مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)

مقایسه پنج روش استخراج DNA ژنومی در گیاه دارویی گاوزبان ایرانی (Echium amoenum)

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه سلولی و مولکولی، دانشکده زیست شناسی ، دانشگاه دامغان، دامغان، ایران

2 گروه سلولی و مولکولی، دانشکده زیست شناسی، دانشگاه دامغان، دامغان، ایران

3 گروه علوم گیاهی. دانشکده زیست شناسی. دانشگاه دامغان. دامغان.ایران

4 گروه سلولی و مولکولی، دانشکده زیست‌شناسی، دانشگاه دامغان، دامغان، ایران

5 دانشکده ریاضی و علوم کامپیوتر، دانشگاه دامغان، دامغان، ایران

چکیده

در مطالعه تاکسونومی گیاهان دارویی روش های مبتنی بر DNA، جذاب تر از روش های کلاسیک هستند. استخراج DNA از گیاهان دارویی به دلیل متابولیت های ثانویه بیشتر با مشکلاتی مواجه است. در این مطالعه جهت انتخاب یک روش مناسب برای استخراج DNA از برگ های تازه و هرباریومی گیاه گاوزبان ایرانی، پنج دستورکار شامل روش دویل و دویل اصلی، دو روش دویل و دویل تغییریافته (که بدون 2-مرکاپتواتانول یا استات آمونیوم است)، روش تغییریافته موری و تامسون و کیت Gene All ارزیابی شدند. کیفیت و کمیت DNA با روش های الکتروفورز روی ژل و اسپکتروفتومتری بررسی گردید. قابلیت استفاده DNA خالص سازی شده از طریق PCR توالی فاصله انداز رونویسی شونده داخلی (ITS) در DNA ریبوزومی هسته ای آزمایش شد. در مقایسه با روش دویل و دویل اصلی، حذف 2-مرکاپتواتانول یا استات آمونیوم از این روش، تاثیر معناداری (p-value > 0.05) روی کیفیت و کمیت DNA استخراج شده از گیاه گاوزبان تازه و هرباریومی نداشتند. اگرچه بیشترین غلظت DNA از برگ های هرباریومی با روش موری و تامسون تغییریافته به دست آمد، ناحیه ITS در این نمونه تکثیر نشد. محصولات PCR مورد انتظار از ناحیه ITS در سایر نمونه های DNA تکثیر شدند. درنتیجه، روش دویل و دویل تغییریافته ساده تر با حذف 2-مرکپتواتانول یا استات آمونیوم برای استخراج DNA از برگ های تازه و خشک گیاه گاوزبان مفید است. این تغییر اثر منفی روی مرحله PCR در ادامه کار ندارد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Comparison of Five Genomic DNA Extraction Methods in Iranian Medicinal Plant, Echium amoenum

نویسندگان [English]

  • Zahra Alidoosty shahraky 1
  • Parisa Farrokh 2
  • Atefe Amirahmadi 3
  • Arezou Rezaei 4
  • Javad Ghasemian 5

1 Department of Cellular and Molecular Biology, School of Biology, Damghan University, Damghan, Iran.

2 Department of Cellular and Molecular Biology, School of Biology, Damghan University, Damghan, Iran

3 Plant science department. Faculty of biological science. Damghan university. Damghan. Iran

4 Department of Cellular and Molecular Biology, School of Biology, Damghan University, Damghan, Iran

5 School of mathematics and computer sciences, Damghan University, Damghan, Iran

چکیده [English]

DNA-based techniques are more interesting for the taxonomic study of medicinal plants than the classical methods. DNA isolation from medicinal plants due to the higher secondary metabolites is faced with some difficulties. In this study, five protocols, including the original Doyle and Doyle method, two modified Doyle and Doyle methods in which 2-mercaptoethanol or ammonium acetate were removed, modified Murray and Thompson method, and Gene All kit were assayed to select an appropriate method for the DNA extraction of fresh and herbarium leaves of Echium amoenum Fisch. & C.A. Mey. The quality and quantity of the DNA were examined by gel electrophoresis and spectrophotometric analysis. The applicability of the purified DNA was checked by the PCR of nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer (ITS) sequence. Compared to the original Doyle and Doyle method, the elimination of 2-mercaptoethanol or ammonium acetate had no significant effects (p-value > 0.05) on the quantity and quality of the extracted DNA from fresh and herbarium E. amoenum. Although the highest DNA concentration was obtained by the modified Murray and Thompson method from herbarium leaves, the ITS region was not amplified in this sample. The expected PCR products of the ITS region were amplified from the other DNA samples. In conclusion, the easier modified Doyle and Doyle method by eliminating 2-mercaptoethanol or ammonium acetate is beneficial for DNA extraction from both fresh and herbarium leaves of E. amoenum. This modification does not negatively effect on the following PCR step.

کلیدواژه‌ها [English]

  • CTAB
  • DNA extraction
  • Medicinal plant
  • Echium amoenum

مقایسه پنج روش استخراج DNA ژنومی در گیاه دارویی

گاوزبان ایرانی (Echium amoenum)

زهرا علیدوستی شهرکی1، پریسا فرخ1،2*، عاطفه امیراحمدی1،2، آرزو رضایی1،2 و جواد قاسمیان3

