بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپ­های اسپرس (Onbrychis sativa) با استفاده از نشانگرهای سیتوژنتیکی و زراعی

محسن فرشادفر^1*، هومن شیروانی¹ و زهرا بقایی فر²

¹ ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، گروه کشاورزی

² ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 01/11/1398          تاریخ پذیرش: 18/06/1399

چکیده

تنوع ژنتیکی 13 ژنوتیپ مختلف اسپرس زراعی (Onbrychis sativa) با استفاده از خصوصیات سیتوژنتیکی و مورفولوژیکی مورد ارزیابی قرار گرفت. در بررسی سیتوژنتیکی، با توجه به جدول تجزیه واریانس اختلاف معنی­داری بین ژنوتیپ­ها بر اساس صفات کاریوتیپی مشاهده گردید. به منظور تعیین میزان تقارن کاریوتیپی ژنوتیپ­ها، آماره­های ضریب تغییرات (CV) و درصد کل فرم (T.F%) محاسبه شدند. نتایج نشان داد که ژنوتیپ البرز-18 دارای متقارن­ترین کاریوتیپ و ژنوتیپ بناب-20247 دارای نامتقارن­ترین کاریوتیپ می باشد. با استفاده از اطلاعات کاریوتیپی تجزیه کلاستر انجام شد که در نتیجه ژنوتیپ­ها در سه گروه قرار گرفتند. در بررسی مزرعه­ای، صفات مورفولوژیکی مانند ارتفاع، تعداد ساقه اصلی، تعداد ساقه فرعی، وزن تر و خشک، زمان گلدهی اندازه­گیری شد. آزمایش بصورت اسپلیت پلات در زمان در قالب طرح بلوک­های کامل تصادفی با سه چین و دو تکرار انجام شد. نتایج جدول تجزیه واریانس نشان داد اختلاف معنی­داری برای اثرات متقابل چین و ژنوتیپ تنها در صفت تعداد ساقه فرعی وجود دارد. تجزیه کلاستر برای صفات زراعی نشان داد که ژنوتیپ­ها در سه گروه قرار گرفتند.  نتایج نشان داد ژنوتیپ بیجار-624 بر اساس صفات مورفولوژیکی خصوصا عملکرد و پارامترهای سیتوژنتیکی با سایر ژنوتیپ­ها بیشترین فاصله ژنتیکی را داشت، که می­توان از این ژنوتیپ در آزمایشات تلاقی پروژه­های اصلاحی برای انتقال صفات مؤثر استفاده کرد.

واژه­های کلیدی: تنوع ژنتیکی، اسپرس، نشانگر، کاریوتیپ

* نویسنده مسئول، تلفن: 09183313221، پست الکترونیکی: m.farshadfar@pnu.ac.ir

مقدمه

زراعت مرتعی علاوه بر تهیه غذا برای دام، به تجدید مواد آلی خاک، جلوگیری از فرسایش خاک، اصلاح قابلیت خاک ورزی و بازگرداندن حاصلخیزی خاک، کمک می‌کند. ریشه گراس‌ها، که بطور عمیق درلایه‌های خاک توسعه می‌یابند، نقش مهمی در افزایش میزان نفوذ پذیری خاک دارند. افزایش عملکرد علوفه خشک همراه با بهبود کیفیت غذایی گیاهان علوفه‌ای، تاثیر قابل ملاحظه‌ای در افزایش فرآورده‌های دامی دارد (5). اسپرس از جمله نباتات علوفه‌ای بومی ایران است که در شرایط متنوع آب و هوایی رویش دارد، در مراتع طبیعی به چشم می‌خورد و در هر منطقه از کشور، به نام و رقم معینی کشت و کار می‌گردد. بعلت پروتئین زیاد و خوش‌خوراکی، شاید از مهم‌ترین و بهترین علوفه‌ها باشد هدف اصلی از به‌نژادی اسپرس بدست آوردن رقمی است که عملکرد علوفه سبز و علوفه خشک آن بالا و همچنین میزان زیادتری پروتئین داشته باشد (7). لذا جهت مطالعات ژنتیکی و اصلاح ارقام مناسب‌تر و عملکرد بالاتر و سازگارتر ابتدا باید میزان تنوع ژنتیکی بین و درون گونه‌های جنس اسپرس تعیین و سپس اقدام به اصلاح آن نمود (10). ذخایر توراثی هر گونه گیاهی به ویژه اکوتیپ‌ها و جمعیت‌های وحشی آن گونه، اساس تنوع آن گونه به شمار می­روند که می‌توانند در برنامه‌های اصلاحی به نژاد گران مورد استفاده قرار گیرند (11). اهداف اصلی این تحقیق بررسی تنوع ژنتیکی و مقایسه ژنوتیپ­های اسپرس زراعی با استفاده از صفات مورفولوژیکی و سیتوژنتیکی می‌باشد.

