رشد و تکثیر شاخساره و برخی پارامترهای بیوشیمیایی گیاه استویا در شرایط کشت درون شیشه‌ای تحت تأثیر الیسیتورهای زیستی و غیر زیستی

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان، زنجان، ایران

2 بخش تحقیقات گیاه پزشکی، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی استان زنجان، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، زنجان، ایران

چکیده

به منظور بررسی رشدوهمچنین اندازه‌گیری برخی مؤلفه‌های بیوشیمیایی استویا تحت تأثیرالیسیتورهای زیستی وغیر زیستی درشرایط کشت بافت دو آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد. بر همین اساس، ابتدا اثر دو نوع سایتوکینین Kin و BAP به منظورانتخاب غلظت بهینه به عنوان پروتکل تکثیر گیاه استویا و سپس اثر الیسیتورهای کیتوزان، متیل جاسمونات و عصاره مخمر در چهار غلظت بر افزایش رشد گیاه و همچنین پارامترهای بیوشیمیایی گیاه استویا در شرایط کشت بافت انجام گرفت. نتایج آزمایش اولیه نشان داد که غلظت 2 میلی‌گرم بر لیتر BAP جهت پرآوری شاخساره به عنوان غلظت بهینه باعث بیشترین رشد طول و تعداد شاخساره شد، بنابراین این غلظت به محیط کشت پایه اضافه گردید. اثر الیسیتورهای مختلف افزایش معنی‌داری بر طول و تعداد شاخه نشان دادند، به طوری‌که بیشترین طول و تعداد شاخه در غلظت 200 میلی‌گرم بر لیتر کیتوزان بود که به نسبت شاهد به ترتیب 70 و 95 درصد افزایش داشت. اثر الیسیتورها بر پارامترهای بیوشیمیایی نشان داد که به غیر از کربوهیدرات، اثر افزایشی به نسبت شاهد نداشتند، به طوری که محتوای آب و همچنین کلروفیل گیاه با افزایش غلظت الیسیتورها کاهش بیشتری را نشان داد. میزان کربوهیدرات کل تحت تأثیر غلظتهای کیتوزان 200، متیل جاسمونات 100 و عصاره مخمر 50 میلیگرم بر لیتر به طور معنیداری به نسبت تیمار شاهد افزایش داشت. به طور کلی مشخص شد که این تحقیق می‌تواند به عنوان یک پروتکل مناسب جهت تولید انبوه گیاه استویا به عنوان یک گیاه اقتصادی مهم در شرایط کشت بافت مورد استفاده قرار گیرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Shoot multiplication and some biochemical parameters of Stevia rebaudiana plants under the effect of biotic and abiotic elicitors in vitro

نویسندگان [English]

  • Diako Rasouli 1
  • Bahram Maleki 1
  • Hossein Jafary 2
  • Neda Zand 2

1 Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, university of Zanjan, Zanjan, Iran

2 Plant Protection Research Department, Zanjan Agricultural and Natural Resources Research and Education Center, AREEO, Zanjan, Iran

چکیده [English]

To study the shoot multiplication and to measure some biochemical parameters of Stevia under elicitors via in vitro condition, two experiments were conducted in a completely randomized design with three replications. Accordingly, in the first experiment, the effects of two cytokinins, Kin and BAP, at 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 and 3 mg/L concentrations to pick the optimal concentration as shoot multiplication protocol and then the effect of chitosan (CH), methyl jasmonate (MeJA) and yeast extract (YE) at 50, 100, 200 and 300 mg/L concentrations on plant growth and biochemical parameters of Stevia plant under in vitro culture was investigated as a second experiment. The primary experiment showed 2 mg/L BAP was the best regulator for shoot multiplication, therefore, supplemented with MS medium. The effect of various concentrations of elicitors showed a significant increase in shoot length and number. The highest amount of shoot length and number were observed in CH 200 mg/L, which showed a significant increase (70 and 95% respectively) compared to control plants. The effect of elicitors on biochemical parameters except for carbohydrates showed no effect compared to control. So that the water content and chlorophyll, showed more reduction with increasing doses of elicitors. The content of total carbohydrate was significantly increased by Chitosan 200, Methyl jasmonate 100 and Yeast extract 50 mg /L with relative to control. Overall, it was found that this research could be used as a proper protocol for mass production of Stevia rebaudiana as an economically valuable plant in tissue culture conditions.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Chitosan
  • Yeast extract
  • In vitro culture
  • Methyl jasmonate
  • Stevia rebaudiana

رشد و تکثیر شاخساره و برخی پارامترهای بیوشیمیایی گیاه استویا در شرایط کشت درون شیشه­ای تحت تأثیر الیسیتورهای زیستی و غیر زیستی

دیاکو رسولی1*، بهرام ملکی1، حسین جعفری2 و ندا زند2

1 ایران، زنجان، دانشگاه زنجان، دانشکده کشاورزی، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی

2 ایران، زنجان، آموزش و ترویج کشاورزی، سازمان تحقیقات، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی استان زنجان، بخش تحقیقات گیاه پزشکی

تاریخ دریافت: 18/05/1399          تاریخ پذیرش: 07/07/1399

چکیده

به منظور بررسی رشد و تکثیر و همچنین اندازه­گیری برخی مؤلفه­های بیوشیمیایی گیاه استویا تحت تأثیر الیسیتورهای زیستی و غیر زیستی در شرایط کشت بافت دو آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد. بر همین اساس، ابتدا اثر دو نوع سایتوکینین کینیتین و بنزیل آمینو پورین (Kin و BAP) در غلظت­های  5/0، 1، 5/1، 2، 5/2 و 3 میلی­گرم بر لیتر به منظور انتخاب غلظت بهینه به عنوان پروتکل تکثیر گیاه استویا در آزمایش اول و سپس اثر الیسیتورهای کیتوزان، متیل جاسمونات و عصاره مخمر در چهار غلظت 50، 100، 200 و 300 میلی­گرم بر لیتر بر افزایش رشد گیاه و همچنین پارامترهای بیوشیمیایی گیاه استویا در شرایط کشت بافت به عنوان آزمایش دوم انجام گرفت. نتایج آزمایش اولیه نشان داد که غلظت 2 میلی­گرم بر لیتر BAP جهت پرآوری شاخساره به عنوان غلظت بهینه باعث بیشترین رشد طول و تعداد شاخساره شد، بنابراین این غلظت به محیط کشت پایه اضافه گردید. اثر الیسیتورهای مختلف افزایش معنی­داری بر طول و تعداد شاخه نشان دادند، به طوری­که بیشترین طول و تعداد شاخه در غلظت 200 میلی­گرم بر لیتر کیتوزان بود که به نسبت شاهد به ترتیب 70 و 95 درصد افزایش داشت. اثر الیسیتورها بر پارامترهای بیوشیمیایی نشان داد که به غیر از کربوهیدرات، اثر افزایشی به نسبت شاهد نداشتند، به طوری که محتوای آب و همچنین کلروفیل گیاه با افزایش غلظت الیسیتورها کاهش بیشتری را نشان داد. میزان کربوهیدرات کل تحت تأثیر غلظت­های کیتوزان 200، متیل جاسمونات 100 و عصاره مخمر 50 میلی­گرم بر لیتر به طور معنی­داری به نسبت تیمار شاهد افزایش داشت. به طور کلی مشخص شد که این تحقیق می­تواند به عنوان یک پروتکل مناسب جهت تولید انبوه گیاه استویا به عنوان یک گیاه اقتصادی مهم در شرایط کشت بافت مورد استفاده قرار گیرد.    

