بهینه کردن انتقال ژن نایسین به واسطه­ی اگروباکتریوم در گیاه هویج

معصومه فلاح زیارانی¹، مسعود توحیدفر¹ و محمد حسین میرجلیلی²

¹ ایران، تهران، دانشگاه شهید بهشتی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، گروه علوم و زیست فناوری گیاهی

² ایران، تهران، دانشگاه شهید بهشتی، دانشکده گیاهان دارویی، گروه گیاهان دارویی

تاریخ دریافت: 06/02/1400          تاریخ پذیرش: 07/09/1400

چکیده

نایسین یک آنتی­باکتریال طبیعی است که به عنوان نگهدارنده در مواد غذایی و داروها استفاده می­شود. تولید گیاهچه­ی تراریخته هویج حاوی پروتئین نوترکیب نایسین به واسطه­ی اگروباکتریوم، سویه­ی LBA4404 و پلاسمید pBI121 بررسی شد. پلاسمید pBI121 حاوی ژن­های گزارشگر  NPTIIبه ترتیب با پیشبرهایCaMV35S  و ترمیناتورNOS  می­باشد. به منظور تهیه­ی پلاسمید نوترکیب، ابتدا ژن نایسین از باکتری لاکتوکوکوس لاکتیس شناسایی شد. پس از بهینه­سازی کدونی، بین دوسایت برشی BamHI و SacI در وکتورpBI121  کلون سازی شد. ریزنمونه­های ریشه، برگ، ساقه و گره-ی هویج با سوسپانسیون اگروباکتریوم حاوی پلاسمید نوترکیب با غلظت­های مختلف مایه تلقیح (با OD 4/0، 6/، 8/0 و 1) آلوده شدند و در زمان­های مختلف هم­کشتی (0، 1، 2 و 3 روز) قرار داده شدند و بعد از سه روز در محیط کشت کالوس­زایی حاوی کانامایسین و سفاتاکسیم کشت شدند. کالوس­هایی که قادر به رشد روی محیط گزینش بودند، انتخاب و به محیط باززایی حاوی کانامایسین و سفاتاکسیم در سه غلظت 100، 250 و 500 میلی­گرم در لیتر منتقل شدند. کالوس­زایی در 40 درصد ریزنمونه­ها مشاهده شد. 55 درصد کالوس­های مقاوم، جنین­زا شدند. جنین­های تولید شده پس از جوانه زنی به محیط باززایی منتقل شدند. بیشترین درصد گیاهان مقاوم به کانامایسین (45 درصد) مربوط به استفاده ازریزنمونه-ی ساقه و غلظت باکتری 6/0 تا 8/0 و زمان­های مختلف هم­کشتی 1و 2 روز و غلظت 250 میلی­گرم در لیتر سفاتاکسیم بود. به منظور اطمینان از عدم آلودگی گیاهان به اگروباکتریوم و تأیید صحت انتقال ژن، واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی Vir Gene انجام و صحت انتقال ژن تأیید شد. واکنش زنجیره ای پلی مراز نشان داد که 60 درصد گیاهان تراریخته فرضی، حداقل یک نسخه از ژن های nptII و نایسین را در ژنوم خود دارا هستند.

