استفاده از روش ISSR در مطالعه سیستماتیکی و تعیین تنوعات جمعیت­های

 گونه Aspergillus niger

امیرعباس مینایی فر^*ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 06/04/1400          تاریخ پذیرش: 07/09/1400

چکیده

آسپرژیلوس نایجر یکی از رایجترین گونه­های جنس آسپرژیلوس با پراکنشی وسیع در سطح جهان و گستره­ای نامحدود از میزبان­های متعدد است، با توجه به اهمیت این گونه در اقتصاد، سلامت و بهداشت شناسایی این گونه حایز اهمیت می باشد، هرچند روش­های مرسوم ریخت­شناسی در شناسایی بعضی گونه­های آسپرژیلوس کارایی قابل قبولی دارند اما در تشخیص  ورایته­های گونه­های این جنس عموماً ناکارآمد هستند، این موضوع در مورد شناسایی جمعیت­های آسپرژیلوس نایجر نیز صدق می­کند، در این تحقیق علاوه بر شناسایی ریختی بر اساس صفات میکروسکوپی و ماکروسکوپی نمونه­های آسپرژیلوس نایجر جدا شده از پنج محصول زراعی و استراتژیک کشور شامل گندم، جو، ذرت، سویا و کلزا، از بیست پرایمر استاندارد شده بر اساس روش ISSR برای بررسی جمعیت­های این گونه نیز استفاده شد. نتایج آنالیزهای چند متغیره بر اساس یافته­های ISSR نشان می­دهد با استفاده از این روش می­توان واریته­های آسپرژیلوس نایجر جدا شده از میزبان­های متفاوت و مناطق مختلف را از یکدیگر تشخیص داد.

واژه­های کلیدی: آسپرژیلوس نایجر، دانه­های روغنی، غلات، ISSR

* نویسنده مسئول، تلفن:  09133584719 ، پست الکترونیکی: aaminaeifar@pnu.ac.ir      

مقدمه

جنس Aspergillus اولین­بار توسط Micheli در سال 1729 معرفی شد(4)، این جنس حدود 150 گونه شناخته شده دارد که با احتساب واریته ها و بعضاً نظرات گوناگون در خصوص تجمیع یا تفریق برخی گونه­ها، تعداد گونه­های آن تا 200 مورد نیز اعلام شده است،  بعضی از گونه­های Aspergillus به دلیل تغذیه از میزبان­های متعدد، سرعت تکثیر و  سازگاری بالا جهان گستر می­باشند، گونه­های مختلف این قارچ بدلیل برخورداری از آنزیم­های مختلف از بعضی وجوه بعنوان قارچی مفید و از وجوه دیگر بعنوان یک قارچ مضر شناخته می‌شوند(10).

