بررسی ساختار و وقایع تکوینی اندام‌های زایشی و دانه در گونه Onobrychis viciifolia

نیره اولنج^*، نیره تنعمی و مریم کولیوند

ایران، همدان، دانشگاه ملایر، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 4/9/99                  تاریخ پذیرش: 25/10/99

چکیده

ساختار و وقایع تکوینی اندام‌های زایشی و دانه در گونه Onobrychis viciifolia Scop. (Fabaceae)، برای اولین بار توسط میکروسکوپ نوری و با استفاده از فنون مختلف رنگ­آمیزی مورد بررسی قرار گرفت. مادگی پایک‌دار این گیاه دارای کرک‌های بلند و یک تخمک است. تخمک بالغ خمیده، پرخورش و دو پوششی است و دارای سفت زیگزاگی می‌باشد. میوز مگاسپوروسیت به تشکیل یک تتراد T شکل می‌انجامد. درOnobrychis viciifolia  کیسه‌رویانی از نوع پلی­گونوم است. هسته­های­قطبی در نزدیکی دستگاه تخم‌زا هستند. تلفیق آنها سریع و قبل از لقاح است. بافت آندوسپرم دانه در ابتدا حالت سنوسیتیک دارد. پوسته دانه شامل لایه کوتیکول، ماکرواسکلرید و استئواسکلرید ضخیم است که در زیر آن لایه پارانشیمی با تجمع نشاسته بالا قرار دارد. در ناف دانه، لایه نردبانی دو‌لایه، اثر تراکئید و پارانشیم زیر نافی دیده می‌شود. تکوین بساک زمانی که گل‌ها خیلی کوچک هستند آغاز می‌شود.‌ بساک‌ها چهار کیسه گرده‌ای هستند و تکوین دیواره از نوع دولپه ای می باشند که متشکل از چهار لایه شامل: اپیدرم، لایه مکانیکی، یک لایه میانی و تاپی ترشحی است. تکوین گرده­ها در کیسه­های گرده یک بساک همزمان است. دانه­های گرده بالغ بیضی شکل و دو سلولی هستند .در زمان شکوفایی بساک ضخامت فیبری لایه مکانیکی افزایش می‍یابد.

واژه­های کلیدی: تخمک، کیسه‌رویانی، مگاسپوروسیت، بساک، Onobrychis viciifolia

* نویسنده مسئول، تلفن:    08132355338 ، پست الکترونیکی: n.olanj60@gmail.com

مقدمه

گونه viciifolia Onobrychis چند ساله با ساقه­های متعدد، سبز رنگ، ضخیم و بلند، با ارتفاع 100 تا 160 سانتی­متر است. برگ­ها مرکب، بصورت ساقه­ای، دارای دمبرگ خیلی کوتاه و تقریبا بدون کرک هستند، برگ­های پایینی دارای دمبرگ بلند با 8-6 جفت برگچه، به شکل مستطیلی یا تخم ­مرغی تا بیضوی می­باشند. گل­آذین خوشه، کرک­دار و دارای براکته
 سر نیزه ای - درفشی به طول 3 میلی­متر است. کاسبرگ به طول 6-5 میلی­متر با دندانه­های خطی تا درفشی، لوله کاسه 2 تا 5/2 برابر بلندتر از دندانه­ها است. جام گل صورتی رنگ، درفش تقریبا هم اندازه با ناو، لگوم 7-5 میلی متر، تقریبا گرد و کروی با کرک های کوتاه است (38).

در پژوهش حاضر بمنظور بررسی دقیق­تر ویژگی­ها و مراحل رویان شناسی این گیاه، ساختار تشریحی مادگی، پرچم، دانه و همچنین مراحل تکوینی این اندامها در گونه مورد نظر به تفصیل توسط میکروسکوپ نوری و برخی معرف­های اختصاصی مورد بررسی قرارگرفت. از اهداف این بررسی می­توان‌ به مطالعه عمیق­تر صفات و مراحل تکوینی این گیاه و گسترش شناخت ما از ویژگی­های رویان­شناسی تیره مورد نظر اشاره نمود. علاوه بر آن، مقایسه ویژگی­ها و مراحل متعدد و با ارزش رویان­شناسی از این گیاه، می­تواند در بررسی­های تبار شناختی تیره پروانه­آسایان مورد استفاده قرار گیرد.

مواد و روشها

گیاه O. viciifolia از رویشگاه­های طبیعی استان همدان (شهرستان ملایر، جاده ملایر-اراک، نرسیده به روستای میشن، ارتفاع 1893 متر) از اواخر اردیبهشت تا اواخر خرداد ماه سال 96 جمع آوری و در هرباریوم دانشگاه ملایر نگهداری شد.

