مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)

تاثیر محلول پاشی آهن بر الگوی بیان ژن های تولید کننده آنتوسیانین میوه توت‌فرنگی طی مراحل نموی

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه علوم باغبانی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان، زنجان، ایران

2 عضو هیات علمی دانشکده کشاورزی

3 عضو هیئت علمی پژوهشکده فناوری های نویسن زیستی دانشگاه زنجان

4 عضو هیئت علمی دانشگاه زنجان گروه باغبانی

5 گروه علوم باغبانی دانشگاه ابین المللی امام خمینی (ره) قزوین، قزوین

6 عضو هیئت علمی مرکز ملی تحقیقات شوری یزد

چکیده

آنتوسیانین ها از جمله ترکیبات مهم در کیفیت میوه توت‌فرنگی هستند که ژن‌های مختلفی در تولید و انباشت این متابولیت‌ها نقش دارند. هـدف از این پژوهش بررسی تاثیر محلـول‌پاشـی آهن، تعیین غلظت بهینه و مطالعه اثر آن بر الگوی بیان ژن‌های دخیل در بیوسنتز آنتوسیانین‌های میوه توت‌فرنگی رقم کاماروسا طی مراحل نموی بود. آزمایش بصورت فاکتوریل در قالب طرح بلوک‌های کامل تصادفی با سه تکرار اجرا شد. بدین منظور، ابتدا در یک آزمایش مقدماتی بوته‌های توت‌فرنگی با کلات آهن 14% در غلظت‌های صفر، 200، 400، 600، 800، 1000، 1200، 1400، 1600، 1800 و 2000 میکرومول بر لیتر محلول‌پاشی شده و سپس میزان تجمع آنتوسیانین‌ها و بیان ژن‌های دخیل در بیوسنتز آنها در روزهای سوم، ششم، نهم و دوازدهم بعد از محلول‌پاشی ارزیابی گردیدند. طبق نتایج، میوه‌های محلول‌پاشی شده با آهن در غلظت 1400 میکرومول بر لیتر بیشترین میزان تجمع آنتوسیانین را نشان دادند. همچنین، کاربرد غلظت انتخابی آهن موجب تسریع رسیدگی میوه‌ها نیز گردید که در نهایت غلظت 1400 میکرومول بر لیتر به عنوان غلظت بهینه در نظر گرفته شد. افزایش بیان ژن‌های FaSUT1، FaMYB1، FaPAL، FaCHS و کاهش بیان ژن FaMYC1 در میوه‌های تیمار شده با کلات آهن 14% در غلظت 1400 میکرومول بر لیتر می‌تواند دلیلی بر افزایش تجمع آنتوسیانین‌ها باشد. بنابراین، جهت تولید گلخانه‌ای توت‌فرنگی و کشت آن در محیط بدون خاک، با توجه به نتایج این پژوهش، به منظور افزایش آنتوسیانین‌ها می‌توان غلظت 1400 میکرومول بر لیتر آهن با روش محلول‌پاشی را پیشنهاد نمود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Effect of foliar iron application on anthocyanin genes expression during of developmental stages in strawberry fruit

نویسندگان [English]

  • Saeed Rezaei 1
  • Mohammadesmaeel amiri 2
  • Abbas Bahari 3
  • farhang razavi 4
  • Morteza Soleimani Aghdam 5
  • hossein beyrami 6

1 Department of Horticulture, Faculty of Agriculture, University of Zanjan, Zanjan, Iran

2 Scientific Member of Horticulture Dep.

3 Department of Agronomy Science in Research Institute of Modern Biological Techniques, University of Zanjan, Iran

4 Department of Horticultural Sciences, Faculty of Agriculture, University of Zanjan, Zanjan, Iran.

5 University of Imam khomeini

6 National salinity research center

چکیده [English]

Introduction: Anthocyanins are important compounds in strawberry fruit quality. There are different genes involved in the production and accumulation of these metabolites. The aim of this study was to investigate the effect of foliar application of iron, determine the optimal concentration and study its effect on the expression pattern of genes involved in the biosynthesis of anthocyanins of strawberry fruit of Camarossa cultivar during developmental stages.
Material and Methods: The experiment was factorial based on a randomized complete block design with three replications. So that, first in a preliminary experiment strawberry plants were sprayed with 14% iron chelate at concentrations of 0, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, and 2000 µmol/L. Then properties were evaluated after foliar application.
Results and Discussion: According to the results, fruits sprayed with iron at a concentration of 1400 μmol/L showed the highest level of total anthocyanin. Also, the application of selective concentrations of iron accelerated the ripening of fruits, which in the end, a concentration of 1400 μmol/L was considered as the optimal concentration. Increased expression of FaSUT1, FaMYB1, FaPAL, FaCHS genes and decreased expression of FaMYC1 gene in fruits treated with iron chelate 14% at a concentration of 1400 μmol/L can be a reason for increased accumulation of anthocyanins.
Conclusion: Therefore, in order to produce strawberry greenhouses and cultivate them in a soilless environment, according to the results of this study, in order to increase anthocyanins contents, a concentration of 1400 μmol/L of iron can be suggested by foliar application.

کلیدواژه‌ها [English]

  • spraying
  • camarossa
  • gene expression
  • anthocyanin

تاثیر محلول­پاشی آهن بر الگوی بیان­ ژن­های تولید کننده آنتوسیانین

میوه توت‌فرنگی طی مراحل نموی

سعید رضائی1*، محمد اسماعیل امیری1، عباس بهاری2، فرهنگ رضوی1، مرتضی سلیمانی اقدم3 و حسین بیرامی4

1 ایران، زنجان، دانشگاه زنجان، دانشکده کشاورزی، گروه علوم باغبانی

2 ایران، زنجان، دانشگاه زنجان، پژوهشکده فناوری­های نوین زیستی

3 ایران، قزوین، دانشگاه بین المللی امام خمینی، دانشکده کشاورزی، گروه علوم باغبانی

4 ایران، یزد، مرکز ملی تحقیقات شوری یزد، سازمان تحقیقات، آموزش وترویج کشاورزی

تاریخ دریافت: 02/09/1399          تاریخ پذیرش: 10/05/1400

چکیده

آنتوسیانین­ها از جمله ترکیبات مهم در کیفیت میوه توت­فرنگی هستند که ژن­های مختلفی در تولید و انباشت این متابولیت­ها نقش دارند. هـدف از این پژوهش محلـول‌پاشـی آهن، تعیین غلظت بهینه و مطالعه تأثیر آن بر الگوی بیان ژن‌های دخیل در بیوسنتز آنتوسیانین­ها میوه توت­فرنگی رقم کاماروسا طی مراحل نموی بود. آزمایش بصورت فاکتوریل در قالب طرح بلوک­های کامل تصادفی با سه تکرار اجرا شد. بدین منظور، ابتدا در یک آزمایش مقدماتی بوته­های توت­فرنگی با کلات 14% آهن در غلظت­های صفر، 200، 400، 600، 800، 1000، 1200، 1400، 1600، 1800 و 2000 میکرومول بر لیتر محلول­پاشی شده و سپس میزان تجمع آنتوسیانین­ها و بیان ژن­های دخیل در بیوسنتز آنها در روزهای سه، شش، نه و دوازده روز بعد از محلول­پاشی ارزیابی گردیدند. طبق نتایج، میوه­های محلول­پاشی شده با آهن در غلظت 1400 میکرومول بر لیتر بیشترین میزان تجمع آنتوسیانین را نشان دادند. همچنین، کاربرد غلظت انتخابی آهن موجب تسریع رسیدگی میوه‌ها نیز گردید که در نهایت غلظت 1400 میکرومول بر لیتر به عنوان غلظت بهینه در نظر گرفته شد. افزایش بیان ژن‌های FaSUT1، FaMYB1، FaPAL، FaCHS، FaMYC1 بهمراه افزایش فعالیت آنزیم PAL و کاهش بیان ژن FaMYC1 در میوه‌های تیمار شده با کلات 14% آهن در غلظت 1400 میکرومول بر لیتر می­تواند دلیلی بر افزایش تجمع آنتوسیانین باشد. بنابراین، جهت تولید گلخانه­ای توت­فرنگی و کشت آن در محیط بدون خاک، طبق نتایج این پژوهش می‌توان غلظت 1400 میکرومول بر لیتر آهن با روش محلول‌پاشی را پیشنهاد نمود.

واژه های کلیدی: محلول­پاشی، کاماروسا، بیان ژن، آنتوسیانین

* نویسنده مسئول، تلفن: 09149235174،  پست الکترونیکی: Rezaei.s@znu.ac.ir

مقدمه

 

توت­فرنگی یکی از میوه­های بسیار محبوب در سرتاسر جهان می­باشد که بدلیل غنی بودن از آنتوسیانین‌ها و انواع ویتامین­ها در تغذیه و سلامت انسان نقش بسزایی دارد (20 و 50). ارزش اقتصادی و تغذیه­ای توت‌فرنگی بسیاری از محققان را به مطالعه فیزیولوژیکی و مولکولی آن، بویژه روند تغییرات ترکیب‌های پلی‌فنولی و آنتوسیانینی علاقه­مند کرده است. تولید و انباشت این ترکیبات در میوه­ها با کاربرد برخی از مواد معدنی نظیر آهن، نیتروژن، روی و فسفر افزایش می‎یابد (42). بنابراین، لازم است طی دوره رشـد گیاه طبق اصول علمی نسبت به توصیـه کودی اقدام

کرد تا عملکرد و کیفیت مطلوبی بدست آید.

