اثر ملاتونین بر شاخص های رشد و ترکیبات فنلی تحت تنش شوری کشت

در شیشه در گیاه یونجه (Medicago sativa L.)

شبنم جلیلی¹، علی اکبر احسانپور^1* و سید مرتضی جوادی راد²

¹ ایران، اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم و فناوری های زیستی، گروه زیست شناسی گیاهی و جانوری

² ایران، اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم و فناوری های زیستی، گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی

تاریخ دریافت: 09/06/1400          تاریخ پذیرش: 24/08/1400

چکیده

یونجه (Medicago sativa L.) یکی از مهمترین گیاهان علوفه ای در کشور می باشد که میزان و کیفیت تولید آن با تنش شوری محدود می گردد. ملاتونین بعنوان یک ایندول آمین در تحقیق حاضر با غلظت های 1/0، 10 و 15 میکرومولار بهمراه غلظت های 150 و 200 میلی مولار نمک بمنظور بررسی نقش ملاتونین درتحمل به شوری گیاهچه های یونجه پس از سه هفته رشد در شرایط کشت بافت استفاده شد، با افزایش غلظت شوری میزان رشد و نیز قدرت آنتی اکسیدانی و سنتز ترکیبات آنتی اکسیدان کاهش یافت. ملاتونین، سبب افزایش وزن تر، وزن خشک، طول ساقه، رنگیزه های فتوسنتزی، میزان کاروتنوئید و همچنین ترکیبات فنلی از جمله فنل کل، فلاونوئید و نیز دو آنزیم مهم با خاصیت آنتی اکسیدان در مسیر سنتز پلی فنل ها PAL و TAL گردید.  بنابراین به نظر می رسد ملاتونین با کاهش عوامل سرکوبگر رشد از جمله پاکسازی ROS و در نتیجه کاهش آسیب های اکسیداتیو و نیز افزایش فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدان و ترکیبات دفاعی گیاه از جمله ترکیبات فنلی و از طرف دیگر افزایش ظرفیت و توان فتوسنتزی گیاه با حفظ رنگیزه های فتوسنتزی در افزایش تحمل به شوری ایفای نقش نموده است.

واژه های کلیدی: ملاتونین، تنش شوری، یونجه، کشت بافت، ترکیبات فنلی

* نویسنده مسئول، تلفن:  03137934150  ،  پست الکترونیکی: ehsanpou@sci.ui.ac.ir

مقدمه

در میان تنش های محیطی تنش شوری یکی از مخرب ترین تنش های غیر زیستی می باشد که سبب تجمع زیاد نمک در اندام های گیاه و به دنبال آن تولید انواع گونه های فعال اکسیژن، ایجاد سمیت، کاهش تقسیم سلولی، عدم تعادل یونی، کاهش جذب آب، اختلال در جذب عناصر، بسته شدن جزئی یا کلی روزنه ها و کاهش عملکرد فتوسنتز و کاهش رشد گیاه می شود (44). یونجه بعنوان گیاه علوفه ای بدلیل کیفیت بالای غذایی و درصد پروتئین بالا، وجود اکوتیپ های متنوع برای مناطق مختلف و ارتقای سطح حاصلخیزی خاک با تثبیت ازت هوا از اهمیت بسیار بالایی برخوردار می باشد. وجود ژنوتیپ ها و اکوتیپ های مختلف یونجه نشان دهنده پتانسیل بسیار کارآمد برای شناسایی انواع متحمل در برابر تنش های مختلف به ویژه تنش شوری می باشد (4). عوامل محیطی مختلف سبب افزایش در متابولیسم فنیل پروپانوئیده  در گیاه می شود. ترکیبات فنلی دارای فعالیت پاکسازی رادیکال های آزاد اکسیژن، خاصیت آنتی اکسیدانی، ممانعت از پراکسیداسیون لیپیدها و ضد میکروبی می باشند (39). فنل‌ها را می‌توان در پنج زیرگروه شامل: کومارین‌ها، لیگنین‌ها، فلاونوئیدها، فنولیک اسیدها و تانن‌ها دسته بندی نمود (14). فلاونوئیدها فراوان‌ترین ترکیب از پلی‌فنل‌ها در رژیم غذایی انسان است که ساختار پایه‌ای آنها از هسته فلاون با 15 اتم کربن که در سه حلقه نظم یافته‌، تشکیل شده است (15) .گیاهان حاوی ترکیبات فلاونوئیدی، فعالیت آنتی اکسیدانی بالایی از خود نشان می دهند که عمدتاً مربوط به توانایی این ترکیبات به انتقال الکترون یا اتم های هیدروژن بوده و به همین دلیل از نظر دارویی حائز اهمیت می باشند. آنتوسیانین‌ها در فعالیت آنتی‌اکسیدانی فلاونوئیدها شرکت می‌کنند و به گستردگی در میوه‌ها و سبزیجات یافت می‌شوند (24). در شرایط استرس، متابولیسم ثانویه گیاه دچار تغییر شده و بمنظور مقابله با تنش و ایجاد تعادل فیزیکی در گیاه مکانیسم دفاعی گیاه فعال می گردد و فعالیت برخی آنزیمها که به آنها آنزیم های دفاعی نیز گفته می شود دچار تغییر می گردد. آنزیم PAL  (Phenyl alanine ammonio lyase)و TAL (Tyrosine ammonio lyase) آنزیم های کلیدی مسیر فنیل پروپانوئیدها هستند. آنزیم PAL اولین آنزیم مسیر فنیل پروپانوئیدها که واکنش حذف غیر اکسیداتیو گروه آمین از ال- فنیل آلانین را به ترانس سینامیک اسید کاتالیز می کند این واکنش منجر به تولید محدوده وسیعی از فنیل پروپانوئیدهای مشتق شده از محصولات ثانویه درگیاهان می گردد. آنزیم TAL کاتالیز کننده تیروزین به P- کوماریک اسید می باشد (33).