بمنظور مطالعات میکروسکوپ نوری، جوانه­های کوچک، گل­ها و دانه­ها در مراحل مختلف تکوینی، پس از تثبیت در FAA70 (فرمالین، استیک اسید و اتانول) و شستشو با آب جاری، در الکل 70 درصد ذخیره­سازی شدند. بافت­های قالب­گیری شده در پارافین، توسط میکروتوم دستی (دید سبز،Semi-automatic، مدل: DS 9209، ایران) با ضخامت 6 میکرومتر برش­گیری شدند. پس از مراحل پارافین­زدایی، رنگ­آمیزی با روش مضاعف هماتوکسیلین-ائوزین صورت گرفت. برش­های متعددی برای هر مرحله رویان­شناختی به کمک میکروسکوپ نوری Hund wetzlar دارای دوربین دیجیتال در بزرگنمایی­های مختلف عکس­برداری شد.

بمنظور بررسی‌های دقیق‌تر از تکوین مادگی و دانه این گیاه که دارای ساختار ویژه­ای می‌باشند، برش­های دستی نیز تهیه شد که توسط رنگ­های مختلفی نظیر لوگول، استوکارمن و متیلن بلو رنگ­آمیزی شدند.

نتایج

تکوین مادگی، تخمک و دانه در گیاه O. viciifolia: گیاه O. viciifolia، گیاهی علفی و یک ساله با گل­آذین خوشه­ای است. در این گیاه گل‌ کوچک، دوجنسی، پروانه­آسا و به رنگ صورتی است (شکل A1). کاسه زنگ‌مانند گل از پنج کاسبرگ پیوسته تشکیل شده است که در مراحل اولیه نمو تمام اجزای گل را پوشش می‌دهد. جام گل دارای پنج گلبرگ است: یک گلبرگ درفش، دو گلبرگ بال، دو گلبرگ ناو. درفش حاشیه­های توسعه یافته­ای دارد و همه اجزای گل را در بر­می­گیرد. در این گیاه گل‌ دارای تخمدان فوقانی است (شکل B1). یک دانه کلیوی شکل درون میوه O. viciifolia که بصورت نیام ناشکوفا با تزئینات مشبک است، وجود دارد (شکل ‌C1).

شکل 1- فرم رویشی، گل، میوه و دانه گیاه در O. viciifolia.A  . گیاه اسپرس با فرم رویشی علفی و گل آذین خوشه، در این گیاه گل‌ کوچک، دوجنسی، پروانه­آسا و به رنگ صورتی است. B- مراحل تکوین گل و کاسه دندانه­دار که در مراحل اولیه نمو، اجزای گل را می­پوشاند. C- نیام ناشکوفا با تزئینات مشبک و دارای یک دانه کلیوی شکل (▲).

در گل­آذین خوشه این گیاه اختلاف زمانی در تشکیل گل‌ها کاملا بوضوح دیده می‌شود (شکل A2). در داخل یک گل منفرد، پریموردیوم بساک­ها بسیار سریع‌تر از پریموردیوم تخمک نمو می­یابد و زودرس هستند (شکل B2). همان‌گونه که در تصاویر متعددی از این گیاه به چشم می‌خورد، مادگی تک برچه است که هر برچه دارای یک تخمک می­باشد. تخمک‌ در جداره حفره تخمدان قرار دارند. پریموردیوم تخمک، توده کوچکی از یاخته است که توسط یک لایه اپیدرم احاطه شده است و از همان مراحل ابتدایی خمیدگی پیدا می‌کند (شکل ­های B,C2). بتدریج در بین سلول‌های خورش، سلول مادر مگاسپور (مگاسپوروسیت) در پریموردیوم تخمک تمایز می‌یابد که با حجم زیاد و هسته درشت خود از سایر یاخته­ها قابل تشخیص است. در مراحل ابتدایی نمو پوسته­ها از هم فاصله دارند و پوسته بیرونی رشد سریع‌تری نسبت به پوسته درونی دارد (شکلD2). مگاسپوروسیت با دو میوز متوالی تتراد را بوجود می آورد. آرایش تترادی در این گونه از نوع T شکل است. در این نمونه تخمک از نوع دو‌پوسته‌ای است، در بخش‌های پایینی، پوسته درونی از دو لایه تشکیل شده است اما پوسته بیرونی متشکل از چندین لایه سلول ‌می‌باشد. هم‌زمان باتشکیل تتراد پوسته­های تخمک بهم نزدیک شده و تخمک را در بر می­گیرند (شکل­های E,F2).

شکل 2- مراحل تکوین مادگی O. viciifolia توسط میکروسکوپ نوری. A- مراحل اولیه تکوین تخمدان و بساک و اختلاف زمانی تشکیل گل‌ها در گل آذین خوشه (▲). B- تکوین بساک­ها (▲) بسیار سریع‌تر از تخمک است. C- آغاز خمیدگی تخمک از ابتدایی‌ترین مراحل نمو (▲). D- سلول مگاسپوروسیت با هسته درشت (▲). E- لایه­بندی پوسته­ها شامل لایه درونی (ii) و بیرونی (oi) در طی تکوین تخمک، پوسته بیرونی و درونی بهم می‌رسند. F- تشکیل تتراد T شکل(▲). ii: پوسته درونی؛ :oiپوسته بیرونی.