آهن عنصر ضروری برای رشد و نمو گیاهان است که نقش مهمی در متابولیسم سلولی دارد. این عنصر در سنتز کلروفیل، زنجیره انتقال الکترون، فتوسنتز و تنظیم فعالیت آنزیم‌های چرخه کالوین نقش دارد (34، 43 و 48). علایم کمبود آهن ابتدا در برگ­های جوان دیده می­شود. به همین خاطر، در گیاهان توت­فرنگی که کمبود آهن دارند، کلروفیل­ها به مقدار لازم ساخته نمی­شود که نهایتا منجر به کاهش کارایی فتوسنتز و افزایش رقابت بین رشد رویشی و زایشی می‌شود. بنابراین، از رشد و عملکرد گیاه کاسته می­شود (3 و 34).

مطالعات مختلف نشان داده است که آهن در تولید و ذخیره متابولیت­های ثانویه از جمله فلاونوئیدها و آنتوسیانین­ها نقش دارد (30). پژوهشگران ثابت کرده­اند که همبستگی مثبتی بین مصرف آهن و میزان تجمع ترکیبات فنولیکی گیاهان وجود دارد، بطوریکه با تغذیه برگی آهن، مقدار تولید این ترکیب­ها افزایش می­یابد (7).  در همین راستا گزارش شده است که میزان عملکرد و کیفیت میوه‌های گلابی از طریق محلول­پاشی با آهن با غلظت 250 پی­پی­ام افزایش می­یابد (24). علاوه بر این، در تحقیقی که در مورد تاثیر کمبود آهن بر روی میوه‌ هلو انجام شده است، مشخص گردیده است که کمبود آهن منجر به کاهش شدید محتوای فنولیکی و آنتوسیانینی‌ میوه­ها می­شود (6). علی­رغم اینکه بیشتر پژوهش­ها بطور عمده از جنبه فیزیولوژیکی مورد بررسی قرار گرفته است، در رابطه با شناسایی و بررسی الگوی بیان ژن­های درگیر در مسیر تولید آنتوسیانین­ها مطالعات بسیار کمی صورت پذیرفته است. در مسیر تولید آنتوسیانین­ها و دیگر ترکیبات فنولی چندین ژن نقش موثر دارند که از این قبیل می­توان به ژن­های FaMYB، FaPAL، FaCHS، FaMYC1،FaTTG1، FaMADS9 و  FaSHP اشاره کرد (14، 24، 31 و 36).

ژن FaMYC1 در تولیـد پرونوسیانیدین­ها نقش کلیدی دارد

که در مراحل اولیه رشد میوه توت­فرنگی بمیزان زیادی بیان می‌شود ولی با شروع رنگ­گیری میوه و افزایش بیان ژن­های FaMYB1، FaCHS، FaSUT1 و FaPAL پروتوسیانیدین‌های بیشتری به آنتوسیانین تبدیل می­شوند. بر این اساس مقدار آمینواسیدها، آنتوسیانیدین­ها و ترکیبات رنگی در مراحل نزدیک به رسیدن توت­فرنگی افزایش پیدا می­کند (50). با وجود پژوهش­هایی که درباره اثر آهن بر عملکردهای مختلف فیزیولوژیکی محصولات باغبانی انجام گرفته است اما تاکنون گزارش مستندی در مورد اثر این عنصر بر روند بیان ژن­های سنتز کننده متابولیت­های ثانویه میوه توت­فرنگی وجود ندارد. بنابراین، هدف از این پژوهش بررسی تاثیر آهن بر الگوی بیان ژن­های مختلف در مسیر تولید آنتوسیانین­ها و فلاونوئیدها میوه توت‌فرنگی رقم کاماروسا طی مراحل مختلف نموی در گلخانه بود.

مواد و روشها

این تحقیق بصورت فاکتوریل در قالب طـرح بلـوک­هـای کامل تصـادفی با سـه تکرار در یکـ گلخانـه­ هیدروپونیک شهرک گلخانه­ای شهر زنجان (بخش خصوصی) با مشخصات جغرافیایی 1602 متر ارتفاع از سطح دریا، طول جغرافیایی 48 درجه و 39 دقیقه، عرض جغرافیایی 36 درجه و 71 دقیقه با رطوبت نسبی 50-60 درصد و میانگین دمای شبانه­روز 21 درجه سلیسیوس در سال 1397 بر روی میوه­های توت­فرنگی رقم کاماروسا در طول دوره رشد و نمو اجرا شد.

بطور کلی رشد و نمو میوه توت‌فرنگی شامل چهار مرحله مختلف رشدی (توت سبز، سفید، صورتی و قرمز) است (50) که محلول­پاشی میوه‌ها در مرحله اول رشد (توت سبز: تقریبا یک هفته بعد از تشکیل میوه) انجام شد. بمنظور تیمار میوه­ها از کلات آهن (Fe-EDTA) با نام تجارتی فتریلون (Fetrilon®) و درجه خلوص 14% استفاده گردید. ابتدا در یک آزمایش مقدماتی جهت تعیین غلظت بهینه، محلول­پاشی تمام غلظت­های (صفر -200-400-600-800-1000-1200-1400-1600-1800 و 2000) میکرومول بر لیتر روی بوته­های توت­فرنگی (در مرحله اول رشد میوه‌ها) اعمال گردید. محلول­پاشی فقط یک مرتبه و در هر گیاه تقریبا به میزان 40 میلی­لیتر در ساعات عصر انجام شد. سپس غلظت 1400 برای تیمار کلات 14% آهن بر اساس نتایح گزارش شده توسط رضائی و همکاران (1398) جهت بررسی صفات مورد ارزیابی انتخاب گردید (3). در هر نوبت از نمونه‌برداری، میوه­های برداشت شده بعد از قرار دادن در فویل آلومینیومی در ازت مایع منجمد شده و به فریزر 80- درجه سلیسیوس آزمایشگاه پژوهشکده فناوری­های نوین زیستی دانشگاه زنجان منتقل شدند. در این آزمایش صفات اسید کل، محتوای آنتوسیانین کل، فعالیت آنزیم PAL و میزان بیان ژن­های FaMYB1، FaSUT1، FaCHS، FaMYC1، FaPAL مورد ارزیابی قرار گرفتند.

اندازه­گیری صفات: اندازه‌گیری اسید کل مطابق با روش­های استاندارد AOAC تعیین و بصورت درصد بیان گردید (8). سنجش فعالیت آنزیم PAL با استفاده از روش Zucker (1968) انجام شد (53). بدین صورت که ابتدا دو گرم از بافت میوه با ده میلی­لیتر بافر بورات سدیم با 8/8=pH کوبیده شد. سپس محلول تهیه شده در دور 12000 به مدت ده دقیقه سانتریفیوژ شد. 500 میکرولیتر از عصاره سانتریفیوژ شده، دو سی سی بافر بورات سدیم با 500 میکرولیتر محلول فنیل آلانین 20 میلی­مولار داخل لوله آزمایش ریخته و به مدت یک ساعت در حمام آب گرم 37 درجه سلیسیوس قرار داده شد. فعالیت آنزیم با اندازه‌گیری میزان جذب محلول در طول موج 290 نانومتر تعیین و  بر حسب واحد بر میلی‌گرم پروتئین عصاره آنزیم (U mg-1  protein) گزارش شد. برای اندازه­گیری آنتوسیانین کل آب میوه توت­فرنگی از روش اختلاف جذب در pH های مختلف استفاده شد (21). جذب نمونه­ها تهیه شده توسط بافر 1=pH و 5/4=pH توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج­های 510 و 700 نانومتر قرائت و بر حسب میلی­گرم سیانیدین 3-گلوکوزید در 100 گرم وزن تر میوه بیان شد.

طراحی پرایمرها با استفاده از اطلاعات موجود در دیتابیس NCBI برای ژن­های توت­فرنگی با نرم افزار Allele ID و با بکارگیری استراتژی exon junction انجام شد. بمنظور انتخاب برخی از ژن‌های گیاه توت­فرنگی دخیل در سنتز آنتوسیانین و رسیدگی میوه، جستجو در بانک­های اطلاعاتی و مقالات انجام گرفت و سپس پرایمرها برای ژن­های مورد نظر طراحی و از شرکت ماکروژن کره جنوبی تهیه گردید (جدول 1).

