تحریک تولید ترکیبات فنولی در کشت سلولی آویشن شیرازی (Zataria multiflora Boiss.) تحت تیمار سالیسیلیک‌اسید

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری گروه آموزشی علوم گیاهی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی،صندوق پستی 1571914911تهران، ایران

2 گروه آموزشی علوم گیاهی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی،صندوق پستی 1571914911تهران، ایران

3 گروه آموزشی علوم گیاهی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، صندوق پستی 111-14115تهران، ایران

چکیده

آویشن شیرازی Boiss.) Zataria multiflora) با داشتن ترکیبات فنولی و ترپنوئیدی، دارای طیف وسیعی از ویژگی‌های بیولوژیکی است. القای متابولیت های ثانویه در سیستم‌های کشت سلولی توسط محرک‌ها یکی از مهم‌ترین استراتژی‌ها برای بهبود تولید ترکیبات ارزشمند دارویی است. در مطالعه حاضر رده سلولی آویشن شیرازی در محیط کشت B5بنیان‌گذاری و سلول‌ها در مرحله رشد لگاریتمی به مدت سه روز تحت تیمار سالیسیلیک‌اسید در غلظت‌های 0، 90، 180 و 360 میکرو مولار قرار گرفتند و فعالیت آنزیم‌های مسیر فنیل پروپانوئیدی و آنتی‌اکسیدان، محتوای پراکسید هیدروژن (H2O2) و نیتریک اکسید (NO) و همچنین میزان ترکیبات فنولی توسط اسپکتروفتومتر و HPLC تعیین شد. سالیسیلیک‌اسید، منجر به افزایش فعالیت آنزیم‌های سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT)، پراکسیداز (POX)، همچنین محتوای NO و H2O2 گردید. در غلظت های 90 و 180 میکرو مولار، فعالیت آنزیم‌های فنیل‌آلانین‌آمونیالیاز (PAL) در حدود 2/1 برابر، تیروزین آمونیالیاز (TAL) در حدود 4/1-3/1 برابر، پلی‌فنل‌اکسیداز (PPO) در حدود 7/1-5/1برابر افزایش یافت. همچنین محتوای فنول کل در این غلظت‌ها به ترتیب 79/5 و 38/4 میلی‌گرم بر گرم وزن تر در مقایسه با گروه شاهد افزایش نشان داد. در کشت‌های سلولی آویشن شیرازی، در غلظت های مختلف بکار رفته، محتوای 4- هیدروکسی بنزوئیک اسید، بنزوئیک اسید، اپی کاتکین و سیرینجیک اسید افزایش یافت. به نظر می‌رسد که کشت سلولی آویشن شیرازی و استفاده از محرک غیر زیستی سالیسیلیک اسید در غلظت های مناسب می‌تواند به عنوان یک سیستم کارآمد برای تولید متابولیت های ثانویه استفاده گردد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Stimulation of phenolic compounds production in Zataria multiflora Boiss. cell suspension culture through salicylic acid elicitation

نویسندگان [English]

  • Khadijeh Bavi 1
  • Ramazan Ali Khavari-Nejad 2
  • Farzaneh Najafi 2
  • Faezeh Ghanati 3

1 (PhD student) Department of Plant Sciences, Faculty of Biological Sciences, Kharazmi University, P.O.Box: 1571914911, Tehran, Iran

2 Department of Plant Science, Faculty of Biological Sciences, Kharazmi University, P.O. Box: 15719-14911, Tehran, Iran

3 Department of Plant Biology, Faculty of Biological Sciences, Tarbiat Modares University, P.O.Box: 14115-111, Tehran, Iran

چکیده [English]

Zataria multiflora is medicinal plant with a wide range of biological properties due to having phenolic and terpenoid compounds. Induction of secondary metabolites in plant cell culture systems by elicitors is one of the most important strategies to improve the production of medicinal metabolites. In the present study, a cell line was established from Z. multiflora in B5 medium and the effects of salicylic acid at 90, 180 and 360 µM on suspension-cultured cells was evaluated for 3 days in their logarithmic growth phase. The activity of phenylpropanoid biosynthetic pathway and antioxidant enzymes, the level of regulatory molecules hydrogen peroxide (H2O2) and nitric oxide (NO) and also the amount of phenolic compounds were determined by spectroscopy and HPLC techniques. The activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and peroxidase (POD) and also H2O2 and NO content increased in different concentration of elicitor. Salicylic acid at 90 and 180 µM concentrations significantly enhanced the activity of phenylalanine ammonia-lyase (PAL), about 1.2 fold, tyrosine ammonia-lyase (TAL), 1.3 - 1.4 fold and polyphenol oxidase (PPO), 1.5 - 1.7 fold as well as total contents of phenol (5.79 and 4.38 mg g-1 FW) compared to control, respectively. In addition, the production of 4-hydroxy benzoic acid, benzoic acid, epicatechin and syringic acid were induced in Z. multiflora at different concentrations of salicylic acid. This study indicates that Z. multiflora cell suspension culture combined with optimal concentrations of salicylic acid could be a useful and efficient system for sustainable production of valuable secondary metabolites.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Zataria multiflora
  • salicylic acid
  • Nitric oxide
  • Phenolic compounds
  • Antioxidant enzymes

تحریک تولید ترکیبات فنولی در کشت سلولی آویشن شیرازی

(Zataria multiflora Boiss.) تحت تیمار سالیسیلیک‌اسید

خدیجه باوی1*، رمضانعلی خاوری نژاد1، فرزانه نجفی1 و فائزه قناتی2

1 ایران، تهران، دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم گیاهی

2 ایران، تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم گیاهی

تاریخ دریافت:09/04/1400           تاریخ پذیرش: 20/08/1400

چکیده

آویشن شیرازی Boiss.) Zataria multiflora) با داشتن ترکیبات فنولی و ترپنوئیدی، دارای طیف وسیعی از ویژگی‌های بیولوژیکی است. القای متابولیت های ثانویه در سیستم‌های کشت سلولی توسط محرک‌ها یکی از مهم‌ترین استراتژی‌ها برای بهبود تولید ترکیبات ارزشمند دارویی است. در مطالعه حاضر رده سلولی آویشن شیرازی در محیط کشت  B5بنیان‌گذاری و سلول‌ها در مرحله رشد لگاریتمی به مدت سه روز تحت تیمار سالیسیلیک‌اسید در غلظت‌های 0، 90، 180 و 360 میکرو مولار قرار گرفتند و فعالیت آنزیم‌های مسیر فنیل پروپانوئیدی و آنتی‌اکسیدان، محتوای پراکسید هیدروژن (H2O2) و نیتریک اکسید (NO) و همچنین میزان ترکیبات فنولی توسط اسپکتروفتومتر و HPLC تعیین شد. سالیسیلیک‌اسید، منجر به افزایش فعالیت آنزیم‌های سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT)، پراکسیداز (POX)، همچنین محتوای NO و H2O2 گردید. در غلظت های 90 و 180 میکرو مولار، فعالیت آنزیم‌های فنیل‌آلانین‌آمونیالیاز (PAL) در حدود 2/1 برابر، تیروزین آمونیالیاز (TAL) در حدود 4/1-3/1 برابر، پلی‌فنل‌اکسیداز (PPO) در حدود 7/1-5/1برابر افزایش یافت. همچنین محتوای فنول کل در این غلظت‌ها بترتیب 79/5 و 38/4 میلی‌گرم بر گرم وزن تر در مقایسه با گروه شاهد افزایش نشان داد. در کشت‌های سلولی آویشن شیرازی، در غلظت های مختلف بکار رفته، محتوای 4- هیدروکسی بنزوئیک اسید، بنزوئیک اسید، اپی کاتکین و سیرینجیک اسید افزایش یافت. بنظر می‌رسد که کشت سلولی آویشن شیرازی و استفاده از محرک غیر زیستی سالیسیلیک اسید در غلظت های مناسب می‌تواند بعنوان یک سیستم کارآمد برای تولید متابولیت های ثانویه استفاده گردد.