در گیاه مورد مطالعه تخمک از نوع پرخورش و واژگون است و سفت از نوع زیگزاگی می‌باشد. با تحلیل رفتن سه سلول از مجموعه سلول­های تترادی و با چند میتوز پی­در­پی، سلول­های باقی مانده، کیسه‌رویانی اولیه را تشکیل می­دهند. کیسه‌رویانی از نوع پلی­گونوم (هشت هسته­ای) می­باشد (شکل‌های A-C3) که در آن سه سلول آنتی پود در سمت شالازی و مجموعه دستگاه تخم‌زا در قطب سفتی قرار گرفته‌اند (شکل D3).

 در مراحل اولیه نمو، کیسه‌رویانی بیضی­شکل است اما رفته رفته با رشد و توسعه آن، در طی بلوغ گلابی شکل می‌شود. سلول‌های خورش نیز که در ابتدا تمام فضای تخمک را پر کرده‌اند، پس از توسعه کیسه رویانی، از سمت سفت، تحلیل رفته و به مصرف اجزای آن می‌رسند (شکل‌های A-E3). در گونه مورد مطالعه شکل مادگی کشیده و روی سطح آن مملو از کرک‌های بلند و انبوه است (شکل‌های E, F, K3).

یکی از ویژگی‌های کیسه‌رویانی این گیاه این است که هسته­های دوتایی به سرعت و قبل از لقاح با یکدیگر تلفیق می‌شوند. این دو هسته در ابتدا در نزدیکی دستگاه تخم‌زا‌ هستند (شکل C3) اما رفته رفته از آن فاصله می‌گیرند (شکل‌های F, G3). بعد از تلفیق، در هسته­های دوتایی کشیدگی سیتوپلاسمی رخ می‌دهد (شکل‌های ‌F-H3) که سبب می‌شود از یک طرف با دستگاه تخم­زا و از طرف دیگر با سایر اجزا درون کیسه­رویانی ارتباط برقرار کنند (شکل‌های F-I3).

دستگاه تخم­زا که در قطب سفتی قرار دارد، شامل یک سلول میانی به نام تخم­زا و دو سلول کناری به نام سینرژید است که تفاوت این سلول­ها در قطبیت آنها است. قطبیت سلول­ها با موقعیت هسته و واکوئل مرکزی بزرگ مشخص می شود (شکل‌های J-L3). در تمامی مراحل رویانی بافت آندوسپرم، به چشم می خورد. این بافت ارتباطات گسترده‌ای با سایر سلول‌های کیسه‌رویانی دارند (شکل H3). پس از لقاح سلول تخم تشکیل می‌شود. سلول تخم و کشیدگی سیتوپلاسمی اطراف آن بخش اعظمی از منطقه سفت را به خود اختصاص داده است که این کشیدگی‌های سیتوپلاسمی در سمت سفتی به صورت برجستگی‌های انگشت مانندی به چشم می‌خورد (شکل‌های K, L3).

در برش طولی و عرضی کیسه‌رویانی، سلول­های اندوتلیوم بوضوح قابل مشاهده هستند. لایه اندوتلیوم از درونی‌ترین لایه پوسته درونی تشکیل می‌شود. سلول‌های این لایه بصورت شعاعی امتداد یافته و دارای هسته کاملا واضح و سیتوپلاسمی متراکم هستند که محدوده کیسه رویانی را مشخص می‌کنند (شکل‌های A4 L,3).

شکل 3- مراحل تکوین تخمک جوان و بالغ O.viciifolia توسط میکروسکوپ نوری. A- تخمک پرخورش(▲) با سفت زیگزاگی (↑). B- در مراحل اولیه تکوین کیسه‌رویانی کوچک است (▲). C- سلول تخم‌زا، سینرژید‌ها و هسته‌های قطبی در نزدیکی دستگاه تخم‌زا (▲). D- دوسلول آنتی پود (▲▲) به همراه سلول تخم‌زا (↑). E- توسعه گلابی شکل کیسه‌رویانی در مراحل تکوینی بعدی (رنگ آمیزی مضاعف استوکارمن و متیلن بلو). F وG - تلفیق سریع هسته­های دوتایی(▲)، سطح مادگی دارای کرک (↑).H - کشیدگی سیتوپلاسمی (▲) هسته های دوتایی به سمت
آنتی­پود، ارتباط گسترده بافت آندوسپرم با سایر سلول­های کیسه رویانی (↑). I- هسته دوتایی بعد از تلفیق(▲). J- سلول تخم­زا (▲) و یکی از سینرژیدها (↑). L و K- سلول تخم (▲) و کشیدگی سیتوپلاسمی اطراف آن، بخش اعظمی از منطقه سفت را به خود اختصاص داده است که این کشیدگی‌های سیتوپلاسمی در سمت سفتی بصورت برجستگی‌های انگشت مانندی به چشم می‌خورد، کرک­های سطح مادگی (↑). لایه اندوتلیوم (en) کاملا مشخص است. :en اندوتلیوم.

در زمان لقاح، دو اسپرم از طریق لوله گرده به کیسه‌رویانی وارد می‌شوند که یکی از آنها با سلول تخم­زا و دیگری با سلول مرکزی که از الحاق زودهنگام هسته­های دوتایی حاصل شده است، ادغام می‌شود. نتیجه لقاح اول، تشکیل سلول تخم (زیگوت) در کیسه­رویانی بالغ است که طی مراحلی به پیش رویان تبدیل می­شود (شکل‌های C, D4). نتیجه لقاح سلول مرکزی با اسپرم دوم سبب تشکیل هسته اولیه آندوسپرم می‌شود که پس از تقسیمات پی در پی بافت آندوسپرم را بوجود می‌آورد (شکل B4).

