تاثیر نیتروپروساید بر تنش اکسیداتیو القا شده توسط آرسنیک در گیاهچه­های گندم

منصوره صدرایی¹، احمد مهربان^1* و ابولفضل توسلی²

¹ ایران، زاهدان، دانشگاه آزاد واحد زاهدان

² ایران، زاهدان، دانشگاه پیام نور واحد زاهدان دانشکده کشاورزی

تاریخ دریافت: 16/03/1398          تاریخ پذیرش: 24/02/1399

چکیده

در این تحقیق، نقش تنظیمی احتمالی نیتروپروساید (NO) در کاهش تنش اکسیداتیو گیاهچه­های گندم تحت سمیت آرسنیک مورد بررسی قرار گرفت. گیاهچه­های 20 روزه گندم تحت تیمار آرسنیک (0، 25 و 50 میکرومولار) و نیتروپروساید (0، 50 و 100 میکرومولار) قرار گرفتند و به صورت هیدروپونیک به مدت 20 روز در این شرایط رشد کردند. تیمار آرسنیک باعث کاهش محتوای نسبی آب و کلروفیل و افزایش محتوای پرولین شد. آرسنیک (50 میکرومولار) همچنین باعث افزایش محتوای مالون دی آلدئید (173%)، پراکسید هیدروژن (194%)، گلوتاتیون احیا شده (89%) و گلوتاتیون اکسید شده (138%) شد، درحالی که باعث کاهش آسکوربیک اسید (41%) و نسبت گلوتاتیون احیا شده به اکسید شده (21%) نسبت به تیمار شاهد شد. افزایش غلظت آرسنیک باعث افزایش فعالیت آنزیم­های آسکوربات پراکسیداز، گلوتاتیون S-ترانسفراز و آسکوربات پراکسیداز شد. فعالیت دهیدروآسکوربات ردوکتاز و گلی اکسالاز I در هر دو سطوح آرسنیک کاهش یافت درحالیکه گلوتاتیون پراکسیداز و گلی اکسالاز II فقط تحت غلظت 50 میکرومولار آرسنیک کاهش یافت. تیمار نیتروپروساید باعث افزایش محتوای نسبی آب، کلروفیل، پرولین، محتوای آسکوربیک اسید و گلوتاتیون، و همچنین بهبود فعالیت آنزیم­های دهیدروآسکوربات ردوکتاز، مونودهیدروآسکوربات ردوکتاز، گلوتاتیون پراکسیداز، کاتالاز و گلی اکسالاز I و II در گیاهچه­های گندم تحت سمیت آرسنیک شد. این نتایج پیشنهاد می‌کند که نیتروپروساید باعث افزایش تحمل گیاه به آسیب تنش اکسیداتیو حاصل از سمیت آرسنیک از طریق افزایش سیستم دفاعی آنتی اکسیدان و مسیر گلی اکسالاز شد که در نهایت باعث بهبود رشد گیاه شد.

واژه های کلیدی: آنزیم­های آنتی اکسیدان، سمیت فلزات سنگین، سیستم گلی‌اکسالاز، گندم، نیتروپروساید سدیم

* نویسنده مسئول، تلفن: 09153411134، پست الکترونیکی: a.mehraban@iauzah.ac.ir

مقدمه

از آنجایی که تنش­های غیرزیستی مانند شوری، خشکی و سمیت فلزات سنگین تاثیر منفی بر رشد، تولید زیست‌توده و عملکرد گیاهان دارند، امروزه شناخت پاسخ گیاهان به این تنش­های غیرزیستی اهمیت زیادی دارد (28). با توجه به نوع زندگی گیاهان و ثابت بودن آنها در خاک، مکانیسم­های محدودی برای مقابله با تنش‌های مختلف دارند. درک مکانیسم دریافت سیگنال­های محیطی توسط گیاهان و انتقال آنها به بخش‌های مختلف سلولی برای فعال‌کردن پاسخ­های سازشی گیاه، می­تواند اهمیت زیادی برای توسعه استراتژی­های اصلاحی و ترانس­ژنتیک به منظور افزایش تحمل گیاهان زراعی به تنش­های محیطی داشته باشد (15).