واژه های کلیدی: آویشن شیرازی، سالیسیلیک اسید، نیتریک اکساید، ترکیبات فنولی، آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان

* نویسنده مسئول، تلفن: 09166166024  ، پست الکترونیکی: [email protected]  

مقدمه

 

گیاهان یک منبع تجدید پذیر بالقوه از ترکیبات زیستی فعال هستند. این ترکیبات منبع ارزشمندی از داروها، سموم دفع آفات، مواد طعم‌دهنده و معطر و افزودنی‌های غذایی هستند. سنتز و تجمع متابولیت های ثانویه، ازجمله ترکیبات فنولی بخشی از پاسخ دفاعی گیاهان در برابر حملات گیاه‌خواران، حشرات، عوامل بیماری‌زا و اشعه ماورا بنفش جهت بقا، سازگاری و رقابت با آن‌ها می‌باشد (38، 43 و 44). کشت سلول، بافت و اندام گیاهی، تکنولوژی جذاب و پایدار برای افزایش بیوسنتز ترکیبات ثانویه باارزش، بدون نیاز به برداشت بیش از حد گیاهان از زیستگاه‌های طبیعی آن‌ها می‌باشد (20). استفاده از محرک‌های مختلف زیستی و غیر زیستی یک استراتژی مؤثر و مفید برای افزایش تولید و انباشت متابولیت های باارزش داروئی می‌باشد که با کاهش زمان لازم برای بدست آوردن غلظت های بالایی از این ترکیبات و افزایش سرعت تولید آنها همراه است (9). تحریک سلول‌ها بطور گسترده‌ای درکشت های تعلیقی سلول‌های گیاهی برای افزایش تولید متابولیت های ثانویه در شرایط آزمایشگاهی یا القای ژن‌های درگیر در بیوسنتز متابولیت های ثانویه مورد استفاده قرار گرفته است (26 و 34). در بسیاری از مطالعات نشان داده شده است که اثرات محرک‌های زیستی و غیر زیستی بر روی گیاهان بسته به نوع گیاه، غلظت محرک بکار رفته، شرایط کشت، مدت زمان تیمار و ترکیب مواد مغذی متفاوت است. محرک‌های مختلف زیستی و غیر زیستی مانند کیتوزان، کیتین و عصاره مخمر، اشعه UV، میدان مغناطیسی، نانو ذرات نقره با القای مکانیسم‌های دفاعی منجر به بیوسنتز و انباشت ترکیبات ثانویه می‌گردند (4، 8 و 23). این محرک‌ها با تنظیم میزان بیوسنتز، تجمع و یا انتقال واکوئلی متابولیسم اولیه و ثانویه گیاه را تحت تأثیر قرار می‌دهند (13 و 44). محرک‌های مختلف می‌توانند با ایجاد تنش اکسیداتیو منجر به تولید گونه‌های فعال اکسیژن (ROS)، القای مسیرهای انتقال علامت و در نهایت تولید متابولیت های ثانویه شوند. گونه‌های فعال اکسیژن بویژه پراکسید هیدروژن (H2O2) در غلظت های پایین از طریق القای بیان ژن‌های خاص و تولید متابولیت های ثانویه بعنوان یک مولکول علامتی در پاسخ‌های سلول به تنش‌های زیستی و غیر زیستی عمل می‌کند. غلظت های بیشترROS  بعنوان یک عامل سمی می‌تواند باعث تنش اکسیداتیو و آسیب به غشاهای سلولی گردد (24). هموستازی ROS از طریق القای فعالیت آنتی‌اکسیدان‌های آنزیمی و غیر آنزیمی مانند ترکیبات فنولی برای جلوگیری از آسیب اکسیداتیو تنظیم می‌شود (41). همچنین مولکول نیتریک اکساید (NO) یکی از علامت رسان‌های مهم در القای بسیاری از پاسخ‌های دفاعی است. مطالعات فراوانی نشان‌دهنده نقش محرک‌های مختلف بر تولید این مولکول علامتی می‌باشند (3). سالیسیلیک اسید (2- هیدروکسی بنزوئیک اسید) مولکول علامت رسان است که بسیاری از فعالیت‌های فیزیولوژیک مهم گیاه مانند رشد، تمایز و متابولیسم را تنظیم می‌کند (29). این ترکیب فنولی قادر است با تحریک بیان ژن‌ها در فعال‌سازی بسیاری از مکانیسم‌های دفاعی در گیاه نقش کلیدی ایفا کند (46). در تحقیقات متعددی مشخص ‌شده است که می‌توان از سالیسیلیک اسید بعنوان یک محرک غیر زیستی برای تحریک مقاومت به عوامل بیماری‌زا و تولید متابولیت های ثانویه مانند تانشینون در کشت‌های سلولی Salvia miltiorrhiza ، آنتوسیانین درکشت کالوس Daucus carota، کلروژنیک اسید و مشتقات آن در کشت سلولی  Gardenia jasminoides و محتوای فنولی و فلاونوئیدها در کشت سلولیOrostachys cartilaginous  استفاده کرد (29، 37، 46 و 48).

Zataria multiflora معروف به آویشن شیرازی، گیاهی معطر و با ارزش دارویی از خانواده نعناعیان (Lamiaceae) است که در افغانستان، پاکستان و مناطق مرکزی و جنوبی ایران رشد می‌کند. این گیاه چند ساله بدلیل محتوای بالای متابولیت های ثانویه مانند پلی فنول‌ها و ترکیبات ترپنوئیدی در طب سنتی کاربرد فراوان داشته است (47). تحقیقات زیادی در زمینه خواص بیولوژیکی و دارویی عصاره و اسانس گیاه آویشن شیرازی شامل فعالیت‌های ضد قارچی، ضد باکتری، آنتی‌اکسیدانی، ضد التهابی و سیمت زایی بر سلول‌های سرطانی صورت گرفته است (25 و 40). از آنجایی که گزارش‌های کمی در مورد افزایش تولید متابولیت های ثانویه با استفاده از محرک‌های مختلف در کشت سلول‌های Z. multiflora ارائه شده است، در تحقیق حاضر اثر سالیسیلیک اسید بر پروفایل ترکیبات فنولی و فعالیت آنزیم‌های کلیدی مسیر بیوسنتز ترکیبات فنولی، فنیل‌آلانین‌آمونیالیاز (PAL) و تیروزین آمونیالیاز (TAL) در کشت سلولی این گونه مورد بررسی قرار گرفته است. همچنین محتوای مولکول‌های علامت رسان NO و H2O2 و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی نیز مورد مطالعه قرار گرفته‌اند.

مواد و روشها

جمع‌آوری و کشت بذر: بذرهای Z. multiflora از جمعیت گیاهان در حال رشد وحشی در منطقه کوهپایه (ارتفاع 2000 متر) واقع در استان کرمان در منطقه جنوب شرقی ایران جمع‌آوری شدند. نمونه گیاهی با شماره هرباریومی 4477 در مرکز تحقیقات منابع طبیعی و کشاورزی استان کرمان قرار گرفت. بذرها پس از شستشو با آب مقطر، در محلول هیپوکلریت سدیم 5٪ (w/v)  با چند قطره Tween 20 به مدت 5 دقیقه استریل شدند. پس از سه بار شستشو با آب مقطر استریل. در الکل 70٪ به مدت 30 ثانیه قرار گرفته و در پایان با آب مقطر استریل آبکشی شدند. بذرها روی محیط (Murashige and Skoog) MS حاوی 5/6 گرم در لیتر آگار و 30 گرم در لیتر ساکارز قرار داده شد و در یک دوره رشد 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در اطاقک رشد در دمای 25 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. از گیاهچه‌های حاصل برای ایجاد قطعات جداکشت و کشت بافت استفاده شد.