در داخل کیسه‌رویانی بالغ که در این مرحله حالتی U شکل دارد، از تقسیمات متوالی سلول تخم، پیش­رویان تشکیل می‌شود. در مراحل اولیه تقسیمات پیش­رویان، حجم آن تقریبا با سلول تخم تفاوت چندانی ندارد. پیش‌رویان ارتباط مستقیمی با آندوسپرم برقرار می‌کند (شکل‌های
 C- H4).

شکل 4- مراحل تکوین تخمک O. viciifolia پس از لقاح توسط میکروسکوپ نوری. A- برش عرضی کیسه‌رویانی و لایه سلولی اندوتلیوم (en)، از بین رفتن سلول‌های خورش از اطراف هسته‌های کیسه‌رویانی(↑). B- هسته اولیه آندوسپرم (pen). C- مرحله اولیه تشکیل پیش رویان (pe)؛ نتیجه لقاح اول، تشکیل سلول تخم (زیگوت) در کیسه­رویانی بالغ است که طی مراحلی به پیش رویان تبدیل می­شود. D- ارتباط سیتوپلاسمی پیش رویان (↑) با آنتی پودها (▲). Hو G و F و E- مراحل اولیه تشکیل پیش رویان که از طریق تقسیمات پی در پی بوجود می آید. :pen هسته اولیه آندوسپرم؛:pe پیش رویان؛ :en اندوتلیوم.

در مراحل بعدی، پیش‌رویان دوسلولی و سلول پایه ایجاد می‌شوند. در این گونه، بافت آندوسپرم در ابتدا حالت سنوسیتیک دارد که سپس بتدریج سلولی می‌شود (شکل‌های A, B5). در ادامه مراحل رشد و نمو دستگاه زایشی ماده، رویان گلوبولار یا کروی تشکیل می شود (شکل C5). رشد و نمو رویان کروی در مرحله بعدی منجر به تشکیل رویان قلبی شکل می‌شود. در این مرحله هنوز بقایایی از سلول بازال قتبل تشخیص است (شکل D5).

هم‌راستا با تغییراتی که در رویان شکل می‌گیرد، تغییراتی نیز در تخمک و پوسته‌های آن اتفاق می‌افتد که منجر به تشکیل دانه و پوسته دانه می‌شود. در این گونه نیام با سطح صاف، ناشکوفا، مدور و دارای یک بند است. بطور معمول نیام بالغ در جنس Onobrychis دارای یک دانه است که یکی از نشانه­های ‌ویژه‌ این جنس می‌باشد.

اطراف دانه بالغ این گیاه را پوسته ضخیمی متشکل از لایه‌های استئواسکلرید، ماکرواسکلرید و سلول­های پارانشیمی فرا گرفته است (شکل‌های E, F5). برش عرضی دانه نشان ‌می‌دهد که در بخش ناف دانه، تخمک توسط بند (فونیکول) کاملا مشخصی به دیواره داخلی مادگی که سطح بیرونی آن مملو از کرک‌های بلندی است، متصل شده است (شکل‌های G, H5). رنگ آمیزی با لوگول جزئیات و ویژگی‌های بیشتری از کرک های سطح مادگی را نشان می‌دهد (شکل‌ H5). همچنین زمانی که لپه‌‌ها و پوسته دانه با رنگ آمیزی‌های مختلف مورد بررسی قرار می‌گیرند، محدوده و ذخایر موجود در سلول‌های آنها را بهتر می‌توان مورد مطالعه و ارزیابی قرار داد. بعنوان مثال، رنگ‌آمیزی با لوگول و استوکارمن، ذخیره بالای نشاسته در لپه‌های این گیاه را نمایان می‌سازد (شکل‌های A, B, C6). این رنگ‌آمیزی‌ها نشان می‌دهد که در برش عرضی دانه، بیشترین تجمع نشاسته در سلول­های پارانشیمی و اطراف تراکئید بوده و لایه آندوسپرم و تراکئید عاری از نشاسته است (شکل‌های D, E6).