ملاتونین یا –N  استیل متوکسی تریپتامین، اولین بار در عصاره پینه آل گاو یافت شد. شناسایی ملاتونین در گیاهان عالی اولین بار بوسیله ی Van Tassel  و  O’Neillدر سال 1993 صورت گرفت. محققان بیان داشتند، مسیر بیوسنتزی ملاتونین در گیاهان و جانوران مشابه و L –تریپتوفان پیش ماده سنتز آن نیز در هر دو یکسان است. مقدار ملاتونین در گیاهان بدلیل شرایط محیطی مختلف (به ویژه تحت شرایط استرس)، مراحل تکامل گیاه و یا روش های مختلف شناسایی و اندازه گیری نه فقط از یک گونه به گونه ی دیگر، بلکه در واریته های یک گونه نیز متفاوت می باشد (6) این ترکیب در بسیاری از بافت های گیاه از جمله : ریشه، ساقه، برگ، گل، میوه و بذر در غلظت های مختلف از پیکوگرم تا میکروگرم وجود دارد. بعنوان یک آنتی اکسیدان بسیار قوی در برابر انواع گونه های واکنشگر اکسیژن و نیتروژن فعالیت می کند (25).  Arnao و همکارانش بیان داشتند، ملاتونین می تواند سبب افزایش 3- 4 برابری میزان رشد در بخش هوایی و نیز ریشه گردد (5). از طرف دیگر، در گیاهان Helianthus  (25) و
  Zea mays (17) ملاتونین سبب بهبود شرایط رشد تحت تنش شوری گردید. در بذرهای گیاه Vigna radiate L. تیمار شده با ملاتونین، 20% افزایش رشد طول ریشه و همچنین کمترین از هم گسیختگی ساختارهای سلولی تحت تنش سرما را نشان داد (36). اثرات مشابه دیگری نیز، تحت تنش اسمزی در خیار گزارش شده است. کاربرد ملاتونین در Mung bean موجب افزایش تجمع ترکیبات فنلی و پرولین پس از 2 روز تنش سرمایی گردید (37). اگر چه اثر مثبت ملاتونین بر افزایش مقاومت در برابر برخی تنش‌ها پیش از این نیز گزارش شده است، اما، با توجه به اطلاعات اندک مبنی بر اثر ملاتونین بر ترکیبات فنلی و بویژه آنزیم های موثر در مسیر بیوسنتز فنیل پروپانوئیدها بخصوص در شرایط کنترل شده در کشت بافت تحقیقات بسیار محدود انجام گردیده است لذا  هدف از پژوهش حاضر نیز مطالعه اثر این هورمون بر فاکتورهای رشد، محتوی کلروفیل و برخی از ترکیبات فنلی و فعالیت آنزیم‌های TAL و PAL بعنوان مهم‌ترین آنزیم‌های درگیر در مسیر بیوسنتز این ترکیبات در شرایط کشت در شیشه است. این پژوهش  در شناسایی بهتر نحوه عملکرد ملاتونین در گیاه یونجه بعنوان یک گیاه مدل برای مقابله با تنش شوری از طریق تغییرات مسیر ترکیبات فنلی و نحوه اثر ملاتونین بر این ترکیبات دارای اهمیت می باشد.

مواد و روشها

کشت بذر و تیمار گیاهچه یونجه با ملاتونین و شوری: بذر گونه زراعی یونجه (Medicago sativa) رقم اصفهانی از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه گردید. ابتدا بذرها به مدت 3 دقیقه با محلول اتانول 70 درصد ضدعفونی و سپس به مدت 20 دقیقه در هیپوکلریت سدیم 15 درصد حجمی قرار گرفت و در پایان، با آب مقطر استریل سه مرتبه شستشو داده شد. در مرحله بعد، بمنظور جوانه زنی، بذور در محیط آب  بهمراه آگار قرار گرفت و پس از جوانه زنی  (بعد از 2 روز) به محیط کشت MS  (30) که حاوی غلظت های 1/0، 10 و 15 میکرومولار ملاتونین(Solarbio Life Sciences، پکن، چین) و همچنین غلظت های 150 و 200 میلی مولار نمک انتقال داده شد. تیمار بدون نمک و ملاتونین بعنوان نمونه کنترل در نظر گرفته شد (لازم به ذکر است که از میان آزمایش ها اولیه از بین دامنه صفر تا 100 میکرومولار ملاتونین بهترین غلظت ها اتخاب گردید). کلیه کشت‌ها در اتاق کشت با دمای 25 درجه سانتیگراد، فتوپریود نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و شدت نور حدود 45 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه رشد داده شد. پس از 3 هفته پارامترهای رشد، میزان کلروفیل و کارتنوئید، فنل کل، فلاونوئید، آنتوسیانین‌ها و فعالیت آنزیم‌های   PAL  و TAL اندازه‌گیری شد.  ‌کلیه آزمایشات با حداقل 3 تکرار انجام شد و آنالیز واریانس داده ها با استفاده از نرم افزار SPSS انجام شد و مقایسه میانگین داده ها بر اساس آزمون دانکن و در سطح05/0 P≤ محاسبه شد.