واژه های کلیدی: استویا، کیتوزان، کشت بافت، متیل جاسمونات، عصاره مخمر

* نویسنده مسئول، تلفن: 04442338776، پست الکترونیکی: [email protected]

مقدمه

 

استویا با نام علمی  Stevia rebaudiana (Bertoni)یکی از گیاهان دارویی شناخته شده از خانواده Asteraceae می­باشد. این گیاه بومی نواحی گرمسیری و نیمه گرمسیری آمریکای جنوبی مانند پاراگوئه و برزیل بوده (14) که امروزه در دیگر نقاط جهان از جمله اروپا و بخش­هایی از آسیا کشت می­شود (17). برگ­های استویا حاوی شیرین کننده­های قوی بدون کالری به نام گلیکوزیدهای استویول (SGs) می­باشند که عامل مزه شیرین این گیاه هستند به طوری که امروزه در صنایع غذایی و دارویی کاربرد فراوانی دارند. (31). تولید گلیکوزیدهای استویول از گیاهان استویا با توجه به پتانسیل بالای آن­ها به عنوان مواد طبیعی غیر سمی، میزان شیرین کنندگی بالا، مقدار کالری پایین، مقاومت در برابر حرارت و ثبات PH دارای ارزش بسیار زیادی می­باشد (14). برای بهره­برداری گیاه استویا در صنعت، تولید و تکثیر آن در مقیاس وسیع ضروری به نظر می­رسد. این گیاه در حال حاضر از طریق بذر تکثیر می­یابد. با این حال، تکثیر از طریق بذر به علت درصد زنده­مانی (viability) پایین و همچنین کاهش قدرت جوانه­زنی محدود شده است (26). از طرفی، با توجه به اینکه استویا یک گیاه خود ناسازگار است تکثیر آن از طریق بذر بسیار مشکل بوده و باعث بوجود آمدن بذرهای عقیم می­شود (9)، همچنین با توجه به دگرگشن بودن، بذور تولید شده نامتقارن بوده و از لحاظ فنوتیپی غیر یکدست می­باشند. بنابراین می­توان از روش­های غیر جنسی جهت تکثیر این گیاه استفاده نمود (15). یکی از روش­هایی که جهت تکثیر انبوه گیاهان استفاده می­شود قلمه­زنی می­باشد. این روش جهت تولید گیاهان همگن و یکدست روش مناسبی می­باشد اما با توجه به این که قلمه زدن به عنوان یک تکنیک سنتی در سطح وسیع و انبوه کار پر زحمت و طاقت­فرسایی است لذا می­توان از تکنیک­های دیگر تکثیر غیر جنسی نظیر کشت بافت استفاده نمود (18). کشت بافت گیاهی می­تواند نقش مهمی در تولید تجاری گیاه استویا ایفا کند به طوری­که با حفاظت از ذخایر ژرم پلاسم (Germplasm) پایه مادری در مدت زمان کوتاهی تکثیر انبوهی را باعث می­گردد (4). بنابراین کشت بافت به عنوان یک روش کنترل شده و in vitro بهترین جایگزین برای انتشار سریع گیاه استویا است (33).

اکثر گیاهان مقدار بسیار پایینی از متابولیت­های ثانویه تولید می­کنند و این میزان تولید ممکن است تحت شرایط مشخصی صورت گیرد. در کشت بافت گیاهی، الیسیتورها می­توانند جهت افزایش سنتز متابولیت­های ثانویه با کشت سلول­های گیاهی به کار رفته و در نتیجه می­توان در زمان کمتری به میزان تولید بیشتری دست یافت (1).  مطالعات بسیاری تایید کرده­اند که تجمع متابولیت­های ثانویه مختلف می­تواند به طور مؤثری ناشی از کاربرد الیسیتورها باشد (8, 10, 23). به طور کلی، الیسیتورها ترکیباتی زیستی و یا غیر زیستی می­باشند که از طریق القای پاسخ­های دفاعی در گیاهان می­توانند باعث تولید و انباشت متابولیت­های ثانویه ­شوند (41). الیسیتورهای زیستی ممکن است دارای ترکیبات مشخصی مانند کیتین و کیتوزان و یا مانند قارچ­های همگن و عصاره مخمر دارای مجموعه­ای از ترکیبات زیستی باشند (37). از طرفی، الیسیتورهای غیر زیستی مانند اسید جاسمونیک و یا اسید سالیسیلیک به منظور افزایش تولید ترکیبات ثانویه مورد بررسی قرار گرفته­اند (25). مطالعات متعددی بر روی گیاه استویا در خصوص القای کالوس و توسعه کشت سوسپانسیون با استفاده از ریزنمونه­های متنوع (برگ، گره، میانگره و غیره) انجام گرفته است (3, 13, 19, 20)، همچنین مطالعاتی نیز به بررسی بیان ژن­های درگیر در مسیر بیوسنتزی گلیکوزیدهای استویول در گیاه استویا پرداخته­اند که بخشی نیز توسط نویسندگان مقاله تحت تاثیر الیسیتورهای کیتوزان، متیل جاسمونات و عصاره مخمر انجام گرفته است (2)، در حالی که گزارش­های اندکی در ارتباط با تأثیر الیسیتورهای زیستی و غیر زیستی بر افزایش شاخه­زایی گیاه استویا در شرایط کشت بافت و همچنین اثر این الیسیتورها بر پارامترهای رشد گیاه در دسترس می­باشند.