القای تولید کالوس و راه‌اندازی کشت سلولی: بمنظور ایجاد کالوس، ریز نمونه‌های برگی از گیاهچه‌های 30 روزه به محیط کشت B5 حاوی 86/1 میلی‌گرم بر لیتر نفتالن استیک اسید (NAA)، 2/0 میلی‌گرم بر لیتر بنزیل آدنین (BA)، ساکارز 3درصد و آگار 7/0% درصد با 6/5  pH منتقل شد. بعد از گذشت دو هفته القای کالوس در ریز نمونه‌ها در تاریکی و دمای 25 درجه سانتی‌گراد آغاز شد. واکشت کالوس‌ها هر چهار هفته یک‌بار در محیط جامد صورت گرفت (شکل 1 الف). پس از یک ماه لاین مناسبی از سلول‌های هم شکل با سرعت رشد یکسان برای انجام آزمایش‌ها  بدست آمد که از سرعت تکثیر مناسبی برخوردار بودند. برای راه‌اندازی کشت سلولی مایع، مقدار سه گرم از کالوس‌های نرم و شکننده بعد از 20 بار واکشت به ارلن های 100 میلی‌لیتری که حاوی 25 میلی‌لیتر محیط کشت مایع B5 حاوی 86/1 میلی‌گرم بر لیتر نفتالن استیک اسید (NAA)، 2/0 میلی‌گرم بر لیتر بنزیل آدنین (BA) و ساکارز 3درصد انتقال یافت و در دمای 25 درجه سانتی‌گراد با سرعت 120دور در دقیقه در تاریکی روی شیکر قرار گرفتند. کشت تعلیقی سلول‌های آویشن شیرازی بر اساس منحنی رشد و زمان بدست آمده در دوره رشد لگاریتمی هر هفته یک‌بار و به مدت 8 هفته واکشت شدند (شکل 1 ب و ج).

تیماردهی: محرک غیر زیستی سالیسیلیک اسید در غلظت های 0،90،180 و 360 میکرو مولار بعد از استریل شدن با فیلتر سر سرنگی (با اندازه µm 22/0)، هفت روز پس از واکشت (مرحله رشد لگاریتمی) به سلول‌های کشت تعلیقی اضافه شدند. سه روز پس از اعمال تیمار و بمنظور انجام آزمایش‌های موردنظر، سلول‌ها جمع‌آوری و به سرعت در نیتروژن مایع منجمد شدند. همه آزمایش‌ها در چهار تکرار صورت گرفتند.

اندازه‌گیری رشد سلولی: سلول‌ها با استفاده از قیف بوخنر و در شرایط مکش، از محیط کشت مایع جدا شده و پس از شستشو با آب مقطر، در دمای 50 درجه سانتی‌گراد خشک و رشد سلولی تعیین شد.

سنجش پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی: بمنظور سنجش محتوای مالون دی آلدئید (MDA) بعنوان شاخص پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی، 2/0 گرم از توده سلولی در 3 میلی‌لیتر اسید تری‌کلرو‌استیک 1/0% (TCA) سائیده شد. مخلوط حاصل درrpm 10000به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ گردید و 500 میکرولیتر از محلول رویی با 2 میلی‌لیتر اسید تیوباربیتوریک محلول در TCA 20% مخلوط گردید. مخلوط حاصله در حمام آبگرم در دمای °C 95 درجه سانتی‌گراد به مدت نیم ساعت قرار داده شد و سپس سریع سرد گردید. میزان جذب نوری مخلوط در طول‌موج‌های 532 و 600 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر ثبت شد. محتوایMDA  با استفاده از ضریب خاموشی mM-1cm-1 155 محاسبه و برحسب میکرومول بر گرم وزن تر بیان گردید (21).

سنجش مقدار نیتریک اکساید: جهت تعیین مقدار NO، 2/0گرم توده سلولی با استفاده از بافر فسفات پتاسیم در 7pH  استخراج شد و در rpm 12000 به مدت 15دقیقه، در دمای °C 4 سانتی‌گراد سانتریفوژ گردید. 250 میکرولیتر از محلول رویی همراه با 750 میکرولیتر فسفات پتاسیم و 500 میکرولیتر معرف گریس
(1% sulfanilamide and 0.1% N-1- napthylethylenediamine dihydrochloride in 5% phosphoric acid) در دمای اتاق برای مدت 10 دقیقه انکوبه شد (18). جذب نوری نمونه‌ها در 540 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر بررسی شد و مقدار NO با استفاده از منحنی استاندارد نیتریت سدیم بر حسب میکرومول برگرم وزن تر محاسبه گردید.

سنجش پراکسید هیدروژن: بمنظور اندازه‌گیری محتوای H2O2، 1/0 گرم بافت تر در 3 میلی‌لیتر تری‌کلرواستیک اسید (TCA) 1/0 درصد روی یخ ساییده شد. مخلوط حاصل به مدت ۱۵ دقیقه با سرعت rpm ۱۲۰۰۰ در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد سانتریفوژ شد. سپس به 5/0 میلی‌لیتر از محلول رویی، مقدار ۵/0 میلی‌لیتر بافر پتاسیم فسفات ۱۰ میلی مولار (۷ pH ) و یک میلی‌لیتر یدید پتاسیم یک مولار اضافه شد و جذب نوری آن در طول‌موج ۳۹۰ نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر ثبت شد. مقدار H2O2 تولید شده در نمونه‌ها بر اساس منحنی استاندارد و بر حسب میکرومول برگرم وزن تر محاسبه شد (45).

سنجش محتوای فنول کل: جهت سنجش محتوای فنول کل، 2/0 گرم از توده سلولی (وزن تر) در متانول هموژنیزه و به مدت 15 دقیقه در rpm 12000سانتریفوژ گردید. با افزودن 3 میلی‌لیتر اتیل‌استات به محلول رویی، فاز فنولی جدا شده و بعد از تبخیر اتیل استات، رسوب حاصله در اتانول 75% (v/v) حل گردید. جذب نوری نمونه‌ها در طول‌موج 280 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. از گالیک اسید برای رسم منحنی استاندارد جهت تعیین محتوای فنول کل استفاده شد و در نهایت فنول کل به حسب میلی‌گرم بر گرم وزن تر بیان گردید (35).

سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز: برای تعیین فعالیت آنزیم کاتالاز، مقدار 2/0 گرم از سلول‌های منجمد شده در بافر فسفات سدیم 25میلی مولار (8/6 pH) به صورت هموژن درآمد. مخلوط حاصل سپس در  rpm 12000 به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفوژ شد. از محلول رویی برای تعیین غلظت پروتئین موجود در سلول‌ها و سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز استفاده گردید. غلظت پروتئین به روش برادفورد تعیین گردید (7). مخلوط واکنش شامل 25 میکرولیتر عصاره آنزیمی، 1225 میکرولیتر بافر پتاسیم فسفات ۲۵ میلی مولار (8/6 pH) و250 میکرولیتر پراکسید هیدروژن ده میلی  مولار تهیه شد. فعالیت آنزیم کاتالاز بر اساس میزان تجزیه پراکسید هیدروژن و در نتیجه کاهش میزان جذب آن در طول‌موج ۲۴۰ نانومتر سنجیده و به ازای میلی‌گرم پروتئین در عصاره آنزیمی محاسبه گردید (10).

تعیین فعالیت آنزیم پراکسیداز: جهت سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز، مقدار 2/0 گرم از سلول‌های منجمد شده در بافر فسفات سدیم 25 میلی مولار با 1/6 pH  سائیده شد. سپس در دور rpm 12000به مدت 20 دقیقه در دمای °C 4 سانتریفوژ گردید. از بخش رویی برای سنجش فعالیت آنزیمی استفاده شد. مخلوط واکنش شامل بافر فسفات سدیم ۶۰ میلی مولار (1/6pH)، گایاکول 28 میلی مولار، پراکسید هیدروژن 5 میلی مولار و عصاره آنزیمی بود. بلافاصله پس از افزودن عصاره، جذب نمونه‌ها در طول زمان یک دقیقه در طول‌موج ۴۷۰ نانومتر قرائت گردید و فعالیت آنزیم پراکسیداز به صورت تغییرات جذب در دقیقه به ازای میلی‌گرم پروتئین عصاره بیان شد (28).