اندازه گیری شاخص های رشد: پس از کشت گیاهان در تیمارهای مختلف، نمونه برداری جهت اندازه گیری شاخص هایی مانند وزن تر، وزن خشک، طول اندام هوایی و تعداد برگ در هر تکرار صورت گرفت. وزن تر هر یک از نمونه ها پس از برداشت سریعا با استفاده از ترازو وزن گردید و سپس بمنظور تعیین وزن خشک، هر نمونه به مدت 24 ساعت در آون با دمای 70 درجه سانتی گراد قرار گفت.

اندازه گیری رنگیزه های فتوسنتزی: مقدار 2/0 گرم از بافت تازه ی گیاه با استفاده از استون 80 درصد در تاریکی بر روی یخ سائیده شد، سپس به مدت 10 دقیقه در
 g 5000 سانتریفیوژگردید. جذب محلول به دست آمده با دستگاه Multi-mode reader در سه طول موج 663، 645 و 470 نانومتر بترتیب برای کلروفیل a ، b و کاروتوئید اندازه گیری شد و با استفاده از فرمول های زیر محاسبه گردید (23)  

Chla = (12.25 A663.2) – (2.79 A646.8)

Chlb = (21.21 A646.8) – (5.1 A663.2)

Chla+b = chla + chlb

Car = (1000A470 - 1.8 chla - 85.02 chlb) / 198

اندازه گیری فنل کل و فلاونوئید: بمنظور استخراج ترکیبات فنلی و فلاونوئیدها، 100 میلی گرم بافت تازه برگ با 5 میلی لیتر متانول 80% هموژن گردید.  میزان فنل کل عصاره با استفاده از فولین-سیوکالتیو اندازه‌گیری شد. 5/1 میلی لیتر معرف فولین سیوکالتیو 10 %، 1 میلی لیتر سدیم کربنات 5/7 % و سپس 5/0 میلی لیتر از عصاره گیاهی به آن افزوده شد. مخلوط واکنش به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق نگهداری، سپس جذب عصاره در طول موج 765 نانومتر خوانده شد. محتوای فنل کل به وسیله ی گالیک اسید بر حسب میلی‌گرم بر گرم وزن تر محاسبه گردید (35).

میزان فلاونوئید با روش رنگ‌سنجی با استفاده از کلرید آلومینیوم صورت گرفت. بدین منظور 1/0 میلی لیتر عصاره متانولی، 2/0 میلی لیتر آلمینیوم کلراید10%، 2/0 میلی لیتر پتاسیم استات 1 مولار با یکدیگر ترکیب و به مدت 30دقیقه در دمای محیط نگهداری شد. پس از آن، جذب در 415 نانومتر قرائت شد (11).

اندازه گیری آنتوسیانین: ابتدا از برگ‌های یونجه عصاره متانولی تهیه شد (نسبت 99 به 1 متانول و کلریدریک اسید در 4 درجه سانتیگراد). سپس، جذب نمونه‌ها در 550 نانومتر خوانده و میزان آنتوسیانین‌ها از رابطه 1 محاسبه شد (40).

A = ɛbc                   فرمول 1:

A= میزان جذب خوانده شده

ɛ= ضریب خاموشی

b= عرض کوئت (1 سانتی متر)

c= غلظت بر حسب میلی مول

اندازه‌گیری فعالیت آنزیم TAL: مقدار 3/0 گرم بافت برگ یونجه را با 4 میلی لیتر بافر تریس 50 میلی مولار(pH:8/5) که محتوی 2-مرکاپتواتانول (4/14 میلی مولار) و pvp 5% بود هموژن گردید و سپس به مدت 10 دقیقه با دور g 6000 سانتریفیوژ شد. عصاره حاصل جهت سنجش فعالیت آنزیم های PAL و TAL با استفاده از Multi-mode reader استفاده گردید. مخلوط واکنش شامل: 5/5 میکرومولار -L تیروزین، 500 میکرو مولار بافر تریس با اسیدیته برابر8 و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی برگ در حجم نهایی 1 میلی‌لیتر بود. پس از 60 دقیقه در دمای 40 درجه سانتیگراد واکنش تبدیل تیروزین به کوماریک اسید با اضافه نمودن 05/0 میلی‌لیتر کلریدریک اسید 5 نرمال متوقف شد و در طول موج 333 نانومتر فعالیت آنزیم TAL اندازه گیری شد (9).