اکثر گونه­های این جنس کپک­های ساپروفیتی هستند که توان استفاده از بقایای آلی و بازیافت نیتروژن و کربن را دارا می­باشند که از این ویژگی بطور گسترده در صنایع غذایی تخمیری استفاده می شود، اما برخی از گونه­های این جنس از گروه قارچ­های فرصت طلب بوده و می­توانند باعث بروز بیماری­های خطرناکی مانند آسپرژیلوزیس شوند. همچنین بعضی از گونه های Aspergillus قادر به تولید مایکوتوکسین­های مسموم کننده و سرطان­زا مانند آفلاتوکسین می­باشند که هر ساله خسارات فراوانی را به محصولات کشاورزی وارد نموده و برای سلامت انسان نیز خطرناک می باشند (23). در بین گونه های متعدد آسپرژیلوس، Aspergillus niger van Tieghem ، یکی از مهمترین و تاثیرگذارترین گونه­های این جنس است که با قدرت تکثیر بالا و دارا بودن میزبان­های مختلف از رایج‍ترین گونه­های این جنس نیز می­باشد (6). آسپرژیلوس نایجر کاربردهای صنعتی متعددی در تولید اسیدهای آلی و آنزیم های صنعتی دارد (14 و 18). همچنین توانایی بالای این قارچ در آلوده سازی محصولات زراعی و ایجاد خطرات بهداشتی و تخریب محصولات (1) باعث شده تا این گونه در زندگی انسان چه از جنبه‌های مثبت و چه از جنبه‌های منفی آن حائز اهمیت باشد. برای تشخیص گونه‌هایAspergillus  بطور معمول از مشخصات ظاهری شامل صفات ماکروسکوپی نظیر رنگ و میزان رشد کلنی و صفات میکروسکوپی مانند شکل و اندازه وزیکول‌، کونیـدی، کـونیدیوفور، فـیالید و متـولا استـفاده می‌شـود (21). گونه‌های Aspergillus دارای تغییر پذیری ظاهری وابسته به شرایط محیط رشد هستند، بعلاوه صفات ریخت شناسی معرفی شده برای گونه‌های مختلف از لحاظ شکل ظاهری و ابعاد، شباهت‌های بسیار زیادی نیز به یکدیگر دارند (10). همچنین برای تمایز برخی گونه‌های این قارچ نیاز به شرایط کنترل شده و محیط‌های کشت استاندارد مختلفی است که در بعضی موارد بسیار هزینه بر و وقت­گیر می‌باشد و در تشخیص واریته­های Aspergillus نیز از دقت بالایی برخوردار نیست. به همین دلیل از ابتدای شناسایی این قارچ کلیدهای شناسایی متعددی ارائه گردیده که هر یک دارای ابهاماتی می‌باشند (21). با توجه به  نقاط ضعف ذکر شده در خصوص روش­های ریخت شناسی، کوشش‌هایی جهت شناسایی سریع‌تر و دقیق‌تر گونه‌های این قارچ با کمک روش‌های مولکولی مانند RLFP (26)، RAPD (19)، SSR (9)، AFLP (12) و ISSR (24) انجام گرفته است، طی چندسال اخیر مطالعاتی مولکولی مختلفی روی گونه­ها و واریته­های آسپرژیلوس با استفاده از روش­های مولکولی با هدف تعیین ارتباطات درون و بین گونه­ای این قارچ صورت گرفته است، همچنین علاوه بر تعیین روابط تکاملی، برخی از این مطالعات جهت تعیین واریته­های مولد مایکوتوکسین­های مضر و سرطان­زا بوده است (7). هدف از این تحقیق، تعیین تنوعات درون گونه­ای این قارچ در ایران و همچنین سنجش و بررسی ارتباط تنوعات جمعیتی این گونه با شرایط اقلیمی در سطح کشور می‍باشد، تحقیقی که تاکنون در ایران انجام نگرفته است.