1 ایران، دامغان، دانشگاه دامغان، دانشکده زیست‌شناسی

2 ایران، دامغان، دانشگاه دامغان، پژوهشکده علوم زیستی

3 ایران، دامغان، دانشگاه دامغان، دانشکده ریاضی و علوم کامپیوتر

تاریخ دریافت: 02/06/1400          تاریخ پذیرش: 07/09/1400

چکیده

در مطالعه تاکسونومی گیاهان دارویی روش­های مبتنی بر DNA، جذاب­تر از روش­های کلاسیک هستند. استخراج DNA از گیاهان دارویی به دلیل متابولیت­های ثانویه بیشتر با مشکلاتی مواجه است. در این مطالعه جهت انتخاب یک روش مناسب برای استخراج DNA از برگ­های تازه و هرباریومی گیاه گاوزبان ایرانی، پنج دستورکار شامل روش دویل و دویل اصلی، دو روش دویل و دویل تغییریافته (که بدون 2-مرکاپتواتانول یا استات آمونیوم است)، روش تغییریافته موری و تامسون و کیت Gene All ارزیابی شدند. کیفیت و کمیت DNA با روش­های الکتروفورز روی ژل و اسپکتروفتومتری بررسی گردید. قابلیت استفاده DNA خالص سازی شده از طریق PCR توالی فاصله­انداز رونویسی شونده داخلی (ITS) در DNA ریبوزومی هسته­ای آزمایش شد. در مقایسه با روش دویل و دویل اصلی، حذف 2-مرکاپتواتانول یا استات آمونیوم از این روش، تاثیر معناداری (05/0 p-value >) روی کیفیت و کمیت DNA استخراج شده از گیاه گاوزبان تازه و هرباریومی نداشتند. اگرچه بیشترین غلظت DNA از برگ­های هرباریومی با روش موری و تامسون تغییریافته به دست آمد، ناحیه ITS در این نمونه تکثیر نشد. محصولات PCR مورد انتظار از ناحیه ITS در سایر نمونه­های DNA تکثیر شدند. درنتیجه، روش دویل و دویل تغییریافته ساده­تر با حذف 2-مرکپتواتانول یا استات آمونیوم برای استخراج DNA از برگ­های تازه و خشک گیاه گاوزبان مفید است. این تغییر اثر منفی روی مرحله PCR در ادامه کار ندارد.

واژه­های کلیدی: CTAB، استخراج DNA، گیاه دارویی، گاوزبان ایرانی.

* نویسنده مسئول، تلفن: 02335220223، پست الکترونیکی: farrokh@du.ac.ir

مقدمه

 

گاوزبان ایرانی (Echium amoenum Fisch. & C.A. Mey) به خانواده Boraginaceae تعلق دارد و یکی از گیاهانی است که دارای ارزش غذایی و دارویی زیادی می‌باشد (5). رویشگاه طبیعی آن منطقه محدودی در شمال ایران و قفقاز است و در طب سنتی ایران جایگاه ویژه­ای دارد (23). گل و برگ گاوزبان نشاط آور است و از سه قرن قبل از میلاد این خصوصیات گیاه گاوزبان شناسایی شده بود (5،3). گل، برگ و سرشاخه گلدار گیاه گاوزبان کاربردهای دارویی دارند (3). گل گاوزبان با ویژگی­های ضدالتهابی، تسکین دهنده و آرام بخش، برای درمان سرما خوردگی و گلودرد به کار می­رود (23)، همچنین از آن برای درمان ورم کلیه استفاده می­شود (3).

اگرچه ویژگی‌های ریخت شناسی در تاکسونومی سنتی همچنان در شناسایی گونه‌های گیاهی با ارزش و کاربردی است، اما استفاده از مارکرهای مولکولی در سال‌های اخیر گسترش یافته و موجب رفع محدودیت‌های تاکسونومی سنتی در شناسایی برخی از گونه‌ها شده است  (20، 25). نخستین مرحله برای استفاده از این روش­های مولکولی، خالص سازی DNA می­باشد (9، 15، 32). فراوانی متابولیت­های ثانویه­ای مانند آلکالوئیدها، پلی ساکاریدها و پلی فنل­ها در گیاهان مشکلاتی را در تهیه DNA باکیفیت ایجاد می­کند (15، 17، 19) و فراوانی این متابولیت­های ثانویه در گیاهان دارویی قابل توجه­تر از سایر گیاهان است (15، 32).

در مطالعات گیاهی مناسب­ترین بخش برای استخراج DNA برگ­های گیاهان هستند که البته میزان متابولیت­های ثانویه در آن­ها بالا است (9، 15). متابولیت­های برخی گیاهان دارویی در مرحله لیز سلول تداخل ایجاد می­کنند (32) و برخی موجب اکسیداسیون و تخریب DNA (9، 32) یا مهار فعالیت آنزیم­های اندونوکلئاز در هضم آنزیمی یا مهار فعالیت DNA پلیمراز در واکنش PCR می­گردند (9، 14، 32). همین مسئله موجب شده که پژوهشگران روش­های استخراج DNA را برای گیاهان مختلف بهینه سازی کنند. در سال­های گذشته روش­هایی برای استخراج DNA از گیاهان دارویی مختلف معرفی شده است (8، 10، 34، 37). از سوی دیگر توجه برخی از مطالعات هم رسیدن به یک روش موثر ساده و سریع یا کم هزینه برای استخراج DNA از گیاهان بوده که از کیفیت نسبی برخوردار باشد (18، 21، 26، 28). استخراج DNA از نمونه­های هرباریومی هم در مطالعات گیاهی اهمیت خاصی دارد. به ویژه زمانی که گیاهی نادر باشد و یا رویشگاه آن به راحتی در دسترس نباشد. معمولا جداسازی DNA از نمونه­های خشک شده نسبت به گیاهان تازه دشوارتر است و با توجه به تفاوت­های ترکیبات شیمیایی گیاهان مختلف و روش خشک کردن گیاه و زمان نگهداری آن­ها در هرباریوم، نیاز است تا تغییراتی را در روش استخراج برای داشتن DNA با کیفیت و کمیت مناسب ایجاد کرد (13، 31).

مطالعات انجام شده در زمینه استخراج DNA از گیاه گاوزبان محدود است. در یک مطالعه، حسین پور آزاد و همکاران روش STE (ساکارز- تریس- EDTA) را برای استخراج DNA از برگ­های تازه گیاه گاوزبان بهینه سازی کردند. ولی این روش بسیار پرهزینه است چون به موادی همچون لیتیم کلرید، ساکارز، SDS و PVP نیاز دارد (1). به دلیل کاربردهای دارویی گیاه گاوزبان، این مطالعه با هدف رسیدن به یک روش کم هزینه‌تر و استفاده از مواد شیمیایی کمتر به مقایسه کیفیت و کمیت DNA استخراج شده از برگ­های تازه و هرباریومی این گیاه با روش­های دویل و دویل، دو روش تغییر یافته دویل و دویل، روش تغییر یافته موری و تامسون و کیت Gene All می‌پردازد. در دو روش تغییر یافته دویل و دویل، اثر حذف 2-مرکاپتواتانول یا استات آمونیوم بررسی شدند.