به طور کلی با توجه به تحقیقات مختلف مشخص شده است که گیاه استویا به عنوان یک گیاه اقتصادی مهم مطرح بوده که در بسیاری از کشورهای پیشرفته از قند آن در تولید محصولات غذایی شیرین استفاده می­شود (12). در کشور ایران با توجه به بومی نبودن این گیاه و لذا تکثیر آن از طریق کشت بافت، کمتر مورد توجه قرار گرفته است (3) که پیش­بینی می­شود در آینده­ای نزدیک به عنوان یک گیاه استراتژیک جهت تولید محصولات شیرین بدون کالری مورد استفاده قرار گیرد. بنابراین با توجه به ارزش اقتصادی این گیاه تولید و تکثیر آن از اهداف مهم محسوب می­شود. لذا در تحقیق حاضر هدف تهیه پروتکل مناسب برای تکثیر از طریق کشت بافت و بررسی تاثیر استفاده از الیسیتورهای کیتوزان، متیل جاسمونات و عصاره مخمر بر تولید شاخساره و برخی پارامترهای بیوشیمیایی گیاه استویا در شرایط کشت بافت می­باشد.

مواد و روشها

به منظور بررسی اثر الیسیتورهای کیتوزان، متیل جاسمونات و عصاره مخمر بر تولید شاخساره گیاه استویا و همچنین افزایش تولید گلیکوزیدهای استویول در شرایط کشت بافت آزمایشی در قالب طرح کاملا تصادفی در آزمایشگاه تحقیقاتی بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی دانشگاه زنجان انجام گرفت.

ضدعفونی و کشت ریزنمونه­ها: جهت بدست آوردن گیاهان یک­دست و همگن، قلمه­های دو ماهه گیاه استویا از مرکز تحقیقات کشاورزی استان گیلان تهیه شد. ضدعفونی ریزنمونه­های گیاه استویا بر اساس روش وای لنگ و لای کنگ (2004) با اندکی تغییرات انجام گرفت(39). به این منظور قطعات میانگره حاوی حداقل یک جوانه جانبی به اندازه­های 5 تا 6 سانتیمتری برش داده شدند. سپس به مدت پنج دقیقه در محلول ضدعفونی حاوی تویین 20 قرار گرفته و با آب مقطر شستشو داده شدند. در زیر هود لامینار نمونه­ها در محلول هیپوکلریت سدیم پنج درصد قرار گرفته و سه بار با آب مقطر شستشو داده شدند. زمانی که ریز نمونه­ها دارای مقداری رطوبت سطحی بودند اقدام به کشت آن­ها در محیط کشت بافت گردید.

کشت ریز نمونه­های ضدعفونی شده در محیط کشت MS انجام گرفت. محیط کشتMS  (28) حاوی سه درصد ساکاروز و 8/0 درصد آگار بود. همچنین با توجه به هدف تحقیق، به محیط کشت MS سایتوکینین (BAP=6-Benzylaminopurine و Kin= Kinetin) با غلظت­های 5/0، 1، 5/1، 2، 5/2 و 3 میلی­گرم بر لیتر اضافه گردید که بر اساس نتایج آزمایش اولیه مناسب­ترین غلظت به محیط کشت MS اضافه شد. غلظت­های استفاده شده در این تحقیق بر اساس مطالعات و تحقیقات صورت گرفته در شرایط مشابه بر روی گیاهان مختلف انتخاب گردیدند. ریز نمونه­های کشت شده جهت نگه­داری به اتاقک رشد با درجه حرارت 2 ± 25 درجه سانتی­گراد و رطوبت 60- 50 درصد با طول دوره روشنایی16 ساعت در روز منتقل گردیدند. جهت بدست آوردن انشعابات جدید و نمونه­های کافی جهت تیمار، در محیط کشت ریزنمونه­های زیادی در محیط کشت MS تیمار شده با بهترین غلظت از سایتوکینین تحت آزمایش، به‌طور پیوسته کشت گردیدند. بعد از گذشت 8 هفته از تکثیر ریز نمونه­های استویا و بدست آوردن گیاهان کافی در شرایط in vitro گیاهان جهت کشت در مراحل بعدی و اعمال تیمار آماده گردیدند.

اعمال تیمار: تیمارها شامل کیتوزان، متیل جاسمونات و عصاره مخمر در 4 غلظت 50، 100، 200 و 300 میلی­گرم بر لیتر بودند. تیمارهای موردنظر ابتدا با استفاده از فیلترهای سرنگی 2/0 میکرومولار (µm) استریل شدند. قبل از کاشت قلمه­های ضدعفونی شده در محیط کشت، تیمارهای مورد نظر هر کدام به‌صورت جداگانه در شرایط استریل به محیط کشت پایه اضافه گردیدند. جهت بررسی و مقایسه گیاهان تیمار شده با الیسیتورها با گیاهان شاهد بدون الیسیتور، از آب مقطر به‌عنوان تیمار شاهد در محیط کشت پایه استفاده گردید.

اندازه­گیری طول و تعداد ساقه­های استویا: جهت محاسبه طول و تعداد نمونه­های کشت شده در محیط کشت پایه بعد از چهار هفته، طول نمونه­های گیاهی با استفاده از خط­کش اندازه­گیری و تعداد آن­­ها شمارش شده و یادداشت گردید.

اندازه­گیری وزن خشک نمونه­ها: بعد از اندازه­گیری طول و تعداد نمونه­های کشت داده شده در چهار غلظت الیسیتورهای کیتوزان، متیل جاسمونات و عصاره مخمر، وزن خشک آن­ها نیز اندازه­گیری شد. جهت اندازه­گیری وزن خشک، نمونه­ها ابتدا وزن شدند و سپس به مدت یک شب در دمای 50 درجه سانتی­گراد در آون قرار داده شد. سپس وزن نمونه­های خشک شده با استفاده از ترازوی سه صفر بر حسب میلی­گرم اندازه­گیری و به صورت درصدی از وزن تر اولیه بیان شد.

اندازه­گیری پارامترهای رشد: میزان آب موجود در برگ و همچنین پروتئین کل موجود در برگ­های تازه گیاه استویا با استفاده از روش ساداسیوام و مانیکام (30) بدست آمد. همچنین کربوهیدرات کل موجود در برگ­های استویا بر اساس روش ریگوین و امریک (24) محاسبه شد. بر همین اساس، میزان کلروفیل موجود در برگ­های سبز استویا با استفاده از روش هیسوکس و ایزرلستام (16) بدست آمد. پارامترهای رشد اندازه­گیری شده بر حسب میلی­گرم بر گرم بدست آمدند که نتایج آن­ها به صورت درصد بیان گردیدند.

تجزیه و تحلیل آماری: این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی در سه تکرار انجام گردید. همچنین مقایسه میانگین­ها با استفاده از نسخه 2/9 نرم افزار آماری SAS و آزمون چند دامنه­ای دانکن در سطح احتمال پنج درصد انجام شد.