 

 

جدول 1- نام ژن­ها و توالی آغازگرهای استفاده شده در این مطالعه F: forward) - R: Reverse)

Tm©  GC%       طول پرایمر                     توالی پرایمر                                            نام پرایمر

        Length/bp           Genes name                             Sequences

FaSUT1          5- TGTTTGTGTTTGGGTTTTGG-3        20          F      40      54.3

FaSUT1         5-AGTGAGATCAGCAAGGAG-3           18          R      50      53.9

 

FaActin              5-GGTGTGATGGTTGGGATG-3        18       F     55.6        56.1

FaActin         5-GTAGAAGGTGTGATGCCAAA-3      20      R      55.6        56.1

 

FaMYB1        5-GGAAGGACAGATAACGAA-3         18      F      44.4        51.6

FaMYB1         5-TTTGGACGAAGAGTAGTG-3           18      R     44.4        51.6

 

FaPAL             5-GGAGTATTTGGCAAGGGA-3         18       F      50          53.9

FaPAL              5-GGAGTAATGTTGTGGTTGAG-3     18       R      50         53.9

 

FaMYC1        5-GTGTCCTTTCTTCCCTTT-3              18        F     44.4       51.6

FaMYC1        5-TCCTCCTTTCTTCCAACTC-3            19       R     47.4       55.2

 

FaCHS           5-CTCACATTTCACCTCCTC-3              18       F      50         53.9

FaCHS             5-TCGTGGCTTCTAACTTCT-3            18       R      44.4      51.6

 

استخراج RNA با استفاده از کیت  RiboEXTM(Total RNA isolation) شرکت Geneall کره جنوبی انجام شد. تعیین کمیت و کیفیتRNA  استخراجی با استفاده از نانودرآپ و الکتروفورز ژل افقی یک درصد، صورت پذیرفت. سپس سنجش کمیت RNA توسط دستگاه Spectrophotometer (مدل NANODROP 2000 ساخت شرکت Thermo SCIENTIFIC) انجام گرفت. این دستگاه میزان RNA را برحسب نانوگرم بر میکرولیتر نشان می‌دهد. برای سنجش کیفیت RNA از الکتروفورز ژل آگارز یک درصد در بافر TAE و برای تولید cDNA از کیت (Hyper script cDNA synthesis) ساخت شرکت Geneall استفاده شد و برای ساخت cDNA طبق دستورالعمل، با بکارگیری حداقل یک میکروگرم RNA انجام شد جدول (2).

 

 

جدول2- مواد مورد نیاز جهت انجام رونویسی معکوس

     ماده                                                               حجم

       Material                                                           Volume

Total RNA                                                            5µl

Oligo                                                                     1µl

                   5µl                                                    DEPC-treated water

             10µ                                                           RT Master

 

 

 

واکنش qPCR یا Rael-time PCR در دستگاه 6000Rotor Gene  شرکت QIA ساخت کشور امریکا با استفاده از کیت5x eragreen master mix شرکت Salicbiodyne کشور استونی انجام شد. فهرست مواد بکار رفته در واکنش و مقادیر آن‌ها در جدول (3) و (4) آورده شده است. تجزیه و تحلیل داده­ها با استفاده از نرم افزار SPSSver 22 و مقایسه میانگین­ها به روش آزمون چند دامنه­ای دانکن در سطح احتمال پنج درصد و ترسیم نمودارها به کمک نرم افزار Excel انجام شد.

 

 

جدول 3- غلظت و مقادیر حجمی مواد بکار رفته در واکنش  Rael-time PCR

اجزای واکنش                                                         حجم

Material                                                          Volume

5x Eva Green qPCR Mix                                  4 µl

Forward Primer                                                 1 µl

Reverse Primer                                                  1 µl

Template cDNA                                                3µl

Water, nuclease-free                                          11 µl

 

جدول 4- برنامه­ی دمایی- زمانی استفاده شده برای Rael-time PCR

  مرحله                         تعداد چرخه­ها                  دما(©)                        زمان

Stage           temperature          Number of cycles                time           

Initial Denaturation         1                       95 Celsius                15 min

Denaturation                45-40          95 Celsius                              20 s

Annealing                                              52-60  Celsius                    20s

Extention                                                   55 Celsius                   20 s

Melt                            1                        99         

 

 

نتایج

نقش آهن در رنگ­گیری و رسیدگی میوه توت­فرنگی: نتایج حاصل از  بررسی دوره­های مختلف نمونه­برداری نشان دهنده آن بود که محلول­پاشی غلظت 1400 میکرومول بر لیتر آهن موجب تسریع رنگ­گیری و رسیدگی میوه توت­فرنگی گردید (شکل 1).

شکل 1- تاثیر غلظت 1400 میکرومول بر لیتر آهن در تسریع رسیدن میوه توت‌فرنگی طی مراحل نموی

اسید کل: بر پایه نتایج تجزیه واریانس داده­ها اثر آهن، زمان و اثر برهمکنش بین آنها بر میزان اسید کل توت­فرنگی در سطح احتمال یک درصد (01/0 > p) معنی‌دار بود. طبق مقایسه میانگین داده­ها، از نظر میزان اسید کل اختلاف معنی­داری در میوه‌های محلول­پاشی شده با آهن نسبت به یکدیگر در تمام نوبت­های بررسی (سه، شش، نه و 12 روز بعد از محلول‌پاشی) مشاهده شد. همچنین، در نمونه­های تیمار شده با آهن در مقایسه با شاهد، میزان اسید کل در روزهای نهم و دوازدهم بررسی، تفاوت معنی­داری داشتند ولی در روزهای سوم و ششم آزمایش تفاوتی مشاهده نشد. بیشترین و کمترین میزان اسید کل بترتیب مربوط به نمونه­های شاهد در روز ششم و نمونه­های آهن در روز دوازدهم بررسی بود. نمونه­های شاهد از نظر میزان اسید کل اختلاف معنی‌داری نسبت به یکدیگر طی مراحل مختلف نموی نشان دادند (شکل 2).

 

شکل 2- تاثیر غلظت1400 میکرومول بر لیتر آهن بر اسید کل میوه توت‌فرنگی طی مراحل نموی

حروف متفاوت نشان دهنده اختلاف معنی­دار بین میانگین­ها در سطح احتمال پنج درصد آزمون دانکن می­باشد

 

 

نقش ژن FaSUT1  در تولید ساکارز و رسیدگی میوه: مقایسه میانگین­ داده­ها نشان داد، در میوه­های محلول­پاشی شده با آهن نسبت به یکدیگر فقط روز­های سوم و ششم با روزهای نهم و دوازدهم بررسی تفاوت معنی­داری از لحاظ میزان بیان ژن  FaSUT1وجود داشت ولی بین روز­های سوم و ششم و بین روزهای نهم و دوازدهم نمونه­برداری اختلاف معنی­داری مشاهده نشد. هرچند که در نمونه­های آهن، روز دوازدهم بررسی نسبت به روز نهم افزایش جزیی مشاهده گردید. میزان بیان ژن  FaSUT1 در میوه‌های تیمار شده با آهن در مقایسه با شاهد در روزهای نهم و دوازدهم آزمایش اختلاف معنی­داری داشتند ولی در روز­های سوم و ششم بررسی اختلاف معنی‌داری یافت نشد. همچنین در نمونه­های شاهد در همه نوبت­های نمونه‌بردارری به غیر از روز سوم با روز ششم بررسی نسبت به یکدیگر از نظر میزان بیان ژن FaSUT1 تفاوت معنی‌داری وجود داشت (شکل 3).

 

شکل 3- تاثیر غلظت1400 میکرومول بر لیتر آهن بر الگوی بیان ژن  FaSUT1در میوه توت‌فرنگی طی مراحل نموی

حروف متفاوت نشان دهنده اختلاف معنی­دار بین میانگین­ها در سطح احتمال پنج درصد آزمون دانکن می­باشد

 

 

ژن FaPAL و آنزیم فنیل­آلانین­آمونیالیاز: یافته­های حاصل از تجزیه واریانس داده­ها نشان داد که اثر آهن، زمان و اثر برهمکنش بین آنها بر میزان فعالیت آنزیم فنیل­آلانین­آمونیالیاز در سطح احتمال یک درصد (01/0 > p) معنی‌دار شد. بر پایه نتایج مقایسه میانگین­ها، در میوه­های تیمار شده با آهن نسبت به یکدیگر بین دو زمان بررسی در روزهای سوم و ششم اختلاف معنی‌داری از نظر میزان فعالیت آنزیم PAL مشاهده نشد ولی در روزهای نهم و دوازدهم آزمایش، میزان فعالیت آنزیم  PALنمونه­های تیمار نسبت به یکدیگر و در مقایسه با نمونه­های روزهای سوم و ششم محلول­پاشی شده با آهن بطور معنی‌داری افزایش یافت. همچنین، میوه­های تیمار شده با آهن در روزهای سوم و ششم بررسی تفاوت معنی‌داری از نظر میزان فعالیت آنزیم PAL نسبت به شاهد نداشتند اما در روزهای نهم و دوازدهم آزمایش در مقایسه با شاهد، میزان فعالیت PAL در نمونه­های آهن بطور معنی‌داری افزایش نشان داد. هر چند که در نمونه­های شاهد نسبت به یکدیگر از نظر میزان فعالیت  PAL بین دو زمان بررسی در روزهای سوم و ششم تفاوت معنی‌داری یافت نشد ولی بین روزهای نهم و دوازدهم در مقایسه با یکدیگر و دیگر زمان­های بررسی در نمونه­های شاهد اختلاف معنی­دار بود (شکل الف- 4).