واژه­های کلیدی: نایسین، گیاه تراریخته، هویج، لاکتوکوکوس لاکتیس، nptII

* نویسنده مسئول، تلفن: 00989124627014+  ، پست الکترونیکی: m_tohidfar@sbu.ac.ir

مقدمه

رشد میکروارگانیسم­ها در غذا موجب واکنش­های شیمیایی و آنزیمی می­شود که در نتیجه­ی آن تغییراتی در رنگ، طعم، بافت، غلظت، ارزش غذایی و سلامت آن ایجاد می­کند. آلودگی میکروبی علت اصلی فساد مواد غذایی است. رشد میکروبی ناخواسته در غذاها به سلامت افراد و به اقتصاد ملی ضرر می­زند. بنابراین، جلوگیری یا تأخیر در ایجاد تغییرات مختلف در یک محصول غذایی ضروری است. مواد نگهدارنده، موادی هستند که به منظور جلوگیری، کاهش یا محافظت رشد میکروب­ها و یا فساد ناشی از تغییرات شیمیایی، به مواد غذایی یا دارویی در دوره­ی نگهداری و در هنگام مصرف، در فرمولاسیون آن اضافه می­شوند (37). انواع مختلفی از نگهدارنده­ها در صنایع غذایی مورد استفاده قرار می­گیرند. این ترکیبات یا منشأ طبیعی دارند و یا به صورت سنتتیک (شیمیایی) تولید می­شوند (27). بنزوآت­ها، نیتریت­ها، سولفیت­ها، سوربات­ها نمونه­هایی از نگهدارنده­های شیمیایی هستند که در مواد غذایی استفاده می­شوند (30). برخی از نگهدارنده­های مواد غذایی مانند دی اکسید گوگرد و نیتریت­ها مضرر هستند. دی اکسید گوگرد باعث تحریک لوله های تنفسی و نیتریت سرطان­زا ­است (27). نگرانی­هایی در مورد اثرات مضرر افزودنی­های شیمیایی وجود دارد. از جمله مشکلات استفاده از نگهدارنده­های شیمیایی آسیب به کبد به دلیل فشار وارده به کبد برای دفع این نگهدارنده­ها و افزایش ابتلا به سرطان می­باشد (27). به منظور رفع این مشکلات، امروزه نگهدارنده­های طبیعی مورد توجه زیادی قرارگرفته_­اند. نگهدارنده­های طبیعی، منشأ گیاهی یا جانوری دارند و یا از منابع میکروبی حاصل می­شوند که این نگهدارنده­ها به نگهدارنده­های سبز معروف هستند (8و 36). از بین نگهدارنده­های طبیعی، نگهدارنده­های تولید شده توسط میکروب­ها مورد توجه بیشتری قرارگرفته­اند. نمونه­ای از نگهدارنده­های میکروبی شامل اسیدها، باکتریوسین­ها، الکل و دی استیل می­باشند (5و 36).

تعداد زیادی از باکتری­های لاکتیک اسید و دیگر باکتری های گرم مثبت پپتیدهایی تولید می­کنند که فعالیت ضد میکروبی دارند (22). این پپتیدها دارای طیف وسیعی از فعالیت­ها هستند. یک کلاس از این پپتیدهای ضدمیکروبی که در سال­های اخیر توجه زیادی را به خود جلب کرده اند لانتی­بیوتیک­ها هستند (7). برجسته­ترین لانتی­بیوتیک که در حال حاضر استفاده می­شود نایسین است که توسط چندین استرین از لاکتوکوکوس لاکتیس تولید می­شود (10 ،13 ،18 ،19 و 34). نایسین به عنوان ماده ­ی نگهدارنده­ی غذایی به مدت طولانی در کشورهای مختلف به طور گسترده استفاده شده و امروزه به علت گرایش مصرف­کنندگان به نگهدارنده­های زیستی، مصرف این مواد در صنایع غذایی افزایش یافته است (13 و26).

تاکنون ژن ضدمیکروبی به گیاه  منتقل  نشده  است.  اما  از

عصاره­ی گیاهان دارویی به منظور کنترل باکتری­های گرم مثبت و منفی استفاده شده است. Elisha و همکاران در سال 2017 از عصاره­ی برگ­های 9 گیاه شاملHypericum roeperianum G.W. Schimp.exA. Rich. var. Roeperianum, (Hypericaceae, PRU 120126), Cremaspora triflora (Thonn.) K., Schum (Rubiaceae, PRU 120129), Heteromorpha arborescens (Spreng.) Chan. &Schltdl (Apiaceae, PRU 120026), Pittosporum viridiflorum Sims (Pittosporaceae, PRU 120025), Bolusanthus speciosus (H. Bolus) Harms (Fabaceae, PRU 120027), Calpurnia aurea (Aiton) Benth ssp aurea (Fabaceae, PRU 120125), Maesa lanceolata Forssk (Maesaceae PRU120125), Elaeodendron croceum (Thunb.) DC (Celastraceae, PRU 120127)  و Morus mesozygia Stapf ex A.Chev (Moraceae, PRU 120128)) (21) و Mostafa و همکاران از عصاره­ی گیاهان Punica granatum, Syzygium aromaticum, Zingiberofficinales و Thymus vulgaris استفاده کردند (2). نتایج، اثرات بازدارندگی عصاره­ی این گیاهان بر روی تعدای از باکتری­های گرم منفی شامل اشرشیاکولای و گرم مثبت شامل استافیلوکوکوس اورئوس را ثابت کرد. Manandhar و همکاران از عصاره­ی متانولی گیاهان دارویی (Oxalis corniculata, Artemisia vulgaris, Cinnamomum tamala, and Ageratina adenophora) (33 ،38) و Atef1 و همکاران از عصاره­ ی برگ گیاهان داروییMoringa oleifera L.  و Matricaria recutita استفاده کردند (29) و نتیجه مانند تحقیقات قبلی بود.

