هوایی در شرایط شوری تا غلظت 100 میلی‌مولار افزایش داشته اما در غلظت 150 میلی‌مولار تفاوتی با شاهد نداشت. تیمار توام شوری و کیتوزان باعث افزایش وزن تر بخش هوایی شد. وزن خشک اندام هوایی در سطح 50 و 100 میلی‌مولار افزایش داشت. در شرایط تنش شوری به کاربرد کیتوزان منجر به افزایش میزان وزن خشک بخش هوایی گیاه کلزا به ویژه در غلظت های 100 و 150 شوری نسبت به همان غلظت شوری شده که بیشترین مربوط به شوری 150 میلی‌مولار همراه با کیتوزان 5 میلی‌گرم‌در‌لیتر است (جدول 5).

اثر تنش شوری و کیتوزان بر روی نشت الکترولیتها: اثر شوری و کیتوزان و تیمار توام شوری و کیتوزان بر نشت الکترولیت درسطح 5 درصد معنی‌دار بود (جدول 3) با بالا رفتن غلظت شوری میزان نشت الکترولیت افزایش یافته که نشان دهنده آسیب و کاهش پایداری غشاء می باشد. در غلظت 100 میلی مولار همراه با کیتوزان 5 میلی‌گرم‌در‌لیتر بیشترین میزان نشت الکترولیت مشاهده شد ودر غلظت 100 و 150 میلی‌مولار همراه با کیتوزان 10 میلی‌مولار کاهش داشت (شکل 2).

جدول 5- طول، وزن تر و خشک ریشه و بخش هوایی در گیاه کلزا تحت تأثیر تیمار توام شوری و کیتوزان

انجراف معیار ± میانگین
وزن خشک ریشه	وزن تر ریشه	طول ریشه	وزن خشک بخش هوایی	وزن تر بخش هوایی	طول بخش هوایی	تیمارها
^e0002/0 ± 001/0	^c001/0 ± 004/0	^d370/0 ± 816/1	^e003/0 ± 008/0	^f014/0 ± 144/0	^d038/1 ± 66/11	شاهد
^f0002/0 ± 0015/0	^e002/0 ± 006/0	^f452/0 ± 420/2	^c003/0 ± 011/0	^c026/0 ± 189/0	^a032/1 ± 120/15	شوری 50 میلی مولار
^h0002/0 ± 0010/0	^f001/0 ± 004/0	^g420/0 ± 460/1	^d006/0 ± 010/0	^c008/0 ± 188/0	^c666/1 ± 953/12	شوری 100 میلی مولار
^h0004/0 ± 0013/0	^f003/0 ± 006/0	^h674/0 ± 016/3	^e005/0 ± 009/0	^f021/0 ± 150/0	^g907/0 ± 133/9	شوری 150 میلی مولار
^c0002/0 ± 0012/0	^e001/0 ± 005/0	^c480/0 ± 533/3	^d001/0 ± 010/0	^c012/0 ± 184/0	^b429/1 ± 84/13	کیتوزان 5 میلی گرم در لیتر
^e0001/0 ± 0013/0	^d000/0 ± 006/0	^g281/0 ± 836/1	^e001/0 ± 009/0	^d023/0 ± 174/0	^c 357/0 ± 57/12	کیتوزان 10 میلی گرم در لیتر
^de0007/0 ± 0011/0	^c001/0 ± 006/0	^d150/0 ± 090/3	^b001/0 ± 012/0	^a029/0 ± 217/0	^c 950/0 ± 22/12	شوری 50 میلی مولار همراه با کیتوزان 5 میلی گرم
^a0011/0 ± 0039/0	^b003/0 ± 007/0	^a552/0 ± 520/4	^c003/0 ± 012/0	^b033/0 ± 202/0	^c 450/0 ± 86/12	شوری 100 میلی مولار همراه با کیتوزان 5 میلی گرم
^b0003/0 ± 0017/0	^a002/0 ± 008/0	^e529/0 ± 703/2	^a003/0 ± 014/0	^a050/0 ± 211/0	^c 869/1 ± 73/12	شوری 150 میلی مولار همراه با کیتوزان 5 میلی گرم
^d0002/0 ± 0014/0	^e001/0 ± 005/0	^b519/0 ± 076/4	^e001/0 ± 008/0	^f016/0 ± 147/0	^e 209/1 ± 66/10	شوری 50 میلی مولار همراه با کیتوزان 10 میلی گرم
^g0003/0 ± 0013/0	^g001/0 ± 002/0	^e710/0 ± 730/2	^d002/0 ± 017/0	^e018/0 ± 161/0	^d 372/1 ± 79/11	شوری 100 میلی مولار همراه با کیتوزان 10 میلی گرم
^e0001/0 ± 0003/0	^d001/0 ± 006/0	^a674/0 ± 360/4	^c004/0 ± 012/0	^c045/0 ± 191/0	^f 566/1 ± 566/9	شوری 150 میلی مولار همراه با کیتوزان 10 میلی گرم

اثر تنش شوری و کیتوزان بر روی محتوای نسبی آب برگ گیاه کلزا: براساس جدول تجزیه واریانس اثر شوری و کیتوزان و تیمارهای توام بر محتوای نسبی آب برگ گیاهان در سطح 5 درصد معنی‌دار بود (جدول 2). با افزایش غلظت شوری محتوای نسبی آب برگ کاهش یافت. در بررسی اثر متقابل شوری و کیتوزان با توجه به شکل 3 می‌توان گفت که کیتوزان توانسته تا حدی کاهش محتوای نسبی آب برگ در اثر شوری را افزایش دهد.