مواد و روشها

در این تحقیق بمنظور شناسایی و بررسی تنوعات درون گونه­ای نمونه­های Aspergillus niger، از پنج محصول زراعی مهم و پرمصرف داخل کشور شامل جو، گندم، ذرت، کلزا و سویا و از قطب­های اصلی تولید آن­ها که بترتیب شامل شهرستان­های قزوین، فسا، دزفول، مشهد و اردبیل می باشد، نمونه برداری شد، نمونه برداری بصورت تصادفی ساده و از پنج مزرعه در هر منطقه صورت گرفت. بمنظور سنجش ارتباط بین عوامل اقلیمی و یافته­های مولکولی و برای کاهش اثر عوامل میکروکلیمایی ناشی از فرایندهای پس از برداشت و انبار داری، نمونه برداری­ها بعد از برداشت و قبل از شروع فرایندهایی مانند خرمنکوبی، خشک کردن و انبار نمودن محصولات انجام گرفت، اطلاعات مزارع نمونه برداری شده شامل عرض جغرافیایی و ارتفاع از سطح دریا با دستگاه جی پی اس مدل Garmin-etrex 10 ثبت شد، سایر اطلاعات لازم شامل متوسط بارندگی و متوسط دمای سالانه نیز با مراجعه به ایستگاه­های هواشناسی  هر شهرستان دریافت شد (جدول 1). پس از جمع آوری نمونه­ها و انتقال آنها به آزمایشگاه نسبت به کشت اولیه و جداسازی آسپرژیلوس­های موجود در نمونه­ها از سایر قارچ­های همراه اقدام شد، پس از خالص سازی آسپرژیلوس­ها، جهت شناسایی دقیقتر گونه­ها، نمونه­های خالص شده به محیط‌های کشت افتراقی CYA MEA, و CY20S و شرایط استاندارد کشت داخل انکوباتور انتقال داده شد، پس از گذشت یک هفته از زمان کشت، نسبت به مطالعه و ثبت صفات ماکروسکوپی (9 صفت اصلی متمایز کننده به ازای سه محیط کشت افتراقی مورد استفاده) و میکروسکوپی (5 صفت اصلی متمایز کننده) و شناسایی نمونه­ها بر اساس کلید استاندارد شناسایی گونه­های Aspergillus مبادرت شد(10)، برای آنالیز نتایج حاصل از اندازه­گیری­های ماکروسکوپی و میکروسکوپی از نرم افزار SPSS Ver. 22 استفاده شد. در بخش مطالعه مولکولی این تحقیق برای استخراج DNA از روش ژانگ استفاده شد (24). براساس پژوهش­های قبلی (5، 22 و 24)، تعداد بیست پرایمرهای مناسب انتخاب شد (جدول 2)، همچنین شرایط و نسبت محتوای ترکیبات PCR برای انجام تحقیق حاضر به این شرح زیر بهینه سازی شد؛ برای انجام واکنش زنجیره ای پلیمرازی، 5/0 میکرولیتر DNA استخراج شده از هر نمونه به اضافه 2 میکرولیتر بافر پی­سی­آر، 5/1 میکرولیترکلرید منیزیم،1میکرولیتر dNTP، 1 میکرولیتر پرایمر، 5/0 میکرولیتر آنزیم Taq polymeras  و مابقی آب مقطر تا رسیدن به حجم نهایی 20 میکرولیتر تهیه شد، برنامه دمایی نیز به این شرح تنظیم شد؛ 93 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه، 45 سـیکلِ 93 درجـه سانتیگراد بـه مـدت 30 ثانیـه، 55 درجه به مدت 60 ثانیه و 72 درجه سانتیگراد بـه مـدت 90 ثانیه و در نهایت یک سیکل 72 درجه سانتیگراد به مدت 6 دقیقه. محصول حاصل از فرایند PCR با استفاده از جریان برق 110 ولت به مدت 80 دقیقه روی ژل آگارز  5/1% W/V)) در محلول بافر  TAE ( X1) ران شد،  بمنظور ظهور باندها از رنگ اتیدیوم بروماید و برای تعیین شاخص، از مارکر 100 bp استفاده شد. برای غربالگری باندهای حاصله، حضور و عدم حضور باندها بترتیب با کد 1 و 0 نمایش داده شد.  بمنظور تجزیه و تحلیل اطلاعات بدست آمده و انجام آنالیز واریانس مولکولی (AMOVA) و تعین پارامترهای تنوع ژنتیکی از نرم افزار GenAlex 6.4  استفاده شد. برای انجام آنالیزهای خوشه بندی و تجزیه به مولفه­های اصلی نتایج بدست آمده از غربالگری باندها و همچنین سنجش ارتباط عوامل اقلیمی و انجام آنالیز CCA از نرم افزار PAST ver. 2.17  استفاده شد.

شکل1- یک نمونه از تصویر ژل الکتروفورز حاصل از  جمعیت­های آسپرژیلوس نایجر با پرایمر UBC 834

جدول1- داده­های محیطی نقاط نمونه برداری

نتایج

بر اساس نتیجه حاصل از آنالیز واریانس یکطرفه در نرم افزار SPSS اختلاف معنی­داری بین صفات ماکروسکوپی و میکروسکوپی (جدول 5) در واریته­های جدا شده از منابع مختلف مشاهده نشد (P> 0.05)، بنابراین از انجام آزمون تعقیبی مانند دانکن و یا توکی و همچنین آنالیزهای چند متغییره بر اساس صفات ریخت شناسی صرفنظر شد. نتایج بدست آمده از مطالعه ISSR نشان می­دهد که در غربالگری اولیه، در مجموع از بیست پرایمر انتخاب شده، پرایمر UBC 825، با تولید 11 باند بیش از سایر پرایمرها باند ایجاد نموده است، پس از آن پرایمرهای UBC 809،UBC 834، UBC 899 وUBC 817 با تولید 10 باند قرار دارند (جدول 2). آنالیز اطلاعات بدست آمده از روش ISSR در نرم افزار GenAlex نشان­دهنده وجود تنوع درون جمعیتی برابر با 33 درصد و تنوع بین جمعیتی برابر با 67 درصد است (جدول های 3و 4).