باوجود اهمیت نایسین، تاکنون پروتئین نایسین به گیاه منتقل نشده است (23). هدف از این تحقیق بررسی تولید پروتئین نایسین در گیاه هویج با استفاده از چهار ریزنمونۀ مختلف توسط اگروباکتریوم به روش باززایی غیرمستقیم می­باشد.

مواد و روشها

دریافت توالی ژن نایسین و بهینه­سازی کدونی ژن نایسین: توالی ژن نایسین از باکتری لاکتوکوکوس لاکتیس از سایت NCBI با کد MG913135.1 دریافت شد. بهینه­سازی کدونی به منظور بیان این ژن در گیاه با استفاده از سایت (http://www.kazusa.or.jp/codon) انجام شد (3 و 20).

پس از بهینه­سازی به منظور اطمینان یافتن از عدم تغییر فعالیت پروتئین جدید، توالی جدید در سایت NCBI به منظور یافتن توالی­های مشابه مورد جست و جو قرارگرفت. به منظور تأیید عدم­تغییر فعالیت پروتئین تولیدشده پس از بهینه­سازی­کدونی، فعالیت پروتئین جدید بوسیله­ی سایت Blocks (http://blocks.fhcrc.org)  نیز بررسی شد.

طراحی سازه: سازه‌­ی طراحی شده حاوی ژن نایسین با عناصر تنظیمی مناسب جهت تولید هویج حاوی پروتئین ضد­باکتری در شکل 1 آورده شده است (شکل 1).

شکل1- نقشه­ی فیزیکی پلازمید نوترکیب pBI121 حاوی ژن ضد باکتری نایسین. Kan R: نشانگر مقاومت به کانامایسین. KDEL: پپتید نشانه برای جمع­آوری پروتئین در پلاستید. توالی Kozak: برای افزایش بیان ژن در گیاه. پروموتر CamV35s خاتمه دهنده­ی NOS. ژن نایسین از باکتری لاکتوکوکوس لاکتیس که به منظور بیان بیشتر در گیاه بهینه­سازی شده است.

ابتدا ژن نایسین حاوی توالی کزاک و توالی نشانه­ی KDEL بین دو سایت برشی BbmHI و SacI در پلازمید pBI121 کلون شد. به منظور جمع­آوری پروتئین نایسین در شبکه آندوپلاسمی، توالی نشانه­ی KDEL به انتهای ژن اضافه شد. ژن نایسین تحت پیشبر CaMV35S و ترمیناتورNOS  قرارگرفت. سازه­ی نوترکیب، ابتدا در باکتری E.coli استرین Dh5α تراریخت شد. کلونی­های رشد کرده در محیط LB حاوی 50 میلی­گرم در لیتر کانامایسین غربال شدند. در مرحله­ی بعد پلازمید pBI121 نوترکیب به اگروباکتریوم سویه­ی LBA4404 تراریخت شد (1). به منظور غربالگری از محیط (LB) Luria-Bertani حاوی کانامایسین و ریفامپسین استفاده شد و کلون­های رشد کرده در این محیط انتخاب شدند.

ضدعفونی بذر: بذر هویج رقم Nantes از موسسه­ی اصلاح نهال و بذر کرج تهیه شد. به منظور ضد­عفونی، بذور به مدت 1 دقیقه در اتانول 90 درصد و سپس 20 دقیقه در محلول هیپوکلریت 5 درصد قرار داده شدند. سپس با آب دو بار تقطیر شده سه تا پنج بار شست و شو داده شده و به مدت یک شب بذرهای ضدعفونی شده در آب دو بار تقطیر شده قرار داده شدند. بذرها روی محیط (Murashige and Skoog) ½MS محتوی ساکارز 3 و 8/0 درصد آگار کشت شدند.