تعیین فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز: 2/0 گرم از سلول منجمد شده در3 میلی‌لیتر بافر HEPES-KOH با غلظت 50 میلی مولار (8/7pH) حاوی 1/0 میلی مولار EDTA عصاره گیری و به مدت 20 دقیقه در rpm 12000 در دمای °C 4 سانتریفوژ شد. از محلول رویی برای سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز استفاده گردید. مخلوط واکنش شامل بافر HEPES-KOH با غلظت 50 میلی مولار و 8/7pH  حاوی EDTA با غلظت 1/0 میلی مولار، نیترو بلو تترازولیوم (NBT)  با غلظت 75 میکرومولار و کربنات سدیم 50 میلی مولار (2/10pH )، ریبوفلاوین 1 میکرومولار، L-متیونین 12 میلی مولار و عصاره آنزیمی بود. میزان جذب نوری در لوله‌های محتوی مخلوط واکنش قبل و بعد از قرار گرفتن در معرض نور فلورسنت در طول‌موج 560 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد. با استفاده از این اختلاف جذب، واحد آنزیمی نمونه‌ها محاسبه و فعالیت آنزیم برحسب واحد آنزیم در میلی‌گرم پروتئین عصاره بیان گردید (15).

فعالیت آنزیم پلی‌فنل‌اکسیداز: برای استخراج پلی‌فنل‌اکسیداز، 2/0 گرم توده سلولی منجمد شده در بافر فسفات سدیم 20 میلی مولار (8/6 pH) در هاون روی یخ تا همگن شدن نمونه‌ها سائیده شد و سپس نمونه‌ها به مدت 15 دقیقه با سرعت rpm 12000 سانتریفوژ شدند. از محلول رویی برای سنجش فعالیت آنزیم  PPOاستفاده گردید. مخلوط واکنش شامل بافر فسفات سدیم (mM 20 ,5/6pH  )، 4 متیل کتکول 20 میلی مولار و عصاره آنزیمی بود. جذب نمونه‌ها در طول زمان یک دقیقه در طول‌موج 410 نانومتر قرائت و فعالیت آنزیم برحسب میلی‌گرم پروتئین بیان گردید (22).

سنجش فعالیت آنزیم‌های PAL و TAL: فعالیت آنزیم‌های PAL  و TAL بر اساس روش Beaudoin-Eagan  و  Thorpe انجام شد (6). برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم PAL، مقدار 2/0 گرم توده سلولی در 3 میلی‌لیتر بافر تریس (50 میلی مولار حاوی 15 میلی مولار β مرکاپتواتانول در 2/8 pH) هموژن گردید و مخلوط حاصل در 15000 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه سانتریفوژ گردید. یک میلی‌لیتر بافر استخراج، 5/0 میلی‌لیتر  -L فنیل‌آلانین 10 میلی‌مولار، 4/0 میلی‌لیتر آب مقطر دو بار تقطیر و 4/0 میلی‌لیتر عصاره آنزیمی با هم مخلوط شده و در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت یک ساعت قرار داده شد. مخلوط واکنش توسط 1/0 میلی‌لیتر اسیدکلریدریک 6 مولار متوقف و اسید سینامیک توسط اتیل استات استخراج شد. سپس اتیل استات تبخیر و باقیمانده در 1 میلی‌لیتر هیدروکسید سدیم 05/0 مولار حل و جذب محلول در طول‌موج 290 نانومتر خوانده شد. اندازه‌گیری فعالیت آنزیم TAL بطور مشابه با آنزیم PAL انجام شد، با این تفاوت که از -L تیروزین 1/0 مولار به عنوان سوبسترای آنزیم استفاده و جذب نمونه‌ها در 320 نانومتر بررسی شد. فعالیت آنزیم‌های PAL و TAL بترتیب بر حسب میکرومول اسید سینامیک و p کوماریک اسید در میلی‌گرم پروتئین در ساعت تعیین شد.

سنجش ترکیبات فنولی به روش HPLC: برای بررسی میزان اسیدهای فنولی از دستگاه HPLC مدل (Waters, e2696, USA) استفاده شد. 1/0گرم از نمونه خشک سلولی (freeze dry) با 3 میلی‌لیتر متانول اسیدی 1% بطور کامل همگن شد و به مدت 24 ساعت روی شیکر در دمای اتاق قرار داده شد. سپس به مدت 20 دقیقه با سرعت rpm 12000 سانتریفوژ گردید و محلول رویی بعد از جدا شدن توسط هوادهی خشک شد. پس از تبخیر حلال در دمای اتاق به رسوب خشک حاصله 350 میکرولیتر متانول خالص اضافه شد و به مدت 10 دقیقه با دور rpm 13000 سانتریفوژ گردید. محلول فوقانی برای انجام HPLC با استفاده از فیلترµM 22/0 میکرون  صاف گردید. برای شستشوی ستون از یک برنامه زمانی با شیب خطی استفاده شد. فاز متحرک شامل دو سیستم محلول A شامل متانول خالص و محلولB  حاوی آب اسیدی 3% (V/V) بود. جذب متابولیت های ثانویه با استفاده از آشکارساز فرابنفش (UV) در طول‌موج 280 نانومتر و دمای 25 درجه سانتی گراد بررسی شد. اندازه‌گیری ترکیبات فنولی به کمک مقایسه زمان بازداری نمونه‌ها با ماده استاندارد (Sigma-Aldrich) و محاسبه سطح زیر منحنی کروماتوگرام حاصل از HPLC با استفاده از منحنی استاندارد صورت گرفت (5).

تجزیه و تحلیل آماری: آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی با چهار تکرار انجام گرفت. جهت تحلیل داده‌ها و رسم منحنی‌های مربوطه از نرم­افزار Excel و SPSS نسخه 19 استفاده گردید. مقایسه میانگین­ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح P ≤ 0.05 انجام شد.

نتایج

ترسیم منحنی رشد و بررسی اثر غلظت های مختلف سالیسیلیک اسید بر رشد سلولی: بمنظور بررسی زمان مناسب برای افزودن تیمار سالیسیلیک اسید، از منحنی رشد بدست آمده از سلول‌های آویشن شیرازی استفاده گردید. منحنی رشد نشان داد که سلول‌ها در 4-3 روز اول رشد کندی دارند (فاز تأخیری). رشد تصاعدی این سلول‌ها مطابق با روز 4 تا 10 پس از واکشت یعنی در فاز لگاریتمی می‌باشد (شکل 1ب). در این مرحله شیب رشد سلول‌ها افزایشی بوده و به شدت سلول‌ها در حال تقسیم هستند. زمان مناسب تیماردهی با استفاده از منحنی رشد کشت تعلیقی سلول‌های آویشن شیرازی تیمار داده شده در روز هفتم از مرحله لگاریتمی انتخاب شد. سلول‌ها به مدت سه روز تحت تیمار قرار گرفتند. در تحقیق حاضر آنالیز اثر غلظت های مختلف سالیسیلیک اسید بر رشد سلولی با استفاده از وزن خشک مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج آزمایش نشان داد که با افزایش غلظت سالیسیلیک اسید، رشد سلولی کاهش معنی‌داری در مقایسه با گروه شاهد نشان داد. بیشترین کاهش در رشد در غلظت های180 و 360 میکرومولار مشاهده شد و رشد سلولی بترتیب 38/12% و 41/ 27% در مقایسه با گروه شاهد کاهش نشان داد (شکل2).

تعیین محتوای MDA، H2O2 و NO: نتایج نشان داد که تیمار سالیسیلیک اسید در غلظت های 90، 180 و 360 میکرومولار منجر به افزایش معنی‌داری در میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی سلول و مقدار MDA در مقایسه با گروه شاهد گردید (بترتیب 136%، 136% و 118%) (شکل 3 الف).  مقدار H2O2 در سلول‌های تیمار داده شده با سالیسیلیک اسید در غلظت های مختلف افزایش معنی‌داری را در مقایسه با گروه شاهد نشان داد و بیشترین مقدار H2O2 در غلظت 90 میکرو مولار سالیسیلیک اسید مشاهده شد (شکل 3 ب). همچنین محتوای NO در غلظت های 90 و 180 میکرومولار افزایش معنی‌داری را در حدود 135% و 118% به ترتیب نسبت به گروه شاهد نشان داد (شکل 3 ج).