اثر تنش شوری و کیتوزان بر روی محتوای سدیم و پتاسیم: مقایسه نتایج حاصل از تجزیه واریانس داده ها (جدول 2) نشان داد اثر تنش شوری، کیتوزان و تیمار توام بر میزان سدیم و پتاسیم در سطح 1 درصد معنی‌دار بود (01/0>P). در تنش شوری بیشترین مقدار سدیم در سطح 150 میلی‌مولار مشاهده شد. استفاده از کیتوزان باعث کاهش میزان سدیم بخش هوایی نسبت به گیاهان تحت تنش شوری همان گروه شده است (شکل 4).

شکل2- مقایسه برهمکنش غلظت های شوری و کیتوزان بر روی نشت الکترولیتها گیاه کلزا در مقایسه با شاهد. داده میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می باشد. میانگین های دارای حروف مشابه از نظر آماری اختلافی ندارند.

شکل3- مقایسه برهمکنش غلظت های شوری و کیتوزان بر روی محتوای نسبی آب در برگ گیاه کلزا در مقایسه با شاهد. داده میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می باشد. میانگین های دارای حروف مشابه از نظر آماری اختلافی ندارند.

شکل4- مقایسه برهمکنش غلظت های شوری و کیتوزان بر روی محتوای سدیم در بخش هوایی گیاه کلزا در مقایسه با شاهد. داده میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می باشد. میانگین های دارای حروف مشابه از نظر آماری اختلافی ندارند.

میزان پتاسیم در بخش هوایی کلزا در غلظت های 50 میلی‌مولار در مقایسه با شاهد افزایش داشته است ولی در غلظت 100 و 150 میلی‌مولار کاهش نشان داد (شکل 5). نشان داد که استفاده از کیتوزان در غلظت 5 میلی‌گرم‌ در‌لیتر اثر کاهشی داشته در حالی که غلظت 10 میلی‌گرم‌در‌لیتر باعث افزایش میزان پتاسیم در بخش هوایی گیاه کلزا شده است (شکل 5). استفاده همزمان از کیتوزان و شوری بر روی میزان پتاسیم در گیاه کلزا در غلظت 100 و 150 میلی‌مولار همراه با کیتوزان 5 و 10 میلی‌گرم‌در‌ مقایسه با شوری در همان غلظت‌ها افزایش داشت. در غلظت 50 میلی‌مولار همراه با کیتوزان در مقایسه با شوری همان غلظت کاهش داشت.

شکل5- مقایسه برهمکنش غلظت های شوری و کیتوزان بر روی محتوای پتاسیم در بخش هوایی گیاه کلزا در مقایسه با شاهد. داده میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می باشد. میانگین های دارای حروف مشابه از نظر آماری اختلافی ندارند.

اثر تنش شوری و کیتوزان بر روی بیان ژن PIP: بررسی منحنی‌های تکثیر ‍ژن مورد مطالعه نشان داد که تکثیر به خوبی صورت گرفته و وجود سیکل آستانه یا CT های متفاوت نشانگر تغییر بیان ژن ها تحت تیمارهای مختلف شوری و کیتوزان است (اشکال 6، 7و 8).

شکل 6- منحنی ذوب و تکثیر ژن rRNA (کنترل داخلی)

شکل 7 - منحنی ذوب و ثکثیر ژن Plasma membrane intrinsic proteins

براساس جدول2 تجزیه واریانس داده‌ها تحت تأثیر شوری و تیمار توام شوری و کیتوزان بر روی بیان ژن PIP در سطح 5 درصد معنی‌دار بوده (05/0>P) ولی تأثیر کیتوزان معنی دار نبود. باتوجه به شکل (8) بیان ژن در شوری 50 میلی‌مولار نسبت به شاهد کاهش ولی در شوری 100 و 150 میلی‌مولار افزایش یافته است. در تیمارهای توام بالاترین میزان بیان مربوط به تیمار 50 و 100 میلی‌مولار شوری همراه با 5 میلی‌گرم ‌در‌لیتر کیتوزان بود. در حالی که در همین غلظت کیتوزان با 150 میلی‌مولار شوری بیان ژن کمتر از سایر گروهها بود.

شکل 8 - مقایسه برهمکنش غلظت های شوری و کیتوزان بر روی بیان ژن PIP گیاه کلزا در مقایسه با شاهد. داده میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می باشد. میانگین های دارای حروف مشابه از نظر آماری اختلافی ندارند.