انتقال ژن: از اگروباکتریوم سویه­ی LBA4404 یک کلونی درفالکون CC50 حاوی CC5 محیط LB مایع و آنتی­بیوتیک (بسته به نوع سازه­ی مورد استفاده متفاوت است) ریفامپسین (500 میلی­گرم در لیتر) و کانامایسین (50 میلی­گرم در لیتر) کشت داده شد. سپس فالکون برای مدت 48 ـ24 ساعت در دمای 28 درجه­ی سانتی‌گراد بر روی شیکر با دورrpm 220 قرارگرفت. پس از 24 تا 48 ساعت، 200 میکرولیتر از باکتری رشد کرده به CC5 محیط LB مایع حاوی ریفامپسین و 50 میلی­گرم در لیتر کانامایسین اضافه شده و برای حدود 7 ساعت بر روی شیکر در28 درجه­ی سانتیگراد قرار داده شد تا غلظت باکتری بهoptical density (OD) 4/0، 6/0، 8/0 و 1 برسد. ریزنمونه‌‌های برگ، ساقه، ریشه و گره گیاه هویج 14 روزه در محلول باکتری به مدت 5 ،10 ،15 دقیقه غوطه­ور شدند. پس از خشک کردن با کاغذ صافی، هم­کشتی نمونه‌‌ها به مدت صفر، یک، دو و سه روز در محیط کشت (نمک‌‌های MS محتوی ساکارز 3 و 8/0 درصد آگار) در تاریکی انجام شد. سپس ریزنمونه‌‌ها به محیط کالوس­زایی حاوی نمک‌‌های MS، 1 میلی­گرم در لیتر (NAA)Naphthaleneacetic acid  و همراه با 50 میلی­گرم در لیتر کانامایسین با دوره نوری 16 ساعت روشنایی و دمای 28 درجه سانتی­گراد و شدت نوری 2800 لوکس انتقال داده شدند. برای حذف احتمالی آلودگی اگروباکتریوم از آنتی­بیوتیک سفاتاکسیم در غلظت 100 ، 250 و 500 میلی­گرم در لیتر استفاده شد. 5 تا 6 هفته، پس از انتقال ریزنمونه­ها به محیط کالوس­زایی، کالوس­های تشکیل شده در محیط حاوی کانامایسین به منظور جنین­زایی به محیط MS حاوی 1 میلی­گرم در لیتر NAA، 50 میلی­گرم کانامایسین و سفاتاکسیم به مدت 3 -2 هفته منتقل ‌‌شدند. جنین­ها به منظور تولید گیاهچه به محیط مشابه محیط قبلی منتقل شدند. شرایط نوری در تمام مراحل رشد یکسان (دمای 28 درجه­ی سانتی­گراد و 16ساعت روشنایی، 8 ساعت تاریکی بود). برای انتقال گیاهچه‌‌ها به گلدان به نسبت 1:1:1 ماسه: ورمیکولیت: پیت استفاده شده و هر روز گیاهچه‌‌ها با آب اسپری ‌‌شدند تا ریشه­ی هویج تشکیل و گیاه کامل تشکیل شود. درصد کالوس­زایی و جنین­زایی در تمام مراحل بررسی شد.

تجزیه­ی PCR گیاهان تراریخت احتمالی: به منظور استخراج DNA از برگ از روش تغییر یافته­یDellaporta  استفاده شد (6و 9). برای غربال اولیه­ی گیاهان تراریخت احتمالی و تأیید اولیه حضور ژن در آنها از روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با آغازگرهای اختصاصی ژن و همچنین آغازگرهای اختصاصی نشانگر کانامایسین استفاده شد. PCR (Polymerase chain reaction) در حجم 25 میکرولیتر (5/12 میکرولیتر از اجزای تشکیل دهنده واکنش) (Master pcr)، 1 میکرولیتر DNA ( ng/µl50-100(، 1 میکرولیتر آغازگر رو به جلو (10 پیکومول)، 1 میکرولیتر پرایمر معکوس (10 پیکومول)، 5/9 میکرولیتر آب مقطر استریل) انجام شد.