جدول 2- پرایمرهای مورد استفاده در این تحقیق (طراحی شده توسط دانشگاه بریتیش کلمبیا)

*: R = (A, G), Y = (C, T), B = (C, G, T), H= (A, C, T), V= (A, C, G)

آنالیز خوشه­بندی انجام شده بر اساس UPGMA در نرم افزار PAST نشان­دهنده دو خوشه مجزاست، جمعیت آسپرژیلوس نایجر جدا­شده از کلزای مشهد بهمراه جمعیت جدا­شده از سویای اردبیل در یک خوشه و جمعیت­های از گندم فسا، جوی قزوین و ذرت دزفول در خوشه­ای دیگر قرار گرفته­اند (شکل 1). در آنالیز PCoA بر اساس مولفه­های اصلی قرابت جدایه­های خالص شده از جوی قزوین، ذرت دزفول و گندم فسا از سایر جمعیت­ها مشخص می‍شود، هرچند قرابت جدایه­های گندم و ذرت با یکدیگر بیشتر است، در این آنالیز وضعیت دقیقتری از قرابت جدایه­های حاصل از کلزا و سویا نیز مشخص می­شود (شکل 2). در آنالیز CCA عوامل زیست محیطی مناطق زراعی که نمونه برداری از آنها انجام شده  شامل میانگین دمای سالانه، میانگین بارندگی سالانه، ارتفاع و عرض جغرافیایی (جدول 1) نیز علاوه بر نتایج حاصل از ISSR مورد سنجش قرار گرفته و در محاسبات لحاظ می شوند که براین اساس نتیجه حاصل از CCA در شکل 3 نشان داده شده است. نتایج حاصل از این آنالیز هم موید جدایی جمعیت­های آسپرژیلوس نایجر خالص شده از غلات و دانه­های روغنی است (شکل 3).

جدول 3- نتایج حاصل از آنالیز واریانس مولکولی (AMOVA) جمعیت­های آسپرژیلوس نایجر در نرم افزار  GenAlex

df: degree of freedom; SS: sum of squared observations; MS: mean of squared observations; EV: estimated variance; ΦPT: proportion of the total genetic variance among individuals within an accession.

جدول 4- ماتریس تشابه ژنتیکی (Nei) جمعیت­های آسپژیلوس نایجر مطالعه شده با استفاده از نشانگرهای مولکولی ISSR

P1= جمعیت فسا، P2= جمعیت مشهد، P3= جمعیت دزفول، P4= جمعیت اردبیل، P5= جمعیت قزوین

شکل2- آنالیز خوشه­بندی جدایه­های آسپرژیلوس نایجر بر اساس داده­های ^ISSR (B: کلزا، G: سویا، H: جو، T: گندم، Z: ذرت)

شکل 3- آنالیز مولفه­های اصلی (PCoA) جدایه­های آسپرژیلوس نایجر بر اساس داده­های ISSR

(B: کلزا، G: سویا، H: جو، T: گندم، Z: ذرت)

شکل 4- آنالیز CCA جدایه­های آسپرژیلوس نایجر بر اساس داده­های ISSR و داده های محیطی( ارایه شده در جدول 2 )

(B: کلزا، G: سویا، H: جو، T: گندم، Z: ذرت، ALT: ارتفاع ازسطح دریا، LAT: عرض جغرافیایی منطقه، RIN: متوسط بارش و TEM: متوسط دما)