بر اساس تجزیه واریانس داده­ها اثر آهن بر میزان بیان ژن FaPAL در سطح احتمال پنج درصد (05/0 > p) و اثر زمان و برهمکنش بین آهن و زمان در سطح احتمال یک درصد (01/0 > p) معنی­دار بود. طبق نتایج مقایسه میانگین­ها، در میوه‌های تیمار شده با آهن نسبت به یکدیگر بین تمام زمان­های نمونه­برداری تفاوت معنی‌داری از نظر میزان بیان ژن FaPAL مشاهده شد. همچنین، میوه­های محلول­پاشی شده با آهن در مقایسه با نمونه­های شاهد از نظر میزان بیان ژن FaPAL در همه زمان‌ها بجز زمان اول (روز سوم) بررسی اختلاف معنی­داری داشتند. در نمونه­های شاهد نیز نسبت به یکدیگر بجز روز ششم با روز نهم بررسی، در بقیه زمان­ها اختلاف معنی­داری یافت شد. بیشترین میزان بیان ژن FaPAL مربوط به نمونه تیمار شده با آهن در نوبت چهارم و کمترین آن مربوط به نمونه شاهد در نوبت اول آزمایش بود بطوریکه با تاثیرگذاری آهن میزان بیان ژن FaPAL در میوه­های محلول­پاشی شده طی نمو میوه­ها بویژه در مرحله سوم نسبت به شاهد افزایش بیشتری نشان داد (شکل ب- 4).

 

شکل 4- تاثیر غلظت1400 میکرومول بر لیتر آهن (الف)  بر میزان فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز و (ب) بیان ژن FaPAL میوه توت‌فرنگی طی مراحل نموی. حروف متفاوت نشان دهنده اختلاف معنی­دار بین میانگین­ها در سطح احتمال پنج درصد آزمون دانکن می­باشد.

 

 

آنتوسیانین کل و ژن­های FaMYC1، FaMYB1، FaCHS: طبق یافته­های حاصل از تجزیه واریانس داده­ها مشخص گردید اثر آهن، زمان و برهمکنش بین آنها بر میزان آنتوسیانین کل در سطح احتمال یک درصد (01/0 > p) معنی‌دار شد. مقایسه میانگین داده­ها نشان داد، میزان آنتوسیانین کل تمامی نمونه­های محلول­پاشی شده با آهن در همه نوبت­های بررسی (روزهای سوم، ششم، نهم و دوازدهم) در مقایسه با یکدیگر اختلاف معنی­داری داشتند بطوریکه میزان آن در روز دوازدهم بررسی بطور معنی­داری بیشتر از روز نهم، در روز نهم بطور معنی‌داری بیشتر از روز ششم و در نهایت روز ششم بطور معنی­داری بیشتر از روز سوم بررسی بود. جالب توجه بود که میزان آنتوسیانین کل آهن و شاهد در روزهای نهم و دوازدهم آزمایش نسبت به روزهای سوم و ششم بررسی افزایش قابل ملاحظه­ای داشت. طبق نتایج، میزان آنتوسیانین کل در میوه­های تیمار شده با آهن در مقایسه با شاهد، فقط در روزهای نهم و دوازدهم بررسی تفاوت معنی­داری داشت ولی در روزهای سوم و ششم نمونه‌برداری اختلاف معنی‌داری مشاهده نگردید. در نمونه­های شاهد نیز از نظر میزان آنتوسیانین کل به غیر از روز سوم با روز ششم دوم در بقیه نوبت­های نمونه­برداری نسبت به یکدیگر اختلاف معنی­داری داشتند (شکل الف- 5).

نتایج تجزیه واریانس داده­ها نشان داد که اثر آهن و زمان آزمایش در سطح احتمال یک درصد  (01/0 > p) و اثر برهمکنش بین آهن و زمان نمونه­برداری در سطح احتمال پنج درصد  (05/0 > p) بر میزان بیان ژن FaMYC1 میوه توت‌فرنگی معنی‌دار بود. طبق مقایسه میانگین داده­ها، میزان بیان ژن FaMYC1 در طول زمان آزمایش در هر دو نمونه‌های آهن و شاهد کاهش یافت بطوریکه بیشترین و کمترین میزان بیان ژن FaMYC1 بترتیب در نوبت­های اول و چهارم (روزهای سوم و دوازدهم) بررسی مشاهده گردید. بر این اساس در میوه­های محلول­پاشی شده با آهن و شاهد در همه نوبت­های نمونه‌برداری (روزهای سوم، ششم، نهم و دوازدهم) در مقایسه با یکدیگر از نظر میزان بیان ژن FaMYC1  تفاوت معنی­داری داشتند. در نمونه­های تیمار شده با آهن نسبت به نمونه­های شاهد بجز نوبت اول (روز سوم) بررسی در بقیه نوبت­ها اختلاف معنی­داری وجود داشت (شکل ب- 5).

 

شکل 5- تاثیر غلظت1400 میکرومول بر لیتر آهن بر (الف) آنتوسیانین کل و بیان ژن­های FaMYC1 (ب)، FaMYB1  (ج) و FaCHS (د) میوه توت‌فرنگی طی مراحل نموی. حروف متفاوت نشان دهنده اختلاف معنی­دار بین میانگین­ها در سطح احتمال پنج درصد آزمون دانکن می­باشد.

 

 

طبق تجزیه واریانس داده­ها، اثر آهن و زمان نمونه­برداری بر میزان بیان ژن FaMYB1 در سطح احتمال یک درصد (01/0 > p) و اثر برهمکنش بین آنها در سطح احتمال پنج درصد (05/0 > p) معنی­دار بود. مقایسه میانگین داده­­ها نشان داد که میزان بیان ژن FaMYB1 در طول دوره رشد و نمو میوه توت­فرنگی همواره افزایش یافت. در میوه‌های تیمار شده با آهن نسبت به یکدیگر بجز نوبت سوم با چهارم (روزهای نهم و دوازدهم بررسی) در بقیه زمان­های آزمایش اختلاف معنی‌داری از نظر میزان بیان ژن FaMYB1 وجود داشت. همچنین، در نمونه­های محلول­پاشی شده با آهن در مقایسه با شاهد در همه نوبت­های نمونه‌برداری بجز مرحله چهارم (روز دوازدهم) بررسی تفاوت معنی­داری یافت شد. در نمونه­های شاهد نیز از نظر میزان بیان ژن FaMYB1 نسبت به یکدیگر فقط اختلاف بین روزهای سوم و ششم بررسی با روزهای نهم و دوازدهم معنی­داری شد (شکل ج- 5).

بر پایه نتایج تجزیه واریانس، اثر آهن بر میزان بیان ژن FaCHS در سطح احتمال پنج درصد (05/0 > p) و اثر زمان و برهمکنش بین آهن و زمان نمونه­برداری در سطح احتمال یک درصد (01/0 > p) در طول دوره رسیدن میوه توت­فرنگی معنی­دار شد. طبق یافته­های حاصل از مقایسه میانگین­ داده­ها مشخص گردید در نمونه­های تیمار شده با آهن در همه نوبت‌های بررسی (روزهای سوم، ششم، نهم و دوازدهم) نسبت به یکدیگر و در مقایسه با نمونه­های شاهد بجز نوبت اول (روز سوم) در بقیه نوبت­های بررسی از نظر میزان بیان ژن FaCHS اختلاف معنی­داری وجود داشت. در نمونه­های شاهد نیز در مقایسه با یکدیگر به غیر از نوبت اول با نوبت دوم نمونه‌برداری، در بقیه روزهای بررسی تفاوت معنی­داری از نظر میزان بیان ژن FaCHS مشاهده شد (شکل د- 5).

بحث و نتیجه­گیری

نقش آهن در رنگ­گیـری و رسیـدگی میوه توت­فرنگی:

آهن برای تولید پروتئین­هایی که پیش نیاز ساخت کلروفیل هستند، مورد نیاز بوده و کمبود آن باعث کاهش کلروفیل در گیاه می‌شود که این امر موجب کاهش فتوسنتز، مواد ساکارزی و رشد گیاه می­شود (1 و 34). طبق مطالعات، کاربرد آهن باعث افزایش رنگیزه‌های فتوسنتزی و بدنبال آن افزایش کربوهیدرات کل و تحریک انتقال کربوهیدرات­ها از برگ­های گیاه به میوه­ها می­شود که به این ترتیب به بهبود رشد و نمو میوه کمک می­کند (5). افزون بر این، محققان همبستگی مثبتی بین غلظت آهن و عملکرد گیاهان را کشف کردند؛ بدین صورت که در اثر مصرف آهن، مقدار کلروفیل­ها، فتوسنتز و رشد رویشی گیاه بیشتر شده و باعث افزایش سطح کربن­گیری و در نتیجه بیشتر شدن میزان ماده خشک تولیدی گیاه می­شود (1 و 7). در نتیجه تسریع رسیدگی میوه­ها با محلول‌پاشی آهن را می­توان بدلیل افزایش فتوسنتز و تغذیه بهتر میوه­ها بعنوان مهمترین مخازن جذب کربوهیدرات­ها دانست.