آغازگرهای استفاده شده به منظور انجام PCR برای نشانگر NPTII، ژن نایسین و ژن VirG در جدول زیر آورده شده است.

جدول 1- توالی آغازگرهای رو به جلو و معکوس نشانگر NPTII، ژن نایسین و ژن VirG

شرایط انجام PCR برای ژن nptII به صورت زیر می­باشد. مرحله­ی اول شامل واسرشت سازی اولیه در دمای 94 درجه سانتی­گراد به مدت 2 دقیقه، مرحله­ی دوم شامل 35 چرخه و دمای 94 درجه سانتی­گراد به مدت 1 دقیقه، 55 درجه سانتی­گراد به مدت 1 دقیقه و 72 درجه سانتی­گراد به مدت 3 دقیقه و مرحله نهایی 72 درجه سانتی­گراد 5 دقیقه انجام شد. برای آغازگرهای ژن نایسین برنامه­ی چرخه­ی حرارتی شامل واسرشت­سازی اولیه در دمای 94 درجه سانتی­گراد به مدت 2 دقیقه، مرحله­ی دوم شامل 35 چرخه و دمای 94 درجه سانتی­گراد به مدت 1 دقیقه، 62 درجه سانتی­گراد به مدت 1 دقیقه و 72 سانتی­گراد درجه به مدت 1 دقیقه و مرحله­ی نهایی 72 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه صورت گرفت. به منظور اطمینان از عدم آلودگی گیاهان تراریخت به اگروباکتریوم، DNA استخراج شده بوسیله­ی آغازگرهای اختصاصی ژن vir، توسط واکنش زنجیره ای پلیمراز بررسی شدند. شرایط واکنش زنجیره ای پلیمراز برای ژن vir به صورت زیر می­باشد. مرحله­ی اول شامل واسرشت سازی اولیه در دمای 94 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه، مرحله­ی دوم شامل 35 چرخه و دمای 94 درجه سانتی­گراد به مدت 1 دقیقه، 58 درجه سانتی­گراد به مدت 1 دقیقه و 72 درجه سانتی­گراد به مدت 1 دقیقه و مرحله نهایی 72 درجه سانتی­گراد 7 دقیقه انجام شد.

محصولات تکثیری بوسیله­ی الکتروفورز روی ژل آگارز 1 درصد تفکیک شد و در دستگاه Gel Doc (Syngene) عکس­برداری و برای حضور یک نوار اختصاصی مورد بررسی قرارگرفت.

نتایج

تأیید انتقال ژن به اگروباکتریوم: به منظور تأیید انتقال ژن به اگروباکتریوم، از روش واکنش زنجیره ای پلیمراز با آغازگرهای اختصاصی ژن nptII و آغازگرهای ژن نایسین استفاده شد. با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن نایسین باند  bp978 و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن nptII باند  bp785 در محصول PCR آشکار شد. اما در اگروباکتریوم غیرتراریخت و کنترل منفی باندهای مورد نظر مشاهده نشدند که نشان دهنده نوترکیب باکتری است.

انتقال ژن و تجزیه­ی PCR گیاهان تراریخت احتمالی: بذرهای ضدعفونی شده بعد از هفت روز جوانه زدند و گیاهان 15روزه جهت تهیه ریزنمونه­ها استفاده شد. کارایی ضدعفونی 100 درصد بود و هیچ­گونه آلودگی قارچی و باکتریایی مشاهده نشد.

پس از غوطه­وری ریزنمونه­ها در مایع تلقیح و قراردادن ریزنمونه­ها در محیط انتخابی ریزنمونه­هایی که ژن مورد نظر را دریافت نکرده­اند سفید شده و از بین رفتند. ریزنمونه­هایی که در محیط انتخابی سالم مانده­اند به منظور کالوس­زایی، جنین­زایی و تولید گیاهچه در محیط مشابه محیط قبلی هر دو هفته یکبار واکشت شدند (شکل 2، A, B, C).