بحث و نتیجه گیری

تنش‌های زنده و غیرزنده از عوامل مهم کاهش تولید محصولات زراعی محسوب می‌شوند (26). تنش شوری منجر به تجمع گونه اکسیژن فعال شده که توانایی صدمه زدن به غشا لیپیدی، پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک را دارد (14). براساس نتایج Shahid و همکاران (2011) با افزایش تنش شوری میزان درصد جوانه زنی در گیاه نخود فرنگی کاهش یافته که علت، تأثیر مستقیم شوری بر روی رشد جنین است (40) که با نتایج این پژوهش همخوانی دارد. Ansari وهمکاران (2019) علت کاهش جوانه‌زنی بذر یونجه تحت تنش شوری را کاهش پتانسیل اسمزی بیان کرد و از سوی دیگر اختلال در جذب برخی از عناصر که باعث کاهش سرعت و درصد جوانه زنی می‌شود (12). کاهش جوانه زنی ناشی از عدم جذب آب در شرایط شوری است که به دلیل کاهش پتانسیل اسمزی محیط اتفاق می افتد. اثرات سوء غلظتهای بالای شوری بر جوانه زنی مربوط به سمیت یونها سدیم و کلر یا هر دو و انباشته شدن همزمان کاتیونها و آنیونها در سلول است. تنش شوری رشد ساقه را بیش از ریشه مهار می کند. اثر شوری بر بخش هوایی ناشی از اثر بازدارندگی نمک بر تقسیم سلولی در مریستم است. شوری در گیاهان مختلف بر طول بخش هوایی و ریشه، تعداد برگها، و نسبت بخش هوایی به ریشه تأثیر می گذارد (48). اثر تحریک کنندگی کیتوزان بر جوانه زنی و رشد گیاهچه های گندم، ذرت و بادام زمینی و رشد ریشه ها، ساقه برگهای گیاهان مختلف از جمله ژربرا گزارش شده است (6). برخی از محققین بیان کردند که کیتوزان ممکن است از طریق تأثیر بر تولید هورمون های گیاهی مانند اکسین و جیبرلین بر روی رشد گیاهان تأثیر گذارد (7). کیتوزان با القاء مسیر سیگنالینگ مربوط به بیوسنتز اکسین از طریق مسیر وابسته به تریپتوفان باعث رشد و نمو گیاهان می شود (6). تنش شوری باعث استرس اکسیداتیو و تولید رادیکالهای آزاد می شود و کیتوزان با تحریک تولید ترکیبات آنتی اکسیدان با اثرات تنش مقابله کرده و باعث افزایش بیوماس گیاه می شود (36). کیتوزان با خنثی کردن رادیکالهای آزاد از DNA سلول محافظت می کند. این ویژگی ممکن است مربوط به ساختار خاص کیتوزان باشد بطوری که گروههای آمین و هیدروکسیل موجود در کیتوزان با رادیکالهای آزاد وارد واکنش شوند (6). ممانعت از رشد تحت شرایط شوری ممکن است به علت کاهش دسترسی گیاه به آب یا سمیت کلرید سدیم باشد. تحت شرایط شوری جذب دی اکسید کربن بعنوان منبع اصلی انرژی برای رشد و نمو، کاهش یافته و در نتیجه رشد کاهش می یابد (34). ریشه ها مستقیماً در تماس با محیط رشد حاوی نمکهای سمی هستند که رشد بلند مدت ریشه را متوقف می کند. در نتیجه بیوماس را تحت تأثیر قرار می دهد. از آنجا که افزایش در طول ریشه افزایش جذب آب و مواد معدنی را باعث می شود، بنظر می رسد در شرایط تنش شوری گیاهان تیمار شده با کیتوزان با افزایش طول ریشه توانسته از اثرات مخرب شوری بر رشد و گسترش ریشه جلوگیری کنند (8). کیتوزان با افزایش فعالیت آنزیم های متابولیسم نیتروژن و بهبود انتقال نیتروژن در برگها باعث افزایش رشد در گیاهان می شود (32). محلول پاشی با کیتوزان بر رشد رویشی، افزایش وزن خشک اندام هوایی و ریشه، جوانه زنی در گیاه ذرت و لوبیا شده است. اثر تحریک کنندگی کیتوزان بر رشد گیاه به دلیل افزایش جذب آب و عناصر ضروری و کاهش انباشت رادیکالهای آزاد اکسیژن از طریق افزایش فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانی می باشد. افزایش عملکرد تحت تأثیر کیتوزان به دلیل تأثیر آن بر تحریک فرایندهای فیزیولوژیکی، بهبود رشد رویشی و افزایش جذب دی اکسید کربن می باشد (1). تنش شوری به دلیل آسیب به دیواره سلولی، کاهش پتانسیل اسمزی و تعادل آب باعث تغییر در محتوای نسبی آب سلول می شود. در نتیجه غلظت اتیلن افزایش یافته و رشد ریشه ها کاهش می یابد. کیتوزان با کاهش رادیکالهای آزاد موجود در محیط، باعث حفاظت سلول در شرایط تنش، افزایش پایداری و بهبود نفوذپذیری انتخابی غشاء پلاسمایی می شود (10). محتوای نسبی آب بالا، توانایی گیاهان را برای