نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه علوم گیاهی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران
2 گروه علوم گیاهی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی تهران، ایران
3 1- گروه علوم گیاهی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران
چکیده
خرفه (Portulaca oleracea L.) یک گیاه دارویی از خانواده Portulacaceae است که نقش حفاظتی در برابر آسیبهای کبد، هپاتیت ویروسی، دیابت و سرطان دارد. تنش شوری از مهمترین عوامل محدودکننده رشد و نمو گیاهان بهویژه در مناطق خشک و نیمهخشک میباشد. کیتوزان یک الیسیتور زیستی و از ترکیبات اصلی دیواره سلولی بسیاری از گونههای قارچی میباشد. هدف از این مطالعه ارزیابی اثرات تنش شوری و کیتوزان روی شاخصهای فیزیولوژیکی و پارامترهای رشد گیاه خرفه بود. این آزمایش به صورت فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار انجام گرفت. بدین منظور گیاه خرفه تحت تیمارهای مختلف شوری (0، 25 و 35 دسیزیمنسبرمتر) و کیتوزان (0، 2/0 و 4/0 گرمدرلیتر) قرار گرفت. گیاهان بعد از اعمال تیمار برداشت شدند. پارامترهای مختلف مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی برای تیمارهای مختلف بررسی شد. نتایج نشان داد که با توجه به گوشتی و شور پسند بودن گیاه خرفه، سطح شوری 25 دسیزیمنسبرمتر رشد مساعد و سطح شوری 35 دسیزیمنسبرمتر کاهش رشد را در گیاه خرفه نشان داد. شوری باعث افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز، پراکسیداز، پلی فنل اکسیداز و فلاونوئید شده و محتوای آنتوسیانین را کاهش میدهد. تیمار همزمان شوری و کیتوزان باعث افزایش رشد، محتوای فنل، فعالیت پراکسیداز، پلی فنل اکسیداز شده و فعالیت آنزیم کاتالاز را و محتوای آنتوسیانین را کاهش میدهد. در این پژوهش کیتوزان نقش بهبود دهندهای در شرایط تنش ایفا کرده است. با توجه به روند رو به رشد اراضی شور در کشور، استفاده از الیسیتورها بهخصوص کیتوزان بهعنوان پلیمر زیستی کاهشدهنده آثار تنش شوری در گیاه خرفه، حائز اهمیت میباشد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Role of chitosan in reducing the effects of salinity stress through enzymatic and non-enzymatic antioxidants in Portulaca oleracea L.
نویسندگان [English]
1 Department of Plant Sciences, Faculty of Biological Sciences, Kharazmi University, P.O. Box: 15719-14911, Tehran, Iran
2 Department of Plant Sciences, Faculty of Biological Sciences, kharazmi University, Tehran, Iran
3 Department of Plant Sciences, Faculty of Biological Sciences, Kharazmi University, P.O. Box: 15719-14911, Tehran, Iran
چکیده [English]
Portulaca oleracea L. is a medicinal plant of the family Portulacaceae. Salinity stress is one of the most important factors limiting the growth and development of plants, especially in arid and semi-arid regions. Chitosan is a biological elicitor and is a major component of the cell wall of many species of fungi. In this study effects of salinity and chitosan stress on physiological parameters and growth parameters of the Portulaca oleracea L were studied. The experiment was arranged in a randomized complete design with 3 replications. For this purpose, the plant was exposed to different treatments of NaCl (0, 25 and 35 ds m-1), chitosan (0, 0.2 and 0.4 g l-1) Plants were harvested after treatment. Different morphological and physiological parameters were studied for different treatments. By measuring growth parameters and according to broiler and halophytic characteristics of the plant, the salinity 25 ds m-1 as a favorable growth and salinity 35 dsm-1 showed a decrease in growth in the plant. Salinity stress increased catalase enzyme activity, peroxidase, polyphenoloxidase and flavonoid content but reduced anthocyanine. Interaction of salinity and Chitosan increased growth of purslane, phenol, peroxidase, polyphenoloxidase enzyme activity and reduced catalase enzyme activity and anthocyanine content. In this study chitosan is improving agent in stress conditions and improved the physiological and biochemical traits associated with oxidative stress. Considering the growing salinity of the country, it is important to use the elicitors, especially chitosan, as a biopolymer that reduces the effects of salinity stress on the Portulaca oleracea L.
کلیدواژهها [English]
نقش کیتوزان بر کاهش اثرات تنش شوری از طریق آنتیاکسیدانهای آنزیمی و غیرآنزیمی در گیاه خرفه (Portulaca oleracea L.)
الهه خسروی، اعظم سلیمی*، مریم چاوشی و هانیه زیدی
ایران، تهران، دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم گیاهی
تاریخ دریافت: 25/05/1399 تاریخ پذیرش: 14/07/1400
چکیده
خرفه (Portulaca oleracea L.) یک گیاه دارویی از خانواده Portulacaceae است که نقش حفاظتی در برابر آسیبهای کبد، هپاتیت ویروسی، دیابت و سرطان دارد. تنش شوری از مهمترین عوامل محدودکننده رشد و نمو گیاهان بهویژه در مناطق خشک و نیمهخشک میباشد. کیتوزان یک الیسیتور زیستی و از ترکیبات اصلی دیواره سلولی بسیاری از گونههای قارچی میباشد. هدف از این مطالعه ارزیابی اثرات تنش شوری و کیتوزان روی شاخصهای فیزیولوژیکی و پارامترهای رشد گیاه خرفه بود. این آزمایش به صورت فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار انجام گرفت. بدین منظور گیاه خرفه تحت تیمارهای مختلف شوری (0، 25 و 35 دسیزیمنسبرمتر) و کیتوزان (0، 2/0 و 4/0 گرمدرلیتر) قرار گرفت. گیاهان بعد از اعمال تیمار برداشت شدند. پارامترهای مختلف مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی برای تیمارهای مختلف بررسی شد. نتایج نشان داد که با توجه به گوشتی و شور پسند بودن گیاه خرفه، سطح شوری 25 دسیزیمنسبرمتر رشد مساعد و سطح شوری 35 دسیزیمنسبرمتر کاهش رشد را در گیاه خرفه نشان داد. شوری باعث افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز، پراکسیداز، پلی فنل اکسیداز و فلاونوئید شده و محتوای آنتوسیانین را کاهش میدهد. تیمار همزمان شوری و کیتوزان باعث افزایش رشد، محتوای فنل، فعالیت پراکسیداز، پلی فنل اکسیداز شده و فعالیت آنزیم کاتالاز را و محتوای آنتوسیانین را کاهش میدهد. در این پژوهش کیتوزان نقش بهبود دهندهای در شرایط تنش ایفا کرده است. با توجه به روند رو به رشد اراضی شور در کشور، استفاده از الیسیتورها بهخصوص کیتوزان بهعنوان پلیمر زیستی کاهشدهنده آثار تنش شوری در گیاه خرفه، حائز اهمیت میباشد.