بحث و نتیجه گیری

روش­های ریخت­شناسی در شناسایی قارچ­های ساپروفیت هرچند بدلیل سهولت نسبی، شناسایی قابل قبول گونه­ها و هزینه کمتر همچنان رایج و مورد استفاده هستند اما عموماً توانایی تشخیص جمعیت­های یک گونه را ندارند بنحوی که با استفاده از این روش­ها امکان شناسایی و تفکیک افراد متعلق به یک گونه که از میزبان­های مختلف جدا شده و یا در شرایط اقلیمی متفاوتی رشد نموده­اند وجود ندارد (11)، نتایج حاصل از مطالعه ریخت­شناسی میکروسکوپی و ماکروسکوپی صورت گرفته در این تحقیق نیز موید این مطلب است بنحوی که هرچند با استفاده از محیط­های کشت تخصصی و کلیدهای شناسایی مرفولوژیک امکان شناسایی و جداسازی گونه
Aspergillus niger از سایر گونه­ها فراهم آمد، اما بدلیل تشابه زیاد صفات مرفولوژیکی افراد این گونه و نبود تفاوت معنی­دار بین آنها همانطور که در بخش نتایج اشاره شد (P> 0.05)، امکان تفکیک جمعیت­های این گونه با استفاده از این صفات میسر نشد. بنابراین، این روش برای شناسایی و تفکیک جمعیت­های گونه A.niger کارآمد نیست. تاکنون تحقیقات محدودی برای استفاده از مارکرهای مولکولی جهت شناسایی و تفکیک گونه­ها و جمعیت­های آسپرژیلوس خصوصاً Aspergillus niger با استفاده از روش ISSR صورت گرفته است، بعنوان نمونه Zhao و همکاران با استفاده روش­های مولکولی ITS و  ISSR به مطالعه جمعیت­های این گونه پرداخته اند، بر اساس نتیجه این تحقیق با استفاده از روش­های مولکولی ذکر شده امکان تشخیص جمعیت­های گونه نایجر میسر شده است (25)، Mazrou و همکاران نیز ­بمنظور شناسایی دقیقتر گونه­های­ قارچی از جمله A.niger که در حل شدن فسفات اضافه شده به خاک­های زراعی موثرند با استفاده از روش ISSR اقدام نموده­اند (15)، اما بیشتر مطالعات صورت گرفته با استفاده از تکنیک  ISSRمربوط به گونه
A. flavus می­باشد، بعنوان مثال Priyanka و همکاران با استفاده از روش ISSR برای شناسایی گونه­های سکشن Flavi  از جنس آسپرژیلوس تلاش نموده اند، آنها بیان می­کنند که این روش، روشی کارآمد و قابل اعتماد در شناسایی اعضای سکشن Flavi می­باشد (20)، الودایی و همکاران برای تشخیص بین نژادهای آسپرژیلوس فلاووس مولد آفلاتوکسین آلوده کننده گندم از روش ISSR و RAPD استفاده نموده اند، نتایج تحقیق آنها نشان داد روش ISSR نسبت به روش RAPD کارایی بهتری در تفکیک بین نژادهای مولد و غیر مولد آفلاتوکسین دارد (5)، سلیم و همکاران در مطالعه بین گونه­ای آسپرژیلوس از روش ISSR استفاده نموده اند، بر اساس نتیجه این تحقیق روش ISSR روشی مناسب برای تشخیص گونه­های آسپرژیلوس از یکدیگر است همچنین گزارش شده است که این روش در تفکیک واریته های مولد مایکوتوکسین نیز تا حدی موفق بوده است(22). در مطالعه حاضر نیز از روش ISSR برای شناسایی جدایه های بدست آمده از محصولات زراعی از مناطق مختلف استفاده شد، بر اساس آنالیز خوشه­بندی UPGMA و آنالیز مولفه­های اصلی جمعیت­های جدایه­های بدست آمده از مناطق مختلف در دو دسته اصلی تقسیم­بندی شد، گروه اول جدایه­های حاصل از غلات گندم، جو و ذرت از فسا، قزوین و دزفول بود و گروه دوم جدایه­های خالص شده از کلزا و سویا از مشهد و اردبیل می­باشد. نتایج حاصل از این تحقیق در خصوص توانایی روش ISSR در تفکیک جمعیت های آسپرژیلوس نایجر بدست آمده از مناطق مختلف با نتایج حاصل از مطالعه Mazrou و همکاران و همچنین مطالعه هاشوش و همکاران در خصوص امکان تفکیک جمعیت­های آسپرژیلوس نایجر با استفاده از روش­های ISSR و RAPD مطابقت دارد (8 و 18)، نتایج این تحقیق با نتایج حاصل از مطالعه ژانگ و همکاران و همچنین مطالعه محمود و همکاران در خصوص توانمندی روش ISSR در تشخیص جدایه­های مختلف متعلق به یک گونه آسپرژیلوس نیز مطابقت دارد (13 و 24). در مقایسه بین روش ISSR و RAPD نتایج تحقیقات الودایی و همکاران بیان می­کنند که روش ISSR به نسبت روش RAPD توانایی تفکیک بیشتری در این خصوص نشان می‍دهد (5).