شکل 2- مراحل القای کالوس و باززایی هویج­های تراریخته با ورکتور pBI121 حاوی ژن نایسین. A. القای کالوس تراریخته­ی احتمالی در محیط انتخابی، B. جنین­زایی تراریخته­ی احتمالی در محیط انتخابی C. باززایی هویج­های تراریخت احتمالی در محیط انتخابی D. گیاهچه­ی ریشه­دار شده از ریزنمونه­ی ساقه در محیط انتخابی E. گیاه تراریخته احتمالی در گلدان در شرایط گلخانه.

دراین مراحل صفات مختلفی اندازه گیری شد به طوری که بیشترین درصد کالوس‌زایی (60 درصد)، جنین‌زایی (55 درصد) و تولید گیاهچه در محیط انتخابی از ریزنمونه‌ی ساقه (45 درصد) به دست آمد. کمترین میزان کالوس‌زایی، جنین‌زایی و ساقه‌زایی (صفر درصد) از ریزنمونه‌ی گره به دست آمد. بعد از ریزنمونه‌ی ساقه، ریزنمونه‌ی ریشه و سپس ریزنمونه‌ی برگ به ترتیب بیشترین میزان کالوس‌زایی، جنین‌زایی و ساقه‌زایی را دارد (شکل 3).

شکل 3- درصد کالوس-زایی، جنین­زایی و ساقه­زایی از چهار ریزنمونه­ی استفاده شده (ساقه، ریشه، برگ و گره) در محیط کشت انتخابی همراه با خطای استاندارد

بهترین نتیجه از مایه تلقیح با غلظت 6/0 تا 8/0 به دست آمد. در غلظت 4/0 درصد تراریختی به شدت کاهش یافت و در غلظت 1 نیز به دلیل آلودگی ریزنمونه­ها درصد تراریختگی کاهش یافت (جدول 2).

جدول 2- درصد تراریختگی در غلظت­های مختلف اگروباکتریوم (OD)

درصد تراریختگی از تعداد گیاهانی که تراریختگی در آن­ها ثابت شده است نسبت به کل گیاهان باززایی شده در محیط انتخابی به دست آمد. بهترین درصد تراریختگی و کنترل اگروباکتریوم از غلظت 250 میلی­گرم در لیتر سفاتاکسیم به دست آمد. در غلظت 100 میلی­گرم در لیتر سفاتاکسیم به دلیل آلودگی اگروباکتریوم درصد تراریختگی کاهش یافت و در غلظت 500 میلی­گرم در لیتر به دلیل اثر بازدارندگی بر رشد ریزنمونه­ها نیز درصد تراریختی کاهش یافت (جدول 3).

جدول 3- درصد تراریختگی در استفاده از غلظت­های مختلف سفاتاکسیم

دراین آزمایش سه زمان تلقیح شامل 5، 10 و 15 دقیقه استفاده شد. در زمان تلقیح 15 دقیقه به دلیل آلودگی ریزنمونه­ها به اگروباکتریوم و از بین رفتن بافت درصد تراریختگی (30 درصد) کاهش یافت، اما در زمان تلقیح 5 و10 دقیقه درصد تراریختگی (60 درصد) بیشتر بود و هیچ گونه آلودگی اگروباکتریوم مشاهده نشد. این دو زمان تلقیح از نظر تراریختگی تفاوتی با هم نداشتند.

نتایج واکنش زنجیره-ای پلیمراز نشان داد از 5 گیاه رشد کرده در محیط انتخابی، 3 گیاه هر دو باند مورد نظر تکثیر شده به وسیله­ی پرایمرهای اختصاصی ژن نایسین و پرایمرهای نشانگر کانامایسین را نشان دادند (شکل های 5 و 6).

شکل 4- محصول واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن نایسین در گیاه هویج. L. نشانگر اندازه وزن مولکولی DNA (1 Kb)، 1. گیاه غیرتراریخته (کنترل منفی)، 2، 3. گیاه تراریخته­ی احتمالی، 4. نمونه آب (واکنش PCR بدون DNA الگو).

وجود باند bp 978 در واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن نایسین اثبات شد. همچنین با استفاده از آغازگرهای اختصاصی  nptII باندbp  785 آشکار شد. این دو باند در سه گیاه از 5 گیاه رشد کرده در محیط انتخابی حاوی کانامایسین و سفاتاکسیم آشکار شده و در گیاه شاهد هیچکدام از این دو باند ظاهر نشدند. وجود این دو باند در گیاهان تراریخته-ی احتمالی در مقایسه با گیاه شاهد نشان­دهنده­ی وجود حداقل یک نسخه از ژن نایسین در گیاهان تراریخته­ی احتمالی می­باشد (شکل 5 و 6).