مواد و روشها

تهیه مواد گیاهی: تعداد 13 ژنوتیپ (البرز-18، گلپایگان-181، اصفهان-182، همدان-281، بیجار-624، کاشان-962، گرگان-1586، گرگان-1601، البرز-3001، سردشت-20297، شهرکرد-20291، مروتپه-20298، بناب-20247) از بانک ژن موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور تهیه گردید.

مطالعات سیتوژنتیکی: در ابتدا بذور داخل پتری­دیش و روی کاغذ صافی کشت شدند. پس از 48 ساعت ریشه آنها به اندازه مناسب برای نمونه‌گیری رسید و در فواصل زمانی 10تا 11 صبح بیشترین تعداد سلول­های متافازی مشاهده گردید. در این زمان پیش تمار با محلول آلفا برومونفتالین 2/0 درصد (حجمی/ حجمی) به‎مدت 5/1 ساعت انجام گرفت. پس از این مرحله ریشه­ها برای عمل تثبیت مدت 18 ساعت در محلول لویتسکی قرار گرفتند. بعد از هیدرولیز، نمونه­ها در محلول رنگ هماتوکسیلین به‎مدت چهار ساعت قرار گرفتند. کروموزوم­های سه سلول متافازی عکس برداری شده از هر ژنوتیپ در یک فایل جداگانه، مرتب گردید. با استفاده از نرم افزار MicroMeasure و از طریق مشخص کردن ابتدا و انتهای کروموزوم و محل سانترومر آنها، ویژگی‎های کروموزومی نظیر طول بازوی بلند ((L)Long arm)، طول بازوی کوتاه ((S) Short arm)، طول کل کروموزوم ((CL) Total chromosome length)، نسبت بازوها ((AR)Arm ratio)، شاخص سانترومری ((CI)Centromer index) محاسبه و در محیط Excel ذخیره شدند، همچنین نوع کروموزوم­ها (K.F) بر اساس روش Levan تعیین گردید (8).