تنظیم اسمزی و حفظ رشد نشان می دهد. بنظر می رسد کیتوزان با افزایش محتوای نسبی آب توانسته رشد گیاه را افزایش دهد زیرا افزایش محتوای نسبی آب برگ شرایط مساعد برای فتوسنتز و تقسیم و توسعه برگ را فراهم کرده که باعث تولید بیشتر مواد فتوسنتزی و افزایش رشد گیاه می شود (50). Shams Peykani در سال 2018 گزارش داد که شوری محتوای نسبی آب در برگ گیاه کلزا را نسبت به شاهد کاهش داد (39). علت کاهش محتوای نسبی آب این است که شوری از جذب آب جلوگیری کرده و تنش خشکی ایجاد می‌کند به این ترتیب سبب کاهش پتانسیل آب برگ و جذب آب از ریشه می‌شود. کیتوزان باعث بهبود نسبی آب می شود که احتمالاً به دلیل تنظیم تعادل بین تأمین آب و تعرق برگ در گروه تیمار توام است (8). افزایش نشت الکترولیت ناشی از آسـیب و کاهش پایداری غشاها و احتمالاً نتیجۀ حاصل تنش اکسیداتیو شوری است (24). پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء در تنش شوری باعث آسیب و نشت یونی از آن می شود. کاهش پایداری غشاء به میزان پراکسیداسیون لیپیدها که توسط گونه های اکسیژن فعال اتفاق می افتد، بستگی دارد (48). تنش یکسری تغییرات در فسفولیپیدهای غشاء ایجاد می کند که اسید چربهای غیراشباع افزایش می یابد. در تنشهای شدید بعضی از قسمتهای فسفولیپیدهای دولایه غشاء حالت شش وجهی پیدا کرده و ساختار غشاء منفذدار شده و نشت مواد رخ می دهد. در شرایط تنش، اختلال در فعالیتهای بیولوژیک غشاء سلولی باعث کاهش سیالیت، غیرفعال سازی یا کاهش سرعت پمپ شدن یونها در غشاء شده و بر میزان نشت یونی افزوده می شود. حفظ تمامیت غشاء سلولی در طی تنش نشانه ای هنگام بکارگیری کیتوزان از وجود مکانیسم های کنترلی در تحمل به پسابیدگی است (23). میزان بالای نشت الکترولیت همیشه علامتی برای آسیب غشاء پلاسمایی نیست و گاهی مربوط به بالا بودن میزان پتاسیم است. Demidchikو همکاران در 2014 بیان کردند که نشت الکترولیت با خروج پتاسیم از سلول در ارتباط است (18). در مطالعه حاضر با افزایش شوری تا سطح 150 میلی مولار افزایش در میزان سدیم و کاهش پتاسیم در مقایسه با شاهد مشاهده شد. نتایج Ferreira و همکاران در 2020 نشان داد که شوری غلظت عناصر غذایی از جمله پتاسیم، و نسبت پتاسیم به سدیم را به میزان قابل توجهی کاهش داده، اما سدیم در اندام هوایی افزایش یافته است (20). به نظرمی‌رسد که به خاطر رقابت سدیم و پتاسیم در تنش شوری، میزان جذب پتاسیم کاهش یافته است. کانال‌های یونی واقع در غشاء سلول یون‌های پتاسیم را وارد می‌کنند که در هنگام تنش شوری به دلیل تشابه شعاع یونی پتاسیم و سدیم، سدیم را انتقال می‌دهند. به همین دلیل میزان سدیم افزایش و میزان پتاسیم کاهش می‌یابد (15). مهمترین استراتژی در گیاهان تحت تنش شوری کده بندی سدیم در ریشه و عدم ارسال آن به بخشهای هوایی است که استفاده از کیتوزان به آن کمک می کند. رشد گیاه در محیط شور باعث بیان ژن AsHKT1 در برگها و ریشه شده و کیتوزان بیان این ژن در ریشه را افزایش داده، در نتیجه از انتقال سدیم به بخشهای هوایی جلوگیری می کند. تیمار با کیتوزان باعث فعال شدن مسیر SOS در ریشه تحت تنش شوری می شود. مهمترین عملکرد AtSOS1، خروج سدیم از سیتوزول به ریزوسفر تحت تنش شوری است. AtSOS1 انتقال در مسیر بلند سدیم از ریشه به برگ تحت شرایط تنش شوری و پتاسیم کم را تنظیم می کند. (45). مسیر SOS فعال شده توسط کیتوزان می تواند باعث خروج سدیم شود زمانی که میزان پتاسیم موجود در محلول غذایی هوگلند کافی بوده و گیاه تحت تنش شوری باشد. ارسال سدیم به واکوئلها یک مکانیسم کلیدی جهت کاهش اثرات سمی یون در سیتوپلاسم است. کده بندی باعث تنظیم اسمزی جهت تأمین آب در شرایط تنش شوری می شود. کیتوزان باعث افزایش ظرفیت کده بندی سدیم در سلولها می شود. کیتوزان در تنظیم بالا دست ژنهای AsATPaB2 و AsATPa2 ریشه و AsATPa6 برگها نقش داشته و باعث افزایش نیروی محرکه پروتون تحت تنش شوری می شود (21). نتایج Dzung و همکاران (2011) نشان داد که کیتوزان طی تنش شوری میزان پتاسیم