واژه های کلیدی: تنش اسمزی، فلاونوئید، کاتالاز، پراکسیداز، خرفه
* نویسنده مسئول، تلفن:02188329220 ، پست الکترونیکی: salimi@khu.ac.ir
مقدمه
شوری یک مشکل در حال توسعه در خاکهای کشاورزی است که رشد و نمو گیاهان را محدود میکند. کشور ایران به دلیل شرایط خاص اقلیمی، مناطق وسیعی از اراضی شور و کویری را در خود جایداده است. با توجه به روند رو به رشد جمعیت و لزوم بهرهبرداری از زمینهای شور، یافتن گیاهان زراعی و دارویی توانمند در مقابل تنشهای شوری، انتخاب روشهای اصلاحی برای احیاء خاکهای شور و اصلاح گیاهان و استفاده از محرکها بهمنظور بالا بردن تحمل به شوری میتواند یک راهکار جهت غلبه بر مشکل شوری باشد (6).
خرفه با نام علمی Portulaca oleracea L. به تیره Portulacaceae تعلق دارد. انتشار جغرافیایی آن در ایران، تقریباً در تمام ایران بهخصوص نواحی شمالی (گیلان و مازندران)، تهران، نواحی غربی، جنوب شرقی (بلوچستان) میباشد؛ و در مناطق جنوبی کشور بهعنوان یک سبزی مهم مورد استفاده قرار میگیرد. خرفه به سهولت در خاکهای خشک و شور رشد میکند (40). بذر خرفه در شوری بالا جوانهزده و میتوانند به چرخهی زندگی خود ادامه داده و بذر تولید کنند (15). ترکیبات شیمیایی موجود در قسمتهای مختلف این گیاه شامل کربوهیدرات، پروتئین، کلسیم، روی، پتاسیم (18)، آلفا توکوفرول، گلوتاتیون، کاروتن، پلیساکاریدها، ساپونینها، آلکالوئیدها، اسیدهای چرب، ویتامینها، استروئیدها، فلاونوئیدها میباشند. از جمله ترکیبات فلاونوئیدی موجود در این گیاه میتوان به کریستئین، کامفرول، میریستئین، آپی ژنین، لوتئولین، ژنیستئین و ژنیستین اشاره کرد، که ویژگی آنتیاکسیدانی دارند (30).
کیتوزان یک ماده غیر سمی، بیوپلیمر آلی و طبیعی، پلیساکارید نیتروژندار و قابلتجزیه زیستی است که میتواند تنشهای محیطی حاصل از شوری و خشکی خاک را کاهش دهد و موجب بهبود روند رشد در گیاهان شود (23).
تنش شوری باعث کاهش وزن تر ریشه، وزن خشک ریشه و اندام هوایی و محتوای نسبی آب در برگ گیاه خرفه شده است (4). کاهش رشد در تنش شوری در رزماری (8) و مریم گلی (37) نیز گزارششده است. Munns و همکاران در 2008 کاهش فتوسنتز براثر تنش شوری در گیاهانی نظیر پنبه، پیاز، حبوبات، گوجهفرنگی، گندم، جو، ارزن، نخود، چغندرقند، برنج و بسیاری از گیاهان دیگر را گزارش نمودند (32). این در حالی است که تیمار کیتوزان توانسته اثرات ناشی از تنش شوری را در کاهو (39)، لوبیا (35)، پونه (41) کاهش داده و رشد گیاه افزایش یابد. در این پژوهش به ارزیابی تحمل به شوری گیاه خرفه پرداخته شد و بهمنظور بالا بردن تحمل گیاه خرفه به تنش شوری اثر محرکهایی همچون کیتوزان را که یک مادهی غیر سمی و با منشأ طبیعی است موردبررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
بذرهای گیاه خرفه، در گلدانهای حاوی ترکیب خاکی یکسوم خاک باغچه، یکسوم پیت ماس و یکسوم ماسه در گلخانه تحقیقاتی فیزیولوژی گیاهی دانشگاه خوارزمی در تهران کاشته شد. آبیاری گلدانها با آب مقطر انجام گردید. در هر نوبت آبیاری، رطوبت گلدانها در حد ظرفیت زراعی نگهداشته شد. ظرفیت زراعی به محتوای آب خاک بعد از اینکه آب مازاد خود را تحت تأثیر نیروی جاذبه از دست داد، اطلاق میگردد. چهل روز پس از کشت، در مرحلهی ۶ تا ۸ برگی تیمار شوری اعمال گردید. گلدانها با محلول کلرید سدیم خالص در سطوح (0، 25 دسی زیمنس (16 گرم بر لیتر) و 35 دسی زیمنس بر متر (4/22 گرم بر لیتر)) آبیاری شدند. تنش شوری به مدت ده روز به صورت یک روز در میان انجام گردید و محلولپاشی کیتوزان نیز در غلظتهای (۰، ۲/۰ و ۴/۰ گرم در لیتر که همه در اسید استیک 5 درصد حلشده بودند) صورت گرفت. برای تهیه محلولهای کیتوزان از پودر کیتوزان با وزن مولکولی پایین و CAS number (4-76-9012)، محصول شرکت سیگما (Sigma) استفاده شد. بعد از اعمال تیمار شوری، کیتوزان با غلظتهای نامبرده سه مرتبه و یک روز در میان به صورت اسپری برگی صورت گرفت. 2 ماه پس از کاشت گیاه، بعد از پایان تیمارها ریشه و اندامهای هوایی گیاهان برداشت شدند.