مواد و روشها

جمع‌آوری و نگهداری گیاهان: گیاه گاوزبان
(E. amoenum) در بهار سال 1397 و در مرحله گلدهی از طبیعت استان مازندران (N: 36.3751172, E: 53.2519149 ) جمع آوری شد. گیاهان تازه جمع آوری شده در کوتاه‌ترین زمان ممکن به آزمایشگاه منتقل شدند و با استفاده از کلیدهای شناسایی بر اساس خصوصیات ریخت شناسی، شناسایی آن‌ها انجام شد. برگ­های جوان و سالم انتخاب شدند و پس از شستشو با آب مقطر، بخشی از آن‌ها به صورت تازه در فریزر 70- درجه سانتی گراد قرار داده شدند و بخش دیگر در دمای اتاق خشک شدند که در هرباریوم دانشگاه دامغان (Amirahmadi 2664; DU 001120) نگهداری می­شود. در زمان انجام این مطالعه تقریبا یک سال از زمان خشک کردن نمونه­ها گذشته بود.

استخراج DNA با روش دویل و دویل: روش دویل و دویل یکی از روش­های قدیمی استخراج DNA است (12). به طور خلاصه، 25/0 گرم برگ گیاه تازه یا 125/0 گرم برگ گیاه هرباریومی بهمراه 3 میلی لیتر بافر CTAB (2% CTAB، 4/1 مولار NaCl، 20 میلی مولار EDTA، 100 میلی مولار Tris-HCl با 8 pH:) در هاون سابیده شد و 2/0 درصد (v/v) 2-مرکاپتواتانول به آن اضافه گردید. سپس 400 میکرولیتر از این مخلوط همگن به میکروتیوب منتقل شد و 30 دقیقه در دمای 60 درجه سانتی گراد در حمام خشک قرار داده شد. دو برابر حجم به هر نمونه کلروفرم-ایزوآمیل الکل (24:1) اضافه شد و سپس در rpm 13000 به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ گردید. مایع رویی با دو برابر حجم ایزوپروپانول سرد مخلوط شد و 30 دقیقه در فریزر قرار گرفت. سپس به مدت 10 دقیقه در rpm 13000 سانتریفیوژ شد. رسوب DNA حاصل با اتانول 70% و استات آمونیم 10 میلی مولار شسته شد و پس از دور ریختن مایع رویی در دمای محیط خشک گردید و در آب مقطر دیونیزه حل شد.

استخراج DNA با روش دویل و دویل بدون 2-مرکاپتواتانول: این روش استخراج DNA تغییریافته مشابه با روش دویل و دویل بود و تنها 2-مرکاپتواتانول از آن حذف شد.

استخراج DNA با روش دویل و دویل بدون استات آمونیوم: یک بار هم استات آمونیوم از بافر شستشوی DNA در روش دویل و دویل حذف گردید و استخراج DNA از برگ­های تازه و هرباریومی گاوزبان انجام شد.

استخراج DNA با روش تغییر یافته موری و تامسون: روش استخراج DNA تغییر یافته موری و تامسون بر اساس روش ریاحی و همکاران انجام گرفت (28). مراحل کار به صورت خلاصه عبارتند از:  25/0 گرم برگ گیاه تازه یا 125/0 گرم برگ گیاه هرباریومی بهمراه 1875 میکرولیتر بافر CTAB (2% CTAB، 4/1 مولار NaCl، 50 میلی مولار EDTA، 100 میلی مولار Tris-HCl با 8 pH:) در هاون سابیده شد و 4/0 % (v/v) 2-مرکاپتواتانول به آن اضافه گردید. سپس 750 میکرولیتر از مخلوط همگن به میکروتیوب منتقل شد و به مدت 60 دقیقه در دمای 60 درجه سانتی گراد در حمام خشک قرار گرفت. در ادامه، 700 میکرولیتر کلروفرم-ایزوآمیل الکل (24:1) به هر نمونه اضافه شد و 15 دقیقه در rpm 10000 سانتریفیوژ شد و 33/0 حجم مایع رویی ایزوپروپانول سرد به هر نمونه اضافه گردید و 60 دقیقه در فریزر قرار گرفت. برای رسوب DNA، میکروتیوب­ها به مدت 15 دقیقه در rpm 10000 سانتریفیوژ شدند و پس از دور ریختن مایع رویی، 100 میکرولیتر بافر TE (Tris-HCl 10 میلی مولار و EDTA 1 میلی مولار)، 1/0 حجم مایع رویی سدیم اگزالواستات 5/2 مولار و 2 برابر حجم آن اتانول %95 سرد به هر میکروتیوب اضافه شد و نمونه‌ها به مدت 30 دقیقه در فریزر 20- درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. سپس نمونه‌ها به مدت 5 دقیقه با سرعت rpm 10000 سانتریفیوژ شدند و رسوب حاصل با اتانول 70% شسته شد و با تکرار سانتریفیوژ در شرایط قبلی، رسوب DNA به دست آمده خشک شد و در آب مقطر دیونیزه حل گردید.