نتایج

آزمایش­های اولیه: کشت بافت گیاهان استویا تحت تأثیر Kin و BAP در شش غلظت مختلف جهت بدست آوردن بهترین محیط کشت پایه انجام گرفت. نتایج مربوط به آزمایش­های اولیه بر روی طول و تعداد شاخه نشان داد که همه غلظت­های BAP به غیر از غلظت 3 میلی­گرم بر لیتر و همه غلظت­های Kin به غیر از غلظت­های 5/2 و 3 میلی­گرم بر لیتر، افزایش معنی­داری در تعداد و ارتفاع شاخه در محیط کشت بافت را باعث شدند (شکل 1). به طور کلی، بیشترین تعداد شاخه و بالاترین طول ساقه در محیط حاوی دو میلی­گرم بر لیتر BAP بود به‌طوری که میانگین طول ساقه 03/6 سانتی­متر (88 درصد افزایش به نسبت کنترل) و تعداد شاخه به طور میانگین 49/5 ساقه (150 درصد افزایش به نسبت کنترل) بود.

 

شکل 1- اثر تنظیم کننده­های رشد BAP و Kin بر طول (a) و تعداد (b) شاخه­های گیاه استویا در محیط درون شیشه­ای. محور عمودی نشان­دهنده طول و تعداد شاخه. Standard error نشان­دهنده انحراف معیار می­باشد. حروف متفاوت نشان دهنده اختلاف معنی دار بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5% هستند.

 

اثر غلظت­های مختلف کیتوزان، متیل جاسمونات و عصاره مخمر بر طول و تعداد شاخه: اثر غلظت­های مختلف کیتوزان، متیل جاسمونات و عصاره مخمر بر طول و تعداد شاخه گیاه استویا در شرایط کشت بافت در سطح یک درصد معنی­دار بود (جدول 1). نتایج حاصل از کشت قلمه­های استویا بعد از 4 هفته، در محیط کشت پایه حاوی غلظت­های 50، 100، 200 و 300 میلی­گرم بر لیتر کیتوزان، متیل جاسمونات و عصاره مخمر (شکل 3) نشان داد که غلظت 200 میلی­گرم بر لیتر کیتوزان باعث بیشترین طول و تعداد شاخه گیاه استویا در محیط کشت گردید که به نسبت شاهد به ترتیب 70 و 95 درصد افزایش داشت (شکل 2-a). همچنین غلظت­های 100 و 300 میلی­گرم بر لیتر کیتوزان و غلظت­های 50 و 100 میلی­گرم بر لیتر متیل جاسمونات و عصاره مخمر  به طور همزمان تأثیر مثبت و معنی­داری بر طول و تعداد شاخه­های گیاه استویا در محیط کشت بافت داشتند. کمترین میزان طول و تعداد شاخه تحت تأثیر غلظت 300 میلی­گرم بر لیتر عصاره مخمر و متیل جاسمونات بود که باعث کاهش معنی­دار به نسبت تیمار شاهد (بدون الیسیتور) شد (شکل 2- d، e).

شکل 2- کشت بافت گیاه استویا در شرایط کشت درون شیشه­ای تحت تأثیر الیسیتورهای مختلف. a: بیشترین طول و تعداد ساقه تحت تأثیر 200 میلی­گرم بر لیتر کیتوزان. b و c: بیشترین طول و تعداد ساقه تحت تأثیر متیل جاسمونات 100 و عصاره مخمر 50 میلی­گرم بر لیتر. d و e: کمترین تعداد و طول ساقه در محیط کشت بافت تحت تأثیر متیل جاسمونات 300 و عصاره مخمر در غلظت 300 میلی­گرم بر لیتر.

 

 

جدول 1- تجزیه واریانس اثر الیسیتورهای مختلف بر رشد شاخساره و پارامترهای بیوشیمیایی گیاه استویا در کشت درون شیشه­ای

منابع تغییرات

درجات آزادی

میانگین مربعات

طول ساقه (cm)

تعداد ساقه

آب نسبی (%)

پروتئین (%)

کربوهیدارت (mg/g)

کلروفیل (mg/g)

وزن خشک (mg/g)

تیمار

12

**57/5

**44/3

**45/49

**63/9

**006/0

**68/6

**22/8

خطا

26

051/0

12/0

60/1

32/1

001/0

32/0

40/0

ضریب تغییرات (%)

03/5

80/9

63/1

26/6

25/3

67/4

74/7

**: وجود اختلاف معنی­دار در سطح یک درصد

 

 

شکل 3- اثر غلظت­های مختلف الیسیتورهای کیتوزان، متیل جاسمونات و عصاره مخمر بر طول (a) و تعداد (b) شاخه­های گیاه استویا در محیط درون شیشه ای. محور عمودی نشان­دهنده طول و تعداد شاخه. Standard error نشان­دهنده انحراف معیار می­باشد. حروف متفاوت نشان دهنده اختلاف معنی دار بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال پنج درصد هستند.

 

اثر غلظت­های کیتوزان، متیل جاسمونات و عصاره مخمر بر وزن خشک گیاه استویا: وزن خشک نمونه­های استویا در شرایط in vitro در غلظت­های مختلف کیتوزان، متیل جاسمونات و عصاره مخمر در شکل 4 نشان داده شده است. به‌منظور بررسی بیوماس گیاه تحت شرایط کشت در شیشه، ریزنمونه­های قلمه استویا تحت غلظت­های مختلف به مدت چهار هفته قرار گرفتند. بعد از چهار هفته وزن خشک نمونه­های خشک شده اندازه­گیری شد. بر اساس نتایج مشخص شد که بیشترین وزن خشک گیاه مربوط به عصاره مخمر در غلظت 50 میلی­گرم بر لیتر (51 درصد) بود که اختلاف معنی­داری با کیتوزان 200 (47 درصد) و متیل جاسمونات 100 میلی­گرم بر لیتر (36 درصد) نداشت. همچنین عصاره مخمر در غلظت 100 و متیل جاسمونات در غلظت 50 میلی­گرم بر لیتر افزایش وزن خشک معنی­داری (به ترتیب 33 و 27 درصد) به نسبت تیمار شاهد نشان دادند. از طرفی تیمارهای کیتوزان 50، 100، 300، متیل جاسمونات و عصاره مخمر در غلظت­های 200 و 300 میلی­گرم بر لیتر اثر معنی­داری جهت بهبود یا کاهش وزن خشک گیاه در شرایط in vitro به نسبت تیمار شاهد نشان ندادند.