اندازه‌گیری فعالیت آنزیم PAL: برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم PAL از عصاره آنزیمی توضیح داده شده در بالا، استفاده گردید. برای تخمین فعالیت آنزیم، 1 میلی‌لیتر محلول واکنش شامل بافر واکنش (500 میکرومولار تریس-کلریدریک اسید با اسیدیته 8) که حاوی 6 میکرومول فنیل آلانین و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی در حجم نهایی 1 میلی‌لیتر تهیه شد. سپس، به مدت 60 دقیقه در دمای 40 درجه سانتیگراد قرار گرفت. در نهایت، به این محلول مقدار 50 میکرولیتر کلریدریک اسید با غلظت 5 نرمال اضافه شد تا واکنش تولید سینامیک اسید از فنیل آلانین متوقف شود. در پایان، فعالیت آنزیم در طول موج 290 نانومتر بر اساس میزان تولید سینامیک اسید بر حسب نانومول بر دقیقه بر میلی‌گرم پروتئین گزارش شد (9).

نتایج

تاثیر تیمار ملاتونین و شوری بر پارامترهای رشد: همان گونه که در شکل 1 مشخص است، وزن تر و خشک ساقه در اثر افزایش غلظت شوری کاهش یافت. به گونه ای که وزن تر در نمونه شاهد از 56/0 گرم به 31/0 و 24/0 گرم بترتیب در گیاهچه های رشد یافته تحت شوری 150 و 200 میلی مولار نمک کاهش یافت(شکل1- الف). همچنین وزن خشک قسمت هوایی اندازه گیری شده در نمونه شاهد از 096/0 گرم به 036/0 گرم در شوری 200 میلی مولار نمک کاهش یافت. نتایج نشان داد که تیمار غلظت های متفاوت ملاتونین سبب افزایش معنی دار و چشمگیر وزن تر و وزن خشک در نمونه بدون نمک گردید. ملاتونین در گیاهچه های تحت تیمار 150 و 200 میلی مولار NaCl سبب افزایش معنی دار وزن تر و خشک شد که همین امر سبب بهبود رشد و نمو یونجه تحت تنش شوری گردید. تنش شوری سبب کاهش تعداد برگ در نمونه شاهد از 19 عدد به 6 عدد برگ در غلظت 200 میلی مولار نمک شد. غلظت 15 میکرومولار ملاتونین، سبب افزایش معنی دار تعداد برگ در گیاهچه های تحت تیمار 150 و 200 میلی مولار نمک نسبت به شوری 150و 200 میلی مولار نمک بدون ملاتونین گردید (شکل 1- ج). با توجه به شکل 1- د، در میانگین طول ساقه، بین غلظت های متفاوت ملاتونین و نمونه شاهد تفاوتی مشاهده نشد اما در شوری 150 میلی مولار نمک، غلظت 10 و 15 میکرومولار ملاتونین اختلاف معنی داری را با 150 میلی مولار نمک (بدون ملاتونین) نشان داد، اما در شوری 200 میلی مولار نمک، ملاتونین اثر معنی داری بر میانگین طول ساقه ی یونجه نشان نداد.

تاثیر تیمار ملاتونین و شوری بر رنگیزه های فتوسنتزی: بمنظور بررسی اثر ملاتونین در کاهش آسیب های رشدی تنش شوری، میزان کلروفیل a, b, ،کلروفیل کل و کاروتنوئید اندازه گیری شد.

شکل 1- وزن تر (الف)، وزن خشک (ب)، تعداد برگ (ج)، میانگین طول ساقه (د) در گیاهچه های یونجه تحت تیمار ملاتونین و نمک. داده‌ها میانگین چهار تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیرمشابه بیانگر معنی‌دار بودن داده‌ها بر اساس آزمون دانکن است (p<0.05).

بر طبق نتایج بدست آمده در شکل 3 ، با افزایش غلظت شوری میزان رنگیزه های فتوسنتزی در برگ گیاهچه یونجه بطور معنی داری کاهش یافت. غلظت های 1/0، 10 و 15 میکرومولار ملاتونین سبب افزایش قابل توجهی در میزان کلروفیل a ،b و کلروفیل کل در گیاهچه های تحت شوری 150 و 200 میلی مولار نمک نسبت به گیاهچه هایی که فقط تحت تنش شوری بدون ملاتونین گردید. به نظر می رسد که تیمار 1/0 میکرومولار ملاتونین موثرترین غلظت در کاهش اثرات شوری و افزایش رنگیزه های فتوسنتزی بخصوص تحت غلظت 150 میلی مولار نمک می باشد. طبق نتایج در شکل 3- ج، این غلظت ملاتونین سبب افزایش 72% محتوی کلروفیل کل در غلظت 150 میلی مولار نمک گردید. کاروتنوئید بعنوان یک رنگیزه آنتی اکسیدان در گیاهچه یونجه با افزایش غلظت شوری کاهش معنی داری را نشان داد بطوری که در نمونه شاهد از 8/5 میلیگرم بر گرم به 5/3 و 1/1 میلیگرم بر گرم بترتیب در شوری 150 و 200 میلی مولار نمک کاهش یافت. کاربرد ملاتونین بعنوان یک تنظیم کننده مثبت رشد و یک آنتی اکسیدان سبب افزایش مقدار این رنگیزه تحت تنش شوری شد و غلظت 1/0 میکرومولار ملاتونین بهترین و موثرترین غلظت در افزایش این رنگیزه آنتی اکسیدان در شرایط بدون شوری و حتی در غلظت های  150 و 200 میلی مولار نمک می باشد.