شکل 5- محصول واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از پرایمرهای اختصاصی رو به جلو و رو به عقب ژن nptII در گیاه هویج. L. نشانگر اندازه وزن مولکولی DNA (1 Kb)، 1. گیاه غیرتراریخته (کنترل منفی)، 2. نمونه آب (واکنش PCR بدون DNA الگو)، 3 و 4. گیاه تراریخته­ی احتمالی.

به منظور اثبات عدم حضور آلودگی اگروباکتریوم در گیاهان تراریخته­ی احتمالی واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن virG انجام شد. وجود باند 850 جفت بازی در نمونه­ی اگروباکتریوم و عدم وجود آن در گیاهان تراریخته­ی احتمالی نشان دهنده عدم آلودگی به باکتری است (شکل 6).

شکل 6- محصول واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن vir در گیاه هویج. M. نشانگر اندازه وزن مولکولی DNA (1 Kb)، 1. اگروباکتریوم حاوی پلازمید. 2. گیاه غیرتراریخته (کنترل منفی)، 3. نمونه آب (واکنش PCR بدون DNA الگو)، 8 -4 و 4. گیاه تراریخته­ی احتمالی

در نهایت همانطور که در این تحقیق مشخص شد درصد تراریختگی 60 درصد به دست آمد. سپس گیاهان تراریخت سازگار شدند. درصد سازگاری گیاهان نیز 55 درصد به دست آمد.

بحث

کالوس­زایی چهار ریزنمونه­ی مختلف (ساقه، ریشه، برگ و گره) در محیط MS حاوی 1 میلی­گرم در لیتر NAA بررسی شد.pant  و همکاران در سال 2007 از 2 میلی­گرم بر لیتر BAP و 1 میلی­گرم در لیتر NAA (31)، Hardegger و همکاران درسال 1998 از 1/0 میلی­گرم در لیتر NAA (17), Rafal در سال 2008 از 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA (32), Roderick و همکاران در سال 1987 از 2 میلی­گرم در لیتر 2,4-D (35) و Yoshihiko و همکاران در سال 2014 از 1 میلی­گرم در لیتر 2,4-D (4 و44) به منظور باززایی استفاده کردند. به منظور بهینه­سازی انتقال ژن به گیاه هویج، تعیین غلظت بهینه مایه تلقیح حاوی اگروباکتریوم و غلظت آنتی­بیوتیک­های سفاتاکسیم و کانامایسین ضروری می­باشد. در غلظت­های کمتر از حد بهینه ممکن است گیاهان غیرتراریخت نیز رشد کنند و در غلظت­های بیش از حد بهینه­سازی ممکن است از باززایی گیاهان تراریخت جلوگیری شود. در نتیجه بهینه-سازی غلظت آنتی­بیوتیک­های مورد استفاده برای افزایش کارایی انتقال ژن نیاز می­باشد (24،12و 25). در تحقیق حاضر از رقت اگروباکتریوم 6/0 تا 8/0، غلظت 50 میلی­گرم در لیتر کانامایسین و 250 میلی­گرم در لیتر سفاتاکسیم استفاده شد. نتیجه­ی این تحقیق مشابه نتایج تحقیقاتYadav  و همکاران در سال 2012 است (44). در حالی که Baranski و همکاران در سال 2014 از 100 میلی­گرم در لیتر کانامایسین استفاده کردند. در تحقیق Pandey و همکاران در سال 2013 نیز بهترین تراکم سلولی به منظور انتقال ژن به گیاه دارویی زیره 6/0 به دست آمد (30). به نظر می­رسد فعال­ترین مرحله رشد و تکثیر لگاریتمی سویه­های اگروباکتریوم در این مقدار رقت حاصل می­شود (45).