 

شکل 4- وزن خشک شاخه­های گیاه استویا در شرایط کشت درون شیشه­ای تحت تأثیر الیسیتورهای مختلف. Standard error نشان­دهنده انحراف معیار می­باشد. حروف متفاوت نشان دهنده اختلاف معنی دار بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال پنج درصد هستند.

 

اثر غلظت­های مختلف کیتوزان، متیل جاسمونات و عصاره مخمر بر محتوای آب و پروتئین گیاه (میلی­گرم بر گرم): نتایج مربوط به درصد محتوای آب و همچنین پروتئین کل در شکل 5 نشان داده شده­اند. بر اساس نتایج مشخص شد که هر دو صفت بررسی شده تحت تأثیر غلظت­های مختلف هر سه الیسیتور کیتوزان، متیل جاسمونات و عصاره مخمر به طور معنی­داری کاهش داشتند. به طوری­که بیشترین درصد این دو صفت به ترتیب 84/0 و 22/0 میلی­گرم بر گرم بود که در تیمار شاهد مشاهده گردید و با افزایش غلظت الیسیتورها کاهش محتوای آب و پروتئین گیاه افزایش یافت.

اثر غلظت­های مختلف کیتوزان، متیل جاسمونات و عصاره مخمر بر کربوهیدرات کل و کلروفیل (میلی­گرم بر گرم): بررسی اثر غلظت­های مختلف کیتوزان، متیل جاسمونات و عصاره مخمر در شرایط کشت بافت نشان داد که اثر این الیستورها بر کربوهیدرات کل به صورت جزئی بود به طوری که بیشترین میزان کربوهیدرات در غلظت 100 میلی­گرم بر لیتر متیل جاسمونات (6/5 درصد) و غلظت 50 میلی­گرم بر لیتر عصاره مخمر (5/6 درصد) مشاهده گردید که به نسبت تیمار شاهد افزایش معنی­داری داشتند. غلظت 200 میلی­گرم بر لیتر کیتوزان بر کربوهیدرات کل افزایش معنی­داری نشان نداد. سایر غلظت­های استفاده شده از الیسیتورهای کیتوزان، متیل جاسمونات و عصاره مخمر اثر معنی­داری بر میزان کربوهیدرات کل نشان ندادند (شکل 6).

همچنین اثر الیستورهای کیتوزان، متیل جاسمونات و عصاره مخمر در این تحقیق نشان داد که هیچ­کدام از غلظت­های استفاده شده باعث افزایش میزان کلروفیل نشدند به طوری که بیشترین میزان کلروفیل در تیمار شاهد مشاهده گردید. کیتوزان و عصاره مخمر به طور کلی اثر معنی­داری بر میزان کلروفیل نشان نداند. از طرفی متیل جاسمونات در هر چهار غلظت باعث کاهش معنی­دار میزان کلروفیل شد (شکل 5).

 

 

شکل 5- میزان محتوای آب نسبی (a) و همچنین پروتئین کل (b) گیاه استویا در شرایط کشت درون شیشه­ای تحت غلظت­های مختلف الیسیتورها. Standard error نشان­دهنده انحراف معیار می­باشد. حروف متفاوت نشان دهنده اختلاف معنی­دار بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال پنج درصد هستند.

 

 

 

شکل 6- میزان کربوهیدرات (a) و کلروفیل (b) گیاه استویا در شرایط کشت درون شیشه­ای تحت غلظت­های مختلف الیسیتورها. Standard error نشان­دهنده انحراف معیار می­باشد. حروف متفاوت نشان دهنده اختلاف معنی­دار بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال پنج درصد هستند.

 

بحث و نتیجه گیری

تحقیقات زیادی مشخص کردند که سایتوکینین باعث تحریک رشد شاخه­های کشت داده شده در محیط کشت بافت می­گردد. یه همین منظور در تحقیقی مشخص گردید که غلظت­های متوسط بین 1 تا 2 میلی­گرم بر لیتر از BAP تأثیر بسزایی در افزایش رشد و تکثیر شاخه­های استویا در شرایط کشت بافت داشتند (34). همچنین افزایش عملکرد برای ساقه­های کشت داده شده از گیاه Orthosiphon stamineus تحت تنظیم‌کننده BAP در محیط MS گزارش شده است(39). بر اساس نتایج بدست آمده مشخص شد که BAP به عنوان یک تنظیم­کننده رشد بیش از Kin در تحقیق حاضر مؤثر بود. بنابراین این تنظیم­کننده رشد به عنوان تیمار اولیه مناسب  جهت افزایش تولید و تکثیر شاخساره به منظور بررسی تاثیر الیسیتورهای زیستی و غیر زیستی بر این گیاه، به محیط کشت پایه MS اضافه گردید.

نتایج بدست آمده از اثر الیسیتورهای کیتوان، متیل جاسمونات و عصاره مخمر بر گیاه استویا در شرایط کشت بافت بیانگر آن بود که الیسیتورهای استفاده شده باعث افزایش تکثیر و رشد شاخساره در این گیاه شدند. نتایج این تحقیق با مطالعه پاتالون و هکاران (2010) مشابه بود. آن­ها گزارش کردند که الیسیتورهای کیتوزان، متیل جاسمونات، عصاره مخمر و سالیسیلیک اسید بعد از شش روز به طور معنی­داری باعث افزایش میزان شاخه­زایی گیاه Drosera burmaniiin شدند که در نهایت این شاخه­زایی باعث افزایش تولید برگ و در نتیجه تولید بیشتر ماده مؤثره گردید (29). همچنین در مطالعه­ای دیگر، کادال و همکاران (2014) بیان کردند که غلظت 150 میلی­گرم بر لیتر کیتوزان به طور معنی­داری باعث افزایش رشد گیاه Rubia cordifolia در کشت ریشه مویی آن شد که این افزایش رشد با افزایش غلظت کیتوزان کاهش را نشان داد (21). به نظر می­رسد در پژوهش حاضر کیتوزان در غلظت 200 میلی­گرم بر لیتر به عنوان غلظت بهینه بوده که بیشترین طول و تعداد ساقه را باعث شده است. در واقع کیتوزان به عنوان یک پلی­ساکارید در گیاه عمل کرده و با تحریک تولید لیگنین در دیواره سلولی باعث افزایش رشد گیاهان می­شود (38)، که این افزایش رشد را می­توان در این تحقیق در طول و تعداد ساقه گیاه استویا مشاهده نمود. همچنین مشخص شده که استفاده از این الیسیتور در شرایط کشت بافت در غلظت مناسب اثر بیشتری بر گیاه داشته و با افزایش رشد می­تواند ماده مؤثره گیاه را نیز افزایش دهد (36). در تحقیقی دیگر بر روی گیاه Gerbera aurantiaca مشخص شد که کیتوزان باعث افزایش برخی از پارامترهای رشد از قبیل طول ساقه گل­دهنده، تعداد برگ در هر ساقه و تعداد گل می­شود (40). اما به طور کلی اثر کیتوزان بر رشد گیاهان به صورت نامشخص باقی مانده که نیازمند آزمایش­های بیشتری بر نحوه عملکرد و میزان آن بر روی گیاه می­باشد (36). از طرفی در این تحقیق مشخص شد که متیل جاسمونات و عصاره مخمر در غلظت­های پایین باعث افزایش طول و تعداد شاخه گیاه استویا شدند. در مطالعه­ای، بایراکتار و همکاران (2016) بیان کردند که متیل جاسمونات به طور معنی­داری باعث کاهش طول و تعداد ساقه در گیاه استویا در شرایط گلخانه­ای شد، به طوری که غلظت­های 100 و 200 میکرومولار متیل جاسمونات باعث کاهش رشد گیاه شده و بعد از دو هفته رشد گیاه متوقف و در نهایت تولید ماده مؤثره گیاه را کاهش داد (7). آن­ها بیان کردند که این کاهش رشد ممکن است به دلیل غلظت بالای متیل جاسمونات و همچنین مدت زمان اعمال تیمار باشد. بر خلاف این تحقیق، در پژوهش حاضر غلظت­ 50 و 100 میلی­گرم بر لیتر در طی چهار هفته باعث افزایش میزان ساقه­دهی گیاه استویا شده است که ممکن است به دلیل شرایط کشت و همچنین تحوه اعمال و افزایش میزان این الیسیتور در شرایط کشت درون شیشه­ای باشد. گزارش­های بسیار اندکی از اثر عصاره مخمر بر رشد گیاه در شرایط کشت بافت موجود است اما ممکن است غلظت­های بهینه این الیسیتور باعث رشد سلول­های رشدی در طی مرحله رویش شده و در نهایت منجربه افزایش رشد شاخساره در کشت بافت شوند.