 اسید کل: شاخص مهمی در تعیین رسیدگی میوه می­باشد که میزان آن با رسیدن میوه کاهش می­یابد. در اکثر میوه­ها مطابق با نتایج بدست آمده از این تحقیق، مقدار اسیدهای آلی در مراحل اولیه رشد افزایش و سپس همزمان با رسیدن محصول بتدریج کاهش می­یابد. کاهش میزان اسید کل در طول دوره رسیدن محصول بمیزان TSS، سرعت تنفس و تجزیه شدن اسیدها ارتباط دارد (4). در توت­فرنگی اسید سیتریک، اسید غالب در مرحله قبل از رسیدن میوه بشمار می‌رود که همزمان با رسیدن میوه مقدار این اسید سریعاً کاهش یافته و در زمان برداشت بحداقل مقدار خود می‌رسد (13). طبق نتایج این پژوهش، کاربرد آهن باعث تسریع رسیدگی میوه توت‌فرنگی گردید و از آنجایی­که میزان اسید کل میوه همگام با رسیدن میوه کاهش می­یابد بنابراین، بنظر می­رسد دلیل اصلی کاهش اسید کل بویژه در میوه­های محلول­پاشی شده، تجزیه شدن زودتر آن باشد.

نقش ژن FaSUT1  در تولید ساکارز و رسیدگی میوه: میوه توت­فرنگی حاوی قندهایی مانند گلوکز، فروکتوز و ساکارز است که مقادیر این قندها به عواملی نظیر رقم، شرایط اقلیمی و تغذیه گیاه بستگی دارد (4). ساکارز رایج­ترین شکل کربوهیدرات­ها در بین مواد فتوسنتزی است که از محل تولید (برگ) بسمت مصرف (میوه) از طریق بافت آبکش منتقل می­شود. قبلا تصور عموم بر این بود که هورمون­ها از جمله آبسزیک اسید عامل اصلی رسیدن میوه هستند. اما امروزه کشف شده است که علی‌رغم نقش ساکارز در کیفیت میوه، این متابولیت می­تواند بعنوان پیام­رسان در تنظیم رسیدن میوه و برخی از فرآیندها نقش داشته باشد (13 و 35). بعنوان مثال، ساکاروز می­تواند بعنوان مولکول پیام‌رسان در میزان جذب عناصر ایفای نقش کند )12). علاوه بر این، گزارش شده است که ساکارز بیان برخی از  ژن­ها را کنترل می­کند (Teng et al., 2005). در تولید ساکارز پروتئین­های مختلفی دخالت دارند که ژن FaSUT1 بطور مستقیم نقش تولید آن را در میوه توت­فرنگی بر عهده دارد (26). پژوهشگران نشان دادند که با بیشتر شدن بیان ژن FaSUT1 علاوه بر افزایش میزان ساکارز، موجب تسریع رسیدن میوه توت‌فرنگی هم شده بود (26).

مطابق با این گزارش­، در مطالعه حاضر آهن علاوه بر افزایش چشمگیر بیان این ژن FaSUT1 در مرحله صورتی رنگ میوه، باعث تسریع رسیدن میوه­ها هم گردید. دلیل افزایش مواد ساکارزی در گیاهان در اثر محلول­پاشی آهن را می­توان به افزایش میزان سبزینه برگ نسبت داد (28). همچنین، تاثیر آهن در افزایش مقدار ساکارز  بدلیل نقش این عنصر در افزایش فتوسنتز است و از آنجایی­که یکی از تولیدات مهم در فتوسنتز،  قند می­باشد (15) در نتیجه افزایش فتوسنتز باعث افزایش ساکارز، تغذیه بهتر میوه­ها و در نهایت تسریع رسیدگی میوه توت­فرنگی می‌شود. این مطالعه نشان داد که ساکارز نقش مهمی در تنظیم بلوغ و رسیدن میوه توت­فرنگی ایفا می­کند.

الگوی بیان ژن FaPAL و تاثیر آن بر فعالیت آنزیم فنیل­آلانین­آمونیالیاز: همانطور که در شکل (1) مشاهده می‌شود رشد و نمو میوه توت­فرنگی رقم "کاماروسا" را می­توان به مراحل توت سبز، سفید، صورتی و قرمز تقسیم کرد. این مراحل نشان‌دهنده تغییرات در ساختار سبزینه­ها، تفاوت­ در مراحل نموی، سطح ترکیب­های فنولیکی و فعالیت آنزیم PAL است (50). آنزیم PAL بعنوان آنزیم کلیدی در متابولیسم فنیل پروپانوئید، تبدیل فنیل‌آلانین به ترانس سینامیک اسید را کاتالیز می‌نماید که اولین مرحله در ساخت فنیل پروپانوئیدها بوده و منجر به تولید متابولیت‌های ثانویه مانند فنل­ها، لیگنین­ها، آنتوسیانین­ها و فلاونوئیدها می‌گردد (9).

طبق بررسی پژوهشگران، میزان فعالیت آنزیم PAL به دلیل کم بودن سوبسترای اولیه مورد نیاز و تراکم بالای سبزینه­ها در مرحله سبز و سفید رنگی میوه توت‌فرنگی بسیار پایین است ولی همزمان با پیشرفت رشد، تجزیه شدن سبزینه­ها و قرمز شدن میوه افزایش می­یابد (11). در حقیقت بدلیل فعالیت پایین آنزیم PAL است که میزان فلاونوئید­ها و فنول­ها در مراحل اولیه رشد میوه کم می­باشد. فلاونوئید­ها و فنول­ها مسئول برخی از ویژگی­های حسی مرتبط با کیفیت میوه­ها نظیر طعم، رنگ و بو هستند (44) که بدنبال بیشتر شدن فعالیت آنزیم PAL میزان تولید این متابولیت­ها نیز افزایش می­یابد.­ در همین راستا ارتباط مستقیم و مثبت آنزیم  TPALدر تولید و انباشت فلاونوئیدها در پرتقال­خونی (38)، توت‌فرنگی (38) و بلوبری (52) تایید شده است.

علاوه بر این، محققان بیان کرده­اند که محلول­پاشی گیاهان توت­فرنگی با غلظت 10 میکرومولار آهن در طول فصل رشد موجب فعالیت بیشتر آنزیم  PALگردید (40). در انگور نیز تغذیه برگی با غلظت‌های 22/0 و 33/0 گرم در لیتر آهن منجر به افزایش فعالیت آنزیم  PALو بیشتر شدن میزان تجمع فلاونوئیدها نسبت به نمونه­های شاهد شد (43). که یافته­های این پژوهش نیز مطابق با آن نتایج بود. از آنجایی که آهن جزو ساختاری برخی از اجزای آنزیم­ها و زنجیرة انتقال الکترون در میتوکندری و کلروپلاست است، کمبود آن باعث اختلال در حالت عادی انتقال الکترون، عملکرد آنزیم­ها، فتوسنتز و در نهایت کاهش رشد می‌شود (10 و 34). در نتیجه مصرف آهن با افزایش میزان فتوسنتز و بهبود رشد گیاه سبب فراهم ساختن مواد اولیه آنزیم PAL و آنزیم­های مرتبط با ساخت ترکیب­های فلاونوئیدی میوه می­گردد.

افزون بر این، آنزیم PAL نه تنها در تولید آنتوسیانین‌ها و فلاونوئید­ها نقش کلیدی دارد بلکه در سیستم پیام­رسانی و فعال نمودن ژن­های دفاعی و عوامل رونویسی نیز پروتئین مهمی بشمار می­رود (50). گزارشات حاکی از آن است که افزایش بیان ژن FaPAL مبنای فعالیت آنزیم PAL می­باشد. به همین دلیل بیان پایین ژن FaPAL منجر به کاهش فعالیت آنزیم PAL و تولید فلاونوئیدها می‌گردد. بطور مثال، در گیاهان تراریخت شده توتون که بیان ژن PAL در آنها با دست­ورزی کم شده بود، میزان فلاونوئید و لیگنین کمتری در مقایسه با گیاهان شاهد داشتند (45). همچنین، نقش مثبت ژن FaPAL در تحریک و تولید متابولیت‌های ثانویه نظیر فلاونوئیدها و آنتوسیانین­ها در میوه توت­فرنگی مورد بررسی و تایید قرار گرفته است، به نحوی ­که با کاهش میزان بیان ژن FaPAL تولید فلاونوئیدها و آنتوسیانین­ها نیز کاهش یافت (26).