از داده­های ISSR و اطلاعات محیطی بطور معمول برای سنجش تنوع ژنتیکی و ارتباط آن با عوامل اقلیمی در جمعیت­های وحشی و زراعی گیاهان گلدار استفاده می‍شود (2و3). همچنین در مطالعات مولکولی بین جمعیت گیاهان عالی جهت سنجش عوامل جغرافیایی مختلف موثر بر بروز اختلافات بین جمعیت­ها، آنالیز CCA بکار گرفته می­شود (16)، هرچند در قارچ­های ساپروفیت برخلاف گیاهان عالی، اثرگذاری عوامل اقلیمی ماکروکلیمایی بعلت حاکمیت شرایط میکروکلیمایی تاثیر کمتری دارند (17)، اما در این تحقیق با توجه به گستره مناطق جغرافیایی و همچنین نمونه­گیری مستقیم از محل اصلی تولید این محصولات بلافاصله پس از برداشت و قبل از انبارشدن، انجام آنالیز CCA بر اساس شرایط ماکروکلیمایی منطقی بنظر می­رسید، از اینرو علاوه بر آنالیزهای معمول از این روش نیز در تجزیه و تحلیل نتایج استفاده شد، در این آنالیز فاکتورهای محیطی متوسط بارندگی و دمای سالانه (بازتابی رطوبت نسبی منطقه)، عرض جغرافیایی و ارتفاع از سطح دریا (بازتابی از میزان و شدت دریافت نور خورشید) بعنوان عوامل ماکروکلیمای موثر در نظر گرفته شده است (جدول 1). ، بر اساس نتیجه این آنالیز (شکل 4) موثرترین عوامل اقلیمی در جدا افتادگی جمعیت خالص شده از سویای اردبیل نسبت به سایر جمعیت­ها، متوسط دمای سالانه (5/8 درجه سانتیگراد، کمترین دما در بین مناطق مورد مطالعه) و عرض جغرافیایی (بالاترین عرض جغرافیایی در بین مناطق مورد مطالعه و کمترین تابش آفتاب در سال) بوده است، موثرترین عوامل جدایی جمعیت­های خالص شده از کلزای مشهد از سایر جمعیت­ها متوسط بارندگی سالانه می­باشد (کمترین میزان بارندگی متوسط در بین مناطق مورد مطالعه) و جدایی دو جمعیت از آسپرژیلوس­های خالص شده از ذرت دزفول و گندم فسا بطور عمده تحت تاثیر میزان متوسط بارندگی سالیانه، متوسط دمای سالیانه و عرض جغرافیایی بوده است، منطقه قزوین بجز در عامل ارتفاع، از لحاظ عرض جغرافیایی، متوسط بارندگی و دما حالتی حدواسط داشته و این موضوع در خصوص موقعیت جمعیت­های جوی جداشده از این محصول در نمودار آنالیز CCA نیز مشاهده می­شود، بر اساس نتایج CCA و PCoA جمعیت جو قزوین به جمعیت­های ذرت دزفول و گندم فسا نزدیکتر است تا جمعیت­های کلزای مشهد و سویای اردبیل، بنظر می­رسد تشابه ترکیبات و مواد مغذی گیاهان میزبان­ که همگی از خانواده Poaceae می باشند در این رخداد موثر باشد، در این خصوص بلالی و همکاران نیز در مطالعه صورت گرفته روی تنوعات درون گونه­ای و بین گونه­ای آسپرژیلوس با استفاده از روش زایموگرافی پکتیناز اشاراتی شده اما اثباتی در این مورد صورت نگرفته است (6)، پیشنهاد می­شود تحقیقات دقیقتری بر روی این موضوع صورت پذیرد چراکه در صورت اثبات وجود ارتباط معنی­دار، می­توان انتظار داشت افق جدیدی در شناسایی و ردیابی جمعیت­های قارچ آسپرژیلوس گشوده شود.

 بر اساس یافته های این تحقیق از روش مولکولی ISSR  می­توان جهت تعیین تنوعات درون گونه­ای A.niger استفاده نمود و با استفاده از این تکنیک می­توان ضعف روش­های معمول ریخت­شناسی در تشخیص یا تفکیک جمعیت­های این گونه را بر طرف کرد.

سپاسگزاری

از مراکز مختلف دانشگاه پیام­نور که با در اختیار قرار دادن امکانات اسکان جهت نمونه­برداری در فصول مناسب همزمان با برداشت محصول در استان­های خراسان رضوی، فارس، خوزستان، قزوین و اردبیل در انجام هرچه بهتر این تحقیق همراهی نموده­اند قدردانی می­گردد.