عملکرد بیوشیمیایی الیسیتورهایی مانند کیتوزان و اسید جیبرلیک بر برخی پارامترهای رشدی گیاه نظیر میزان آب نسبی و همچنین پروتئین گیاه در طی آزمایش هنوز به صورت ناشناخته باقی مانده است (32). در پژوهشی کاهش محتوای آب سلولی تحت محلول­پاشی اسید جیبرلیک نشان داد که این الیسیتور احتمالا باعث افزایش بیوماس برگ گیاه می­شود (27). احمد و همکاران (2016) بیان کردند که کیتوزان اثر معنی­داری بر رشد و پارامترهای بیوشیمیایی درختان پرتقال رقم Washington navel شامل تعداد برگ، رشد برگ و همچنین محتوای آب نسبی برگ نداشت (5). به نظر می­رسد الیسیتورها بیشتر تأثیر بازدارنده بر محتوای آب و پروتئین گیاه بر روی گیاه استویا داشته و نقش تنش را ایفا می­کنند. شرف-الدین و همکاران (2003) گزارش کردند که محتوای پروتئین در گیاهان تیمار شده با اسید جیبرلیک به نسبت گیاهان شاهد کاهش داشت (32). آن­ها بیان کردند که این الیسیتور اثری بر برخی مؤلفه­های رشد شامل زودرسی، میزان محصول و همچنین کربوهیدارت و پروتئین کل در گیاه Cynara cardunculus نداشت به طوری که تأثیر مستقیمی بر پارامترهای رشدی گیاه مشاهده نشد. در تحقیق حاضر با افزایش غلظت هرکدام از الیسیتورها محتوای آب و پروتئین گیاه کاهش بیشتری نشان داد که این کاهش ممکن است به دلیل مقابله گیاه با تنش­های احتمالی و از طرفی افزایش بیوماس گیاه باشد. به طوری­که اگرچه این الیسیتورها باعث کاهش این دو صفت بررسی شده شدند اما با توجه به افزایش وزن خشک گیاه، احتمالا این الیسیتورها نقش دوگانه داشته و در نهایت عملکرد گیاه را افزایش دادند. در واقع به طور قاطع دلیل کاهش آب و پروتئین تحت تأثیر الیسیتورهای استفاده شده را با توجه به نبود اطلاعات کافی نمی­توان بیان کرد اما ممکن است به دلیل کشت درون شیشه­ای احتمالا افزایش غلظت الیسیتورها باعث کاهش رطوبت محیط و در نتیجه آب نسبی گیاه شده باشد. همچنین افزایش غلظت الیسیتورها به خصوص متیل جاسمونات و عصاره مخمر احتمالا اثر منفی بر اسیدهای آمینه داشته و در نهایت پروتئین­ها را کاهش داده­اند.

از طرفی، نتایج متفاوتی از میزان کربوهیدرات کل در گیاهان مختلف تحت تأثیر الیسیتورهای مختلف گزارش شده است. شرف-الدین و همکاران (2003) گزارش کردند که متیل جاسمونات اثر معنی­داری بر کربوهیدرات کل در گیاه Cynara cardunculus نشان نداد (32). از طرفی تاکور و سوهال (2014) بیان کردند که کربوهیدرات تحت تأثیر الیستورهای اسید سالیسیلیک و بنزوتیادیوزل کاهش معنی­داری در هر دو گونه Brassica napus و Brassica juncea داشت (35). همچنین ال-خالیل (2007) در یک بررسی بیان داشت که الیسیتورهای متیل جاسمونات و اسید سالیسیلیک باعث افزایش میزان کربوهیدرات به نسبت تیمار شاهد شدند (11). کربوهیدرات، به عنوان قند گیاه، جزو متابولیت­های مهم و اولیه گیاه محسوب می­شود. به طور کلی و بر اساس مطالعات و گزارش­های متفاوتی که از اثر الیسیتورها بر افزایش یا کاهش کربوهیدرات گیاه موجود می­باشد، می­توان بیان داشت که انتخاب غلظت مناسب در افزایش میزان کربوهیدرات گیاه بسیار مؤثر می­باشد. همچنین بررسی و ارزیابی کربوهیدرات کل در گیاهان نیازمند بررسی چرخه تولید این متابولیت اولیه بوده که در گیاه نقش بسیار ارزشمندی ایفا می­کند. بنابراین با توجه به عدم گزارش­های موجود در این زمینه، نمی­توان به طور کامل اثر الیسیتورها بر میزان کربوهیدرات کل را بیان کرد و نیازمند تحقیقات دیگری در زمینه­های چرخه­ بیوسنتزی کربوهیدرات و آنزیم­های درگیر جهت تشریح کامل این چرخه می­باشد. از سویی دیگر، در این تحقیق کاهش میزان کلروفیل تحت تأثیر متیل جاسمونات مشاهده گردید که با یافته­های آنانیوا و همکاران (2004) مشابه بود (6). آن­ها در تحقیقی اثر غلظت­های مختلف متیل جاسمونات بر میزان کلروفیل کل در گیاه Cucurbita pepo را بررسی کردند که نتایج نشان داد این الیسیتور باعث کاهش معنی­دار کلروفیل گردید. آن­ها بیان کردند با توجه به اینکه مسیر تولید کلروفیل و همچنین متیل جاسمونات (GA3) در گیاه از طریق مسیر بیوسنتزی متیل اریترول فسفات (MEP) می­باشد. افزودن متیل جاسمونات به عنوان تیمار به گیاه باعث افزایش مسیر تولیدی GA3 می­شود و از طرفی تولید کلروفیل را کاهش می­دهد. در تحقیق حاضر نیز با توجه به این­که مسیر بیوسنتزی گلیکوزیدهای استویول به عنوان متابولیت­های ثانویه گیاه استویا در مسیر MEP قرار دارد (22) ممکن است متیل جاسمونات به عنوان یک تیمار بازدارنده عمل کرده و در نتیجه باعث کاهش میزان کلروفیل کل شود.