در این گیاه نیز، مطابق ساختار خاص دانه در پوسته نیام­داران، یک لایه سلول محافظتی، شعاعی، کشیده و ضخیم وجود دارد که فاقد فضای بین سلولی است و سلول مالپیگی نامیده می­شود، که به علت اندازه بزرگ به آن ماکرواسکلرید گفته می شود (شکل‌های D- J6). در سطح دیوار بیرونی سلول‌های ماکرواسکلرید یک لایه کوتیکول ضخیم قرار دارد، که محتوای لیپیدی دارد که توسط رنگ‌آمیزی مضاعف استوکارمن و سبز متیل بوضوح قابل مشاهده است (شکل J6). در بخش ناف دانه، لایه نردبانی دو‌لایه مشاهده می­شود که در طول خط میانی، با شیار بسیار ریزی شکافته شده و محل عبور هوا و بخار آب می‌باشد. این شیار به دستجات تراکئیدی (آوندهایی با تزیینات حلقوی) هدایت می‌شود که به اثر تراکئید معروف است و اطراف آن را لایه‌ای از سلول‌های پارانشیمی ذخیره‌ای‌ فرا گرفته است (شکل‌های D, E, G6). در این گونه بصورت منحصر به فردی، در سرتاسر پوسته دانه، در زیر لایه ماکرواسکلرید، لایه استئواسکلرید به شکل استخوان مانند و با کشیدگی خاص دیده می‌شود و به تناسب محتوای سلولی متفاوتی که دارد، از رنگ‌پذیری متمایزی نیز برخوردار است. لایه بعدی لایه سلول‌های پارانشیمی است که در بخش‌های مختلفی از دانه پراکنده شده که از آن جمله می‌توان به لایه پارانشیمی زیر آندوسپرم، لایه پارانشیمی زیر استئواسکلرید و لایه پارانشیمی زیر نافی اشاره کرد (شکل‌های D- J6). آندوسپرم شامل انواعی از سلول­های لایه آلرون، لایه زیر آلرون و آندوسپرم است (شکل H, J6).

تکوین بساک و دانه گرده O. viciifolia: گونه
 O. viciifolia تک پایه و دارای گل‌های دوجنس است. در گل­آذین خوشه این گیاه، مراحل مختلف نموی گلچه­ها دیده می­شود.

شکل 5- مراحل تکوین دانه O. viciifolia توسط میکروسکوپ نوری. A- مراحل اولیه تشکیل بافت آندوسپرم (▲) در این گونه، بافت آندوسپرم در ابتدا حالت سنوسیتیک دارد که سپس بتدریج سلولی می‌شود. B- بافت آندوسپرم از نوع هسته ای (▲) .C- تشکیل رویان کروی (▲) و بافت آندوسپرم (ed). D- تشکیل رویان قلبی (↑)، بقایای سلول بازال(▲). F و E- دانه و حجم بافت آندوسپرم (ed) در آن. پوسته ضخیم دانه با لایه استئواسکلرید (os)، ماکرواسکلرید (ms) و سلول های پارانشیمی(pa). H و G- رنگ آمیزی با لوگول و برش عرضی مادگی، تخمک و بند (▲). کرک های سطح مادگی (↑). ed: آندوسپرم؛ ms: ماکرواسکلرید؛ os: استئواسکلرید؛ pa: پارانشیم.

شکل 6- مراحل تکوین دانه O. viciifolia توسط میکروسکوپ نوری. A, B- لپه (co) و تجمع نشاسته در آن (رنگ آمیزی با لوگول). C- ذخایر لپه (▲) (رنگ آمیزی با استوکارمن). E و D- برش عرضی دانه، بیشترین تجمع نشاسته در سلول های پارانشیمی و اطراف تراکئید است (↑). بند (fu) از پوسته جدا شده است. استئواسکلرید (os) و ماکرواسکلرید (ms) ضخیم پوسته دانه (رنگ آمیزی با لوگول). G- استئواسکلرید استخوانی شکل (os)، ماکرواسکلرید (ms) و سلول های پارانشیمی (pa)، ماکرواسکلرئید دو لایه در ناحیه بند (▲▲) (رنگ آمیزی با استوکارمن ومتیلن بلو). H- بافت آندوسپرم (ed) (رنگ آمیزی با استوکارمن ومتیلن بلو) I- لایه‌بندی پوسته دانه توسط لوگول و تجمع دانه‌های نشاسته. J- لایه‌بندی پوسته دانه شامل: لایه کوتیکولی (c)، ماکرواسکلرید (ms)، استئواسکلرید (os)، پارانشیم (pa)، آلرون (al) و آندوسپرم توسط رنگ‌آمیزی مضاعف استوکارمن و متیلن بلو. al: آلرون؛ c: کوتیکول؛ co: لپه؛ ed: آندوسپرم؛ fu: فونیکول؛ ms: ماکرواسکلرید؛ os: استئواسکلرید؛ pa: پارانشیم

نافه درون جام و در اطراف مادگی مستقر شده‌‌است (شکل A7). بساک­های یک گل همزمان تکوین پیدا نمی­کنند (شکل B7) اما در همه کیسه­های گرده یک بساک که دارای دو خانه و چهار کیسه ‌گرده است، تکوین دانه­های گرده بصورت هم­زمان دیده می‌شود (شکل‌های C, N7). در نمونه مورد نظر، میکروسپوروسیت‌ها (سلول­های مادرگرده) دارای هسته درشتی بوده و قبل از میوز، توسط لایه کالوزی احاطه شده­اند که در ابتدا فاصله‌ای بین آنها مشاهده نمی-شود. در ادامه این سلول­ها وارد تقسیم میوز شده و طی مراحل مختلف رفته رفته از یکدیگر فاصله پیدا می­کنند (شکل‌های C- J7).