بررسی مورفولوژیک: محل اجرای بررسی­های زراعی، مزرعه مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان کرمانشاه واقع در ایستگاه تحقیقاتی مهرگان با طول جغرافیایی^´ 59, ^°46  و عرض جغرافیایی ^´ 08, ^°34  ، کیلومتر 20 جاده کرمانشاه - سنندج، با خاک لوم (بافت متوسط)، ارتفاع از سطح دریا 1260 متر و میانگین بارندگی سالانه 400 میلیمتر و متوسط دما 20 درجه سانتی­گراد بود. بر اساس مطالعات انجام شده کرمانشاه دارای اقلیم نیمه خشک سرد تا معتدل است. بیشترین میزان بارندگی، براساس آمار هواشناسی 20 ساله در اسفند ماه و کمترین تغییرات بارندگی در فروردین ماه بوده است. این آزمایش بصورت طرح بلوک­های کامل تصادفی در دو تکرار اجرا گردید. هر تکرار دارای 13 پلات آزمایشی و هر پلات شامل 18 بوته گیاه بود. طول هر پلات شش متر، فاصله خطوط از یکدیگر 75 سانتی­متر و فاصله بوته ها بر روی ردیف­ها از یکدیگر 30 سانتی­متر در نظر گرفته شد. همچنین بعلت برداشت سه چین در سال از طرح اسپلیت پلات در زمان بر پایه طرح بلوک­های کامل تصادفی استفاده گردید. آبیاری نیز در هفته یک بار صورت گرفت. مبارزه با علف­های هرز بصورت مکانیکی انجام شد، یادداشت برداری­ بر روی شش بوته که به طور تصادفی از هر کرت انتخاب شده بود انجام گرفت و برای هر کرت ثبت گردید. صفات موفولوژیک شامل، ارتفاع بوته، زمان گلدهی، تعداد شاخه اصلی، تعداد شاخه فرعی، عملکرد وزن تر بوته و عملکرد وزن خشک بوته برای هر ژنوتیپ اندازه­گیری شد. با استفاده از نرم افزارهای Minitab و MSTATC تجزیه واریانس، آزمون چند دامنه­ای­ دانکن در سطح 5% و تجزیه کلاستر انجام گردید.

نتایج

بررسی­های سیتوژنتیکی: نتایج مطالعات سیتوژنتیکی نشان داد که تعداد کروموزوم­های سوماتیک ژنوتیپ­های مطالعه شده2n= 4x= 28  و 2n= 6x = 42 می­باشد. ژنوتیپ گلپایگان-181 میکسوپلویید (2n= 4x= 28, 2n= 6x= 42) و بقیه ژنوتیپ­ها تتراپلویید 2n= 4x= 28 تشخیص داده شدند (شکل1). ژنوتیپ­های بیجار-624 و شهرکرد-20291 دارای کروموزوم­های ماهواره­دار بودند. نتایج کاریوتیپ ژنوتیپ­های مطالعه شده نشان داد که اکثر کروموزوم­ها متاسانتریک یا ساب متاسانتریک می­باشند. ضریب تغییرات در ژنوتیپ بناب-20247 از همه بیشتر (56/27=CV) و در ژنوتیپ البرز-18 از همه کمتر بود (68/19=CV). که این موضوع نشان می­دهد ژنوتیپ البرز-18 از نظر طول کروموزوم­ها نسبت به سایر ژنوتیپ­ها یکنواخت­تر است. اگر به درصد فرم کل این ژنوتیپ نیز توجه کنیم، می­بینیم که درصد کل فرم آن نیز بالا می­باشد (1/46=%TF) که بیانگر حالت تقارن کاریوتیپی بالا برای این ژنوتیپ است. همچنین ژنوتیپ البرز-18 دارای بیشترین طول نسبی کوتاهترین کروموزوم (38/52= S%) بود که این موضوع نیز نشان دهنده تقارن بیشتر این ژنوتیپ نسبت به سایر ژنوتیپ­ها است. با توجه به کلاس استیبنز، ژنوتیپ البرز-18 از نظر تکامل کاریوتیپی در درجه پائین­تری از تکامل قرار گرفت. ژنوتیپ بناب-20247 که دارای بیشترین ضریب تغییرات بود دارای کمترین مقدار طول نسبی کوتاهترین کروموزوم (86/41= S%) می­باشد که نشان دهنده تقارن کمتر این ژنوتیپ نسبت به سایر ژنوتیپ­ها است. از لحاظ اختلاف دامنه طول نسبی کروموزوم­ها (DRL) ژنوتیپ البرز-18 دارای کمترین مقدار می­باشد که بیان کننده تقارن بیشتر کاریوتیپ این ژنوتیپ است ولی بناب-20247 دارای بیشترین مقدار اختلاف دامنه طول نسبی کروموزوم­ها (02/6= DRL) بود. نتایج تجزیه واریانس بیانگر وجود اختلاف معنی­دار در سطح یک درصد بین ژنوتیپ­ها از لحاظ طول بازوی بلند (L)، طول بازوی کوتاه (S) و طول کل کروموزوم (CL) بود (جدول 1). با توجه به نتایج، ژنوتیپ­های مورد بررسی از نظر خصوصیات کروموزومی شامل طول بازوی بلند، طول بازوی کوتاه، طول کل کروموزوم، نسبت بازوی بلند به کوتاه و نسبت بازوی کوتاه به بلند بر اساس تجزیه خوشه­ای در سه گروه قرار گرفتند. بر این اساس گروه اول شامل 10 ژنوتیپ (البرز-3001، سردشت-20297، البرز-18، شهرکرد-20291، گرگان-1586، گرگان-1601، همدان-281، مروتپه-20298، کاشان-962 و گلپایگان-181)، گروه دوم شامل 2 ژنوتیپ (اصفهان-182 و بناب-20247) و گروه سوم شامل 1 ژنوتیپ (بیجار-624) بود.