بر اساس نتایج این تحقیق، مشخص شد تولید و تکثیر سریع شاخه­های گیاه استویا در شرایط کشت بافت با استفاده از تنظیم­کننده­های رشد گیاهی نظیر سایتوکینین­ها افزایش یافت. در واقع محیط کشت بافت بستر مناسبی برای رشد سلول­های گیاهی به وجود آورده و با استفاده از غلظت­های مناسب و بهینه از تنظیم­کننده­ها باعث تسریع رشد گیاه می­شود. در این تحقیق اضافه کردن دو میلی­گرم بر لیتر BAP به محیط کشت MS می­تواند به عنوان یک پروتکل مناسب جهت تولید انبوه گیاه استویا در شرایط کشت بافت استفاده شود. همچنین مشخص شد که الیستورهای استفاده شده به طور کلی اثر افزایشی بر تولید و تکثیر ساقه گیاه استویا داشتند. با توجه به این­که وزن خشک گیاه تحت تأثیر این الیسیتورها افزایش داشت، کاهش پارامترهای رشد ممکن است به دلیل آماده شدن گیاه در مقابل تنش­های احتمالی باشد. بنابراین بررسی پارامترهای رشد نیازمند آزمایش­های مولکولی جهت بیان ژن­های درگیر در چرخه­های موردنظر و در نتیجه مقایسه آن از لحاظ مولکولی و مورفولوژیکی می­باشد. در این تحقیق این گونه می­توان نتیجه­گیری کرد که غلظت­ 200 میلی­گرم بر لیتر کیتوزان، 100 میلی­گرم بر لیتر متیل جاسمونات و 50 میلی­گرم بر لیتر عصاره مخمر به عنوان غلظت­های بهینه بیشترین تأثیر را به نسبت سایر غلظت­ها بر افزایش رشد گیاه استویا در شرایط محیط کشت پایه ایفا نمودند. این تحقیق می­تواند به عنوان مقدمه­ای جهت تولید انبوه گیاه استویا به عنوان یک گیاه اقتصادی مهم در شرایط کشت بافت مورد استفاده قرار گیرد. همچنین مقدمه­ای جهت انجام آزمایش­های جامع­تر شامل بررسی بیان ژن و همچنین افزایش تولید ماده مؤثره گیاه استویا با استفاده از غلظت­های بهینه بدست آمده از این تحقیق باشد.

  • اسمعیل­زاده بهابادی ص، شریفی م. (1392). افزایش تولید متابولیت­های ثانوی گیاهی با استفاده از الیسیتورهای زیستی. مجله سلول و بافت، 4 (2): 119- 128.
  • رسولی د، ملکی ب، جعفری ح، بهاری ع. (۱۳۹۷). بررسی بیان ژن‌های کلیدی در مسیر تولید گلیکوزیدهای استویول در گیاه Stevia rebaudiana تحت الیسیتورهای زیستی و غیر زیستی. فصلنامه علمی ژنتیک نوین.، ۱۳ (۲): ۲۴۷-۲۵۷.
  • ملکی­راد م، نصر ن، کاظمی تبار ک. (1395). مطالعه برخی متابولیت‌های گیاه دارویی استویا (Stevia rebaudiana Bertoni) در شرایط کشت درون‌ شیشه‌ای و طبیعی با استفاده از گاز کروماتوگرافی- طیف سنجی جرمی (GC-MS). مجله زیست­فناوری گیاهان دارویی، 2 (4): 41-54.

 

4-    Ahmad N, Fazal H, Zamir R, Khalil SA, Abbasi BH. (2011). Callogenesis and shoot organogenesis from flowers of Stevia rebaudiana (Bert.). Sugar tech 13: 174-177.

5-    Ahmed AHH, Nesiem MRA-E, Allam HA, El-Wakil AF. (2016). Effect of pre-harvest chitosan foliar application on growth, yield and chemical composition of Washington navel orange trees grown in two different regions. African Journal of Biochemistry Research 10: 59-69.

6-    Ananieva K, Malbeck J, Kamínek M, Van Staden J. (2004). Methyl jasmonate down‐regulates endogenous cytokinin levels in cotyledons of Cucurbita pepo (zucchini) seedlings. Physiologia Plantarum 122: 496-503.

7-    Bayraktar M, Naziri E, Akgun IH, Karabey F, Ilhan E, Akyol B, Bedir E, Gurel A. (2016). Elicitor induced stevioside production, in vitro shoot growth, and biomass accumulation in micropropagated Stevia rebaudiana. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC) 127: 289-300.

8-    Bonfill M, Mangas S, Moyano E, Cusido RM, Palazón J. (2011). Production of centellosides and phytosterols in cell suspension cultures of Centella asiatica. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC) 104: 61-67.

9-    Das A, Gantait S, Mandal N. (2011). Micropropagation of an elite medicinal plant: Stevia rebaudiana Bert. Int J Agric Res 6: 40-48.

10-  Dey A, Kundu S, Bandyopadhyay A, Bhattacharjee A. (2013). Efficient micropropagation and chlorocholine chloride induced stevioside production of Stevia rebaudiana Bertoni. Comptes Rendus Biologies 336: 17-28.

11-  El-Khallal SM. (2007). Induction and modulation of resistance in tomato plants against Fusarium wilt disease by bioagent fungi (Arbuscular mycorrhiza) and/or hormonal elicitors (jasmonic acid & salicylic acid): 2-changes in the antioxidant enzymes, phenolic compounds and pathogen related-proteins. Aust J Basic Appl Sci 1: 717-732.