در این گیاه مطالعات نشان داد که بساک دارای دیواره چهار لایه است که بترتیب از بیرون شامل لایه اپیدرم (اگزوتسیوم)، لایه مکانیکی (آندوتسیوم)، لایه میانی و لایه مغذی (تاپی) می‌باشد. در این گونه لایه میانی دارای یک ردیف سلول کشیده و موقت است که در همان مراحل اولیه مصرف می­شود. بدلیل تک لایه بودن لایه میانی، دیواره بساک از نوع دولپه‌ای (type II) است (شکل F7). لایه مغذی، داخلی­ترین لایه دیواره بساک و از نوع ترشحی است که در مجاورت میکروسپورها قرار دارد. این لایه دارای سلول­های تک هسته­ای است و بدلیل دارا بودن هسته بزرگ و خاصیت رنگ‌پذیری بالا، بنظر می‌رسد از پلی‌پلوئیدی بالایی برخوردار باشد. لایه تاپی در این گیاه . بدلیل ثبات جایگاه سلول‌هایش از نوع ترشحی است (شکل‌های E- J7). بعد از تکمیل مراحل مختلف میوز و سیتوکینز، میکروسپورها ابتدا بصورت منفرد در پوشش کالوزی قرار می‌گیرند و طی مراحل تکوینی فاصله آنها از یکدیگر بیشتر می­شود. در ادامه لایه کالوز از اطراف تتراد‌ها تحلیل رفته و گرده‌های جوان آزاد می‌شوند، در این مرحله دارای سیتوپلاسم متراکم، هسته­های‌ مرکزی و فاقد واکوئل هستند (شکل‌ K7). بعد از رهایی گرده‌های جوان از پوشش کالوزی، لایه اگزین به کمک لایه تاپی در اطراف آنها تکمیل می‌شود (شکل‌های L, M7). در مرحله بعد واکوئلی بزرگ، سیتوپلاسم و هسته را بطرف دیواره می‌راند و پس از آن، هسته گرده‌های جوان با تقسیم میتوز نامساوی، دو هسته با اندازه‌های مختلف را بوجود می‌آورند. بنابراین دانه‌ گرده بالغ در این نمونه دو هسته‌ای است، هسته بزرگتر، رویشی و هسته کوچکتر، زایشی می­باشد. اطراف هسته‌های رویشی و زایشی سیتوپلاسم و دیواره پکتوسلولزی نازکی قرار گرفته و آنها را از یکدیگر جدا می‌کند (شکل L7). دانه‌های گرده در نمای قطبی، کروی و دارای سه شکاف رویشی با فواصل منظم برای خروج لوله گرده در زمان لقاح، و در نمای استوائی، بیضی شکل و دوکی هستند (شکل‌ K7). سلول‌های تاپی که در مراحل اولیه نمو از تراکم واکوئلی کمی برخوردار هستند و رنگ پذیری بالایی را از خود نشان می‌دهند، در مراحل تکوینی بعدی و قبل از تجزیه کامل، بتدریج واکوئله می‌شوند. در مراحل نهایی تکوین بساک لایه تاپی کاملا تحلیل رفته بطوری که در زمان رهایی گرده‌های جوان از پوشش کالوزی، لایه تاپی کاملا از بین رفته است (شکل‌ K7). بنابراین در مراحل پایانی تکوین اندام زایشی نر، در دیواره بساک، تنها لایه مکانیکی و لایه اپیدرمی باقی می‌مانند و اثری از دو لایه دیگر دیده نمی‌شود (شکل‌های K- N7). در دیواره لایه مکانیکی سلول‌ها، ضخیم­شدگی‌های فیبری ایجاد می‌شود که می‌تواند در شکوفایی این لایه و پراکندگی دانه‌های گرده نقش مهمی را ایفا نماید (شکل‌های M,N 7).

بافت رابط بساک، میله و بساک پرچم‌ها را به یکدیگر متصل می­کند. این بافت شامل دو نوع بافت پارانشیمی و آوندی است. در دانه‌های گرده بالغ، تجمع مواد موجب افزایش شدت رنگ­پذیری در آنها می‌شود. دانه‌های گرده پس از بلوغ از محلی که بساک می شکند (استومیوم) آزاد می شوند (شکل N7).