را در نخود افزایش داده است (19). که با نتایج ما هم سویی دارد. به نظر می رسد کیتوزان تحت تنش شوری با کاهش غلظت سدیم و افزایش پتاسیم باعث پاسخ مناسبی برای مقابله با شوری بوده و از سمیت یونی ناشی از شوری کاسته است. در شرایط شوری تجمع یونهای غیرآلی در واکوئل نسبت به ترکیبات آلی نیاز به انرژی کمتری دارد. تجمع یونها عامل برای کاهش پتانسیل آب سلول به منظور صرفه جویی در مصرف انرژی است. در تنش شوری سدیم یک اسمولیت غیرآلی مناسب جهت کاهش پتانسیل آب سلول است. با این حال، حفظ نسبت پتاسیم به سدیم در بافتها برای تنظیم اسمزی سلول، نگهداری تورژسانس سلولی، باز و بسته شدن روزنه ها، فعالیت آنزیمها، سنتز پروتئین، متابولیسم و فتوسنتز ضروری است. در تنش شوری با تجمع سدیم در بافتها پتاسیم به خارج نشت می یابد (38). تجمع سطوح بالای یون سدیم در بافتهای گیاهی تحت شرایط شوری باعث آسیب به متابولیسم سیتوپلاسم و اندامکها می شود. باتوجه به رقابت سدیم و پتاسیم در جذب، وجود سدیم اضافی در محیط عدم تعادل سدیم و پتاسیم سلول به دنبال داشته و کاهش نسبت پتاسیم به سدیم را باعث می شود که در این صورت گیاه دچار کمبود پتاسیم خواهد شد. پتاسیم یک عنصر ضروری پرمصرف برای گیاه است که در تعادل فشار اسمزی، تنظیم باز و بسته شدن روزنه ها، فتوسنتز فعالیت آنزیمها نقش دارد. کیتوزان با تنظیم تعادل تغذیه ای و کاهش سمیت یونی، رشد گیاه را افزایش می دهد. پلی ساکاریدها با حفظ نسبت پتاسیم به سدیم از طریق تنظیم ژنهای چند ناقل Na⁺/K⁺هماهنگ کردن جریان و کده بندی سدیم باعث افزایش تحمل گندم به شوری می شود (50) کیتوزان مسیرهای فوق حساس را فعال کرده و بیان ژنهای AsHKT1 همچنین ژنهای مربوط به ناقل سدیم و پتاسیم را در شرایط شوری افزایش داده و از انتقال سدیم به بافتهای فتوسنتزی جلوگیری می کند (21). از طرفی انتقال آب نیز تحت تأثیر این تنش قرار می‌گیرد. آکوپورینها ناقلهایی هستند که حرکت آب در بین سلولها را تنظیم می‌کنند بطوری که بخش قابل توجهی از انتقال آب ریشه تحت کنترل متابولیکی آنها بوده و در صورت فعال بودن، می‌توانند فشار اسمزی سلول را تنظیم نمایند (17). آکوپورینها به وفور در ریشه یافت می‌شوند (46). گزارشات نشان می‌دهد که ایزوفرمهای PIP1 در انتقال آب نقش دارند. بیان همزمان ایزوفرم‌های (Zm) PIP2 با PIP1 نشان داده که انتقال آب از طریق هترومریزاسیون دو ایزوفرم در مقایسه با فعالیت ZmPIP2 به تنهایی در تخمک‌های Xenopus بالاتر است (25). بیان PIP ها وابسته به مرحله رشد ریشه بوده و با افزایش رشد و بلوغ گیاه دو ژن، PIP1 و PIP2 ، بیشتر بیان می‌شوند. بیان ژنها در بخش‌های خارجی ریشه بیشتر است (17). پروتئینهای سنتز شده جز پروتئینهای غشایی بوده و در بخشهایی که انتقال آب در آنها بیشتر است (آندودرم) به تعداد زیادی شناسایی شده‌اند. بیان گذرای ژن‌های ZmPIP1;1، ZmPIP1;5، و ZmPIP2;4 ذرت، تحت تأثیر تنش در بخش های بیرونی ریشه افزایش یافته ولی در سایر بخشها تغییری ندارد (9). در پژوهش حاضر شوری باعث افزایش بیان ژن PIP و کیتوزان اثر کاهشی بر بیان آن داشت. بیان ژن در ریشه گیاه آرابیدوپسیس تحت تنش شوری دارای عملکرد متفاوت است بطوری که مهار بیان این ژن جهت جلوگیری از کاهش آب در ریشه صورت گرفته و افزایش بیان به دلیل آماس سلول‌ها است (35). ایوبی و رحمانی(1395) بیان ژن‌های خانواده ZmPIP را تحت تنش شوری و خشکی در ذرت مورد بررسی قرار دادند. نتایج نشان داد که بیان ژن ZmPIP تحت تأثیر کلرید کلسیم نسبت به شاهد افزایش یافت. در تنش خشکی پس از 4 روز افزایش داشته در حالی که با افزایش تعداد روز (8 روز) بیان کاهش یافته است (1). میزان بیان ژن ZmPIP در ذرت (29) تحت تنش شوری افزایش یافته که با نتایج این پژوهش همخوانی دارد. از گـزارش محققـین میتوان استنباط کرد که کیتوزان از طریق بهبود وضعیت ریشه‌های کارآمد و افزایش بیان ژن PIP، باعث افـزایش جـذب آب شـده و همچنین با کاهش تعرق در گیاه، باعث حفظ محتوای نسبی آب برگ در شرایط تنش شده است (11).