تاثیر تیمار ملاتونین و شوری بر فنل کل، فلاونوئید و آنتوسیانین: تنش شوری سبب کاهش معنی دار ترکیبات فنلی از جمله محتوی آنتوسیانین، فنل کل و فلاونوئید گردید. تیمار ملاتونین تاثیر قابل توجهی بر میزان آنتوسیانین نداشت و اختلاف معنی داری را با نمونه شاهد و تیمار 150 و 200 میلی مولار نمک بدون ملاتونین و حتی ما بین غلظت های دیگر ملاتونین نشان نداد (شکل3- الف).

شکل 2- میزان کلروفیل a  (الف)، کلروفیل b (ب)، کلروفیل کل (ج) و کاروتنوئید (د) در گیاهچه های یونجه تحت تیمار ملاتونین و شوری. داده‌ها میانگین چهار تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیرمشابه بیانگر معنی‌دار بودن داده‌ها بر اساس آزمون دانکن است (p<0.05).

بر طبق نتایج بدست آمده در شکل3- ب، غلظت های 10 و 15 میکرومولار ملاتونین بیشترین میزان فنل را در شرایط بدون شوری نسبت به نمونه شاهد و همچنین در 150 و 200 میلی مولار نمک نشان داد. تیمار ملاتونین بدون شوری سبب افزایش معنی دار محتوی فلاونوئید گردید، به گونه ای که غلظت 15 میکرومولار ملاتونین بیشترین میزان فلاونوئید را نسبت به نمونه شاهد و همچنین تیمار 10 و 1/0 میکرومولار ملاتونین نشان داد. علاوه بر آن، همانند فنل کل، هر دو غلظت 10 و 15 میکرومولار ملاتونین تحت تنش شوری، موجب افزایش مقدار فلاونوئید نسبت به دیگر تیمارها گردید (شکل 3- ج).

تاثیر تیمار ملاتونین و شوری بر فعالیت آنزیم PAL و TAL : بر طبق نتایج بدست آمده در شکل 5 ( الف  و ب )، با افزایش غلظت شوری میزان فعالیت هر دو آنزیم کاهش یافت. فعالیت آنزیم PAL در غلظت 200 میلی مولار نمک 44% نسبت به نمونه شاهد کاهش یافت. افزایش فعالیت چشمگیر آنزیم PAL در گیاهچه های تیمار شده با ملاتونین در محیط بدون شوری کاملا مشخص است. همچنین گیاهچه های تیمار شده با غلظت 10 و 15 میکرومولار ملاتونین همراه با 150 میلی مولار نمک بترتیب 34% و 39% نسبت به گیاهچه های تیمار شده فقط با شوری 150 میلی مولار نمک افزایش فعالیت آنزیم را نشان داد و از طرف دیگر 15 میکرومولار ملاتونین همراه با غلظت 200 میلی مولار نمک با افزایش 28 درصدی فعالیت آنزیم PAL  نسبت به گیاهچه های تیمار شده فقط با شوری 200 میلی مولار نیز تفاوت معنی داری را نشان داد. فعالیت آنزیم TAL  مطابق شکل 5- ب، دقیقا رفتاری مشابه فعالیت آنزیم PAL در گیاهچه های تحت تیمار ملاتونین و شوری نشان داد. فعالیت آنزیم TAL در 150 میلی مولار نمک بهمراه غلظت 10 میکرومولار ملاتونین 34% افزایش و در غلظت 200 میلی مولار نمک، تیمار ملاتونین نیز موجب افزایش فعالیت آنزیم TAL گردید، اما در میان غلظت های مختلف ملاتونین تفاوت معنی داری مشاهده نشد.

شکل 3- میزان آنتوسیانین (الف)، فنل کل (ب) و فلاونوئید (ج) در گیاهچه های یونجه تحت تیمار ملاتونین و شوری. داده‌ها میانگین چهار تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیرمشابه بیانگر معنی‌دار بودن داده‌ها بر اساس آزمون دانکن است (p<0.05)

شکل 4- میزان فعالیت آنزیم PAL (الف) و میزان فعالیت آنزیم TAL (ب) در گیاهچه های یونجه تحت تیمار ملاتونین و شوری. داده‌ها میانگین چهار تکرار ± انحراف معیار است. حروف غیرمشابه بیانگر معنی‌دار بودن داده‌ها بر اساس آزمون دانکن است (p<0.05)