استخراج DNA با روش کیت Gene All: استخراج DNA از برگ تازه و هرباریومی گاوزبان با کیت Gene All (کره جنوبی) طبق دستورالعمل کیت انجام شد. به طور خلاصه، در این روش ابتدا از 400 میکرولیتر بافر لیز (PL) برای سابیدن برگ­های تازه (1/0 گرم) یا هرباریومی (025/0 گرم) استفاده شد و سپس مخلوط به دست آمده در حدود 10 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد (حمام خشک) قرار گرفت. در مرحله بعد، به هر نمونه 140 میکرولیتر بافر PD (بافر دناتوره کننده) اضافه شد و 5 دقیقه روی یخ قرار گرفت و محلول رویی به ستون­های موجود در کیت منتقل شد و 2 دقیقه در rpm 13000 سانتریفیوژ گردید. به اندازه 5/1 برابر حجم محلول زیر ستون، بافر BD (بافر متصل شونده) اضافه شد و مخلوط حاصل به ستون­های دیگر موجود در کیت انتقال داده شد و 30 ثانیه در rpm 8000 سانتریفیوژ گردید. DNA متصل شده به ستون، دو مرتبه با محلول شستشو دهنده (CW) شسته شد و در نهایت با 100 میکرولیتر بافر AE و 1 دقیقه سانتریفیوژ در rpm 8000، DNA از ستون جدا و جمع آوری گردید.

بررسی کیفیت و کمیت DNA استخراج شده: تمام DNAهای استخراج شده تا زمان استفاده در فریزر 20- درجه سانتی گراد نگهداری شدند. برای بررسی کیفیت DNA استخراج شده نسبت جذب نمونه­ها در 280/260 و 230/260 نانومتر با اسپکتروفتومتر اندازه­گیری شد و بر اساس جذب نمونه­های استخراج شده در 260 نانومتر، غلظت آن­ها بر حسب μg/ml محاسبه شد. همچنین، کیفیت DNA استخراج شده با الکتروفورز روی ژل آگارز 8/0 درصد بررسی گردید. از همه نمونه‌ها به میزان تقریبا ثابت (150 نانوگرم) در چاهک­های ژل قرار گرفت.

واکنش PCR: بمنظور بررسی کیفیت DNAهای استخراج شده و امکان تکثیر ژن­ها با PCR، بخشی از ناحیه ITS (ناحیه فاصله انداز رونویسی شونده داخلی) درnrDNA  (DNA ریبوزومی هسته­ای) با پرایمرهای عمومی (جدول 1) تکثیر گردید.

 

 

جدول 1- توالی پرایمرهای مورد استفاده در تکثیر قطعه ITS هسته‌ای.

منبع

توالی ´3         ´5

نام پرایمر

29

GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG

ITS5m (F)

38

TCCTCCGCTTATTGATATGC

ITS4 (R)

 

 

ناحیه ITS در برگ­های گاوزبان تازه که با روش­های دویل و دویل بدون 2-مرکاپتواتانول، دویل و دویل بدون استات آمونیوم، روش تغییر یافته موری تامسون و کیت Gene All استخراج شده بودند، با PCR استاندارد تکثیر شدند. به­علاوه، DNA استخراج شده از برگ گیاه خشک گاوزبان هم در روش­ کیت Gene All با PCR استاندارد تکثیر شد. مخلوط واکنش PCR شامل 10 میکرولیتر مستر میکس آمپلیکون، 5/0 میکرولیتر از هر یک از پرایمرها با غلظت 10 پیکومولار، 500 تا 700 نانوگرم DNA استخراج شده و آب مقطر استریل تا حجم 20 میکرولیتر بود. دمای اتصال پرایمرها در واکنش PCR استاندارد طبق جدول 2 بود.

 

 

جدول 2- دمای اتصال پرایمرها در واکنش استاندارد PCR برای ژن ITS.

دمای اتصال پرایمر

براساس درجه سانتی گراد

روش استخراج DNA

55

DNA استخراج شده به روش دویل و دویل بدون 2-مرکاپتواتانول و CTAB بدون استات آمونیوم در گیاه تازه

56

DNA استخراج شده با کیت Gene All در گیاه تازه و هرباریومی

58

DNA استخراج شده به روش تغییریافته موری و تامسون در گیاه تازه

 

 

ناحیه ITS در نمونه‌های گاوزبان هرباریومی که DNA آن­ها با روش­های دویل و دویل، دویل و دویل بدون 2-مرکاپتواتانول، دویل و دویل بدون استات آمونیوم استخراج شده بودند و گاوزبان تازه که با روش دویل و دویل استخراج DNA آن انجام شده بود با Touch-down PCR تکثیر شدند. مخلوط مواد واکنش Touch-down PCR مشابه با PCR استاندارد تهیه شد و شرایط دمایی به کار رفته مطابق جدول 3 بود. محصولات PCR روی ژل آگارز 1 درصد الکتروفورز شدند و باندهای مورد انتظار بررسی شدند.

 

جدول 3- شرایط دمایی واکنش Touch-down PCR.

مرحله

دما (درجه سانتی گراد)

زمان

واسرشت شدن اولیه

94

2 دقیقه و 30 ثانیه

10 چرخه

واسرشت شدن

94

50 ثانیه

اتصال پرایمرها

69-60

هر 30 ثانیه، دما یک درجه کاهش می­یابد

تکثیر

72

50 ثانیه

25 چرخه

واسرشت شدن

94

50 ثانیه

اتصال پرایمرها

58

30 ثانیه

تکثیر

72

50 ثانیه

تکثیر نهایی

72

7 دقیقه
         

 

 

تحلیل آماری: استخراج DNA و بررسی مربوط به کیفیت و کمیت آن­ها در همه روش­ها با سه بار تکرار انجام شد. تحلیل آماری در این مطالعه با نرم افزار SPSS نسخه 16 انجام شد. با توجه به تعداد کم داده­ها، برای مقایسه داده‌های پنج روش استخراج DNA در گیاه گاوزبان تازه و هرباریومی از آزمون ناپارامتری کراسکال- والیس استفاده شد و برای مقایسه داده‌های دو نمونه تازه و هرباریومی در هر روش استخراج DNA از آزمون ناپارامتری من-ویتنی استفاده گردید.