نتیجه‌گیری کلی

براساس نتایج بدست آمده در این تحقیق، در مناطق تحت تنش شوری با کاربرد کیتوزان می توان از طریق حفظ محتوای نسبی آب برگ، افزایش پتاسیم و رشد رویشی بخش هوایی و ریشه را بهبود ببخشد و باعث افزایش تحمل گیاه به تنش شد. بنابراین می توان ازکیتوزان به عنوان یک پلیمر زیستی بیخطر در افزایش مقاومت به تنش شوری استفاده نمود.

1- ایوبی، ا.، و رحمانی، ف.، 1395. مطالعه تغییرات میزان بیان دو ژنی ZmPIP تحت تنشهای محیطی غیرزنده در برگ ذرت، تنشهای محیطی در علوم زراعی، 9(4)، صفحات 417- 422.

2- امیری، ا.، سیروس مهر، ع.، و اسمعیل زاده بهابادی، ص.، 1394. اثر محلول پاشی اسید سالیسیلیک و کیتوزان بر عملکرد گیاه گلرنگ در شرایط تنش خشکی، مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)، 28(4)، صفحات 712-725.

3- خواجه پور، م.، 1383. تولید نباتات صنعتی، انتشارات دانشگاه صنعتی اصفهان.

4- موسی پور یحیی آبادی، ح.، اصغری پور، م.ر.، و بصیری، م.، 1395 . نقش کیتوزان در بهبود مقاومت به شوری از طریق تأثیر بر برخی خصوصیات مورفولوژیک و فیزیولوژیک گیاه شنبلیله (Trigonella foenum-graecum L.)، علوم و فنون کشت های گلخانه ای، 7 ( 27)، صفحات 174-165.

5- مقیمی مقدم، س. ن.، کلارستاقی،ک.، و صدر آبادی، ر.، 1393. بررسی اثرات توسعه ریشه در ارتباط با تحمل به خشکی در چهار رقم گندم، فصلنامه ی علوم به زراعی گیاهی، 4(2)، صفحات 9-13.

6- مهدوی، ب.، مدرس ثانوی، س.ع.م.، آقا علیخانی، م.، و شریفی، م.، 1392. اثر غلظتهای مختلف کیتوزان بر جوانه زنی و آنزیمهای آنتی اکسیدانت، مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)، 26(3)، صفحات 352-365.

7- Acemi, A., 2020. Chitosan versus plant growth regulators: a comparative analysis of their effects on in vitro development of Serapias vomeracea (Burm.f.) Briq. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 141, PP: 327- 338, doi.org/10.1007/s11240-020-01789-3.

8- Acosta-Motos, J.R., Ortuno, M.F., Bernal-Vicente, A.B., Diaz-Vivancos, P., and Sanchez-Blanco, M.J., 2017. Plant responses to salt stress: adaptive mechanisms. Agronomy, 7, 18p. doi:10.3390/agronomy7010018.

9- Afzal, Z., Howton, T.C., Sun, Y., and Mukhtar, M.S., 2016. The roles of aquaporins in plant stress responses. Journal of developmental biology, 4(1), 9 p. doi.org/10.3390/jdb4010009.

10- ALKahtani, M.D.F., Attia, K.A., Hafez, Y.M., Khan, N., Eid, A.M., Ali, M.A.M., and Abdelaal, K.A.A., 2020. Chlorophyll fluorescence parameters and antioxidant defense system can display salt tolerance of salt acclimated sweet pepper plants treated with chitosan and plant growth promoting rhizobacteria. Agronomy, 10, 1180 p. doi:10.3390/agronomy10081180.

11- Almenida, L.G., Magalhaes, P., Karam, D., Da Silva, E., and Alvarenga, A.A., 2020. Chitosan application in the induction of water deficit tolerance in maize plants. Acta Scientiarum Agronomy, 42, 27 p. doi.org/10.4025/actasciagron.v42i1.42463.

12- Al-Whaibi, M.H., Siddiqui, M.H., and Basalah, M.O., 2012. Salicylic acid and calcium induced protection of wheat against salinity, Protoplasma, 249, PP: 769-778. doi: 10.1007/s00709-011-0322-1.

13- Ansari, M., Shekari, F., Mohammadi, M.H., Juhos, K., Végvári, G., and Biró, B., 2019. Salt-tolerant plant growth-promoting bacteria enhanced salinity tolerance of salt-tolerant alfalfa (Medicago sativa L.) cultivars at high salinity, Acta Physiologiae Plantarum, 41(12), 195p. doi.org/10.1007/s11738-019-2988-5.

14- Ansari, S.H., Ansari, M.I., Fujita, M., and Hasanuzzaman, M., 2021. Abiotic stress and reactive oxygen species: generation,signaling, and defense mechanisms. Antioxidants, 10: 277. doi.org/10.3390/antiox10020277.

15- Assaha, D.V.M., Ueda, A., Saneoka, H., Al Yahyai, R., and Yaish, M.W., 2017. The Role of Na⁺ and K⁺ transporters in salt stress adaptation in glycophytes, Frontiers in Physiology, 8, 500 p. doi.org/10.3389/fphys.2017.00509.

16- Channuntapipat, C., Wirthensohn, M., Ramesh, S.A., Batlle, I., Arús, P., Sedgley, M., and Collins, G., 2003. Identification of incompatibility genotypes in almond (Prunus dulcis Mill.) using specific primers based on the introns of the S‐alleles. Plant Breeding. 122(2):164-8. doi.org/10.1046/j.1439-0523,2003.00842.X.