اثر سالیسیلیک‌‌اسید بر فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان: فعالیت آنزیم SOD افزایش معنی‌داری را در غلظت های بکار رفته 90، 180 و 360 میکرومولار نشان داد. بیشترین فعالیت این آنزیم در غلظت 90 میکرومولار در حدود 5/1 برابر و در غلظت های 180 و360 میکرو مولار در مقایسه با گروه شاهد در حدود 2/1 برابر افزایش نشان داد (جدول 1). با افزایش غلظت سالیسیلیک اسید فعالیت آنزیم CAT در مقایسه با گروه شاهد بطورمعنی‌داری افزایش نشان داد و بیشترین میزان افزایش فعالیت در غلظت 360 میکرومولار مشاهده شد، بطوریکه در این غلظت فعالیت آنزیم 7/2 برابر در مقایسه با گروه شاهد افزایش یافت (جدول 1). همچنین فعالیت آنزیم POX در سلول‌های تیمار شده افزایش معنی‌داری را در مقایسه با گروه شاهد نشان داد. در غلظت 90 میکرو مولار، فعالیت آنزیم پراکسیداز 6/2 برابر و در غلظت های 180 و360 میکرومولار فعالیت آنزیم در مقایسه با گروه شاهد در حدود 2 برابر افزایش یافت (جدول 1).

فعالیت آنزیم‌های PAL،TAL  و PPO: تیمار سالیسیلیک اسید در غلظت های 90 و 180 میکرومولار منجر به افزایش معنی‌داری در میزان فعالیت آنزیم‌های کلیدی در مسیر فنیل پروپانوئیدی،  PALو TAL گردید. فعالیت آنزیم PAL در این غلظت‌ها در مقایسه با گروه شاهد در حدود 2/1 برابر و فعالیت آنزیم TAL در حدود 4/1- 3/1 برابر افزایش نشان داد. همچنین در این غلظت‌ها فعالیت آنزیم PPO در حدود 7/1- 5/1 برابر افزایش نشان داد (جدول1).

تعیین محتوای فنول کل: تیمار سلول‌های آویشن شیرازی با سالیسیلیک اسید، محتوای فنول کل را افزایش داد. بیشترین افزایش در محتوای فنول کل در غلظت 90 میکرومولار (12/ 0 ±79/5 میلی‌گرم بر گرم وزن تر) مشاهده شد. در غلظت های 180 و 360 میکرو مولار بترتیب میزان فنول کل 17/0 ± 38/4 و 09/0 ± 23/4 میلی‌گرم بر گرم وزن تر افزایش نشان داد که این افزایش در مقایسه با گروه شاهد معنی‌دار بود (شکل 3 د).

تعیین پروفایل متابولیت های ثانویه: سالیسیلیک اسید باعث القای متابولیت های ثانویه مانند 4- هیدروکسی بنزوئیک اسید، اسید بنزوئیک، اپی کاتکین و اسید سرینجیک در کشت‌های سلولی آویشن شیرازی گردید. محتوای اسید سینامیک و ρ- کوماریک اسید در حضور همه غلظت های اسید بطور معنی‌داری در مقایسه با شاهد کاهش نشان داد. در غلظت های 180 و 360 میکرو مولار سالیسیلیک اسید القای تولید اپی کاتکین (10± 5/112میکروگرم بر گرم وزن خشک) و آپیژنین (2 ± 9/25 میکروگرم بر گرم وزن خشک) بترتیب در غلظت های 180 و 360 میکرومولار سالیسیلیک اسید مشاهده شد (جدول 2). بیشترین مقدار رزوسینول (1/0±  7/61 میکروگرم بر گرم وزن خشک)، 4- هیدروکسی بنزوئیک اسید (4/0±  9/43 میکروگرم بر گرم وزن خشک) و اسید سیرنجیک (3±  7/74 میکروگرم بر گرم وزن خشک) در غلظت 180 میکرومولار مشاهده شد. محتوای گالیک اسید در غلظت 90 میکرومولار بطور معنی‌داری در مقایسه با گروه شاهد 9/4 برابر افزایش نشان داد (جدول 2)

 

 

 

 

شکل 1- تشکیل کالوس نرم و شکننده آویشن شیرازی  Z. multiflora در محیط کشت جامد B5، محتوی 86/1 میلی‌گرم بر لیتر NAA و 2/0 میلی‌گرم بر لیتر  BAبعد از 20 واکشت (الف)، منحنی رشد سلولی در کشت سوسپانسیون سلولی آویشن شیرازی در محیط کشت   B5 مقادیر نشان داده شده میانگین ± انحراف معیار می­باشد (ب)، سوسپانسیون سلولی از سلول‌های آویشن شیرازی تیمار داده شده با سالیسیلیک اسید در محیط کشت مایع B5، محتوی 86/1 میلی‌گرم بر لیتر NAA و 2/0 میلی‌گرم بر لیترBA در مرحله لگاریتمی رشد (ج).

شکل 2- تأثیر غلظت های مختلف سالیسیلیک اسید بر رشد در سلول‌های Z. multiflora پس از سه روز از تیمار. مقادیر نشان داده شده میانگین ± انحراف معیار می­باشد. حروف متفاوت نشان‌دهنده­ تفاوت معنی­دار در سطح 05/0≥p  هستند.

 

 

شکل 3- تأثیر غلظت های مختلف سالیسیلیک اسید بر محتوای MDA (الف)،  H2O2(ب)، NO (ج) و فنول کل (د) در سلول‌های Z. multiflora پس از سه روز از تیمار. مقادیر نشان داده شده میانگین ± انحراف معیار می­باشد. حروف متفاوت نشان دهنده­ تفاوت معنی­دار در سطح 05/0≥p  هستند.

 

جدول 1- تأثیر غلظت های مختلف سالیسیلیک اسید بر فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و مسیر فنیل پروپانوئیدی در سلول‌های Z. multiflora پس از سه روز از تیمار. مقادیر نشان داده شده میانگین ± انحراف معیار می‌باشد. حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی‌دار در سطح 05/0≥p  هستند.

Salicylic acid

(μM)

CAT

POX

SOD

PPO

PAL

TAL

 

(∆Abs 240/mg protein)

(∆Abs 470/mg protein)

(U/mg protein)

(∆Abs 410/mg protein)

(µmolcinnamic.acid/mg protein./h)

(µmol coumaric

acid/mg protein/h)

 

0

42.92±1.76d

10.92±2.24c

78.54±1.04c

2.69±0.31c

1.57±0.03c

0.44±0.01b

 

90

62.13±0.81c

28.25±1.23a

114.44±5.51a

4.08±0.10b

2.05±0.03b

0.55±0.04a

 

180

67.62±2.22b

22.84±1.13b

90.35±0.79b

4.57±0.23a

2.15±0.02a

0.53±0.02a

 

360

113.80±1.52a

21.41±1.05b

88.42±3.55b

6.02±0.10d

1.33±0.02d

0.41±0.01b

 

جدول 2- تأثیر غلظت های مختلف سالیسیلیک اسید بر محتوای متابولیت های ثانویه در سلول‌هایZ. multiflora پس از سه روز از تیمار. مقادیر نشان داده شده میانگین ± انحراف معیار می‌باشد. حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی‌دار در سطح 05/0≥p  هستند.