بحث

گیاهان می توانند ملاتونین خارجی را از محیط جذب کرده و درون بافت های خود ذخیره کنند. طبق نتایج بدست آمده عملکرد ملاتونین در تنظیم رشد و نمو گیاهان، حتی در گونه های گیاهی مشابه وابسته به غلظت می باشد (41). در تحقیق حاضر تنش شوری بطور چشمگیری سبب کاهش فاکتورهای رشدی از جمله وزن تر و خشک، طول ساقه و تعداد برگ گیاهچه یونجه گردید. مشابه نتایج بدست آمده نیز اشرفی و همکاران در گیاه یونجه تحت تنش شوری بیان داشتند (8)،کاهش طول ساقه با افزایش میزان غلظت نمک همراه است که میزان عملکرد اندام های هوایی کاهش یافت که احتمالا بدلیل کاهش میزان رنگیزه های فتوسنتزی و در نتیجه کاهش میزان فتوسنتز در واحد سطح و مواد فتوسنتزی باشد. عملکرد محافظتی و بهبود عملکرد فتوسنتز و افزایش رشد توسط ملاتونین نیز در گیاهان Malus domestica, Cucumis sativus L گزارش شده است، بویژه افزایش کارکرد فتوسیستم دو در گیاهان تیمار شده با ملاتونین و در نتیجه افزایش رشد و نمو گیاه در شرایط تنش می شود. کاربرد ملاتونین سبب بهبود نرخ جوانه زنی، رشد و تولیدات گیاهی می شود(5). کاهش ارتفاع گیاه و وزن خشک بدلیل رشد و نمو کندتر گیاه، ناشی از تنش اسمزی ایجاد شده توسط شوری است و یا ممکن است بدلیل بازدارندگی فتوسنتز از طریق اثرات مستقیم تنش شوری بر روی سیستم فتوسنتزی گیاه یونجه باشد. غالبا در تنش شوری انتقالات یونی تعادل اسمزی را بر هم زده و در نتیجه رشد را محدود می کند (29) در خانواده گرامینه با افزایش تنش شوری غلظت یون های سدیم و کلر در ساقه زیاد و غلظت یون پتاسیم کاهش یافت در نتیجه رشد نسبی ساقه کاهش می یابد. پیامد شوری برای گیاهان عموما کاهش رشد می باشد که بدلیل کاهش محتوی آب و فتوسنتز است چرا که با افزایش شوری پتانسیل آب موجود در محیط ریشه کاهش یافت و واکنش سریع و اولیه گیاه نسبت به تنش شوری نیز بستن روزنه ها می باشد (27) غلظت 10 و 15 میکرومولار ملاتونین بطور موثری سبب کاهش اثرات منفی شوری بر رشد گیاهچه یونجه شد. مطالعات متعددی در گیاهان Glycyrrhiza uralensis, Lupinus albus L, Arabidopsis thaliana  (3، 7 و 46) ملاتونین را بعنوان یک تنظیم کننده رشد نیز نشان داد. ملاتونین دارای ساختار ایندولی همانند IAA و نیز کارکردی مشابه اکسین در تنظیم رشد و نمو گیاهان دارد (6). در تحقیق پیش رو تیمار ملاتونین احتمالا بدلیل کاهش اثرات منفی ناشی از تنش شوری همانند بهبود فرایند فتوسنتز، بهبود روابط آبی، کاهش مقاومت روزنه ای، جذب یون ها و افزایش آنتی اکسیدان های غیر آنزیمی و نیز فعالیت آنزیم های انتی اکسیدان سبب بهبود رشد و افزایش وزن تر و خشک بعنوان دو عامل تعیین کننده در مقاومت به شوری گیاه گردید. مطابق با نتایج بدست آمده نیز در گیاهان lupin (7) و Brassica juncea (10) ملاتونین به صورت وابسته به غلظت سبب افزایش رشد و نمو گردید. همچنین Wei (2015) گزارش کرد که ملاتونین می تواند موجب افزایش بیان ژن های مربوط به تقسیم سلولی و در نتیجه افزایش رشد و یا باعث فعالیت مجدد ژن های سرکوب شده توسط تنش شوری گردد (41). از طرف دیگر احتمالا ملاتونین به واسطه اینتراکشن های هورمونی با دیگر تنظیم کنندگان گیاهی از جمله اکسین، جیبرلیک اسید و آبسزیک اسید می تواند باعث افزایش شاخص های رشدی، افزایش فتوسنتز و افزایش بیوماس تحت تنش شوری شود.