وزن تر و خشک ریشه و اندام هوایی گیاه: پس از برداشت گیاهان، اندامهای هوایی و ریشههای هر تکرار بهطور جداگانه بهمنظور وزنتر توزین گردید سپس بهمنظور محاسبه وزن خشک به مدت ۴۸ ساعت درون آون با دمای ۷۰ درجه سلسیوس قرار داده شدند سپس وزن خشک ریشه و اندام هوایی گیاه، برحسب گرم با استفاده از ترازوی Sartatius مدل B1150S اندازهگیری شد.
تهیه عصاره پروتئینی و سنجش محتوای پروتئین کل: 5/0 گرم برگ تازه گیاهان پس از توزین، با دو میلیلیتر بافر فسفات پتاسیم (8/6 pH) بر روی یخ بهصورت هموژن درآمد؛ و در دمای چهار درجهی سانتیگراد در سرعت g 15000 به مدت 12 دقیقه سانتریفیوژ (مدل Smart R17، شرکت hanil، کره) شد.
شکل 1- اثر تیمار شوری (دسی زیمنس بر متر) بر گیاه خرفه (Portulaca oleracea L.).
سپس فاز بالایی جدا و در فریزر C°20- ذخیره شد. این عصاره برای سنجشهای آنزیمی و سنجش پروتئین کل نیز مورداستفاده قرار گرفت. 25 میلیگرم کوماسی برلیانت بلو در 5/12 میلیلیتر اتانول 96 درصد حل شد. سپس 25 میلیلیتر اسید ارتوفسفریک 85 درصد به آن اضافه شد و درنهایت حجم کل را با آب مقطر به 250 میلیلیتر رسانده و معرف تهیهشده (برادفورد) در دمای چهار درجه سانتیگراد نگهداری شد. برای سنجش پروتئین برگ و ریشه هر نمونه، 100 میکرولیتر از عصاره بهدستآمده را با 200 میکرولیتر آب مقطر و پنج میلیلیتر از معرف برادفورد تهیهشده مخلوط کرده سپس در طولموج 595 نانومتر جذب نوری هر یک از نمونه توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل 2100، شرکت unico، آمریکا) خوانده شد (13).
سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز: میزان فعالیت آنزیم کاتالاز با بررسی کاهش مقدار پراکسید هیدروژن در 240 نانومتر انجام شد. سه میلیلیتر مخلوط واکنش که شامل 2800 میکرولیتر بافر فسفات پتاسیم 50 میلیمولار (8/6pH)،100 میکرولیتر پراکسید هیدروژن 15 میلیمولار و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی میباشد به عصارهی آنزیمی اضافه شد و تغییرات جذب در 240 نانومتر به مدت سه دقیقه با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل 2100، شرکت unico، آمریکا) ثبت شد. سپس فعالیت آنزیم برحسب تغییرات جذب به ازای دقیقه برای همه نمونهها محاسبه شد (16).
سنجش فعالیت آسکوربات پراکسیداز: در این روش مخلوط واکنش حاوی بافر فسفات پتاسیم 50 میلی مولار (7 pH)، آسکوربات 5/0 میلیمولار، آباکسیژنه 1/0 میلیمولار، EDTA 1/0 میلیمولار و 150 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. فعالیت آسکوربات بر اساس اکسیداسیون آسکوربیک اسید و کاهش در جذب، در طولموج 290 نانومتر به مدت یک دقیقه با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل 2100، شرکت unico، آمریکا) اندازهگیری شد. یک واحد فعالیت آنزیمی بهعنوان مقدار آنزیمی است که 1 میکرو مول آسکوربیک اسید را در مدت یک دقیقه اکسید کند. سپس فعالیت آنزیم برحسب تغییرات جذب به ازای دقیقه برای همه نمونهها محاسبه شد (16).
سنجش فعالیت پلی فنل اکسیداز: سنجش فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز با استفاده از روش (Kar and Mishra, 1976) انجام گرفت. بر اساس این روش مخلوط واکنش (5 میلیلیتر) شامل بافر پتاسیم فسفات 125 میکرومولار (pH 6.8)، 50 میکرومولار پیروگالول و 1 میلیلیتر عصاره آنزیمی بود. مخلوط واکنش به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد سپس 5/0 میلیلیتر سولفوریک اسید 5% به آن اضافه شد سپس تغییرات جذب محلول واکنش نسبت به شاهد با دستگاه اسپکتروفتومتر در طولموج 420 نانومتر به مدت 3 دقیقه خوانده شد (22).
سنجش ترکیبات فنل کل: با استفاده از معرف فولین- سیکالته ترکیبات فنل اندازهگیری شد. در این روش 5/0 گرم بافت تر برگ با 3 میلیلیتر متانول 85% ساییده شد. 300 میکرولیتر از عصاره حاصل با 1500 میکرولیتر معرف فولین رقیقشده (با نسبت 1 به 10) ترکیب شد. پس از 5 دقیقه 1200 میکرولیتر کربنات سدیم 7٪ به آن اضافه شد و پس از 90 دقیقه جذب نوری نمونه به کمک دستگاه اسپکترفتومتر (مدل 2100، شرکت unico، آمریکا) در طولموج 760 نانومتر اندازهگیری شد و با استفاده از منحنی استاندارد اسید گالیک و با توجه به وزنتر برگ و حجم عصاره ترکیبات فنل کل بر اساس میلیگرم اسیدگالیک در گرم عصاره بیان شد (36).