17- Chumont, F., and Tyerman, S.D., 2014. Aquaporins: Highly regulated channels controlling plant water relations. Plant Physiology, 164, PP: 1600-1618. doi.org/10.1104/.113.233791.

18- Demidchik, V., Straltsova, D., Medvedev, S.S., Pozhvanov, G.A., Soko-lik, A., and Yurin, V., 2014. Stress-induced electrolyte leakage: The role of K⁺ permeable channels and involvement in programmed cell death and metabolic adjustment. Journal of Experimental Botany, 65, PP: 1259–1270. doi: 10.1093/jxb/eru004.

19- Dzung, N.A., Khanh, V.T., and Dzung, T.T., 2011. Research on impact of chitosan oligomers on biophysical characteristics, growth, development and drought resistance of coffee. Carbohydrate Polymers, 84(2), PP:751-5, doi: 10.1016/j.carbpol.2010.07.066.

20- Ferreira, J.F.S., Barros, J., Liu, X., and Sandhu, D., 2020. Spinach plants favor the absorption of K⁺ over Na⁺ regardless of salinity, and may benefit from Na⁺ Wwhen K⁺ is deficient in the soil. Plants, 9, 507 p. doi:10.3390/plants9040507.

21- Geng, W., Li, Z., Hassan, M., and Peng, Y., 2020. Chitosan regulates metabolic balance, polyamine accumulation, and Na⁺ transport contributing to salt tolerance in Creeping bentgrass, BMC Plant Biology, 20, 506 p. doi.org/10.1186/s12870-020-02720-w.

22- Gupta, B., and Huang, B., 2014. Mechanism of salinity tolerance in plants: physiological, biochemical, and molecular characterization, International Journal of Genomics, Article ID 701596 | doi.org/10.1155/2014/701596.

23- He, M., and Ding, N.Z., 2020. Plant unsaturated fatty acids: multiple roles in stress response, Front Plant Science, 11, 562785 p. doi: 10.3389/fpls.2020.562785.

24- Hnilickova, H., Hnilicka, F., Orsak, M., and Heinak, V., 2019. Effect of salt stress on growth, electrolyte leakage, Na⁺and K⁺ content in selected plant species. Plant, Soil and Environment, 65 (2), PP: 90–96. doi.org/10.17221/620/2018-PSE.

25- Horie, T., Kaneko, T., Sugimoto, G., Sasano, S.H., Panda, S., and Shibasaka, M., 2011. Mechanisms of water transport mediated by PIP aquaporins and their regulation via phosphorylation events under salinity stress in barley roots. Plant and Cell Physiology 52(4), PP:663-75. doi: 10.1093/pcp/pcr027.

26- Huang, D., Wu, W., Abrams, S.R., and Cutler, A.J., 2008. The relationship of drought-related gene expression in Arabidopsis thaliana to hormonal and environmental factors. Journal of experimental Botany, 59(11), PP: 2991-3007, doi: 10.1093/jxb/ern155

27- Isayenkov, S.V., and Maathuis, F.J.M., 2019. Plant Salinity Stress: Many Unanswered Questions Remain. Frontiers in Plant Science, 10, 80 p. doi.org/10.3389/fpls.2019.00080.

28- Kamran, M., Parveen, A., Ahmar, S., Malik, Z., and Hussain, S., 2020. An overview of hazardous impacts of soil salinity in crops, tolerance mechanisms, and amelioration through Sselenium supplementation. International Journal of Molecular Sciences, 21, 148 p. doi:10.3390/ijms21010148.

29- Marulanda, A., Azcón, R., Chaumont, F., Ruiz-Lozano, J.M., and Aroca, R., 2010. Regulation of plasma membrane aquaporins by noculation with a Bacillus megaterium strain in maize (Zea mays L.) plants under unstressed and salt-stressed conditions, Planta, 232(2), PP: 533 -543, doi: 10.1007/s00425-010-1196-8.

30- Mahdavi, B., 2013. Seed germination and growth responses of Isabgol (Plantago ovata Forsk) to chitosan and salinity, International Journal of Agriculture and Crop Sciences, 5(10), 1084 p.

31- Manickavelu, A., Kambara, K., Mishina, K., and Koba, T., 2007. An efficient method for purifying high quality RNA form wheat pistils. National Library of Medicine, 54(2), PP: 254- 258.

32- Mervat, S.H., Sadak, I., and Talaat, M., 2021. Attenuation of negative effects of saline stress in wheat plant by chitosan and calcium carbonate. Bulletin of the National Research Centre, 45, 136 p. doi.org/10.1186/s42269-021-00596-w.

33- Mohammadi, G.R., and Amiri, F., 2010. The effect of priming on seed performance of canola (Brassica napus L.) under drought stress, American-Eurasian Journal of Agricultural & Environmental Sciences, 9(2), PP: 202-207.

34- Munns, R., Tester, M., 2008. Mechanisms of salinity tolerance. The Annual Review of Plant Biology, 59, PP: 651–81. doi.org/10.1146/annurev.arplant.59.032607.092911.

35- Nkulu, N.K., Imran, Q.M., Lee, I., and Yun, B., 2020. Salinity stress-mediated suppression of expression of salt overly sensitive signaling pathway genes suggests negative regulation by AtbZIP62 transcription factor in Arabidopsis thaliana. International journal of Molecular, 21, 1726 p, doi:10.3390/ijms21051726 Sciences.