بررسی­های مورفولوژیکی: ژنوتیپ­های مورد مطالعه از لحاظ تمام صفات فنوتیپی مطالعه شده در چین اول، صفات ارتفاع گیاه و زمان گلدهی و تعداد ساقه فرعی در چین دوم، صفات ارتفاع گیاه، تعداد ساقه اصلی، وزن تر بوته و وزن خشک بوته در چین سوم اختلاف معنی­داری در سطح احتمال 1 درصد نشان دادند.

جدول 1- نتایج تجزیه واریانس برای صفات کاریوتیپی در میان 13 ژنوتیپ مطالعه شده اسپرس

        ** معنی­دار در سطح 1%

شکل 1- سلول­های متافازی ژنوتیپ­های اسپرس زراعی با بزرگنمایی2775

همچنین برای بررسی اثرات متقابل چین و تیمار از طرح اسپلیت پلات در زمان در قالب طرح بلوک کامل تصادفی بر طبق جدول 2 استفاده شد که این تجزیه نشان داد که بین چین­ها برای تمامی صفات اندازه­گیری شده اختلاف معنی­دار وجود دارد اما برای ژنوتیپ­ها اختلاف معنی­داری مشاهده نگردید همچنین اختلاف معنی­داری برای اثرات متقابل چین و تیمار در مورد تعداد ساقه فرعی مشاهده شد و برای سایر صفات اختلاف معنی­داری مشاهده نگردید. مقایسه میانگین­ها توسط آزمون دانکن در سطح معنی­دار %5 نشان داد که برای صفت ارتفاع بوته در چین اول و دوم بالاترین مقدار مربوط به ژنوتیپ گلپایگان-181 و در چین سوم مربوط به ژنوتیپ بناب-20247 بود. بیشترین تعداد ساقه­های اصلی در چین اول و سوم برای ژنوتیپ مروتپه-20298 و بناب-20247 بود. از نظر تعداد ساقه فرعی در چین اول و دوم در ژنوتیپ­های بیجار-624 و کاشان-962 بیشترین بود. از لحاظ زمان گلدهی ژنوتیپ البرز-3001 در چین اول و ژنوتیپ مروتپه-20298 در چین دوم دارای بالاترین میزان در بین ژنوتیپ­های دیگر بودند. اختلاف ژنوتیپ مروتپه-20298 از لحاظ وزن تر بوته در دو چین اول و سوم در سطح احتمال 5% نسبت به دیگر ژنوتیپ­ها معنی­دار بود. از نظر وزن خشک بوته، ژنوتیپ بیجار-624 در چین اول و ژنوتیپ بیجار-624 و البرز-3001  در چین سوم نسبت به سایر ژنوتیپ­ها برتری نشان دادند. همان­گونه که در این تحقیق مشاهده می­شود ژنوتیپ­های بیجار-624 و البرز-3001 در چین سوم و ژنوتیپ بیجار-624 در چین اول حداکثر میزان وزن خشک را دارا می­باشند. از طرفی ژنوتیپ­های بیجار-624 و مروتپه-20298 در چین اول و ژنوتیپ­های البرز-3001 و مروتپه-20298 در چین سوم در مقایسه با ژنوتیپ­های دیگر از میانگین وزن تر بیشتری برخوردار بودند. در این مطالعه از تجزیه خوشه­ای برای گروهبندی ژنوتیپ­های موجود استفاده گردید و از نظر کلیه صفات مورفولوژیکی مورد بحث، گروهبندی انجام شد. 13 ژنوتیپ مورد بررسی در سه گروه قرار گرفتند. گروه اول شامل ژنوتیپ­های (البرز-3001، شهرکرد-20291، البرز-18، گلپایگان-181، اصفهان-182، کاشان-962، بناب-20247)، گروه دوم شامل ژنوتیپ­های (همدان-281، گرگان-1601، گرگان-1586، سردشت-20297) و گروه سوم شامل دو ژنوتیپ (بیجار-624 و مروتپه-20298) بود.