سنجش میزان آنتوسیانینها: برای سنجش آنتوسیانین 1/0 گرم از بافت تر برگ توسط محلول متانول اسیدی در هاون چینی ساییده شد. عصاره حاصل به فالکون منتقل و به مدت 24 ساعت در تاریکی در دمای C˚ 4 قرار داده شد. نمونه فوق به مدت 10 دقیقه در g 4000 سانتریفیوژ (مدل LC06) شدند. سپس 100 میکرولیتر کلروفرم جهت حذف کلروفیل به آن افزوده و جذب محلول رویی در طولموج 530 نانومتر توسط اسپکترفتومتر (مدل 2100، شرکت unico، آمریکا) خوانده شد. جهت سنجش آنتوسیانین از نمودار استاندارد آنتوسیانین، سیانیدین -3-گلوکوزید استفاده شد و غلظت نمونهها برحسب میلیگرم در گرم مادهتر نمونه محاسبه گردید (17).
سنجش فلاونوئیدها: برای مقایسه 1/0 گرم برگ تر را در 5 میلیلیتر اتانول اسیدی (اتانول 95 درصد و اسید استیک با نسبت 99 به 1) خوب ساییده و عصاره حاصل به مدت 10 دقیقه در 4000 دور سانتریفیوژ میشود سپس محلول رویی جدا و به مدت 10 دقیقه در دمای 80 درجه سانتیگراد حرارت داده میشود پس جذب محلولهای بهدستآمده توسط اسپکترفتومتر uv-visible در طولموجهای 270، 300 و 330 نانومتر خوانده میشود. برای تنظیم دستگاه از بلانک اتانول اسیدی به عنوان شاهد استفاده میشود. میزان ترکیبات بر اساس شدت جذب آنها مقایسه میشود (24).
تجزیه و تحلیل دادهها: در این تحقیق کلیه آنالیزها با سه تکرار انجام شد و تجزیه و تحلیل دادهها بر پایه آزمایش فاکتوریل دوعاملی با طرح کاملاً تصادفی انجامگرفته است. با استفاده از نرمافزار آماری SPSS (version 23) دادهها تحلیل و نمودارهای مربوطه با نرمافزار Excel ترسیم گردید. آنالیز واریانس دادهها توسط نرمافزار SPSS صورت گرفت و مقایسه میانگین دادهها با استفاده از آزمون دانکن (Duncan) در سطح پنج درصد انجام شد.
نتایج
وزن تر اندام هوایی و ریشه: مقایسه نتایج حاصل از تجزیه واریانس دادهها نشان داد که وزن تر اندام هوایی در سطح شوری 25 دسی زیمنس بر متر نسبت به شاهد افزایش معنیداری داشته و در شوری 35 کاهش داشته است. در بررسی دو غلظت 2/0 و 4/0 گرم در لیتر از کیتوزان مشاهده شد که در شرایط بدون تنش غلظت 2/0 گرم در لیتر کیتوزان کاهش معنیدار داشته و غلظت 4/0 گرم در لیتر افزایش معنیداری در مقایسه با شاهد نشان داد. در شرایط تنش در سطح شوری 25 دسی زیمنس بر متر سطوح کیتوزان نسبت به شرایط تنش کاهش معنیدار نشان داد و در سطح شوری 35 دسی زیمنس بر متر غلظت 2/0 گرم در لیتر کیتوزان کاهش و غلظت 4/0 گرم در لیتر کیتوزان نسبت به شرایط تنش افزایش معنیداری نشان داد جدول (1).
وزن تر ریشه در سطح شوری 25 دسی زیمنس بر متر در مقایسه با شاهد افزایش معنیداری داشته است. بررسی کیتوزان در شرایط بدون تنش نشان داد که غلظت 2/0 و 4/0 گرم در لیتر نسبت به شاهد افزایش معنیدار بر وزن تر ریشه داشته است. در شرایط تنش در سطح شوری 25 و 35 دسی زیمنس بر متر سطوح کیتوزان نسبت به شرایط تنش کاهش معنیداری نشان داد جدول (1).
محتوای پروتئین: بررسی دادهها نشان داد که محتوای پروتئین در شرایط تنش نسبت به شاهد کاهش معنیداری داشته است. محتوای پروتئین در شرایط بدون تنش و در غلظت 2/0 گرم در لیتر اختلاف معنیداری با شاهد نداشته درحالیکه غلظت 4/0 گرم در لیتر باعث افزایش پارامتر نامبرده شده است. محتوای پروتئین در سطح شوری 25 دسی زیمنس بر متر در غلظتهای 2/0 و 4/0 گرم در لیتر کیتوزان نسبت به شرایط تنش افزایش داشته است. محتوای پروتئین در سطح شوری 35 دسی زیمنس بر متر و غلظت 2/0 گرم در لیتر کیتوزان افزایش و غلظت 4/0 گرم در لیتر کاهش معنیداری در مقایسه با شرایط تنش نشان داده است جدول (1).
جدول 1- اثر متقابل غلظتهای مختلف تنش شوری و کیتوزان بر میزان وزن تر اندام هوایی و ریشه، محتوای پروتئین و آنتیاکسیدانهای آنزیمی گیاه خرفه.
فعالیت آنزیم کاتالاز: مقایسه نتایج حاصل از تجزیه واریانس دادهها نشان داد که میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در شرایط تنش افزایش معنیداری در مقایسه با شاهد نشان داد و بیشترین میزان فعالیت این آنزیم در سطح شوری 35 دسی زیمنس بر متر مشاهده شد. فعالیت آنزیم کاتالاز در تیمار کیتوزان در شرایط بدون تنش افزایش معنیداری نسبت به شاهد نشان داد و بیشترین مقدار در غلظت 4/0 گرم در لیتر مشاهده شد. فعالیت آنزیم کاتالاز در سطح شوری 25 دسی زیمنس بر متر غلظت 2/0 گرم در لیتر کیتوزان افزایش معنیداری در مقایسه با شرایط تنش داشته است درحالیکه غلظت 4/0 گرم در لیتر کاهش معنیداری نشان داد. فعالیت آنزیم کاتالاز در سطح شوری 35 دسی زیمنس بر متر غلظتهای 2/0 و 4/0 گرم در لیتر کیتوزان کاهش معنیداری در مقایسه با شرایط تنش نشان داد جدول (1).
فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز: مقایسه نتایج حاصل از تجزیه واریانس دادهها نشان داد که میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در سطح شوری 25 دسی زیمنس بر متر اختلاف معنیداری با شاهد نشان نداد درحالیکه در سطح شوری 35 دسی زیمنس بر متر افزایش معنیداری نسبت به شاهد نشان داد. میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در تیمار با کیتوزان، در شرایط بدون تنش غلظت 2/0 گرم در لیتر افزایش معنیداری در مقایسه با شاهد نشان داد ولی در غلظت 4/0 اختلاف معنیداری با شاهد مشاهده نشد. میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در سطح شوری 25 دسی زیمنس بر متر غلظت 2/0 گرم در لیتر کیتوزان کاهش معنیدار داشته است و غلظت 4/0 گرم در لیتر افزایش معنیداری با شرایط تنش نشان داد. میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در سطح شوری 35 دسی زیمنس بر متر بررسی غلظت 2/0 گرم در لیتر کیتوزان کاهش معنیداری با شرایط تنش نشان داد درصورتیکه در غلظت 4/0 اختلاف معنیداری مشاهده نشد. جدول (1).
فعالیت پلیفنل اکسیداز: میزان فعالیت آنزیم پلیفنل اکسیداز در شرایط تنش نسبت به شاهد افزایش معنیداری داشته است. فعالیت آنزیم پلیفنل اکسیداز در تیمار کیتوزان در شرایط بدون تنش، اختلاف معنیداری با شاهد مشاهده نشده و در سطح شوری 25 دسی زیمنس بر متر غلظت 2/0 گرم در لیتر کیتوزان در مقایسه با شرایط تنش کاهش و غلظت 4/0 گرم در لیتر افزایش معنیدار نشان داد. فعالیت آنزیم پلیفنل اکسیداز در سطح شوری 35 دسی زیمنس بر متر و غلظت 2/0 گرم در لیتر کیتوزان اختلاف معنیداری در مقایسه با شرایط تنش مشاهده نشد درصورتیکه در غلظت 4/0 گرم در لیتر کاهش معنیداری نشان داد جدول (1).
محتوای فنل کل: محتوای فنل در شرایط تنش در مقایسه با شاهد اختلاف معنیداری نشان نداد. محتوای فنل در تیمار کیتوزان در شرایط بدون تنش افزایش معنیداری نسبت به شاهد نشان داد و بیشترین مقدار در غلظت 2/0 گرم در لیتر مشاهده شد. محتوای فنل در سطح شوری 25 دسی زیمنس بر متر غلظت 2/0 گرم در لیتر کیتوزان اختلاف معنیداری با شرایط تنش نشان نداد درحالیکه غلظت 4/0 گرم در لیتر افزایش معنیداری در مقایسه با شرایط تنش نشان داد. محتوای فنل در سطح شوری 35 دسی زیمنس بر متر غلظت 2/0 گرم در لیتر افزایش معنیداری در مقایسه با شرایط تنش داشته است و در غلظت 4/0 گرم در لیتر اختلاف معنیداری مشاهده نشد جدول (2).
محتوای آنتوسیانینها: محتوای آنتوسیانین در سطح شوری 25 دسی زیمنس بر متر اختلاف معنیداری در مقایسه با شاهد نشان نداد درصورتیکه محتوای آنتوسیانین در سطح شوری 35 دسی زیمنس بر متر کاهش معنیداری نسبت به شاهد مشاهده شد. در بررسی محتوای آنتوسیانین در سطوح کیتوزان در شرایط بدون تنش، غلظت 2/0 گرم در لیتر افزایش و غلظت 4/0 گرم در لیتر کاهش معنیداری در مقایسه با شاهد نشان داد. محتوای آنتوسیانین در سطح شوری 25 دسی زیمنس بر متر سطوح کیتوزان کاهش معنیداری نسبت به شرایط تنش نشان داد ولی در بررسی سطوح کیتوزان در شوری 35 دسی زیمنس بر متر اختلاف معنیداری با شاهد مشاهده نشد جدول (2).
محتوای فلاونوئیدها: مقایسه نتایج حاصل از تجزیه واریانس دادهها نشان داد که محتوای فلاونوئید در هر سه طولموج در شرایط تنش افزایش معنیداری در مقایسه با شاهد داشته است و بیشترین مقدار در شوری ۲۵ دسی زیمنس بر متر مشاهده شد. محتوای فلاونوئید در بررسی سطوح کیتوزان در شرایط بدون تنش میزان فلاونوئید (270nm) در غلظت ۴/۰ گرم در لیتر افزایش معنیداری نسبت به شاهد نشان داد. جذب فلاونوئید (300, 330nm) در سطح شوری ۲۵ دسی زیمنس بر متر دو سطح کیتوزان در مقایسه با شاهد کاهش معنیداری نشان داد. فلاونوئید (300nm) در سطح شوری ۲۵ و ۳۵ دسی زیمنس بر متر، سطوح کیتوزان کاهش معنیداری در مقایسه با شرایط تنش نشان داد جدول (2).
فلاونوئید (330nm) در سطح شوری ۳۵ دسی زیمنس بر متر غلظت ۲/۰ گرم در لیتر اختلاف معنیداری با شاهد نشان نداد درحالیکه غلظت ۴/۰ گرم در لیتر در مقایسه با شاهد کاهش معنیداری نشان داد. جدول (2).
جدول 2- اثر متقابل غلظتهای مختلف تنش شوری و کیتوزان بر آنتیاکسیدانهای غیر آنزیمی گیاه خرفه.
بررسی مجموع طولموجهای 270، 300 و 330 نانومتر نشان داد که شوری باعث افزایش محتوای فلاونوئیدها شده است. در سطح شوری 25 دسی زیمنس بر متر، غلظت 4/0 گرم بر لیتر کیتوزان فلاونوئیدها را افزایش داده و شوری 35 دسی زیمنس بر متر بر محتوای فلاونوئید اثر معنیداری نداشته است (نمودار 1).