در پژوهش­های دیگری که طی دوره رسیدن میوه توت‌فرنگی انجام گرفت نتایج نشان داد با تغییر رنگ میوه و نزدیک شدن به مرحله رسیدگی، میزان فعالیت آنزیم PAL و بیان ژن FaPAL به طور معنی­داری افزایش یافت (18 و 51) که یافته‌های این تحقیق همسو با آن نتایج بود. در نتیجه می­توان این گونه بیان کرد که آنزیم  PAL در پدیدار شدن رنگ قرمز میوه هم نقش دارد. در اثبات این موضوع، محققان گزارش کردند که متوقف کردن فعالیت آنزیم PAL با یک ترکیب بازدارنده (L-α-aminooxy-ß phenylpropionic acid) طی مراحل نموی، موجب شد رنگ قرمز میوه توت­فرنگی پدیدار نشود (11). اما نکته حایز اهمیت این است که تنها تعداد بسیار محدودی از گزارشات در مورد تاثیر آهن بر بیان ژن  TPALوجود دارد. با این وجود محلول‌پاشی 23 میکرومولار آهن در انگور بیان ژن  VvPALرا در میوه­ها موقع برداشت افزایش داد (10). آنچه که در این پژوهش قابل توجه است، مشابه بودن الگوی بیان ژن FaPAL و فعالیت آنزیم PAL می‌باشد بطوریکه افزایش بیان ژن FaPAL، افزایش فعالیت آنزیم  PALرا در پی داشت. در نتیجه می­توان چنین اظهار نمود که آهن با تسریع و افزایش سوخت و ساز واکنش­های مربوط به رشد و فعالیت آنزیم­های رشدی و آنتی­اکسیدانی گیاهان، باعث افزایش بیان ژن FaPAL و فعالیت آنزیم فنیل­آلانین­آمونیالیاز طی مراحل نموی میوه توت­فرنگی شده است.

آنتوسیانین کل و میزان بیان ژن­های درگیر در مسیر بیوسنتز آن: شواهد روز افزونی مبنی بر تاثیرات مثبت فلاونوئیدها در سلامتی انسان وجود دارد که آنتوسیانین­ها یکی از مهمترین مشتقات این ترکیب­ها هستند. آنتوسیانین­ها ترکیب­هایی با فعالیت آنتی­اکسیدانی بالا هستند که کیفیت تغذیه­ای محصولات را افزایش می­دهند (2 و 30). به مانند فعالیت آنزیم PAL، میزان آنتوسیانین­ها نیز در ابتدای رشد و نمو میوه توت‌فرنگی خیلی کم است ولی همزمان با شروع رنگ­گیری و افزایش فعالیت آنزیم PAL، تجمع آنها افزایش پیدا می­کند (11 و 26). طبق شکل (6) تولید و انباشت آنتوسیانین­ها در میوه­ها و سبزی­ها بطور مستقیم توسط آنزیم فنیل‌آلانین‌آمونیالیاز صورت می­پذیرد. بیوسنتز آنتوسیانین­ها از طریق مسیر فلاونوئید است که با پیش ماده فنیل­آلانین شروع می­شود. آنتوسیانین تولید شده از مسیر فنیل پروپانوئید/ فلاونوئید مسئول رنگ­گیری میوه است که ژن‌های مختلفی در این مسیرها نقش دارند و هر ژن وظیفه خاصی بر عهده دارد (36 و 42 .(

پژوهشگران دریافتند تا زمانی که فعالیت آنزیم PAL شروع نشده است هیچ آنتوسیانینی در سیب (29) و انگور (27) ساخت و تجمع نمی­یابد. در واقع تولید آنتوسیانین­ها وابسته به فعالیت آنزیم PAL می‌باشد که میزان فعالیت این آنزیم در مراحل اولیه رشد میوه خیلی کم است ولی با رشد و نمو میوه رفته رفته بیشتر می­شود (42). افزون بر این، کاربرد برخی از مواد معدنی مثل آهن موجب بهبود تولید و انباشت آنتوسیانین­ها در میوه­های قرمز رنگ می­گردد. بعنوان نمونه، طی آزمایشی که در مورد تاثیر کمبود آهن بر روی توت‌فرنگی و پرتقال انجام گرفت، گزارش گردید که کمبود آهن باعث کاهش میزان آنتوسیانین‌ می­شود (41). در مقابل محلول­پاشی بوته­های انگور با غلظت­های­ 22/0 و 33/0 گرم در لیتر کلات آهن (Fe-EDDHA) (43) و توت‌فرنگی با غلظت 10 میکرومولار کلات آهن (Fe-EDTA) (40) در طول فصل رشد منجر به افزایش معنی‌داری آنتوسیانین­ کل میوه­های تیمار شده نسبت به شاهد شد. در تحقیق دیگری بیان شده است که تغذیه گیاهان توت‌فرنگی با آهن میزان آنتوسیانین کل بالایی را بهمراه داشت (Nestby et al.,2005). همچنین،Caramanico  و همکاران (2017) با بررسی اثر محلول‌پاشی غلظت‌های (صفر، 23، 46، 92 و 184) میکرومولار کلات آهن در انگور به این نتیجه رسیدند که غلظت 46 بیشترین تاثیر را در افزایش محتوای آنتوسیانین کل میوه­ها در زمان برداشت داشت که با نتایج حاصل از این پژوهش مطابقت دارد. از آنجایی که اثر آهن از طریق تأثیر و تنظیم فشـار اسمزی باعث انتقال بهتر عناصر به نقاط مختلف و رشد بهتر و سریع‌تر گیاه می‌شـود و سطح فعالیت آنزیم فنیل­آلانین­آمونیالیاز را بیشتر می­کند در نتیجه ساخت و محتوای آنتوسیانین­ها افزایش می­یابد (34).

با توجه به تأثیر مثبت آنتوسیانین­ها بر سلامت انسان و نیز بازار پسندی این نوع میوه­ها، بررسی مکانیزم­های مولکولی آن امروزه بسیار حائز اهمیت است. گیاهان دارای طیف وسیعی از ژن­های FaMYB1، FaCHS (chalcone synthase) و FaMYC1 می­باشند که نقش­های بسیار متنوعی در عملکرد گیاهان دارند. چندین مطالعه از نقش­های این عوامل رونویسی صورت گرفته است که مهمترین این عمل­ها شامل کنترل متابولیت­های ثانویه بویژه فلاونوئیدها و آنتوسیانین (Grotewold et al., 1994)، تنظیم اندام‌زایی سلول (39) و دخالت در مسیرهای انتقال پیام (49) می‌باشد. مشخص شده است که ژن­های FaMYB1، FaCHS و FaMYC1 از ژن­های کلیدی در تولید آنتوسیانین­ها بشمار می­روند (2، 16 و 19). مطالعات روز افزون سبب شناسایی این ژن­ها در مسیر ساخت آنتوسیانین گیاهانی مانند برنج (2) سیب (17 و 33)، انگور (51)، هلو، زردالو، بادام، آلو، گلابی (31) و توت­فرنگی شده است (26 و 50).

MYB یکی از بزرگترین و کلیدی­ترین خانواده عوامل رونویسی در گیاهان است که مطابق انتظار ژن  FaMYB1 به طور اختصاصی در تولید آنتوسیانین­ برنج (2) توت­فرنگی (50) و انگور (10) نقش دارد. این ژن با افزایش بیان ژن­های FaCHS و FaPAL موجب تولید این متابولیت ثانویه در توت­فرنگی می­شود (26 و 50). در ذرت نیز ژنMYB  بعنوان فعال کننده بیوسنتز فلاونوئیدها عمل می­کند (22).