جدول 2- نتایج تجزیه واریانس مرکب برای صفات فنوتیپی

^ns غیر معنی­دار، * معنی­دار در سطح 5% و ** معنی­دار در سطح 1%

بحث و نتیجه گیری

سیتوژنتیک: جدول تجزیه واریانس بیانگر وجود اختلاف معنی­دار در سطح یک درصد بین ژنوتیپ­ها از لحاظ صفات کروموزومی بود. نتایج بدست آمده از تحقیقات  Ansariو همکاران (1) بر روی گونه­های مختلف اسپرس زراعی نیز تنوع کاریوتیپی گسترده­ای را برای صفاتی نظیر طول کل کروموزوم، طول بازوی بلند، طول بازوی کوتاه و درصد فرم کل نشان داد. همچنین این نتایج مؤید این مطلب بود که اکثر کروموزوم­ها متاسانتریک و تعداد کمی ساب متاسانتریک هستند. بطور کلی، ژنوتیپ­های بررسی شده کاریوتیپ متقارن داشته و در کلاس­های ابتدایی جدول استبینز قرار گرفتند.Mesicek and Sojak  (9) تعداد کروموزوم­های چندین جنس اسپرس از جمله سیبریکا (sibirica) را مورد مطالعه قرار دادند و عدد پایه کروموزومی را X=7 گزارش نمود. همجنین Khatoon and Ali (6) با مطالعات کروموزومی گسترده­ای که بر روی لگوم­ها انجام دادند به همان تعداد کروموزوم­های ژنومی در لوکسی فلور (loxiflora) رسیدند. با توجه به نتایج، ژنوتیپ­های مورد بررسی از نظر خصوصیات کروموزومی بر اساس تجزیه خوشه­ای در سه گروه قرار گرفتند. با توجه به نتایج تجزیه خوشه­ای می­توان اینگونه تفسیر نمود که قرار گرفتن ژنوتیپ­ها در یک گروه می­تواند نشانه­ای از قرابت ژنتیکی و سیتوژنتیکی ژنوتیپ­ها با یکدیگر باشد. نتایج حاصل از بررسی­هایی که توسطFayyazi  (3) بر روی صفات سیتوژنتیکی 10 ژنوتیپ اسپرس زراعی صورت گرفت نیز نشان دهنده این مطلب بود که بین ژنوتیپ­های داخل گونه از نظر صفات کاریوتیپی اختلاف معنی­داری وجود داشت و این ژنوتیپ­ها بر اساس این صفات به شش گروه تقسیم شدند.