نمودار 1- اثر متقابل غلظتهای مختلف تنش شوری و کیتوزان بر جذب فلاونوئید در طول موجهای 270، 300 و 330 نانومتر
بحث و نتیجه گیری
رشد و نمو گیاهان نتیجهی تقسیم سلولی و افزایش حجم سلول بدون برگشتپذیری میباشد. تنشهای زیستی و غیر زیستی رشد و نمو را کاهش میدهند. در تنش شوری تجمع املاح در ناحیه ریشهای باعث منفیتر شدن پتانسیل آب خاک شده و نتیجه آن کاهش جذب آب، بسته شدن روزنهها و محدودیت در تثبیت CO2 میباشد. علاوه بر کاهش جذب آب در گیاهان، در شرایط تنش شوری سمیت یونی در گیاه ایجاد میشود. تداوم و شدت تنش شوری، تنش اکسیداتیو را به دنبال دارد که تولید و تجمع رادیکالهای آزاد را سبب میشود که به سلول آسیبهای جدی وارد میکنند و این آسیبها رشد گیاه را بهشدت تحت تأثیر قرار میدهد. در این پژوهش در بررسی اثر سطوح مختلف تنش شوری بر معیارهای رشد در گیاه خرفه افزایش وزن تر اندام هوایی و ریشه در سطح 25 دسی زیمنس بر متر و کاهش معنیداری در سطح 35 دسی زیمنس بر متر در مقایسه با شاهد مشاهده شد. نتایج مشابه را میتوان در گیاهانی ازجمله Triticum aestivum (12) مشاهده کرد که تنش شوری منجر به کاهش وزن تر و وزن خشک ریشه و اندام هوایی شده است. کاهش رشد ریشه در تنش شوری از طرفی به پتانسیل اسمزی زیاد محلول خاک مرتبط بوده که جذب آب و مواد غذایی را کاهش داده و از طرف دیگر ﺧﺸﮑﻲ ﻓﻴﺰﻳﻮﻟﻮﮊﻳـﮏ در محیط ریشه و رقابت بین یونهای Cl- و SO42- با NO3- ایجاد شده است که درنهایت باعث کاهش رشد ریشه میگردد (9).
در این مطالعه بررسی اثر کیتوزان بر پارامترهای رشد، در غلظت ۴/۰ گرم در لیتر کیتوزان بهطور معنیداری باعث افزایش وزنتر ریشه و اندام هوایی گردید. کاربرد غلظتهای مختلف کیتوزان در گیاه لوبیا (35) ، گندم (26) نیز منجر به افزایش وزن تر ریشه و اندام هوایی گردید. مکانیسم عمل کیتوزان بر رشد ناشناخته باقی مانده است. کیتوزان ممکن است رشد و نمو گیاه را از طریق سنتز هورمون های گیاهی مانند اکسین و ژیبرلین افزایش دهد (38). از آنجایی که افزایش رشد ریشه در واقع افزایش در جذب آب و مواد غذایی است، به نظر میآید در شرایط تنش شوری، گیاهان تیمار شده با کیتوزان توانستند از اثرات مخرب شوری بر رشد و گسترش ریشه جلوگیری کنند.
محتوای پروتئین: یکی از راهکارها برای درک توانایی گیاهان در تحمل تنشهای محیطی شناسایی تغییرات القاشده با تنش در میزان پروتئین آنها میباشد. با این اندیشه که سازش به تنش، ناشی از سنتز پروتئین در پاسخ به تنشهای محیطی و تغییر بیان ژن است. ازجمله رویدادهای مهم بیوشیمیایی در گیاهان تحت تنش شوری، کاهش یا افزایش پروتئین میباشد. در مطالعه حاضر میزان پروتئین در سطح شوری ۲۵ دسی زیمنس بر متر در مقایسه با شاهد افزایش و در شوری ۳۵ دسی زیمنس بر متر کاهش معنیداری در مقایسه با شاهد نشان داد. اﯾﻦ ﮐﺎﻫﺶ میتواند ﺑﻪ دﻟﯿﻞ ﮐﺎﻫﺶ ﺳﻨﺘﺰ ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ، ﺗﺴﺮﯾﻊ ﭘﺮوﺗﺌﻮﻟﯿﺰی، ﮐﺎﻫﺶ در ﻓﺮاﻫﻤﯽ اﺳﯿﺪﻫﺎی آﻣﯿﻨﻪ و ﯾﺎ دﻧﺎﺗﻮره ﺷﺪن آنزیمهای درﮔﯿﺮ در ﺳﻨﺘﺰ ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ صورت گیرد (33). ازآنجاییکه پتاسیم بیش از ۵۰ آﻧﺰﯾﻢ را ﻓﻌﺎل ﮐﺮده و ﻋﻨﺼﺮی ﻣﻬﻢ در ﺳﻨﺘﺰ ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ ﺑﻪ ﺷﻤﺎر میآید ﻫﻤﭽﻨین tRNA را به ریبوزومها ﻣﺘﺼﻞ میکند. کاهش در پتاسیم و افزایش سدیم در گیاه و در سیتوزول تحت تنش شوری، کاهش سنتز پروتئین و محتوی پروتئینی را به دنبال خواهد داشت در شاهتوت تحت تنش شوری پایین پروتئین افزایش و در شوری بالا کاهش یافت (34). که این نتایج با یافتههای حاصل از پژوهش حاضر همخوانی دارد. در مطالعه حاضر غلظت ۲/۰ گرم در لیتر کیتوزان افزایش معنیداری در محتوی پروتئینی در مقایسه با شاهد نشان داد. کیتوزان در گیاه گلرنگ سبب افزایش پروتئین شد گزارش کردند که تیمار با غلظت کیتوزان کم در نهال گلرنگ تحت تنش باعث افزایش غلظت پروتئین محلول میشود (27)؛ که در توافق با یافتههای ما میباشد. این نتیجه حاکی از آن است که کیتوزان با غلظت پایین توانسته است مانع از تجمع یونهای سدیم در سیتوزول شود. این پاسخ را باید در اثر کیتوزان بر فعالیت پمپهای SOS1، HKT1 و NHX جستجو کرد که نیاز به مطالعه بیشتری در آینده دارد.