Phenolic  Compound (µg g-1 DW)

 

Salicylic acid (µM)

 

Control

90

180

360

 

Apigenin

 

ND

 

ND

 

ND

 

25.9 ± 2a

Epicatechin

ND

ND

112.5±10a

ND

ρ-Coumaric acid

7±0. 1a

ND

5.2±0. 5b

3.3±0. 5c

Cinnamic acid

56±1a

24.3±4b

21.3±0. 1c

19.6±0. 2c

Gallic acid

8±0.4b

39±2a

ND

ND

Resosinol

26±0. 3b

25.1±0. 2b

61.7±0. 1a

17.5±0. 3c

4-Hydroxy benzoic acid

ND

10.5±0. 5b

43.9±0. 4a

9.5±0. 1c

Syringic acid

ND

25.3±7c

74.7±3a

45.9±0. 2b

Benzoic acid

ND

1.1± 0.05c

4.6±0. 1b

4.9±0. 2a

ND: Non detected

 

بحث و نتیجه گیری

نتایج تحقیق حاضر نشان داد که در کشت سلولی آویشن شیرازی با افزایش غلظت تیمار سالیسیلیک اسید، رشد سلولی کاهش می‌یابد. بنظر می‌رسد که محرک‌های مختلف با اثر بر تقسیم سلولی و توقف چرخه سلولی در مرحله G1 منجر به کـاهش تعـداد سلول‌ها و در نتیجه توقـف یـا کـاهش رشـد سـلول می‌گردند (31). همچنین با توجه به شکل‌های 2 و 3 می‌توان نتیجه گرفت که کاهش رشد می‌تواند در اثر پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی تحت تأثیر تیمار با سالیسیلیک اسید باشد. میزان MDA بعنوان محصول نهایی پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی و شاخص بیوشیمیایی تنش اکسیداتیو، افزایش معنی‌داری را در غلظت های مختلف بکار رفته در مقایسه با گروه شاهد نشان داد (شکل3). بنظر می‌رسد که غلظت های مختلف تیمار سالیسلیک‌اسید با ایجاد تنش اکسیدتیو و تولید ROS منجر به پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی و در نتیجه کاهش رشد سلولی شده‌اند (14).

NO و H2O2 بعنوان مولکول‌های علامت رسان نقش مهمی در فرآیندهای فیزیولوژیکی گیاهان و تنظیم پاسخ‌های دفاعی بویژه تولید متابولیت های ثانویه دارند (12). مولکول‌های ROS بویژه H2O2 در غلظت های پایین بعنوان مولکول‌های علامت‌رسان در راه‌اندازی پاسخ‌های دفاعی سلول نقش دارند، در‌حالیکه در غلظت های بالاتر باعث سمیت در سلول و تخریب غشاهای سلولی و سایر ماکرو مولکول‌ها مانند DNA، لیپیدها و پروتئین‌ها می‌شوند (24). بر این اساس میزان این ترکیبات در سلول باید به شدت کنترل شود. سیستم آنتی‌اکسیدانی سلول شامل آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان و ترکیبات غیر آنزیمی این عملکرد مهم را بر عهده‌دارند (33). در پژوهش حاضر، تیمار سالیسیلیک اسید در غلظت های مختلف منجر به افزایش معنی‌داری در محتوای H2O2 گردید که در غلظت 90 میکرومولار به بیشترین حد خود رسید. این میزان با تغییرات MDA مطابق بوده و با افزایش مقدار H2O2 پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی افزایش یافته است. در مقابل، فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان SOD، POX CAT نیز با افزایش غلظت تیمار سالیسیلیک اسید با الگوهای مختلف افزایش پیدا کرد (جدول 2). افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان مکانیسمی برای کنترل سطح مولکول‌های ROS بوده و مانع از تخریب سلول‌ها و مرگ آن‌ها می‌شود. همچنین سیستم آنتی‌اکسیدانی گیاه با تنظیم سطح مولکول علامت رسان H2O2 می‌تواند در القای مسیرهای بیوسنتزی متابولیت های ثانویه نقش داشته باشد. NO بعنوان یک مولکول کلیدی می‌تواند در تحمل تنش اکسیداتیو توسط سلول‌های گیاه نقش داشته باشد. بنظر می‌رسد که این مولکول از طریق افزایش بیان ژن های کد کننده و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان SOD، POX و  CATدر جهت تنظیم عملکرد و سمیت پراکسید هیدروژن عمل می‌کند (16 و 36). همچنین مطالعات نشان می‌دهند که NO می‌تواند به‌صورت مستقیم بر فعالیت و بیان ژن آنزیم‌های درگیر در مسیر بیوسنتز متابولیت های ثانویه و ترکیبات فنولی نقش داشته باشد (27). در این مطالعه مشاهده شد که غلظت های مختلف سالیسیلیک اسید در سلول‌های گیاه آویشن شیرازی منجر به افزایش سطح NO شدند. بنظر می‌رسد که این افزایش در سطح مولکول‌های علامت رسان می‌تواند در ارتباط با تنظیم حالت اکسیداتیو، جهت‌گیری سلول‌ها به سمت  القای پاسخ‌های دفاعی و فعال‌سازی مسیر فنیل پروپانوئیدی در سلول‌های تحت تیمار باشد. Gue و همکاران نیز افزایش در محتوای H2O2 و NO را درکشت های سلولی Orostachys cartilaginous و Salvia miltiorrhiza  تیمار شده با سالیسیلیک اسید گزارش کرده‌اند (19 و 46). دو آنزیمPAL  و TAL نقطه ارتباط متابولیت های اولیه و مسیر فنیل پروپانوییدی محسوب می‌شوند و القای آن‌ها در برابر بسیاری از محرک‌های زیستی و غیر زیستی از اولین پاسخ‌های دفاعی سلول گزارش شده است. این دو آنزیم آمینواسیدهای فنیل آلانین و تیروزین را به اسیدهای فنولی سینامیک اسید و کوماریک اسید تبدیل می‌کنند. بدلیل داشتن این نقش کلیدی، این آنزیم‌ها نقطه‌ی تنظیمی مهمی در بیوسنتز ترکیبات فنولی محسوب شده و بسیاری عوامل تنظیمی و محرک‌ها بیان ژن و فعالیت آن‌ها را هدف قرار می‌دهند (41 و 42). بمنظور بررسی ارتباط بین القای ترکیبات فنولی و تیمار سالیسیلیک اسید، فعالیت آنزیم‌های PAL  و TAL بررسی شد. نتایج نشان داد که فعالیت آن‌ها در راستای افزایش سطح محتوای فنول کل سلول‌های آویشن شیرازی در غلظت های 90 و 180 میکرومولار افزایش یافت. مطالعات نشان می‌دهد که مولکول‌های علامتی NO و H2O2 می‌توانند بیان ژن و فعالیت آنزیم‌های PAL  و TAL تحت تأثیر قرار داده و از این طریق در هدایت متابولیت های اولیه به سمت تولید ترکیبات فنولی نقش داشته باشند (41). بر این اساس، افزایش در فعالیت آنزیم‌های PAL و TAL به ‌موازات افزایش در محتوای NO و H2O2 در غلظت های 90 و 180 میکرومولار سالیسیلیک اسید می‌تواند تائید کننده این اثر در کشت سلولی آویشن شیرازی باشد (شکل 3). فعالیت آنزیم پلی‌فنل‌اکسیداز بعنوان اکسید کننده ترکیبات پلی فنولی مورد بررسی قرار گرفت. مشاهدات نشان می‌دهند که این آنزیم در تقویت سیستم ایمنی گیاهان در برابر محرک‌ها و تنش‌ها نقش ایفا می‌کند (11). در همه غلظت های بکار رفته تیمار سالیسیلیک اسید، فعالیت این آنزیم نیز افزایش پیدا کرد. بنظر می‌رسد که این افزایش فعالیت بعنوان یک پاسخ دفاعی برای به حداقل رساندن تولید و اثرات مخرب ROS در سلول‌ها باشد (42). القا و افزایش فعالیت آنزیم‌های PAL و TAL منجر به افزایش ترکیبات فنولی می‌شود. ترکیبات فنولی با خاصیت آنتی‌اکسیدانی و جاروب کردن گونه‌های فعال اکسیژن می‌توانند سلول‌ها را در برابر تنش اکسیداتیو محافظت کنند (32). همچنین این ترکیبات دارای خواص دارویی زیادی برای انسان هستند. مطالعات زیادی نشان داده‌اند که محرک‌های مختلف زیستی و غیر زیستی منجر به افزایش تولید و تجمع متابولیت های ثانویه در کشت های سلولی، ریشه های مویین و کالوس می گردند (1، 2 و17). رضایی و همکاران در بررسی تأثیر تیمار سالیسیلیک اسید بر کشت سلولیTaxus baccata  نشان دادند که غلظت 360 میکرومولار منجر به افزایش 1/6 برابری تولید تاکسول می‌گردد (39). سالیسیلیک اسید در غلظت 100 میکرومولار در کشت سلولیOrostachys cartilaginous  باعث القای تولید فنولیک اسید و فلاونوئیدها (46) و در Gardenia jasminoides منجر به تولید اسید کلروژنیک و مشتقات آن گردید (29). غلظت ترکیبات فنولی در سلول‌های تحت تیمار آویشن شیرازی در غلظت های مختلف سالیسیلیک اسید پاسخ‌های متفاوتی را نشان دادند. سالیسیلیک اسید در غلظت های مختلف باعث القای اسیدهای فنولی 4- هیدروکسی بنزوئیک اسید، اسید بنزوئیک و اسید سرینجیک در سلول‌های آویشن شیرازی گردید. بیشترین محتوی اسیدگالیک در غلظت 90 میکرومولار سالیسیلیک اسید مشاهده شد. القا تولید فلاونوئیدهای اپی کاتکین و آپیژنین بترتیب در غلظت های 180 و 360 میکرومولار سالیسیلیک اسید مشخص گردید و میزان سینامیک اسید و کوماریک اسید در مقایسه با نمونه شاهد در غلظت های مختلف کاهش یافت (جدول 2). بر این اساس کاهش دو اسید فنولی ابتدایی مسیر فنیل پروپانوئیدی یعنی سینامیک و کوماریک اسید تحت تأثیر سالیسیلیک اسید بدلیل مصرف آن‌ها و تبدیل به سایر ترکیبات فنولی بوده است. بطورکلی بنظر می‌رسد برای افزایش ترکیبات فنولی مختلف با استفاده از تیمار سالیسیلیک‌اسید غلظت های مختلفی مورد نیاز است چرا که هر کدام از ترکیبات در غلظت خاصی بیشترین مقدار را نشان داده‌اند. این پژوهش اولین گزارش در ارتباط با تعیین پروفایل ترکیبات فنولی در کشت سلولی آویشن شیرازی تحت تأثیر محرک سالیسیلیک اسید می‌باشد. بطور کلی می‌توان بیان کرد که با توجه به ترکیبات داروئی با ارزش موجود در گیاه بومی آویشن شیرازی، استفاده از تکنیک کشت سلول و استفاده از محرک سالیسیلیک اسید روش مؤثری برای افزایش تولید این ترکیبات می‌باشد و عوامل مختلف مانند غلظت محرک در انباشت ترکیبات فنولی مختلف نقش دارند. همچنین بنظر می‌رسد که مولکول‌های کلیدیNO  و H2O2  بهمراه اثر تنظیمی آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان می‌توانند در القای تولید ترکیبات فنولی مانند اپی کاتکین، آپیژنین، 4- هیدروکسی بنزوئیک اسید، اسید بنزوئیک و اسید سرینجیک در کشت سلولی آویشن شیرازی تیمار شده با سالیسیلیک اسید نقش داشته باشند.