نتایج

کیفیت و کمیت DNAهای استخراج شده: نسبت جذب 280/260 و 230/260 نانومتر و همچنین غلظت DNA­های استخراج شده از گیاه گاوزبان در جدول 4 دیده می­شود. تفاوت­هایی بین غلظت DNA جداسازی شده در میان گیاه تازه و خشک گاوزبان در هر روش دیده شد که در روش­های دویل و دویل بدون استات آمونیوم و موری تامسون تغییر یافته، غلظت DNA استخراج شده از برگ خشک به طور معناداری بیشتر از برگ تازه بود (05/0 p-value <). با اینکه بیشترین غلظت DNA در میان 5 روش به کار برده شد برای گیاه تازه، در روش موری و تامسون دیده شد (μg/ml 00/31±00/105)، نتایج غلظت DNA در میان 5 روش در گیاه تازه اختلاف معناداری نداشتند
(05/0 p-value >). تحلیل آماری غلظت DNA در میان 5 روش در گیاه هرباریومی اختلاف معنا داری را نشان داد (05/0 p-value <) و DNA استخراج شده با روش­های موری و تامسون و کیت تجاری Gene All بترتیب با μg/ml 66/57±00/318 و 50/1±50/39 بیشترین و کمترین مقادیر بودند.

نسبت جذب 280/260 و 230/260 نانومتر، نشان دهنده کیفیت DNA استخراج شده می­باشند. نسبت جذب 280/260 نانومتر اگر 8/1 تا 2 باشد یعنی DNA خلوص خوبی دارد و فاقد پروتئین و فنل­ها است. نسبت جذب 230/260 نانومتر هم نشان دهنده باقیمانده نمک­ها و آلودگی پلی ساکاریدی در DNA است و بهتر است از 5/1 بیشتر و به 8/1 نزدیکتر باشد (7، 8).

نسبت جذب 280/260 نانومتر به دست آمده در این مطالعه بین 71/1 -63/0 بود که اختلاف معناداری بین روش­های مختلف استخراج DNA در گیاهان تازه و هرباریومی و همچنین بین گیاه تازه و خشک در هر روش استخراج وجود نداشت (05/0 p-value >). نسبت جذب 230/260 نانومتر هم بین 50/1- 25/0 بود که اختلاف معناداری میان 5 روش به کار رفته در میان گیاهان خشک و همچنین میان 5 روش به کار رفته در میان گیاهان تازه دیده شد (05/0 p-value <). DNA استخراج شده با روش دویل و دویل بدون استات آمونیوم هم در گیاه گاوزبان تازه و هم هرباریومی از نظر نسبت جذب 230/260 نانومتر قابل قبول­تر بود و آلودگی کمتری را نشان داد (جدول 4).

 

 

جدول 4- مقایسه کیفیت و کمیت DNA­های استخراج شده از گیاه گاوزبان با 5 روش مختلف.

روش­های استخراج DNA در گیاه گاوزبان

نسبت جذب 280/260

نسبت جذب 230/260

غلظت DNA (μg/ml)

برگ تازه با روش دویل و دویل

10/1±71/1

14/0±92/0

50/7±50/29

برگ هرباریومی با روش دویل و دویل

07/0±28/1

02/0±88/0

55/15±00/100

برگ تازه با روش دویل و دویل بدون 2-مرکاپتواتانول

10/0±64/1

00/0±10/1

70/0±50/81

برگ هرباریومی با روش دویل و دویل بدون 2-مرکاپتواتانول

09/0±45/1

10/0±02/1

50/22±66/77

برگ تازه با روش دویل و دویل بدون استات آمونیوم

09/0±56/1

22/0±50/1

91/28±33/59

برگ هرباریومی با روش دویل و دویل بدون استات آمونیوم

04/0±39/1

01/0±04/1

06/23±00/136

برگ تازه با روش تغیریافته موری و تامسون

14/0±63/0

04/0±25/0

00/31±00/105

برگ هرباریومی با روش تغییر یافته موری و تامسون

06/0±32/1

07/0±84/0

66/57±00/318

برگ تازه با روش کیت Gene All

09/0±45/1

33/0±87/0

04/24±00/84

برگ هرباریومی با روش کیت Gene All

44/0±37/1

37/0±91/0

50/1±50/39

نتایج از تکرار سه بار آزمایش به دست آمده و به صورت انحراف معیار ± میانگین گزارش شده است.

 

 

وضعیت DNA استخراج شده گیاه تازه گاوزبان پس از الکتروفورز در ژل آگارز با سه روش دویل و دویل تقریبا مشابه بود و بهتر از روش­های دیگر به نظر می­رسید. در گیاه خشک گاوزبان هم DNA استخراج شده با روش­های دویل و دویل، دویل و دویل بدون 2-مرکاپتو اتانول و کیت Gene All، ظاهر مشابهی داشتند و مناسب­تر از سایر روش­ها بودند. در بیشتر DNAهای استخراج شده اسمیر دیده ­شد که نشانه تخریب شدن DNA است (شکل 1).

 

 

 
   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1- الکتروفورز DNA استخراج شده از گیاه تازه و هرباریومی گاوزبان. شماره­های 1 تا 5 و 6 تا 10 نشان دهنده DNAهای استخراج شده از گیاه تازه و هرباریومی هستند که بترتیب با روش­های دویل و دویل، دویل و دویل بدون 2-مرکاپتواتانول، دویل و دویل بدون استات آمونیوم، تغیریافته موری و تامسون و کیت Gene All جداسازی شده­اند.

 

نتایج واکنش PCR: باندی با اندازه مورد انتظار bp 700 روی ژل آگارز در تمام DNAهای استخراج شده از گیاه تازه گاوزبان، دیده شد (شکل 2). از میان DNAهای استخراج شده از گیاه گاوزبان هرباریومی، تنها در نمونه به دست آمده از روش تغییر یافته موری و تامسون محصول PCR حتی با تغییر شرایط به دست نیامد (شکل 2).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2- الکتروفورز محصول PCR قطعه ITS در DNA در الف) گیاه تازه و ب) گیاه هرباریومی گاوزبان. شماره­های 1 تا 5 در هر ژل بترتیب مربوط به استخراج DNA با روش­های دویل و دویل، دویل و دویل بدون 2- مرکاپتواتانول، دویل و دویل بدون استات آمونیوم، موری و تامسون تغییر یافته و کیت Gene All است. نشانگر وزن مولکولی DNA (SMOBIO, DM2300) است.