در مطالعه حاضر میزان کلروفیل a ، b ، کلروفیل کل و کاروتنوئید در تیمار شوری کاهش یافت اما تیمار شوری بهمراه ملاتونین سبب افزایش رنگیزه های فتوسنتزی گردید. مشابه با نتایج حاصل از این مطالعه در سایر گیاهان از جمله برنج، گندم و ذرت تنش شوری سبب کاهش میزان کلروفیل گردید (44).کاهش سنتز کلروفیل احتمالا بدلیل کاهش میزان ترکیب آمینووالریک اسید، کاهش تعداد کلروپلاست، تغییرات ساختار تیلاکوئیدها، غشا و تجزیه ی آنها می باشد (17). تجزیه کلروپلاست باعث افزایش فعالیت آنزیم کلروفیلاز، و از طرف دیگر تنش شوری منجر به تولید ROS خواهد شد که سبب غیر فعال شدن آنزیم ها، تجزیه ی پروتئین های سلولی و کلروپلاستی و در نتیجه کاهش میزان کلروفیل می شود (17). در گیاهچه های Malus hupehensis طول گیاهچه، تعداد برگ، میزان کلروفیل و نشت یونی در نمونه های تیمار شده با ملاتونین بسیار کمتر تحت اثرات مخرب ناشی از تنش شوری قرار گرفت از طرف دیگر، میزان هیدروژن پراکسید و ROS کاهش یافت اما آنزیم های آنتی اکسیدان از جمله آسکوربات پراکسیداز، کاتالاز و پراکسیداز بدلیل خاصیت آنتی اکسیدانی ملاتونین در طی تنش شوری افزایش یافت(21). بسیاری از محققان بیان داشتند که ملاتونین از کاهش رنگیزه های فتوسنتزی در شرایط تنش محیطی ممانعت می کند (34 و 41). Chen و همکارانش (2018) گزارش کردند؛ افزایش ظرفیت فتوسنتز در گیاهچه های ذرت بدلیل میزان بالای کلروفیل، مبادلات روزنه ای، غلظت بالای CO₂ درون سلولی و در نهایت محافظت از کلروفیل در برابر استرس اکسیداتیو با اثر مستقیم آنتی اکسیدانی ملاتونین مرتبط می باشد (13). بنابراین کاربرد ملاتونین باعث افزایش رنگیزه های مهم فتوسنتزی، محافظت و کاهش تجزیه کلروفیل، و در نتیجه بهبود فرآیند فتوسنتز در گیاهچه های یونجه تحت تیمار شوری شود. غلظت 1/0 میکرومولار ملاتونین بطور معنی داری سبب افزایش میزان کاروتنوئید بعنوان رنگیره و یک آنتی اکسیدان مهم در یونجه گردید. طبق نتایج دیگر محققان، تیمار ملاتونین بر محتوی کاروتنوئید در گیاه cherry rootstock PHL-C هیچگونه اثری نداشت (32). با استعمال ملاتونین رشد لوبیا رقم صدری بهبود یافت. غلظت رنگیزه‌های فتوسنتزی، پرولین، قندهای محلول و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان افزایش یافت (1). نتایج نشان داد که ملاتونین در افزایش مقاومت گیاه لوبیا به شوری اثر معناداری داشته است و غلظت‌های پایین‌تر ملاتونین، مؤثرتر عمل کرده‌اند.بنابراین استفاده از غلظت بهینه ملاتونین در تنش شوری، سبب بهبود عملکرد روزنه ها همراه با بازگشایی مجدد آنها، می تواند مفید واقع گردد.