ژنMYB  تنها ژن تولید کننده آنتوسیانین­ها نیست، FaMYC1 یکی دیگر از ژن­های دخیل در مسیر ساخت آنتوسیانین­ها می‌باشد. این ژن در تولید پرونوسیانیدین­ها نقش کلیدی دارد که به نوعی پیش ماده آنتوسیانین­ها بشمار می­روند. ژن FaMYC1 در ابتدای رشد و نمو میوه توت­فرنگی بمیزان زیادی بیان می­شود اما با شروع رنگ­گیری و افزایش میزان ساکارز میوه از تولیدش کاسته می­شود (26). در این تحقیق مصرف آهن باعث کاهش بیشتر بیان این ژن طی نمو میوه گردید، در مقابل با افزایش بیان ژن‌های مورد مطالعه (FaMYB1، FaCHS و FaPAL)، تولید آنتوسیانین­ها را سرعت بخشید. علاوه بر این، محققان با بررسی اثر محلول‌پاشی غلظت‌های 184 میکرومولار کلات آهن در انگور به این نتیجه رسیدند که غلظت 184 میکرومولار بیشترین تاثیر را در افزایش بیان ژن VvCHS در میوه­ها در زمان برداشت داشت (43). ژن CHS (چالکون سنتتاز) باعث تبدیل ترکیب چالکون به فلاوانون و لوکوسیانیدین می­شود. آنچه که نتایج مطالعه حاضر نشان می­دهد این است که با نزدیک شدن به مرحله رسیدگی میوه، میزان بیشتری از پرونوسیانیدین­ها به آنتوسیانین­ها تبدیل می­شود. به همین علت تجمع آنتوسیانین­ها و ترکیب­های موثر در رنگ میوه در مراحل نزدیک به رسیدن توت­فرنگی افزایش می­یابد (50). در سال­های اخیر نقش و عملکرد ژن­های تنظیم کننده تولید آنتوسیانین­ها در برخی گیاهان به صورت اختصاصی مورد بررسی قرار گرفته است. بطور مثال، در گوجه­فرنگی و توت­فرنگی خاموش کردن ژن­های SiCHS و (chalcone isomerase)  SiCHIبطور قابل توجهی موجب متوقف شدن ساخت آنتوسیانین­ها شد (25). در کل می­توان چنین بیان نمود که کاربرد برگی آهن با افزایش الگوی بیان ژن­های دخیل در بیوسنتز آنتوسیانین­ها، ساخت و انباشت این ترکیب ارزشمند را بهبود بخشید ولی هنوز ژن­های زیادی در مسیر تولید آنتوسیانین بررسی نشده است، لذا تحقیقات آزمایشگاهی بیشتری در این زمینه مورد نیاز است.

بطور خلاصه (شکل 7) بررسی ژن­های مورد مطالعه نشان می دهد که: (1) بیان ژن FaMYC1  که مسئول تولید پروآنتوسیانین‌ها است در مرحله اول رشد میوه زیاد است (یعنی در مرحله سبز میوه). (2) با رنگ­گیری میوه میزان بیان ژن­های FaSUT1، FaMYB1، FaCHS و FaPAL  افزایش یافت که سبب تولید بیشتر ساکارز، آنتوسیانین و دیگر ترکیبات فلاونوئیدی گردید (یعنی در مرحله انتقال از سفید به صورتی). (3) و در نهایت واکنش­های متقابل این ژن­ها منجر به تسریع رسیدن میوه منجر شد.

شکل 7- تاثیر ژن­های مختلف طی مراحل نموی میوه توت­فرنگی

 

نتیجه­ گیری کلی: اعمال آهن و تاثیر آن بر خصوصیات و فعالیت ژن­های رشد و نموی میوه توت­فرنگی به غلظت و روش کاربرد آن بستگی دارد. طبق نتایج تحقیق، محلول­پاشی کلات آهن با غلظت 1400 میکرومول بر لیتر موجب تسریع رسیدگی میوه گردید. علاوه بر این، بر اسیدیته کل، آنتوسیانین کل، فعالیت آنزیم فنیل­آلانین­آمونیالیاز و بیان ژن­های FaSUT1، FaMYC1، FaMYB1، FaCHS و FaPAL تاثیر معنی­دار ولی بر pH عصاره میوه­ها تاثیر معنی­داری نداشت. مصرف آهن باعث افزایش 6/19 درصدی آنتوسیانین کل، 2/28 درصدی فعالیت آنزیم PAL و کاهش 7/9 درصدی اسیدیته کل در مقایسه با شاهد شد. بنابراین، با انتخاب غلظت بهینه آهن، می‌توان علاوه بـر تسریع رسیدگی میوه و امکان عرضه زودتر محصول به بازار، بهبـود ارزش تغذیـه­ای میوه توت­فرنگی را نیز بهمراه داشت.

  • 1- اصل محمدی، ز.، محمدخانی، ن.، و ثروتی، م. 1399. اثر محلول‌پاشی آهن و روی بر برخی صفات بیوشیمیایی گیاه آویشن باغی (.Thymus vulgaris L) تحت کمبود نیتروژن. مجله پژوهش­های گیاهی. انتشار بصورت آنلاین از 25 خرداد 1399.

    2- حقی، ر.، فاضلی، آ.، احمدی خواه، ا.، و شریعتی، و. 1400. شناسایی ژنهای دخیل در تجمع رنگیزه­های آنتوسیانین و پروآنتوسیانیدین در بافتهای مختلف 282 رقم برنج با استفاده از نقشه­یابی ارتباطی در مقیاس ژنوم. مجله پژوهشهای گیاهی، 34 (2): 384-369.

    3- رضائی، س.، امیری، م. ا.، بهاری، ع.، رضوی، ف.، و سلیمانی اقدم، م.، 1398. تاثیر کلات آهن بر فعالیت آنزیم فنیل­آلانین­آمونیالیاز و خواص آنتی‌اکسیدانی میوه توت­فرنگی رقم کاماروسا طی مراحل نموی، تغذیه گیاهان باغی، دوره 2، شماره 2، صص 16-32.

    4- طباطبائی، س. ج.، 1393. اصول تغذیه معدنی گیاهان. تبریز: انتشارات دانشگاه تبریز.

     