شکل 7- مراحل تکوین بساک و دانه گرده O. viciifolia توسط میکروسکوپ نوری. A- بساک در گلچه های مختلف مراحل نموی مختلفی را از خود نشان می­دهد(▲).. B- بساک‌ دارای دو خانه و چهار کیسه ‌گرده، مراحل نموی متفاوت در بساک­های یک گل (↑). C- عدم فاصله بین سلول های میکروسپوروسیت در ابتدایی‌ترین مراحل تکوین آنها (▲).D  و E- فاصله گرفتن سلول های میکروسپوروسیت از یکدیگر(▲)، لایه مغذی یا تاپی (ta)، داخلی­ترین لایه دیواره بساک و از نوع ترشحی است که در مجاورت میکروسپورها قرار دارد، این لایه دارای سلول­های تک هسته­ای است. F- لایه­های دیواره بساک: لایه اپیدرم (e)، مکانیکی (en)، میانی یک ردیفی (ml) و تاپی ترشحی (ta). G- تکوین همزمان میکروسپوروسیت‌ها در چهار کیسه گرده یک بساک. بافت رابط شامل بافت آوندی (▲) و سلول‌های ذخیره ای پارانشیمی ((pa. J و I و H- میکروسپوروسیت‌ها با سیتوپلاسم متراکم، هسته مرکزی و فاقد واکوئول (▲). فاصله گرفتن میکروسپوروسیت‌ها با افزایش حجم پوشش کالوزی (c). K- نمای استوایی (بیضی) (▲) و قطبی (مثلثی) (↑) میکروسپورها با سه منفذ. L- تشکیل واکوئل بزرگ مرکزی (↑) و تشکیل هسته رویشی (بزرگتر) و هسته زایشی (کوچکتر)▲▲) )، از بین رفتن کامل لایه تاپی M- لایه تاپی از بین رفته و قطر لایه مکانیکی (en) به بیشترین حد خود رسیده. لایه اگزین (↑) و انتین (▲). N- دانه‌های گرده بالغ، سپتوم بساک از بین رفته است (▲). c: لایه کالوز؛ ta: لایه تاپی؛ en: لایه مکانیکی؛ e: اپیدرم؛ ml: لایه میانی.

بحث

در O. viciifolia تخمک از نوع واژگون، دوپوسته‌ای و پرخورش است. تخمک دوپوسته‌ای و پرخورش در تعداد زیادی از گونه­های تیره پروانه‌آسایان گزارش شده است (2، 22، 23، 35، 41). رشد نامتقارن در ناحیه بند و در نهایت واژگونی تخمک، از صفات رایج در بین تاکسون‌های تیره پروانه‌آسایان است (2، 13، 23، 41، 44). در نمونه‌ مورد بررسی، مانند بسیاری از پروانه‌آسایان کیسه‌رویانی بالغ از نوع پلی‌گونوم است (2، 9، 23، 35، 41، 43) که معمول‌ترین نوع کیسه‌رویانی در بین نهاندانگان می‌باشد و بعنوان صفت ابتدایی در نظر گرفته می‌شود (2، 32). همچنین پوسته درونی تخمک‌ بسیاری از پروانه‌آسایان، با دو لایه سلولی مشاهده می‌شود (2، 5، 6، 7، 14، 16، 19، 20، 28، 30، 31، 35، 40، 43، 46، 50) اما در برخی از تاکسون‌ها در تیره مورد نظر پوسته درونی تعداد لایه‌های بیشتری دارد (4، 5). در تخمک‌های دوپوسته‌ای، ابتدا پوسته بیرونی و سپس پوسته درونی بنیانگذاری می‌شود. در این گونه نیز پوسته درونی متشکل از دو لایه سلولی است و رشد پوسته بیرونی سریع‌تر است.

شکل تتراد در پروانه‌آسایان می‌تواند بسیار متنوع باشد تا حدی که در فیلوژنی لگوم ها مورد استفاده قرار گیرد (45، 33، 23). مانند بسیاری از نمونه‌های بررسی شده در پروانه‌آسایان آرایش مجموعه تترادی از نوع T شکل است. قبل از لقاح هسته‌های قطبی نسبت به سایر سلول‌های کیسه‌رویانی می‌توانند جایگاه‌های مختلفی از کیسه رویانی را اشغال کنند. همچنین زمان ترکیب هسته‌های قطبی متفاوت است و از اختصاصات تاکسون می‌باشد (10). در گونه مورد مطالعه، ترکیب هسته‌های قطبی نسبتا سریع است به گونه‌ای که‌ قبل از لقاح هسته‌ها با یکدیگر ادغام شده‌اند. جایگاه این سلول‌ها در این گونه در نزدیکی دستگاه تخم‌زا هستند.

لایه اندوتلیوم در اطراف کیسه‌رویانی از خروج جانبی مواد و عناصر مغذی از این بافت جلوگیری می‌کند (11). همچنین لایه اندوتلیوم در تخمک‌هایی که بافت خورش در آنها بسرعت تحلیل می‌رود، گستره کیسه‌رویانی را تعیین کرده و آن را محدود می‌سازد (12). در این گیاه لایه اندوتلیوم در اطراف کیسه‌رویانی به چشم می‌خورد و دارای سلول‌هایی با هسته کاملا واضح و سیتوپلاسمی متراکم است.

ویژگی‌های ریخت‌شناسی تخمک و بند، شکل و موقعیت آنها از ویژگی‌های مهم تاکسونومیکی در گیاهان گل‌دار، محسوب می­شوند (10). بر اساس فقدان یا حضور بند، دو نوع تخمک با پایه (فونیکولی) و بی‌پایه تشخیص داده شده است (12). در O. viciifolia تخمک با داشتن پایه‌ای مشخص از نوع فونیکولی است.