سپاسگزاری

این پژوهش با حمایت مالی دانشگاههای خوارزمی و تربیت مدرس انجام شده است. نویسندگان مقاله، مراتب قدردانی خود را از کارشناسان محترم آزمایشگاههای دانشکده علوم زیستی دانشگاه خوارزمی و تربیت مدرس اعلام می‌دارند.

1- جامی، س. اسمعیل زاده بهابادی، ص. و مدرس، م. (1397). تأثیر کیتوزان بر ریز ازدیادی، محتوی متابولیت های ثانوی  و فعالیت آنتی اکسیدانی گیاه نوروزک (Salvia leriifolia Benth.). مجله پژوهشهای گیاهی، جلد 31، شماره 3، صفحات 568- 578.
2- شاهرودی، ا. برنارد، ف. مینایی تهرانی، د. و حسنی، س.ب. (1399). اثر تحریکی سالیسیلیک اسید بر فعالیت پلی آمین اکسیداز در کالوس آویشن دنایی. مجله پژوهشهای گیاهی، جلد 33، شماره 1، صفحات 147- 157.
 
3- Ahmad, P, Abdel Latef, A.A., Hashem, A., Abd_Allah, E.F., Gucel, S., Tran, L.S.P., 2016. Nitric oxide mitigates salt stress by regulating levels of osmolytes and antioxidant enzymes in chickpea. Frontiers in Plant Science, 7, PP:  347-357.
4- Balintova, M., Brunakova, K., Petijova, L., and Cellarova, E., 2019. Targeted metabolomic profiling reveals interspecific variation in the genus Hypericum in response to biotic elicitors. Plant physiology and biochemistry, 135, PP: 348-358.
5- Barreca, D., Lagana, G., Leuzzi, U., Smeriglio, A., Trombetta, D., and Bellocco, E., 2016. Evaluation of the nutraceutical, antioxidant and cytoprotective properties of ripe pistachio (Pistacia vera L., variety Bronte) hulls, Food Chemistry, 196, PP: 493-502.
6- Beaudoin-Eagan, L.D., and Thorpe, T.A., 1985. Tyrosine and phenylalanine ammonia lyase activities during shoot initiation in tobacco callus cultures, Plant Physiology, 78, PP: 438-441.
7- Bradford, M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Analytical Biochemistry, PP: 72, 248-254.
8- Cai, Z., Kastell, A., and Smetanska, I., 2014. Chitosan or yeast extract enhance the accumulation of eight phenolic acids in cell suspension cultures of Malus× domestica Borkh. The Journal of Horticultural Science and Biotechnology, 89(1), PP: 93-99.
9- Cai, Z., Kastell, A., Mewis, I., Knorr, D., and Smetanska, I., 2012. Polysaccharide elicitors enhance anthocyanin and phenolic acid accumulation in cell suspension cultures of Vitis vinifera. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 108(3), PP: 401-409.
10- Cakmak, I., and Marschner, H., 1992. Magnesium deficiency and high light intensity enhance activities of superoxide dismutase, ascorbate peroxidase, and glutathione reductase in bean leaves. Plant physiology, 98(4), PP: 1222-1227.
11- Constabel, C. P., and Barbehenn, R., 2008. Defensive roles of polyphenol oxidase in plants. In induced plant resistance to herbivory (pp. 253-270). Springer, Dordrecht.
12- Falahi, H., Sharifi, M., Chashmi, N. A., and Maivan, H. Z., 2018. Water stress alleviation by polyamines and phenolic compounds in Scrophularia striata is mediated by NO and H2O2. Plant Physiology and Biochemistry, 130, 139-147.
13- Farag, M. A., Al-Mahdy, D. A., Meyer, A., Westphal, H., and Wessjohann, L. A., 2017. Metabolomics reveals biotic and abiotic elicitor effects on the soft coral Sarcophyton ehrenbergi terpenoid content. Scientific reports, 7(1), PP: 1-11.
14- Ganesan, V., and Thomas, G., 2001. Salicylic acid response in rice: influence of salicylic acid on H2O2 accumulation and oxidative stress. Plant Science, 160(6), PP: 1095-1106.
15- Giannopolitis, C. N., and Ries, S. K., 1977. Superoxide dismutases: I. Occurrence in higher plants. Plant physiology, 59(2), PP: 309-31.
16- Gill, S. S., Hasanuzzaman, M., Nahar, K., Macovei, A., and Tuteja, N., 2013. Importance of nitric oxide in cadmium stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry, 63, PP:  254-261.
17- Gorelick, J., and Bernstein, N., 2014. Elicitation: an underutilized tool in the development of medicinal plants as a source of therapeutic secondary metabolites. Advances in agronomy, 124, PP: 201-230.
18- Green, L.C., Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S., and Tannenbaum, S. R., 1982. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N] nitrate in biological fluids, Analytical Biochemistry, 126, PP: 131-138.
19- Guo, H., Dang, X., and Dong, J., 2014. Hydrogen peroxide and nitric oxide are involved in salicylic acid-induced salvianolic acid B production in Salvia miltiorrhiza cell cultures. Molecules, 19(5), PP: 5913-5924.
20- Haida, Z., Syahida, A., Ariff, S. M., Maziah, M., and Hakiman, M., 2019. Factors affecting cell biomass and flavonoid production of Ficus deltoidea var. kunstleri in cell suspension culture system. Scientific reports, 9(1), PP: 1-8.
21- Heath, R.L., and Packer, L., 1968. Photoperoxidation in isolated chloroplasts: I. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation, Archives of Biochemistry and Biophysics, 125, PP:  189-198.
22- Heidarabadi, M. D., Ghanati, F., and Fujiwara, T., 2011. Interaction between boron and aluminum and their effects on phenolic metabolism of Linum usitatissimum L. roots. Plant Physiology and Biochemistry, 49(12), PP: 1377-1383.
23- Jamshidi, M., and Ghanati, F., 2017. Taxanes content and cytotoxicity of hazel cells extract after elicitation with silver nanoparticles. Plant physiology and biochemistry, 110, PP: 178-184.
24- Kamalipourazad, M., Sharifi, M., Maivan, H. Z., Behmanesh, M., and Chashmi, N. A., 2016. Induction of aromatic amino acids and phenylpropanoid compounds in Scrophularia striata Boiss. cell culture in response to chitosan-induced oxidative stress. Plant Physiology and Biochemistry, 107, PP: 374-384.
25- Khazdair, M. R., Ghorani, V., Alavinezhad, A., and Boskabady, M. H., 2020. Effect of Zataria multiflora on serum cytokine levels and pulmonary function tests in sulfur mustard-induced lung disorders: A randomized double-blind clinical trial. Journal of Ethnopharmacology, 248, PP: 1-9.