 

بحث

استخراج DNA مرحله­ای اساسی در مطالعات ژنتیک گیاهی است، ولی همیشه جداسازی DNA با کیفیت و کمیت مناسب از گیاهان با دشواری­هایی همراه بوده است (7 ،17). گیاهان دارویی سال­ها است که در جوامع مختلف جهان برای درمان برخی بیماری­ها استفاده می­شوند (24) و استخراج DNA از آن­ها به واسطه وجود متابولیت­های ثانویه بیشتر، سخت­تر است (32). با توجه به کاربردهای گیاه گاوزبان، در این مطالعه پنج روش استخراج DNA ژنومی برای رسیدن به یک شیوه مناسب و کم هزینه‌تر از برگ این گیاه با یکدیگر مقایسه شدند.  

روش موری و تامسون و روش دویل و دویل از قدیمی­ترین روش­های استخراج DNA در گیاهان هستند (12، 22) که پژوهشگران بسیاری بسته به نوع گیاه، تغییراتی در آن­ها ایجاد کرده­اند. برای نمونه، Sumitha و همکاران از روش تغییر یافته موری و تامسون با 5% CTAB، 5 مولار NaCl و 1% پلی وینیل پیرولیدون (PVP) برای استخراج DNA از برگ­های گیاه Geophila repens L. استفاده کردند (35). همچنین ریاحی و همکاران، روش دویل و دویل را بهمراه 2% PVP در بافر استخراج برای چند گونه گیاهی زیرخانواده Papilionideae به کار بردند (28). در مطالعه دیگری، Sari و همکاران چند روش تغییریافته دویل و دویل را که شامل تغییر میزان CTAB، NaCl و 2-مرکاپتواتانول بود برای استخراج DNA از برگ گیاه Sapodilla استفاده کردند (30). از روش دویل و دویل برای استخراج DNA در توتون (Nicotiana rustica L.) و کهور پاکستانی (Prosopis juliflora) هم استفاده شده است (2، 4).

در ارتباط با گیاه گاوزبان، حسین پور آزاد و همکاران با روش استخراج STE به طور میانگین μg/ml 845 DNA به ازای 5/0 گرم برگ­ تازه و جوان به دست آوردند (1). اگرچه این عدد از میانگین غلظت‌های DNA به دست آمده در این مطالعه بیشتر است، اما این پژوهشگران روش استخراج STE را برای برگ خشک گاوزبان استفاده نکردند و همچنین نیاز به مواد شیمیایی بیشتر در این روش (مانند لیتیم کلرید، SDS، PVP و ساکارز) امکان استفاده از آن را محدودتر می‌سازد.

در مطالعه حاضر، با هدف رسیدن به یک روش استخراج DNA از گیاه تازه و هرباریومی گاوزبان با هزینه و مواد کمتر، یک بار 2-مرکاپتواتانول و یک بار استات آمونیوم از روش دویل و دویل حذف شدند. استات آمونیوم بهمراه اتانول در شستشوی رسوب DNA برای حذف بهتر نمک­ها عمل می­کنند (6). 2-مرکاپتواتانول یک ترکیب احیا کننده باندهای دی سولفیدی است و موجب دناتوره شدن پروتئین­ها می­شود و علاوه بر این در حذف تانن­ها و پلی فنل­ها هم موثر است (16). نتایج به دست آمده و تحلیل آماری نشان داد که حذف 2-مرکاپتواتانول یا استات آمونیوم از روش استخراج دویل و دویل در برابر روش اصلی، تاثیر معناداری در غلظت و یا کیفیت (بر اساس نسبت جذب 280/260 و 230/260 نانومتر) DNAهای حاصل از گیاه تازه و هرباریومی ایجاد نکرد (05/0 p-value >). با وجود اینکه نسبت­های جذب 280/260 و 230/260 در بیشتر روش­های استخراج به کار برده شده برای گیاه گاوزبان، بترتیب نشان دهنده آلودگی­های پروتئینی/پلی فنلی و پلی ساکاریدی/نمکی بودند، اما تکثیر ناحیه ITS از DNAهای استخراج شده با روش­های دویل و دویل در گیاه تازه و خشک گاوزبان با موفقیت انجام شد که مشخص می­کند، ترکیبات مهارکننده PCR در حدی نبودند که مانع از تکثیر این ناحیه ژنومی شوند. بنابراین می­توان در مورد گیاه گاوزبان تازه و هرباریومی بر اساس دسترسی به مواد آزمایشگاهی از استات آمونیوم یا 2-مرکاپتواتانول در روش دویل و دویل استفاده نکرد.

اگرچه غلظت DNA استخراج شده از گیاه خشک گاوزبان با روش تغییر یافته موری و تامسون، به صورت معناداری (05/0 p-value <) از دیگر DNAهای استخراج شده از گیاه هرباریومی بیشتر بود، اما این DNA کیفیت مناسبی برای PCR نداشت و حتی با تغییر شرایط واکنش PCR هم از این DNA محصول ناحیه ITS تکثیر نشد. نسبت جذب 230/260 نانومتر در DNA به دست آمده از گیاه خشک گاوزبان با روش تغییر یافته موری و تامسون از دیگر DNAهای استخراج شده از گیاه خشک کمتر بود و آلودگی پلی ساکاریدی/نمکی بیشتری را نشان داد، ولی در عین حال این کاهش در حدی نبود که تفاوت معناداری (05/0 p-value >) بین آن با DNA به دست آمده از گیاه خشک با روش دویل و دویل وجود داشته باشد. نکته­ای که باید به آن توجه شود این است که عوامل مختلفی در میزان جذب در 260 نانومتر و در نهایت در غلظت و کیفیت DNA تاثیر می­گذارند. برای نمونه، نسبت DNA تک رشته و دو رشته موجود در محلول و حضور ترکیباتی مانند RNA و نوکلئوتیدهای آزاد بر جذب 260 نانومتر اثرگذار هستند (11). بنابراین، نسبت­های 230/260 و 280/260 نانومتر که با روش اسپکتروفتومتری به دست می­آیند و همچنین غلظت DNA محاسبه شده بر این اساس نمی­توانند بیان کننده دقیق کیفیت و کمیت DNA باشند. از آنجایی که متابولیت­های ثانویه گیاه در روند استخراج DNA آزاد می­شوند و روی واکنش PCR تاثیر می­گذارند، تکثیر یک ژن با PCR می­تواند نشان دهنده کیفیت DNA باشد (36). علت عدم تکثیر ناحیه ITS در یک شرایط دمایی ثابت در واکنش PCR در این مطالعه می­تواند به تفاوت در کیفیت DNAهای به دست آمده با روش­های استخراج مختلف مربوط باشد. زیرا مهارکننده‌‌های موجود در DNA می‌توانند بر اتصال پرایمرها به الگوی DNA در واکنش PCR تاثیر بگذارند (27، 33).