36- Patel, D., and Saraf, M., 2013. Infuence of soil ameliorants and microfora on induction of antioxidant enzymes and growth promotion of Jatropha curcas L., under saline condition. European Journal Soil Biology, 55, PP: 47–54. doi.org/10.1016/j.ejsob i.2012.12.004

37- Sairam, R.K., and Srivastava, G.C., 2001. Water stress tolerance of wheat (Triticum aestivum L.): variations in hydrogen peroxide accumulation and antioxidant activity in tolerant and susceptible genotypes. Journal of Agronomy and Crop Science, 186(1), PP: 63-70. doi.org/10.1046/j.1439-037x.2001.00461.X

38- Shabala, S., Demidchik, V., Shabala, L., Cuin, T.A., Smith, S.J., Miller, A.J., Davies, J.M., and Newman, I.A., 2006. Extracellular Ca²⁺ ameliorates NaCl induced K⁺ loss from arabidopsis root and leaf cells by controlling plasma membrane K⁺ permeable channels, Plant Physiology 141, PP: 1653–1665. doi: 10.1104/pp.106.082388.

39- Shams Peykani, L., and Farzami Sepehr, M., 2018. Effect of chitosan on antioxidant enzyme activity, proline, and malondialdehyde content in Triticum aestivum L. and Zea maize L. under salt stress condition'. Iranian Journal of Plant Physiology, 9(1), PP: 2661- 2670. doi: 10.22034/ijpp.2018.545906.

40- Shahid, M.A., Pervez, M.A., Balal, R.M., Mattson, N.S., Rashid, A., Ahmad, R., Ayyub, C.M., and Abbas, T., 2011. Brassinosteroid (24-epibrassinolide) enhances growth and alleviates the deleterious effects induced by salt stress in pea ('Pisum sativum'L.), Australian Journal of Crop Science, 5(5), 500 p.

41- Shahid, M.A., Sarkhosh, A., Khan, N., Balal, R.M., Ali, S.H., Rossi, L., and Gomez, C., 2020. Insights into the physiological and biochemical impacts of salt stress on plant growth and development, Agronomy, 10(7), 938 p. doi.org/10.3390/agronomy10070938.

42- Sharif, D., Mamdouh, Z., Elkafafi, S.H., and Zedan, A., 2017. Effect of nano chitosan on growth, physiological and biochemical parameters of Phaseolus vulgaris under salt stress. International Journal of Plant Production 8(5), doi: 10.21608/jpp.2017.40468.

43- Tian, Y., Zhou, D., Yu, J., Li, G., and Lou, Y., 2014. Responses of seed germination, seedling growth, and seed yield traits to seed pretreatment in maize (Zea mays L.), The Scientific World Journal, 834630, PP: 1-8. doi.org/10.1155/2014/834630.

44- Ullah, N., Basit, A., Ahmad, IUllah, I., Shah, S.T., Mohamed, H., Javed, S.H., 2020. Mitigation the adverse effect of salinity stress on the performance of the tomato crop by exogenous application of chitosan. Bulletin of the National Research Centre, 44,181 p. doi.org/10.1186/s42269-020-00435-4.

45- Wang, Q., Guan, C., and Wang, S.M., 2014. Coordination of AtHKT1 and AtSOS1 facilitates Na⁺ and K⁺ homeostasis in Arabidopsis thaliana under salt stress. Journal of Plant Biology, 57(5), PP: 282–90. Doi: 10.1007/s12374-014-0222-y.

46- Wang, G., Wang, Q., Lin, X., Ng, T.B., Yan, R., Lin, J., and Ye, X., 2016. A novel cold-adapted and highly salt-tolerant esterase from Alkali bacterium sp. SL3 from the sediment of a soda lake. Scientific reports, 6, 19494 p. doi: 10.1038/srep19494.

47- Wheatherley, P.E., 1973. Studies in the water relations of cotton plants. The field measurement of water deficit in leaves. New Phytologist, 49, PP: 81–87. doi.org/10.1111/j.1469-8137.1950.tb05146.x

48- Zayed, M.M., Elkafafi, S.H., Zedan, A.M.G., and Dawoud, S.H., 2017. Effect of nano chitosan on growth, physiological and biochemical parameters of Phaseolus Vulgaris under Salt Stress. Journal of. Plant Production, 8 (5), PP: 577 -585.

49- Zhang, X., Lei, L., Lai, J., Zhao, H., and Song, W., 2018. Effects of drought stress and water recovery on physiological responses and gene expression in maize seedlings. BMC Plant Biology, 18, 68 p. doi.org/10.1186/s12870-018-1281-x.

50- Zhang, G., Wang, Y., Wu, K., Zhang, Q., Feng, Y., Miao, Y., and Yan, Z., 2012. Exogenous applications of chitosan alleviate salinity stress in Lettuce (Lactuca sativa L.). Horticulturae, 7, 342 p, doi.org/10.3390/horticulturae7100342.

51- Zhu, C., Schraut, D., Hartung, W., and Schäffner, A.R., 2005. Differential responses of maize MIP genes to salt stress and ABA, Journal of Experimental Botany, 56(421), PP: 2971-2981. doi.org/10.1093/jxb/eri294.