مورفولوژیک: در مطالعات مزرعه­ای بین ژنوتیپ­های مورد مطالعه از لحاظ صفات فنوتیپی در چین­ها اختلاف معنی­داری در سطح احتمال 1 درصد وجود داشت. نتایج بدست آمده از بررسی تنوع فنوتیپی توسطFayyazi  (3) بر روی 10 ژنوتیپ اسپرس زراعی، نشان دهنده این مطلب بود که بین ژنوتیپ­ها برای صفات تاریخ گلدهی، طول شاخه اصلی و تعداد شاخه فرعی تنوع وجود داشت و نیز وزن خشک بیشترین ضریب همبستگی را با ارتفاع گیاه و تعداد شاخه اصلی داشت. با توجه به نتایج می­توان اینگونه عنوان نمود که اگر افزایش علوفه مدنظر باشد، ژنوتیپ­های بیجار-624 و البرز-3001 دارای عملکرد علوفه­ای بیشتری هستند که در برنامه­های به نژادی باید به شاخه­دهی که عامل تشکیل دهنده عملکرد یا محصول علوفه است توجه خاص مبذول داشت. Hwang و همکاران (4) تعدادی از نمونه­های موجود اسپرس را با توجه به صفات متعددی از جمله عملکرد علوفه خشک، مقاومت به سرما مورد مقایسه قرار داده و اختلاف معنی­داری در بین نمونه­ها مشاهده کردند. در این مطالعه از تجزیه خوشه­ای برای گروهبندی ژنوتیپ­های موجود استفاده گردید و از نظر کلیه صفات مورفولوژیکی مورد بحث، گروهبندی انجام شد. 13 ژنوتیپ مورد بررسی در سه گروه قرار گرفتند. در اینجا بیشترین فاصله مربوط به کلاسترهای یک و سه بود که تلاقی ژنوتیپ­های موجود در این دو گروه، بعنوان والدین می­تواند جهت موفقیت در برنامه­های اصلاحی بکار رود.

طبق بررسی­های انجام شده، تنوع ژنتیکی خوبی بین ژنوتیپ­های اسپرس مورد مطالعه وجود داشت و از آنجا که این ژنوتیپ نماینده ژنوتیپ­های اسپرس موجود در بانک ژن می­باشند، لذا در بین کل ژنوتیپ موجود در بانک ژن نیز تنوع قابل ملاحظه­ای وجود دارد. بنابراین، این مطلب را که، در اکثر مطالعات مربوط به ارزشیابی تنوع درون گونه­ای، تنوعی اندک بین جمعیت­ها یافته­اند و یا گاهی هیچگونه تنوعی وجود نداشته است، نمی­توان به عنوان یک پیش فرض برای هر گونه در نظر گرفت. از مقایسات نتایج صفات مورفولوژیکی و کاریوتیپی می­توان به این نتیجه رسید که ژنوتیپ بیجار-624 نسبت به سایر ژنوتیپ­ها، در هر دو مورد، بیشترین فاصله ژنتیکی را داراست و این ژنوتیپ از نظر صفات مورد بحث با سایر ژنوتیپ­ها تفاوت زیادی داشته و قرابت ژنتیکی کمتری با سایر ژنوتیپ­ها دارد. بنابراین در آزمایشات تلاقی پروژه­های اصلاحی می­توان از آن استفاده کرد. ژنوتیپ­های شماره البرز-3001 و بیجار-624 بیشترین عملکرد را در چین­های مختلف به خود اختصاص دادند بنابراین جهت بهبود عملکرد و همچنین برای انتقال صفات مؤثر در افزایش عملکرد می­توان از این ژنوتیپ­ها بعنوان والد در تلاقی استفاده کرد.

سپاسگزاری

این پژوهش با حمایت مالی دانشگاه پیام نور انجام شده است. که از این بابت از مسئولان مربوطه تشکر و قدردانی می­شـود. در ضمن کلیه حقوق مادی و معنوی آن متعلق به دانشگاه پیـام نـور می­باشد.