با در نظر گرفتن این موضوع که کیت­های تجاری همواره در دسترس نیستند و استفاده از آن­ها هزینه بالایی دارد و علاوه بر این یک کیت استخراج DNA ممکن است برای همه گونه­های گیاهی نتیجه قابل قبولی نداشته باشد، پیدا کردن روش­های استخراج ساده و کم هزینه­تر برای گیاهان پرکاربرد، ضروری است. به طور کلی، مجموع آزمایش­های کیفی و کمی این پژوهش نشان می­دهد که از میان روش­های غیرتجاری استخراج DNA به کار رفته در این مطالعه، روش­ دویل و دویل بدون 2-مرکاپتواتانول یا بدون استات آمونیوم می­تواند جایگزین خوبی برای روش استخراج کلاسیک دویل و دویل برای برگ تازه و خشک گیاه گاوزبان باشد. می­توان امکان استفاده از این روش استخراج DNA را برای نمونه­های هرباریومی قدیمی گاوزبان هم در مطالعات آینده بررسی کرد.

سپاسگزاری

از حمایت مالی دانشگاه دامغان برای انجام این کار پژوهشی تشکر می­شود.

  1. 1- حسین پور آزاد، ن.، نعمت زاده، ق.، 1391، معرفی روش سریع و ساده­ی استخراج دی ان ای در گل گلوزبان ایرانی (Echium amoenum Fisch. & Mey)، فصلنامه علمی-پژوهشی گیاه و زیست بوم، 31، صفحات 111-120.

    2- طغیانی، م. ا.، احسان پور، ع. ا.، شریعتی، م.، امام زاده، ر.، 1395، مطالعه تغییرات هورمون­های اکسین و سیتوکینین و تغییرات سوماکلونال در گیاهان باززایی شده و کالوس توتون (Nicotiana rustica L.)، مجله پژوهش­های گیاهی (زیست شناسی ایران)، 29، صفحات 385-394.

    3- نادری حاجی باقرکندی، م.، باقر رضایی، م.، 1383، بررسی فیتوشیمیایی گل گاوزبان Echium amoenum، فصلنامه پژوهشی تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 20، صفحات 377-383.

    4- نصیری، س.، یوسفی، م.، حائری نسب، م.، 1400، بررسی تنوع ژنتیکی کهور پاکستانی (Prosopis juliflora) در استان خوزستان به روش CDDP، مجله پژوهش­های گیاهی (زیست شناسی ایران)، 34، صفحات 182-194 .

    5- نقدی بادی، ح.، سروش زاده، ع.، رضازاده، ش.، شریفی، م.، قلاوند، ا.، امیدی، ح.، 1386. مروری بر گیاه گاوزبان (گیاه دارویی با ارزش و غنی از گامالینولنیک اسید)، فصلنامه گیاهان دارویی، 24، صفحات 1-14.

     