فعالیت آنزیم آنتیاکسیدان: آنزیم کاتالاز و پراکسیداز ترکیباتی مانند آباکسیژنه را به آب و اکسیژن تجزیه میکند و بدین ترتیب از آسیب سلولی جلوگیری میکند. برای پی بردن به میزان فعالیت این آنزیم از میزان اکسیژن آزادشده استفاده میشود. اگر اکسیژن آزادشده زیاد باشد فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان بیشتر خواهد بود (19). در مطالعه حاضر میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در شرایط تنش نسبت به شاهد کاهش معنیداری نشان داد. این کاهش ممکن است به دلیل افزایش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز و پلیفنلاکسیداز در شرایط تنش شوری باشد که باعث تجزیه پراکسید هیدروژن میگردد (11). تنش شوری در گیاه برنج باعث کاهش فعالیت آنزیم کاتالاز میگردد (25) همچنین در غلظت 2/0 گرم در لیتر کیتوزان افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز شده که این حالت در گیاه برنج (Oryza sativa L.) گزارششده است (29).
در مطالعه حاضر، در سطح شوری 35 دسی زیمنس بر متر میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز افزایش معنیداری نشان داد. در برخی گیاهان گزارششده است که با کاهش فعالیت آنزیم کاتالاز در شرایط تنش، فعالیت آسکوربات پراکسیداز افزایشیافته است (11). در تأیید یافتههای بهدستآمده از پژوهش حاضر، Lee و همکاران (2001) نشان دادند که فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در گیاهان گوجهفرنگی تحت شرایط شوری افزایش مییابد (25). در بررسی اثر کیتوزان بر فعالیت آسکوربات پراکسیداز در گیاه خرفه، غلظت 4/0 گرم در لیتر کیتوزان افزایش معنیدار و غلظت 2/0 گرم در لیتر کاهش معنیداری در فعالیت این آنزیم در مقایسه با شاهد نشان داد حسنلو و همکاران (1394) با تولید فلاونولیگنانها در کشت ریشههای مویین خار مریم (Silybum marianum) نشان دادند که کیتوزان میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز را افزایش میدهد که در توافق با یافتههای ما در این پژوهش میباشند (2). فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز بهعنوان یکی از آنزیمهای آنتیاکسیدانی در انواع تنشهای زیستی و غیر زیستی تغییر میکند (28) در لوبیا، فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز در شرایط تنش شوری در مقایسه با شاهد افزایش معنیداری نشان داد (31) که با نتایج حاصل از تحقیق حاضر مطابقت دارد. محققان در بررسی گیاه آفتابگردان تحت تنش شوری گزارش کردند که میزان فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز تحت تیمار با کیتوزان افزایش یافته (21) که با نتایج حاصل از تحقیق حاضر مطابقت دارد. . به نظر میرسد در تیمار همزمان شوری 25 و 35 دسی زیمنس بر متر و دو غلظت کیتوزان، فعالیت آنزیمهای کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز و پلی فنل اکسیداز به صورتی عمل کردند که کاهش یکی از آنها، باعث افزایش فعالیت آنزیم دیگر شده تا بتواند از میزان آب اکسیژنه بکاهد و با کاهش اﺛﺮات ﺳﻮء ﺗﻨﺶ اﮐﺴﯿﺪاﺗﯿﻮ، ﻣﻘﺎوﻣﺖ در ﺑﺮاﺑﺮ ﺗﻨﺶ اﮐﺴﯿﺪاﺗﯿﻮ در ﮔﯿﺎه را اﻓﺰاﯾﺶ دﻫﺪ.
آنتیاکسیدانهای غیر آنزیمی: ترکیبات فنلی نقش مهمی در کاهش و یا مهار اتو اکسیداسیون لیپیدها، جاروب کردن رادیکالهای آزاد، خاموش کردن اکسیژن یکتایی یا تجزیهی پراکسیدها دارند. این ترکیبات بهعنوان یک آنتیاکسیدان ضروری برای حفاظت علیه تکثیر و پیشروی زنجیرهی اکسیداتیو و دفاع علیه گونههای فعال اکسیژن عمل مینمایند. در مطالعه حاضر، محتوای فنل اختلاف معنیداری با شاهد در شرایط تنش نشان نداد که ممکن است به دلیل افزایش فعالیت آنزیم پلی فنل اکسیداز در شرایط تنش باشد. مقدار کل فنل گیاه توتون تحت تنش شوری نیز اختلاف معنیداری با شاهد نشان نداد (1) که با نتایج ما همخوانی دارد ملک پور و همکاران (۱۳۹5) گزارش کردند که کیتوزان باعث افزایش معنیداری در میزان فنل گیاه ریحان شده که با نتایج حاصل از این پژوهش مطابقت دارد (5).