26- Kikowska, M., Budzianowski, J., Krawczyk, A., and Thiem, B., 2012. Accumulation of rosmarinic, chlorogenic and caffeic acids in in vitro cultures of Eryngium planum L. Acta Physiologiae Plantarum, 34(6), PP: 2425-2433.
27- Kovacik, J., Grúz, J., Klejdus, B., Stork, F., Marchiosi, R., Ferrarese-Filho, O., 2010. Lignification and related parameters in copper-exposed Matricaria chamomilla roots: role of H2O2 and NO in this process. Plant Science,  179, PP: 383-389.
28- Lin, J. S., and Wang, G. X., 2002. Doubled CO2 could improve the drought tolerance better in sensitive cultivars than in tolerant cultivars in spring wheat. Plant Science, 163(3), PP: 627-637.
29- Liu, Z. B., Chen, J. G., Yin, Z. P., Shangguan, X. C., Peng, D. Y., Lu, T., and Lin, P., 2018. Methyl jasmonate and salicylic acid elicitation increase content and yield of chlorogenic acid and its derivatives in Gardenia jasminoides cell suspension cultures. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 134(1), PP: 79-93.
30- Mendhulkar, V. D., and Vakil, M. M. A., 2013. Elicitation of flavonoids by salicylic acid and Penicillium expansum in Andrographis paniculata (Burm. f.) Nees. cell culture. Research in Biotechnology, 4(2), PP: 1-9.
31- Mendoza, D., Cuaspud, O., Arias, J. P., Ruiz, O., and Arias, M., 2018. Effect of salicylic acid and methyl jasmonate in the production of phenolic compounds in plant cell suspension cultures of Thevetia peruviana. Biotechnology reports, 19, PP: 1-9.
32- Michalak, A., 2006. Phenolic compounds and their antioxidant activity in plants growing under heavy metal stress. Polish Journal of Environmental Studies, 15(4), PP: 523-530.
33- Mittler, R., 2002. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends in plant science, 7(9), PP: 405-410.
34- Naik, P.M., Al-Khayri, and J.M., 2016. Abiotic and biotic elicitors–role in secondary metabolites production through in vitro culture of medicinal plants. Abiotic and Biotic Stress in Plants. Recent Advances and Future Perspectives. PP: 247-277.
35- Pirie, A., Mullins, and M.G., 1976. Changes in anthocyanin and phenolics content of grapevine leaf and fruit tissues treated with sucrose, nitrate, and abscisic acid, Plant Physiology, 58, PP: 468-472.
36- Qiao, W., Li, C., and Fan, L. M., 2014. Cross-talk between nitric oxide and hydrogen peroxide in plant responses to abiotic stresses. Environmental and Experimental Botany, 100, 84-93.
37- Ram, M., Prasad, K. V., Singh, S. K., Hada, B. S., and Kumar, S., 2013. Influence of salicylic acid and methyl jasmonate elicitation on anthocyanin production in callus cultures of Rosa hybrida L. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 113, PP: 459-467.
38- Ramirez-Estrada, K., Vidal-Limon, H., Hidalgo, D., Moyano, E., Golenioswki, M., Cusidó, R., and Palazon, J., 2016. Elicitation, an effective strategy for the biotechnological production of bioactive high-added value compounds in plant cell factories. Molecules, 21(2), PP: 182-205.
39- Rezaei, A., Ghanati, F., Behmanesh, M., and Mokhtari-Dizaji, M., 2011. Ultrasound-potentiated salicylic acid–induced physiological effects and production of taxol in hazelnut (Corylus avellana L.) cell culture. Ultrasound in medicine & biology, 37(11), PP: 1938-1947.
40- Salehi, F., Behboudi, H., Kavoosi, G., and Ardestani, S.K., 2017. Monitoring ZEO apoptotic potential in 2D and 3D cell cultures and associated spectroscopic evidence on mode of interaction with DNA. Scientific Reports, 7, PP: 1-14.
41- Samari, E., Sharifi, M., Ghanati, F., Fuss, E., and Chashmi, N. A., 2020. Chitosan-induced phenolics production is mediated by nitrogenous regulatory molecules: NO and PAs in Linum album hairy roots. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 140 (3), PP: 563-576.
42- Taghizadeh, M., Nasibi, F., Kalantari, K. M., and Ghanati, F., 2019. Evaluation of secondary metabolites and antioxidant activity in Dracocephalum polychaetum Bornm. cell suspension culture under magnetite nanoparticles and static magnetic field elicitation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 136(3), PP: 489-498.
43- Thakur, M., Bhattacharya, S., Khosla, P. K., and Puri, S., 2019. Improving production of plant secondary metabolites through biotic and abiotic elicitation. Journal of Applied Research on Medicinal and Aromatic Plants, 12, PP: 1-12.
44- Vasconsuelo A., and Boland R., 2007. Molecular aspects of the early stages of elicitation of secondary metabolites in plants. Plant Science, 172(5), PP: 861-875.
45- Velikova, V., Yordanov, I., and Edreva, A., 2000. Oxidative stress and some antioxidant systems in acid rain-treated bean plants: protective role of exogenous polyamines. Plant science, 151(1), PP: 59-66.
46- Wen, T., Hao, Y. J., An, X. L., Sun, H. D., Li, Y. R., Chen, X., Piao, X. C. & Lian, M. L., 2019. Improvement of bioactive compound accumulation in cell cultures of Orostachys cartilaginous A. Bor. through elicitation with salicylic acid and effect of cell extract on bioactive activity. Industrial Crops and Products, 139, 111570.
47- Zargari, A., 1990. Medicinal Plants, vol. 4. Tehran University Press, Tehran, PP: 1–57.
48- Zhao, J. L., Zhou, L. G., and Wu, J. Y., 2010. Effects of biotic and abiotic elicitors on cell growth and tanshinone accumulation in Salvia miltiorrhiza cell cultures. Applied Microbiology and Biotechnology, 87(1), 137-144.
دوره 34، شماره 4
دی 1400
صفحه 806-817
  • تاریخ دریافت: 09 تیر 1400
  • تاریخ بازنگری: 23 شهریور 1400
  • تاریخ پذیرش: 20 آبان 1400
  • تاریخ اولین انتشار: 24 آذر 1400