نقش پوسته دانه در رده­بندی لگوم‌ها بسیار حائز اهمیت است (17، 18). سختی پوشش دانه‌ در حین رسیدن دانه غالبا ناشی از تکوین دیواره‌های ثانویه در اپیدرم و لایه یا لایه‌های زیر اپیدرم است. لایه‌های پیرامونی دانه ‌پروانه‌آسایان بشدت اسکلریفیه می‌شوند. در دانه‌های لوبیا، نخود فرنگی و سویا ماکرواسکلریدهای ستونی شکل در اپیدرم و استئواسکلریدهای استخوانی شکل در زیر اپیدرم قرار دارند. در طی تکوین پوشش دانه پروانه‌آسایان، سلول‌های اپیدرمی، که ماکرواسکلریدها از آنها مشتق می‌شوند، تحت تقسیم شعاعی گسترده که با طویل شدن سلول دنبال می‌شود، قرار گرفته و سپس در آنها دیواره ثانویه شکل‌ می‌گیرد (25). استئواسکلریدها بصورت شعاعی و مماسی تقسیم می‌شوند، اما تا زمانی که دیواره‌های ثانویه ضخیم ماکرواسکلریدها رسوب گذاری نکنند، تمایزیابی سلول‌های استخوانی‌شکل شروع نخواهد شد. در استئواسکلریدهای در حال تکوین، دیواره ثانویه ابتدا در بخش‌های میانی شکل می‌گیرد که از توسعه بیشتر این بخش‌ها جلوگیری می‌کند. در این زمان دیواره‌های اولیه در انتهای سلول همچنان به گسترش خود ادامه می‌دهند (26). در گیاه مورد بررسی ماکرواسکلریدهای ستونی شکل و استئواسکلریدهای استخوانی با ضخامت قابل توجهی اطراف دانه را احاطه کرده­اند. تشکیل لایه ماکرواسکلرید از ویژگی‌های بارز پوسته در این تیره است (3، 25، 26، 34، 51). وجود این لایه سبب عدم نفوذ آب به داخل دانه لگوم‌ها می شود (36). در ناحیه ناف دانه این گیاه، لایه نردبانی دولایه و دستجات تراکئیدی به چشم می‌خورد که بعنوان یک معبر جاذب رطوبت مطرح هستند و در انتقال آب به دانه نقش دارند (36). خصوصیات ناف در پروانه­آسایان می‌تواند این زیر تیره را از زیر تیره‌های دیگر جدا نماید (24).

تعداد خانه‌ها و کیسه‌های ‌گرده بساک در گیاهان گل‌دار غالبا دو و چهار عدد است. اما در برخی گونه‌ها ممکن است تعداد کیسه‌های‌گرده در بساک کمتر باشد (10). در O. viciifolia بساک‌ها مانند سایر اعضا زیرتیره Papilionoideae چهار کیسه گرده ای هستند (15، 23، 30، 31، 48، 49). دیواره کیسه­های گرده این گیاه شامل: لایه اپیدرمی، لایه مکانیکی، لایه میانی و لایه تاپی است. چون لایه میانی و لایه تاپی در این گیاه از یک لایه سلول تشکیل شده‌اند، بنابراین طبق تقسیم‌بندی دیواره کیسه­های گرده از نوع دولپه­ای (Dicotyledonous) است. در تیره پروانه آسایان تعداد لایه­های میانی بین یک (21، 50) و دو عدد است (2، 14، 30، 31، 41، 48). افزایش حجم دیواره کیسه گرده بعلت افزایش تعداد لایه­های میانی یا تاپی می­باشد و این دیواره در تاکسون­های ابتدایی ضخیم­تر است (8).

در گیاه مورد مطالعه تاپی از نوع ترشحی است و نسبتا ناپایدار است به گونه‌ای که در زمان آزاد شدن گرده­ها از کالوز کاملا تحلیل رفته است. در نهاندانگان لایه تاپی از نوع ترشحی و آمیبی است (37). اما در این تبار و تیره پروانه­آسایان، اغلب تاپی از نوع ترشحی گزارش شده است (1، 2، 14، 15، 30، 31، 42، 47، 48).

در بساک جوان، سلول‌های لایه مکانیکی با سلول‌های لایه اپیدرمی و لایه میانی تفاوت کمی دارند. اما در برخی گیاهان در طی دوره میوز و در ابتدای میتوز دانه‌های‌گرده، نوار‌های فیبری روی دیوارهای شعاعی و مماسی داخلی لایه مکانیکی تشکیل می‌شوند. این نوارها معمولا در زاویه‌ای عمود بر لایه اپیدرمی تشکیل می‌شود. در برخی موارد، دیواره سلول لایه مکانیکی ضخیم نمی‌شود و هیچ نوار فیبری در آنها تشکیل نمی‌شود (Epacridaceae و Empetraceae) (10). لایه مکانیکی در نمونه‌ مورد بررسی در این پژوهش نسبتا ضخیم است.

درون کیسه‌گرده بالغ گیاهان، دانه‌های گرده ممکن است دوسلولی یا سه‌سلولی باشند. در گونه‌ مورد بررسی، مانند برخی مطالعات انجام شده در این تیره، دانه‌های گرده بالغ در زمان رهایی از بساک، دارای دو سلول رویشی و زایشی می‌باشند (23، 31).

سپاسگزاری

نگارندگان مقاله حاضر از معاونت پژوهشی و فناوری دانشگاه ملایر برای حمایت مالی از پژوهش حاضر قدردانی می کنند.