محتوای آنتوسیانین: آﻧﺘﻮﺳﯿﺎﻧﯿﻦﻫﺎ ﮔﺮوه ﺑﺰرﮔﯽ از رﻧﮕﺪاﻧﻪﻫﺎی ﻣﺤﻠﻮل در آب میباشند ﮐﻪ در ﺗﻤﺎم بافتهای ﮔﯿﺎﻫﯽ وجود داشته و از ﺧﺎﻧﻮاده ﻓﻼوﻧﻮﺋﯿﺪﻫﺎ میباشند. از نقشهای اصلی آنتوسیانینها میتوان به نقش آنتیاکسیدانی و محافظت سیستم فتوسنتزی در برابر فتواکسیداسیون اشاره نمود که در گیاهان در معرض تنش نقش محافظتی ایفا میکنند (20). در این مطالعه میزان آنتوسیانین در تیمار شوری کاهش معنیداری داشته است. کاهش آنتوسیانین با نتایج یحییآبادی و همکاران (1395) روی شنبلیله همخوانی دارد (7). ﻋﺪم اﻓﺰاﯾﺶ در ﺑﯿﻮﺳﻨﺘﺰ آﻧﺘﻮﺳﯿﺎﻧﯿﻦﻫﺎ را میتوان ﻧﺘﯿﺠﻪ آﺛﺎر ﺳﻤﯽ ﺳﺪﯾﻢ در ﺗﻨﺶ ﺷﻮری و ﯾﺎ آﺛﺎر ﺑﺎزدارﻧﺪﮔﯽ ﺗﻨﺶ اﮐﺴﯿﺪاﺗﯿﻮ ﺣﺎﺻﻞ از ﺗﻨﺶ ﺷﻮری ﻧﺴﺒﺖ داد. توسعه ﺁﻧﺘﻮﺳﻴﺎﻧﻴﻦ، ﻫﻤﺎﻫﻨﮓ ﺑﺎ ﺗﺠﺰﻳﻪ ﮐﻠﺮﻭﻓﻴﻞ، ﺑﻪ ﺑﻴﺸﺘﺮﻳﻦ ﺣﺪ ﺧـﻮﺩ میرسد. ﺣﺘﻲ ﺍﮔـﺮ ﮊﻥ ﻻﺯﻡ ﺑـﺮﺍﻱ ساختهشدن ﺁﻧﺘﻮﺳـﻴﺎﻧﻴﻦ ﻭﺟﻮﺩ ﺩﺍﺷﺘﻪ ﺑﺎﺷﺪ ﺗﺎ ﺷﺮﺍﻳﻂ ﻣﺤﻴﻄﻲ ﻣﻄﻠـﻮﺏ ﻧﺒﺎﺷـﺪ، ساختهشدن ﺁﻥ ﺍﻧﺠﺎﻡ نمیپذیرد. ﻫﻤﭽﻨﻴﻦ، ﺗﺸﮑﻴﻞ ﺁﻧﺘﻮﺳـﻴﺎﻧﻴﻦﻫـﺎ ﺩﺭ ﮔﻴﺎﻫﺎﻥ ﻣﻌﻤﻮﻻً ﺑﺎ ﺗﺠﻤﻊ ﻗﻨﺪها ﺻﻮﺭﺕ میپذیرد ﻭ ﻫﺮ ﻋﺎﻣﻠﻲ ﮐـﻪ ﺳﺒﺐ ﺍﻓﺰﺍﻳﺶ ﻗﻨﺪ ﺩﺭ ﮔﻴﺎﻩ ﺷﻮﺩ، ﺍﻏﻠﺐ ساختهشدن آنتوسیانین را رونق میبخشد (3) که این دلایل میتواند توجیهی برای افزایش میزان آنتوسیانین در سطح شوری ۳۵ نسبت به ۲۵ دسیزیمنسبرمتر باشد چون در این مطالعه میزان قندهای محلول در سطح شوری ۳۵ دسیزیمنسبرمتر به بیشترین میزان رسیده است (محتوای قند گزارش در این مقاله گزارش نشده است). در این مطالعه غلظت ۴/۰ گرم در لیتر کیتوزان باعث کاهش میزان آنتوسیانین در مقایسه با شاهد شد درحالیکه غلظت ۲/۰ گرم در لیتر اختلاف معنیداری با شاهد نشان نداد که ممکن است به خاطر خواص آنتیاکسیدانی کیتوزان باشد. پیش تیمار بذرهای شنبلیله با کیتوزان باعث افزایش میزان آنتوسیانین شد که با یافتههای ما در این پژوهش همخوانی دارد (7).
در این مطالعه میزان فلاونوئید در شرایط تنش در مقایسه با شاهد افزایش معنیداری نشان داد. فعالیت آنتیاکسیدانی فلاونوئیدها در جاروب گونههای فعال اکسیژن شناختهشده است (42). در Hordeum vulgare نیز اعمال شوری منجر به افزایش فلاونوئیدها شد (10) که در توافق با یافتههای ما میباشد. همچنین در این پژوهش کاربرد کیتوزان باعث کاهش میزان فلاونوئید گردید. گزارششده است که کیتوزان از طریق تأثیر بر فعالیت آنزیم PAL کلیدی مسیر تولید مشتقات فنیل پروپانوئیدی باعث افزایش آنتوسیانین در گیاه میشود (14) از طرفی افزایش مقاومت در برابر تنش اکسیداتیو ممکن است در ارتباط با خواص آنتیاکسیدانی کیتوزان باشد. کیتوزان ممکن است باعث فعال شدن ژنهای جدیدی شود که آنزیمها و درنهایت مسیرهای بیوسنتزی مختلفی را راهاندازی کنند و باعث تشکیل متابولیتهای ثانویه شوند.
نتایج حاصل از بررسی تنش شوری و کیتوزان نشان داد که گیاه خرفه تا حد زیادی به شوری مقاومت دارد. تیمار شوری در سطح ۲۵ دسیزیمنسبرمتر باعث بهبود رشد در گیاه خرفه گردید. کاربرد کیتوزان با غلظت ۲/۰ گرم در لیتر بر پروتئین اثر مثبت داشته است یعنی کیتوزان با بالا بردن فاکتورهای بیوشیمیایی باعث بهبود رشد شده است. در بررسی اثر کیتوزان بر روی ترکیبهای فنلی و فلاونوئیدی در سطح شوری ۲۵ دسیزیمنسبرمتر، کیتوزان با غلظت ۲/۰ گرمدرلیتر اثر تنش اکسیداتیو را کاهش داد. این مسئله بهویژه در اندازهگیری فلاونوئیدها، آنتوسیانینها و آسکوربات پراکسیداز بهخوبی مشاهده شد... به نظر میرسد که گیاه خرفه این پتانسیل را داراست که بهعنوان یک گیاه دارویی ارزشمند در مناطق شور موردتوجه قرار گیرد. همچنین میتوان از کیتوزان بهعنوان یک پلیمر زیستی بیخطر در افزایش مقاومت به تنش شوری استفاده نمود.
سپاسگزاری
این تحقیق بخشی از پایان نامه کارشناسی ارشد تحت عنوان "بررسی اثر کیتوزان و تنش شوری روی شاخصهای فیزیولوژیکی و برخی ترکیبات شیمیایی گیاه خرفه (Portulaca oleracea L.)" بوده که با اعتبار مالی دانشگاه خوارزمی انجام شده است. نویسندگان بر خود لازم میدانند از کلیه همکاران مرتبط با این تحقیق در گروه علوم گیاهی دانشکده علوم زیستی سپاسگزاری نمایند.