    1. Abdullah, F. I., Chua, L. S., Rahmat, Z., Samad, A. A., and Wagiran, A., 2016. Plant Genomic DNA Extraction for Selected Herbs and Sequencing their Internal Transcribed Spacer Regions Amplified by Specific Primers. Natural Product Communications, 11(10), PP: 1491-1496.
    2. Aboul-Maaty, N. A. F., and Oraby, H. A. S., 2019. Extraction of high-quality genomic DNA from different plant orders applying a modified CTAB-based method. Bulletin of the National Research Centre, 43, PP: 25-34.
    3. Abu-Romman, S., 2011. Comparison of methods for isolating high quality DNA from saga (Salvia officinalis). Journal of Medicinal Plants Research, 5(6), PP: 938-941.
    4. Arruda, S. R., Pereira, D. G., Silva-Castro, M. M., Brito, M. G., and Waldschmidt, A. M., 2017. An optimized protocol for DNA extraction in plants with a high content of secondary metabolites, based on leaves of Mimosa tenuiflora (Willd.) Poir. (Leguminosae). Genetics and Molecular Research, 16(3), PP: gmr16039063.
    5. Biswas, N., and Verma, S. K., 2020. A novel nucleic acid extraction method from aromatic herbs and dried herbal powders using cow skim milk. Scientific Reports, 10(1), PP: 11513.
    6. Demeke, T., and Jenkins, G. R., 2010. Influence of DNA extraction methods, PCR inhibitors and quantification methods on real-time PCR assay of biotechnology-derived traits. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 396, PP: 1977-1990.
    7. Doyle, J. J., and Doyle, J. L., 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemistry Bulletin, 19(1), PP: 11-15.
    8. Drábková, L. Z., 2014. DNA Extraction from Herbarium Specimens. Methods in Molecular Biology, 1115, PP: 69-84.
    9. Friar, E. A., 2005. Isolation of DNA from Plants with Large Amounts of Secondary Metabolites. Methods in Enzymology, 395, PP: 3-14.
    10. Ghadia, B., Singh, A. K., Khatnani, T., Hirpara, M., Patel, S., Joshi, P., 2016. An improved method of DNA purification from secondary metabolites rich medicinal plants using certain chaotropic agents. Acta Physiol Plant, 38(8), PP: 207.
    11. Heikrujam, J., Kishor, R., and Mazumder, P. B., 2020. The Chemistry Behind Plant DNA Isolation Protocols. Biochemical Analysis Tools - Methods for Bio-Molecules Studies, PP: 1-12.
    12. Hosseinpour Azad, N., and Nematadeh, G. H., 2013. Introducing a new method of genomic DNA extraction in dicotyledonous plants. Scholarly Journal of Agricultural Science, 2(6), PP: 242-248.
    13. Hu, Y., Xie, X., Wang, L., Yang, J., Zhang, H., and Li, Y., 2009. An effective and low-cost method for DNA extraction from herbal drugs of Rheum tanguticum (polygonaceae). African Journal of Biotechnology, 8(12), PP: 2691-2694.
    14. Li, H., Li, J., Cong, X. H., Duan, Y. B., Li, L., Wei, P. C., Lu, X. Z., and Yang, J. B., 2013. A high-throughput, high-quality plant genomic DNA extraction protocol. Genetics and Molecular Research, 12(4), PP: 4526-4539.
    15. Manoko, M. L. K., 2018. The power of coefficients and methods of coding in delimiting species using phenetic approach: the case of African Solanum section Solanum sensu Edmonds. Tanzania Journal of Science, 44(1), PP: 37-51.
    16. Mogg, R. J., and Bond, J. M., 2003. A cheap, reliable and rapid method of extracting high-quality DNA from plants. Molecular Ecology Notes, 3, PP: 666-668.
    17. Murray, M. G., and Thompson, W. F., 1980. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research, 8(19), PP: 4321-4325.
    18. Nadi, F., 2017. Bioactive compound retention in Echium amoenum Fisch. & C. A. Mey. petals: Effect of fluidized bed drying conditions. International Journal of Food Properties, 20(10), PP: 2249-2260.
    19. Palhares, R. M. P., Drummond, M. G., Brasil, B. S. A. F., Cosenza, G. P., Brandão, M. G. L., and Oliveira, G., 2015. Medicinal Plants Recommended by the World Health Organization: DNA Barcode Identification Associated with Chemical Analyses Guarantees Their Quality. PLOS ONE, 10(5), PP: e0127866.
    20. Pires, A. C., and Marinoni, L., 2010. DNA barcoding and traditional taxonomy unified through integrative taxonomy: a view that challenges the debate questioning both methodologies. Biota Neotropica, 10(2), PP: 339-346.
    21. Pookhamsak, P., Pornbungkerd, P., and tantasawat, P. A., 2019. Simple, rapid and cost-effective DNA extraction method for high quality DNA suitable for PCR based downstream application in mungbean [Vigna radiata (L.) Wilczek]. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science, 346, PP: 1-9.
    22. Reiss, R. A., and Rutz, B., 1999, Quality control PCR: a method for inhibitors of Taq DNA polymerase. BioTechniques, 27, PP: 920-926.
    23. Riahi, M., Zarre, S., Maassoumi, A. A., Attar, F., and Kazempour Osaloo, S., 2010. An inexpensive and rapid method for extracting papilionoid genomic DNA from herbarium specimens. Genetics and Molecular Research, 9(3), PP: 1334-1342.
    24. Sang, T., Crawford, D. J., and Stuessy, T., 1995. Documentation of reticulate evolution in peonies (Paeonia) using internal transcribed spacer sequences of nuclear ribosomal DNA: Implications for biogeography and concerted evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences, 92, PP: 6813-6817.
    25. Sari, V. K., and Murti, R. H., 2015. An Effective Method for DNA Extraction of Mature Leaf of Sapodilla (Manikara zapota (L.) van Royen). Agrivita, 37(1), PP: 18-23.
    26. Sarrazola, H. J., and Alzate, F. A., 2019. Obtaining DNA from Urticaceae: overcoming the challenges associated with chemical compounds and herbarium specimens. International Journal of Molecular Biology, 4(5), PP: 158-165.
    27. Schmiderer, C., Lukas, B., and Novak, J., 2013. Effect of different DNA extraction methods and DNA dilutions on the amplification success in the PCR of different medicinal and aromatic plants. Journal of Medicinal and Spice Plants, 18(2), PP: 65-72.
    28. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., and Johne, R., 2012. PCR inhibitors-occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology, 113(5), PP: 1014-1026.
    29. Sharma, P., Joshi, N., and Sharma, A., 2010. Isolation of genomic DNA from medicinal plants without liquid nitrogen. Indian Journal of Experimental Biology, 48, PP: 610-614.
    30. Sumitha, V. R., Gangaprasad, A., and Nair, G. M., 2015. Molecular characterization and Assessment of Genetic Similarity among the Accessions of Geophila repens L. Using RAPD Markers. Journal of Advances in Biological Science, 2(1), PP: 1-6.
    31. Susilowati, A., Rachmat, H. H., Rangkuti, A. B., Elfiati, D., and Ambarwati, A., 2019. Optimizing Genomic DNA Isolation and PCR Amplification for Pasak Bumi (Eurycoma longifolia). KnE Engineering, 1(2), PP: 30-39.
    32. Vural, H. C., 2009. Genomic DNA isolation from aromatic and medicinal plants growing in Turkey. Scientific Research and Essay, 4(2), PP: 59-64.
    33. White, T. J., Bruns, T., and Taylor, J., 1990. Amplification and Direct Sequencing of Fungal Ribosomal RNA Genes for Phylogenetics. PCR - Protocols and Applications - A Laboratory Manual, PP: 315- 322.
مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)
دوره 36، شماره 3
مهر 1402
صفحه 216-231
  • تاریخ دریافت: 02 شهریور 1400
  • تاریخ بازنگری: 28 مهر 1400
  • تاریخ پذیرش: 07 آذر 1400