متابولیت های ثانویه نقش مهمی را بعنوان آنتی اکسیدان و آنتی رادیکال در گیاهان در برابر آسیب های ناشی از تنش اکسیداتیو ایفا می کنند. متابولیت های ثانویه مانند فنل ها، فلاونوئید و آنتوسیانین در پاسخ به تنش های محیطی از جمله تنش شوری در گیاهان سنتز می شوند. افزایش این ترکیبات در پاسخ به گونه های واکنشگر اکسیژن بسیار مهم است. قابلیت پاکسازی ROS ترکیبات فنولی در حالت مشابه حدود چهار برابر بیشتر از ویتامین E و C است. توانایی آن ها ناشی از واکنش پذیری بالا به صورت دهنده الکترون و پروتون، تثبیت و جابجایی الکترون های منفرد و نیز شلات کردن یون های فلزی قابل انتقال است (26). بمنظور بررسی اثر ملاتونین بر آنزیم های آنتی اکسیدان در تنش شوری در مطالعه حاضر، آنزیم های آنتی اکسیدان از جمله کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز، پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز نیز اندازه گیری شد و تیمار 1/0 میکرومولار ملاتونین تاثیر قابل توجه و معنی داری در افزایش فعالیت این آنزیم ها در طی تنش شوری داشت (داده ها قابل ارائه نمی باشد).  افزایش میزان فنل ها و فلاونوئیدها در گیاهان تحت تنش شوری بسیار گزارش شده است بعنوان مثال در برگ های گیاه Cakile maritima (20) و یا گیاه Artichoke (31) سنتز این ترکیبات همراه با تیمار شوری افزایش یافت. در گیاهچه های یونجه همراه با افزایش غلظت نمک محتوی فنل کل، فلاونوئید و آنتوسیانین کاهش یافت همچنین احتمالا مقدار گونه های واکنشگر اکسیژن افزایش و موجب سرکوب سیستم دفاعی گیاه در برابر تنش های محیطی می شود. گیاهان راهکارهای دفاعی متعددی برای مقابله با این چنین آسیب ها از جمله: آنزیم های آنتی اکسیدان و ترکیبات آنتی اکسیدان غیر آنزیمی همچون فنل ها، آسکوربیک اسید و گلوتاتیون دارند (15). مطالعات اخیر به نقش ملاتونین در افزایش بیوسنتز متابولیت های ثانویه تحت تنش های محیطی پرداخته است، برای مثال Wei (2019) بیان داشت کاربرد ملاتونین باعث افزایش میزان ترکیبات فنلی از جمله فلاونوئید در سیب، تحت تنش شوری گردید (42) و یا در گیاه Thymus daenensis L. اسپری ملاتونین بر روی برگ های آن سبب افزایش ترکیبات فنلی در طی تنش شوری شد (10). شدت یافتن تنش اکسیداتیو سبب کاهش فعالیت آنزیم های مسیر بیوسنتزی ترکیبات فنلی از جمله PAL و TAL  می گردد و یا با کاهش اسید آمینه فنیل آلانین بعنوان پیش ماده سنتز این ترکیبات موجب کاهش سنتز آنها در گیاهچه یونجه گردد اما تیمار ملاتونین بعنوان یک آنتی اکسیدان موثر و از طرف دیگر با ایجاد یک آبشار آنتی اکسیدان، از متابولیت های حاصل از واکنش های ملاتونین در برابر انواع ROS سبب افزایش میزان هر سه این ترکیبات و فعالیت آنزیم های درگیر در مسیر سنتز آنها گردید. بر طبق نتایج دیگر محققان تیمار ملاتونین سبب افزایش میزان فنل در گیاهان Vigna radiata (38) و Vicia faba L. (16) شد، همچنین پیش تیمار برگ های کیوی با ملاتونین سبب افزایش میزان فلاونوئید و بویژه هشت ژن مربوط به سنتز آن از جمله PAL و چالکون سنتاز گردید و در واقع ملاتونین با اثر بر میزان فلاونوئید توانست پیری برگ ها را به تاخیر بیاندازد (25) همچنین تیمار ملاتونین سبب افزایش آنزیم PAL و نیز میزان تجمع فنل، آنتوسیانین و آسکوربیک اسید بهمراه ظرفیت آنتی‌اکسیدانی در توت فرنگی افزایش یافت (2). آنزیم های PAL و TAL دو آنزیم اصلی مسیر سنتز فنیل پروپانوئیدها می باشند. در تحقیق حاضر فعالیت این دو آنزیم دفاعی گیاه با افزایش غلظت شوری، انواع رادیکال های آزاد و آسیب های ناشی از تنش اکسیداتیو کاهش یافت، همانگونه که سبب کاهش سنتز فنل کل، فلاونوئید و آنتوسیانین گردید. از طرف دیگر، تیمار ملاتونین بهمراه شوری سبب افزایش فعالیت آنزیم ها شد. Xu (2017) بیان داشت؛ ملاتونین سبب افزایش بیان ژن های مسیر بیوسنتز فنل ها از جمله PAL و(Cinnamate 4-Hydroxylase)  C₄H در کلم سفید و قرمز گردید. همچنین ملاتونین از طریق اینتراکشن با دیگر هورمون ها از جمله اتیلن و افزایش میزان ACC بر سنتز پلی فنول ها موثر است، چرا که تیمار ACC سبب افزایش بیان ژن PAL و(Stilbene Synthase) STS  و در نتیجه افزایش ذخیره ی پلی فنول ها می شود (43). بنابراین ملاتونین بطور غیر مستقیم با تاثیر بر ترکیبات و آنزیم های آنتی اکسیدان سبب پاکسازی گونه های واکنشگر اکسیژن و بهبود رشد و محتوی رنگیزه های فتوسنتزی و نهایتا فتوسنتز در گیاهچه های یونجه تحت تیمار شوری گشت. مکانیسم مقاومت به شوری در گیاهان در شرایط گوناگون، متفاوت می باشد، چرا که فرآیندهای مهم فیزیولوژیکی گیاهی به شوری حساس است. شناسایی مکانیزم های افزایش مقاومت در برابر تنش شوری همانند استفاده از ملاتونین بعنوان یک تنظیم کننده رشد با غلظت معین و مناسب، و نیز کاربرد تکنیک های موثر همچون کشت بافت، با هدف اصلاح و بهبود عملکرد گیاه در اراضی شور، از اهمیت بسزایی برخوردار است.

نتیجه گیری

ملاتونین بعنوان یک ترکیب جدید شناخته شده بعنوان یک تنظیم کننده رشد و آنتی اکسیدان، سبب افزایش مقاومت گیاهچه یونجه در برابر تنش شوری و آسیب های ناشی از آن و در نتیجه افزایش وزن تر و خشک، فاکتورهای رشد و رنگیزه های فتوسنتزی که در نهایت منجر به بهبود رشد و تکامل گیاه گردید. از طرف دیگر با ظرفیت آنتی اکسیدانی خود، سب افزایش ترکیبات فنلی و آنزیم های آنتی اکسیدان PAL و TAL و در نتیجه افزایش قدرت پاکسازی ROS و تنظیم عملکرد گیاه و افزایش مقاومت در برابر آسیب های ایجاد شده تحت تنش شوری گردید.

تقدیر و تشکر

نویسندگان  این  مقاله  مراتب قدردانی و سپاس خود را از

مسئولین گروه علوم گیاهی دانشگاه اصفهان و همچنین قطب آنتی اکسیدان های گیاهی به جهت فراهم نمودن شرایط و حمایت های مالی به جهت انجام این پژوهش ابراز می نمایند.