12-  Geuns JM. (2003). Stevioside. Phytochemistry 64: 913-921.

13-  Gupta P, Sharma S, Saxena S. (2010). Callusing in Stevia rebaudiana (natural sweetener) for steviol glycoside production. International Journal of Agricultural and Biological Sciences 1: 30-34.

14-  Gupta P, Sharma S, Saxena S. (2015). Biomass Yield and Steviol Glycoside Production in Callus and Suspension Culture of Stevia rebaudiana Treated with Proline and Polyethylene Glycol. Applied Biochemistry and Biotechnology 176: 863-874.

15-  Hastoy C, Cosson P, Cavaignac S, Boutié P, Waffo-Teguo P, Rolin D, Schurdi-Levraud V. (2018). Deciphering performances of fifteen genotypes of Stevia rebaudiana in southwestern France through dry biomass and steviol glycoside evaluation. Industrial Crops and Products.

16-  Hiscox JT, Israelstam G. (1979). A method for the extraction of chlorophyll from leaf tissue without maceration. Canadian Journal of Botany 57: 1332-1334.

17-  Hossain MA, Siddique A, Mizanur Rhaman S, Hossain A. (2010). Chemical composition of the essential oils of Stevia rebaudiana Bertoni leaves. Asian J Trad Med 5: 56-61.

18-  Jain P, Kachhwaha S, Kothari S. (2009). Improved micropropagation protocol and enhancement in biomass and chlorophyll content in Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni by using high copper levels in the culture medium. Scientia Horticulturae 119: 315-319.

19-  Janarthanam B, Gopalakrishnan M, Sai GL, Sekar T. (2009). Plant regeneration from leaf derived callus of Stevia rebaudiana Bertoni. Plant Tissue Culture and Biotechnology 19: 133-141.

20-  Kim I-S, Yang M, Lee O-H, Kang S-N. (2011). The antioxidant activity and the bioactive compound content of Stevia rebaudiana water extracts. LWT-Food Science and Technology 44: 1328-1332.

21-  Kudale S, Dalvi S, Dixit G. (2014). Effect of chitosan elicitation on alizarin production in hairy root cultures of Rubia cordifolia L. Journal of Chitin and Chitosan Science 2: 62-69.

22-  Kumar H, Kaul K, Bajpai-Gupta S, Kaul VK, Kumar S. (2012). A comprehensive analysis of fifteen genes of steviol glycosides biosynthesis pathway in Stevia rebaudiana (Bertoni). Gene 492: 276-284.

23-  Lee-Parsons CW, Royce AJ. (2006). Precursor limitations in methyl jasmonate-induced Catharanthus roseus cell cultures. Plant Cell Reports 25: 607-612.

24-  Lrigoyen J, Emerich D. (1992). Water stress induced changes in concentration of praline and total soluble sugars in modulates alfalfa (Medicagosatire) plants. Physiologic Planetarium 84: 55-60.

25-  Matkowski A. (2008). Plant in vitro culture for the production of antioxidants—a review. Biotechnology Advances 26: 548-560.

26-  Mitra A, Pal A. (2007). In vitro regeneration of Stevia rebaudiana (Bert) from the nodal explant. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology 16: 59-62.

27-  Modi AR, Shukla YM, Litoriya NS, Patel NJ, Narayan S. (2011). Effect of gibberellic acid foliar spray on growth parameters and stevioside content of ex vitro grown plants of Stevia rebaudiana Bertoni. Medicinal Plants 3: 157-160.

28-  Murashige T, Skoog F. (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15: 473-497.

29-  Putalun W, Udomsin O, Yusakul G, Juengwatanatrakul T, Sakamoto S, Tanaka H. (2010). Enhanced plumbagin production from in vitro cultures of Drosera burmanii using elicitation. Biotechnology Letters 32: 721-724.

30-  Sadasivam S, Manickam A. (2008). Biochemical Methods New Age International (P) Limited. New Delhi: 4-10.

31-  Savita S, Sheela K, Sunanda S, Shankar A, Ramakrishna P. (2004). Stevia rebaudiana–A functional component for food industry. J. Hum. Ecol 15: 261-264.

32-  Sharaf-Eldin M, Schnitzler W, Nitz G, Razin A, El-Oksh I. (2003). Effects of GA3 on growth characteristics, earliness, yield, carbohydrates, and protein in globe arti choke (Cynara cardunculus var. scolymus (L.) Fion). J. Appl. Bot 77: 1-9.

33-  Sivaram L, Mukundan U. (2003). In vitro culture studies on Stevia rebaudiana. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant 39: 520-523.

34-  Sridhar TM, Aswath CR. (2014). Influence of additives on enhanced in vitro shoot multiplication of Stevia rebaudiana (Bert.)—An important anti diabetic medicinal plant. American Journal of Plant Sciences.

35-  Thakur M, Sohal B. (2014). Effect of elicitors on physiomorphological and biochemical parameters of Indian mustard (Brassica juncea) and rapeseed (B. napus). Journal of Applied and Natural Science 6: 41-46.

36-  Uthairatanakij A, Teixeira da Silva J, Obsuwan K. (2007) Chitosan for improving orchid production and quality. Orchid Science and Biotechnology 1: 1-5.

37-  Vasconsuelo A, Boland R. (2007). Molecular aspects of the early stages of elicitation of secondary metabolites in plants. Plant Science 172: 861-875.

38-  Vasconsuelo A, Giuletti AM, Picotto G, Rodriguez-Talou J, Boland R. (2003). Involvement of the PLC/PKC pathway in chitosan-induced anthraquinone production by Rubia tinctorum L. cell cultures. Plant Science 165: 429-436.

39-  Wai Leng L, Lai-Keng C. (2004). Plant regeneration from stem nodal segments of Orthosiphon stamineus Benth., a medicinal plant with diuretic activity. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 40: 115-118.

40-  Wanichpongpan P, Suriyachan K, Chandrkrachang S. (2001). Effect of chitosan on the growth of Gerbera flower plant (Gerbera jamesonii). Chitin and chitosan: Chitin and Chitosan in Life Science, Yamaguchi, Japan: 198-201.

41-  Zhao J, Davis LC, Verpoorte R. (2005). Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites. Biotechnology Advances 23: 283-333.

دوره 34، شماره 4
دی 1400
صفحه 912-922
  • تاریخ دریافت: 04 آبان 1398
  • تاریخ بازنگری: 18 مرداد 1399
  • تاریخ پذیرش: 07 مهر 1399
  • تاریخ اولین انتشار: 11 آبان 1399