    • Alvares-Fernaandez, A., Paniagua, P., Abadia, J., and Abadia, A. 2003. Effects of Fe deficiency chlorosis on yield and quality in peach (Prunus persica Batsch). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51: 5738-5744.
    • Alvarez-Fernandez, A., Carlos Melgar, J., Abadia, J., and Abadi, A. 2011. Effects of moderate and severe iron deficiency chlorosis on fruit yield, appearance and composition in pear (Pyrus communis) and peach (Prunus persica (L.) Batsch). Enviromental and Fxperimental Botany. 71: 280-286.
    • Amaliotis, D., Velemis, D., Bladenopoulou, S. and Karapetsas, N. 2002. Leaf nutrient levels of strawberries (cv.Tudla) in relation to crop yield. Acta Horticulturae. 567: 447-450.
    • Latimer, G.E. and Horwitz, W. 2012. Official methods of analysis. Association of Official Analytical Chemists, International, (19 th ed.) Canada.
    • Bagal, U.R., Leebens mack, H., Walter, W., and Dean, F. 2012. The phenylalanine ammonia lyase (PAL) gene family shows a gymnosperm specific lineage. BMC Genomics. 13(3): 1471-2164.
    • Caramanico, L., Rustioni, L. and De-Lorenzis, G. 2017. Iron deficiency stimulates anthocyanin accumulation in grapevine apical leaves. Plant physiology and biochemity. 119: 286-293.
    • Cheng, G.W. and Breen, P.J. 1991. Activity of phenylalanine ammonia-lyase (PAL) and concentrations of anthocyanins and phenolics in developing strawberry fruit. Journal of the American Society for Horticultural Science.116(5): 865-869.
    • Chiou, T.J., and Bush, D.R. 1998. Sucrose is a signal molecule in assimilate partitioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95: 4784-4788.
    • Dalchau, N., BaeK, S.J., Briggs, H.M., Robertson, F.C., Dodd, A.N., Gardner, M.J., Stancombe, M.A., Haydon, M.J., Stan, G.B., and Gonc-alves, J.M. 2011. The circadian oscillator gene GIGANTEA mediates a long-term response of the Arabidopsis thaliana circadian clock to sucrose. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108: 5104-5109.
    • Daminato M, Guzzo F, Casadoro G. 2013. A SHATTERPROOF-like gene controls ripening in non-climacteric strawberries, and auxin and abscisic acid antagonistically affect its expression. Journal of Experimental Botany. 64: 3775- 3786.
    • Davarpanah, S., Akbari, M., Askari, M.A., Babalar, M., and Naddaf, M.E. 2013. Effect of iron foliar application (Fe-EDDHA) on quantitative and qualitative characteristics of pomegranate CV. "Malas-e-Saveh". World of Sciences Journal. 179-187.
    • Du, H., Zhang, L., Liu, L., Tang, F., Yang, W.J., Wu, Y.M., Huang, Y.B., and Tang, Y.X. 2009.  Biochemical and molecular characterization of plant MYB transcription factor family. Biochemistry. 74: 1-11.
    • Espley, R.V., Hellens, R.P., Putterill, J., Stevenson, D.E., Kutty-Amma, S., and Allan, A. C. 2007. Red colouration in apple fruit is due to the activity of the MYB transcription factor MdMYB10. The Plant Journal. 49: 414-427.
    • Galli, V., Borowski, J.M., Perin, E.C., da Silva-Messias, R., Labonde, J., dos Santos Pereira, I., dos Anjos Silva, S.D. and Rombaldi, C.V. 2015. Validation of reference genes for accurate normalization of gene expression for real time-quantitative PCR in strawberry fruits using different cultivars and osmotic stresses. Gene. 554(2): 205-214.
    • Gantet, P., and Memelink, J. 2002. Transcription factors: tools to engineer the production of pharmacologically active plant metabolites. Trends in Pharmacological Sciences. 23: 563- 569.
    • Giampieri, F., Tulipani, S., Alvarez-Suarez, J.M., Quiles. J., Mezzetti, L.B., and Battino, M. 2012. The
      strawberry: composition, nutritional quality and impact on human health. Nutrition. 28: 9-19.
    • Giusti, M.M., and Wrolstad, R.E. 2001. Characterization and measurement of anthocyanin by UV-visible spectroscopy. P: 1-13. In wrolstad RE and Schwartz SJ (Ed) Current Protocols in Food Analytical Chemistry. John Wiley and Sons, New York.
    • Gonda, T. 1998. The MYB on coprotein. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 30: 547-551.
    • Grotewold, E., Drummond, B.J., Bowen, B., and Peterson, T. 1994. The MYB-homologous P gene controls phlobaphene pigmentation in maize floral organs by directly activating a flavonoid biosynthetic gene subset. Plant Cell. 76: 543-553.
    • Hamouda, H.A., El-Dahshouri, M.F., Hafez, O.M., and Zahran, N.G. 2015. Response of Le conte pear performance, chlorophyll content and active iron to foliar application of different iron sources under the newly reclaimed soil conditions. International Journal of Chemistry Technology Research. 8(4):1446-1453.
    • Jia, H., Jiu, S., Zhang, C., Wang, C., Tariq, P., Liu, Z., Wang, B., Cui, L. and Fang, J. 2016. Abscisic acid and sucrose regulate tomato and strawberry fruit ripening through the abscisic acid‐stress‐ripening transcription factor. Plant biotechnology journal. 14(10): 2045-2065.
    • Jia, H., Wang, Y., Sun, M., Li, B., Han, Y., Zhao, Y., Li, X., Ding, N., Li, C., and Ji, W. 2013. Sucrose functions as a signal involved in the regulation of strawberry fruit development and ripening. New Phytologist. 198: 453–465.
    • Kataoka, I., Kubo, A., Sugiura, Y., and Tomana. T. 1983. Changes in L-phenylalanine ammonia-lyase activity and anthocyanin synthesis during berry ripening of three grape cultivars. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science. 52: 273-279.
    • Kazemi, M. 2013. Effects of Zn, Fe and their Combination Treatments on the growth and yield of tomato.
      Bulletin of Environment, Pharmacology and Life Sciences      . 3(1): 109-114.
    • Kubo, Y., Taira, S., and Ishio. S. 1988. Color development of 4 apple cultivars grown in the southwest of Japan, with special reference to fruit bagging (in Japanese). Journal of the Japanese Society for Horticultural Science. 57: 191-199.
    • Landi, L., Feliziani, E. and Romanazzi, G., 2014. Expression of defense genes in strawberry fruits treated with different resistance inducers. Journal of agricultural and food chemistry. 62: 3047-3056.
    • Li, D., Li, L., Luo, Z., Mou, W., Mao, L. and Ying, T. 2015. Comparative transcriptome analysis reveals the influence of abscisic acid on the metabolism of pigments, ascorbic acid and folic acid during strawberry fruit ripening. PLoS One. 10(6): 137-149.
    • Lin-Wa, K., Bolitho, K., Grafton, K., Kortstee, A., and Karunairetnam, S. 2010. An R2R3 MYB transcription factor associated with regulation of the anthocyanin biosynthetic pathway in Rosaceae. BMC Plant Biology. 10:3-17.
    • Mahmoudi, E., Soltani, M.B., Yadollahi A., and Hosseini, E. 2012. Independence of color intensity variation in red flesh apples from the number of repeat units in promoter region of the MdMYB10 gene as an allele to MdMYB1 and MdMYBA. Iranian Journal of Biotechnology. 10: 153-160.
    • Marschner, H., 2011. Mineral nutrition of higher plants. Academic press. New York, 889 p.
    • Martınez-Noel, G.M., Tognetti, J.A., Salerno, G.L., Wiemken, A., and Pontis, H.G. 2009. Protein phosphatase activity and sucrose-mediated induction of fructan synthesis in wheat. 230: 1071–1079.
    • Medina-Puche, L., Cumplido-Laso, G., Amil-Ruiz, F., Hoffmann, T., Ring, L., Rodrıguez-Franco, A., Caballero, J., Schwab, W., Munoz-Blanco, J., and Blanco-Portales, R. 2014. MYB10 plays a major role in the regulation of flavonoid/ phenylpropanoid metabolism during ripening of Fragaria×ananassa fruits. Journal of Experimental Botany. 65: 401-417.
    • Nestby, R., Lieten, F., Pivot, D., Lacroix, C.R. and Tagliavini, M. 2005. Influence of mineral nutrients on strawberry fruit quality and their accumulation in plant organs: a review. International Journal of Fruit Science. 5(1): 139-156.
    • Olsson, M.E., Ekvall, J.M., Gustavsson, K., Nilsson, J., Pillai, D., Sjoholm, I., Svensson, U., Akesson, B., and Nyman, M. 2004. Antioxidants, low molecular weight carbohydrates, and total antioxidant capacity in strawberry (Fragaria x ananassa): effects of cultivar, ripening, and storage. Agriculture Food Chemistry. 52: 2490-2498.
    • Oppenheimer, D.G., Herman, P. L., Sivakumaran, S., Esch, J., and Marks, M.D. 1991. A myb gene required for leaf trichome differentiation in Arabidopsis is expressed in stipules. Plant Physislogy. 67: 483-493.
    • Pestana, M., P.J. Correia, T. Saavedra, F. Gama and A. Abadia. 2012. Amarilis de Varennes development and recovery of iron deficiency by iron resupply to roots or leaves of strawberry plants. Plant Physiology. 53: 1-5.
    • Pestana, M., Varennes, A.D., Miguel, M.G. and Correia, P.J. 2010. Consequences of iron deficiency on fruit quality in citrus and stawberry. Sapientia-Universidade do Algarve. 25: 193-201.
    • Pestana, M., Varennes, A.D., Miguel, M.G., and Correia, P.J. 2010. Consequences of iron deficiency on fruit quality in citrus and stawberry. Environmentally friendly and safe technologies for quality of fruit and vegetables. 90-94.
    • Schaart, J., Dubos, C., Romero-de la Fuente, I.V. Houwelingen, A., De Vos, R., Jonker, H., Xu, W., Routaboul, M., Lepiniec, L., and Bovy, A. 2013. Identification and characterization of MYB-bHLH-WD40 regulatory complexes controlling proanthocyanidin biosynthesis in strawberry (Fragaria×ananassa) fruits. New Phytologist. 197: 454–467.
    • Shi, P., Song, C., Chen, H., Duan, B., Zhang, Z. and Meng, J. 2018. Foliar applications of iron promote flavonoids accumulation in grape berry of Vitis vinifera cv. Merlot grown in the iron deficiency soil.Food chemistry. 253: 164-170.
    • Shoji, T. 2007. Polyphenols as natural food pigments: changes during food processing. American Journal of Food Technology. 2: 570-581.
    • Stotz, H.U., Thomson, J.G., Wang, Y. 2009. Plant defensins Defense, development and application. Plant Signaling and Behavior. 4: 1010-1012.
    • Taiz, L., and Zeiger, E. 2006. Secondary metabolites and plant defense. Plant physiology. 4: 315-344.
    • Teng, S., Keurentjes, J., Bentsink, L., Koornneef, M., and Smeekens, S. 2005. Sucrosespecific induction of anthocyanin biosynthesis in Arabidopsis requires the MYB75/PAP1 gene. Plant Physiology. 139: 1840-1852.
    • Terry, N. 1980. Limiting factors in photosynthesis. Plant Physiol. 65: 114–120.
    • Urao, T., Yamaguchi-Shinozaki, K., Urao, S., and Shinozaki, K. 1993. An Arabidopsis myb homolog is induced by dehydration stress and its gene product binds to the conserved MYB recognition sequence. Plant Cell. 5: 1529-1539.
    • Vallarino, J.G., Osorio, S., Bombarely, A., Casañal, A., Cruz‐Rus, E., Sánchez‐Sevilla, J.F., Amaya, I., Giavalisco, P., Fernie, A.R., Botella, M.A. and Valpuesta, V., 2015. Central role of Fa GAMYB in the transition of the strawberry receptacle from development to ripening. New Phytologist. 208(2).482-496.
    • Walker, A.R., Lee, E., Bogs, J., McDavid, D.A.J., Thomas, M.R., and Robi, S.P. 2007. White grapes arose through the mutation of two similar and adjacent regulatory genes. The Plant Journal. 49: 772-785.
    • Wang, K., Jin, P., Cao, S., Shang, H., Yang, Z., and Zheng, Y. 2009. Methyl jasmonate reduces decay and enhances antioxidant capacity in chines bay berries. Journal Agricultural and Food Chemistry. 57: 5809-5815.
    • Zucker, M., 1968. Sequential induction of phenylalanine ammonia-lyase and a lyase-inactivating system in potato tuber disks. Plant Physiology. 43: 365-374.
مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)
دوره 35، شماره 4
آبان 1401
صفحه 745-762
  • تاریخ دریافت: 02 آذر 1399
  • تاریخ بازنگری: 05 فروردین 1400
  • تاریخ پذیرش: 10 مرداد 1400