درتحقیق حاضر از اگروباکتریوم تومفاسینس سویه­ی LBA4404 استفاده شد و بهترین نتیجه از ریزنمونه­ی ساقه به دست آمد (شکل2 ،جدول 3). قبولی و همکاران (14)، Baranski (32) و Hardegger و همکاران (17) نیز از همین سویه­ی اگروباکتریوم در تحقیق خود استفاده کردند. اما Roderick و همکاران (35) از سویه­ی C58C1، Hiroo و همکاران (45) از سویه­ی ,EHA101 زارع و همکاران (46) و همچنین پارسا و همکاران (47) از اگروباکتریوم رایزوژنز سویه­ی A4 و سهرابی و همکاران (39) از سویه­ی MSU و 2656 برای انتقال ژن مورد نظر استفاده کردند. در بسیاری از آزمایش­ها سویه­ی LBA4404 به عنوان کارآمدترین سویه معرفی شده است (42، 43). سویه­های مختلف اگروباکتریوم توانایی متفاوتی در انتقال ژن به گونه­های مختلف گیاهی و ژنوتیپ­های درون یک گونه دارند (15).

از دیگر عوامل مهم در موثرتر بودن انتقال ژن مدت زمان تلقیح ریزنمونه­ها در محلول اگروباکتریوم است و به نوع و سن ریزنمونه، گونه­ی گیاهی و حتی ژنوتیپ گیاهی مورد استفاده، سویه­ی اگروباکتریوم، نوع و غلظت ترکیبات محیط کشت، نحوه­ی تلقیح و دمای تلقیح بستگی دارد و باتوجه به همه­ی این عوامل معمولاً از دامنه­ای از 2 تا 60 دقیقه متغیر است (11، 28 و40).

دراین تحقیق از سه زمان 5، 10 و 15 دقیقه برای تلقیح استفاده شد. در زمان 15 دقیقه در تعدادی از ریز نمونه­ها آلودگی اگروباکتریوم مشاهده شد، اما در زمان­های 10 و 5 دقیقه در هیچکدام از ریزنمونه­ها آلودگی اگروباکتریوم ظاهر نشد. زارع و همکاران نیز از زمان 10 دقیقه تلقیح بهترین نتیجه را به دست آوردند (46). از نظر تراریختگی هیچ تفاوتی بین زمان­های تلقیح 5 و 10 دقیقه دیده نشد. نتایج این تحقیق مشابه نتایج حاجی حیدر و همکاران در سال 1394 می­باشد (16). اما Tokuji و همکاران در سال 2014 به مدت دو ساعت ریزنمونه-ها را در مایه تلقیح قرار دادند (45). دراین تحقیق از 4 زمان هم­کشتی استفاده شد. نتایج نشان داد زمان هم­کشتی بالاتر از دو روز موجب بافت­مردگی و در نتیجه کاهش تراریختگی می­شود. ولی در زمان هم­کشتی 1 و 2 روز بافت­مردگی دیده نشده ودر نتیجه کاهش تراریختگی مشاهده نشد. بین زمان هم­کشتی یک و دو روز از نظر تراریختگی تفاوتی مشاهده نشد. در زمان همکشتی صفر تقریباً درصد تراریختگی بسیار جزئی و نزدیک به صفر درصد بود، زیرا عدم هم­کشتی به خاطر عدم زمان کافی به منظور انتقال DNA باعث کاهش فرایند تراریختی می­شود. نتایج به دست آمده از این تحقیق مشابه نتایج به دست آمده از تحقیق محجل کاظمی و همکاران در سال 1399 و Hardegger و همکاران در سال 1998می­باشد (27). Tokuji و همکاران در سال 2014 از زمان 5 روز همکشتی استفاده کردند (45). همچنین زارع و همکاران بهترین نتیجه را از زمان سه روز همکشتی به دست آوردند (46). در تحقیق Baranski کارایی انتقال ژن 90 درصد نرخ تراریزش در مطالعه­ی قبولی و همکاران 8/3 (14)، در آزمایش Roderick و همکاران 62 درصد (35) و در تحقیق Tokuji و همکاران 10 درصد بود (41). اما در تحقیق حاضر درصد تراریختگی 60 درصد به دست آمد.

از دلایل متفاوت بودن نتایج می­توان به متفاوت بودن سویه­ی اگروباکتریوم مورد استفاده، نوع واریته-ی استفاده شده و استفاده از ریزنمونه­های مختلف اشاره کرد (24).