در دهه­های اخیر، آلودگی فلزات سمی در خاک، تبدیل به یک مشکل جدی در تولید محصولات کشاورزی در سراسر جهان شده است. آرسنیک (As) یکی از سمی­ترین فلزات سنگین است که به طور گسترده در طبیعت وجود دارد و سمیت زیادی برای تمام موجودات زنده دارد. اگرچه آرسنیک به طور مستقیم در فرآیند متابولیکی خاصی نقشی ندارد و یا با سیستم آنزیمی خاصی در ارتباط نیست، غلظت بالای آرسنیک در خاک یا محلول غذایی توسط انتقال‌دهنده‌های فسفات در گیاهان جذب می­شود که در نتیجه باعث تاثیر منفی بر فرآیندهای متابولیکی و ممانعت رشد و حتی مرگ در گیاهان می­شود (45). گیاهانی که در خاک­های حاوی غلظت بالای آرسنیک رشد می­کنند علائم ظاهری شامل کلروز و ممانعت رشد را نشان می‌دهند. آرسنیک از انتقال آب ممانعت می­کند و با القای تنش آبی در گیاه، باعث تجمع پرولین و دیگر اسمولیت­ها در گیاه می­شود (45). آرسنیک همچنین تولید انواع اکسیژن­های فعال مانند اکسیژن منفرد، رادیکال سوپراکسید، پراکسید هیدروژن و رادیکال هیدروکسیل را در گیاه القا می­کند که باعث ایجاد تنش اکسیداتیو در گیاهان می­شود. متیل گلی­اگسال یکی دیگر از ترکیبات بسیار سمی در گیاهان است که تحت سمیت فلزات سنگین به میزان زیادی تجمع می‌یابد (49). هر دو ترکیبات انواع اکسیژن فعال و متیل گلی­اکسال برای سلول­های گیاه بسیار سمی هستند و در غیاب مکانیسم محافظتی، با ماکرومولکول­های مهم سلولی مانند پروتئین­ها، لیپیدها و DNA واکنش می­دهند و باعث آسیب به آنها می­شود (49).

برای جلوگیری از آسیب­های سلولی ناشی از رادیکال­ها آزاد، گیاهان دارای متابولیت­های آنتی اکسیدانی آنزیمی و غیرآنزیمی هستند که نقش مهمی در خنثی­سازی رادیکال­های آزاد دارند (28). سیستم دفاعی آنتی اکسیدان گیاهان شامل آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پروکسیداز، گلوتاتیون S-ترانسفراز و چهار آنزیم چرخه آسکوربات-گلوتاتیون (آسکوربات پراکسیداز، مونو دهیدروآسکوربات ردوکتاز، دهیدروآسکوربات ردوکتاز و گلوتاتیون ردوکتاز) و به همراه ترکیبات غیرآنزیمی مانند گلوتاتیون و آسکوربات می­باشد (6، 34). در گیاهان، متیل گلی­اکسال عمدتاً با حفظ همئوستازی گلوتاتیون به وسیله سیستم گلی اکسالاز سمیت­زدایی می‌شوند که شامل دو آنزیم، گلی اکسالاز I و II می­باشد (49). آنزیم گلی اکسالاز I با استفاده از گلوتاتیون احیاشده، متیل گلی­اکسال را به S-D-لاکتوگلوتاتیون تبدیل می­کند، و سپس آنزیم گلی اکسالاز II ترکیب S-D-لاکتوگلوتاتیون را با احیای یک گلوتاتیون به D-لاکتات تبدیل می­کند (30). نشان داده شده است که آنزیم­های سیستم گلی اکسالاز در پاسخ گیاهان به تنش­های مختلف محیطی از جمله فلزات سنگین نقش مهمی دارند (37). همچنین گزارش شده است که تنظیم یا القای هماهنگ هر دو مسیر آنتی اکسیدان و گلی اکسالاز برای تحمل گیاهان در مقابل تنش­های اکسیداتیو ضروری هستند (15).

اخیرا مونوکسید نیتروژن (NO) به عنوان یک مولکول پیامبر مهم شناخته است که گزارشات متعددی نشان داده است که کاربرد خارجی ترکیبات آزادکننده مونوکسید نیتروژن باعث تحمل گیاه به تنش­های غیرزستی می­شود (15، 16). چندین مطالعه ثابت کرده است که نقش محافظتی مونوکسید نیتروژن در مقابل تنش­های زیستی تا حد زیادی مربوط به کاهش انواع رادیکال­های آزاد القا شده توسط مونوکسید نیتروژن در گیاهان است (5). نتایج چندین تحقیق نشان داد که کاربرد خارجی مونوکسید نیتروژن در فرم­ها و غلظت­های مختلف به گیاه در مقابله با اثرات زیان­بار سمیت فلزات سنگین از طریق کاهش جذب و تجمع فلزات سنگین و تقلیل تنش اکسیداتیو حاصل از فلز سنگین کمک می­کند (47). علاوه براین، مونوکسید نیتروژن از سلول­های گیاهی در مقابل تنش اکسیداتیو با تحریک سنتز گلوتاتیون محافظت می­کند (21). مطالعات اخیر نشان داد گلوتاتیون نقش مهمی در تنظیم سطح متیل گلی­اکسالاز و افزایش تحمل تنش اکسیداتیو در گیاهان بازی می­کند (17). از آنجائی که اولین آنزیم مسیر گلی­اکسالاز (گلی اکسالاز I) از گلوتاتیون به عنوان یک کوفاکتور در طی سمیت زدایی متیل اکسال استفاده می­کند، تصور می­شود که تحریک سنتز گلوتاتیون توسط مونواکسید نیتروژن ممکن است نقش مهمی در سمیت­زدایی متیل اکسال به وسیله آنزیم­های مسیر گلی اکسالاز ایفا کند (49). با توجه به سمیت آرسنیک بر رشد گیاه، نقش سدیم نیتروپروساید (SNP) به عنوان یک آنتی­اکسیدان موثر و با تاثیرات مطلوب، در کاهش تنش اکسیداتیو ناشی از قرار گرفتن گیاهچه­های گندم در شرایط سمیت آرسنیک مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها

این پژوهش به صورت هیدروپونیک در سال 1397 در گلخانه دانشگاه پیام نور زاهدان به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار به صورت گلخانه­ای انجام گرفت. تیمارها شامل آرسنیک (دی سدیم آرسنات Na₂HAsO₄) در سه غلظت (صفر، 25 و 50 میکرومولار دی­سدیم آرسنات به ترتیب شامل 0، 038/0 و 075/0 میلی­گرم بر لیتر آرسنیک خالص) و سدیم نیتروپروساید (Na₂[Fe(CN)₅NO].2H₂O) در سه غلظت (صفر، 50 و 100 میکرومولار به ترتیب به میزان 0، 1/13 و 2/26 میلی­گرم بر لیتر نیتروپروساید) به صورت کشت هیدروپونیک بر روی گیاه گندم رقم هامون به طور همزمان اعمال شدند. برای جلوگیری از افزایش غلظت سدیم و القای تنش در زمان اعمال تیمارها، غلظت سدیم­های موجود در ترکیات دی­سدیم آرسنات و نیتروپروساید تحت هر تیمار محاسبه شد و به همان میزان از غلظت سدیم در زمان ساخت محلول هوگلند کاسته شد (از مولیبدات به جای سدیم مولیبدات استفاده شد).

کشت گیاه و اعمال تیمار: بذرهای گندم رقم هامون بعد از ضدعفونی، در سینی­های مخصوص جوانه­دار شدند و بعد از 10 روز، گیاهچه­های یک دست انتخاب و در گلدان­های پلاستیکی دو لیتری مخصوص (دو گیاهچه در هر گلدان) به منظور کشت هیدروپونیک انتقال داده شدند. از محیط کشت هوگلند برای کشت هیدروپونیک استفاده شد و برای هوادهی از پمپ هوا استفاده شد. pH محیط کشت روزانه بررسی شد و هر پنج روز محلول گلدان­ها تعویض شدند. 10 روز بعد از کاشتن گیاهچه­ها و سازگاری با شرایط گلدان­ها، تیمارها اعمال شدند. بعد از 20 روز اعمال تیمارها، نمونه­برداری انجام شد. وزن خشک نمونه­ها بعد از خشک کردن در آون اندازه­گیری شد. برای انجام آزمایشات بیوشیمیایی نمونه­های تازه در فریزر و دمای 80- نگهداری شدند.

رنگیزه­های فتوسنتزی، پرولین و محتوای نسبی آب (RWC): محتوای کلروفیل a و b با استفاده از هموژن شدن نمونه­های برگ (5/0 گرم) با 10 میلی­لیتر استون 80 درصد و سپس سانتریفیوژ در 10000 دور به مدت 10 دقیقه تعیین شد. جذب محلول رویی در طول موج­های 663 و 645 نانومتر اندازه­گیری شد و محتوای رنگیزه­ها محاسبه گردید (2). جهت اندازه­گیری پرولین آزاد از عصاره الکلی برگ استفاده شد. پرولین با قرائت جذب واکنش نین­هیدرین در طول موج 515 نانومتر محاسبه شد (3). برای تعیین محتوای نسبی آب برگ از جوان­ترین برگ بالغ در هر گیاه تعداد پنج دیسک برگی تهیه و برای تعیین وزن تر نمونه­ها، بلافاصله وزن شدند (FW)، سپس تمامی نمونه­ها به مدت 24 ساعت در دمای اتاق و در تاریکی در آب مقطر غوطه­ور گردیده و وزن اشباع آنها اندازه­گیری شد (TM). بعد از آن نمونه­ها به مدت 48 ساعت در دمای 80 درجه سانتی‌گراد در آون خشک شدند و وزن خشک آنها تعیین گردید (DW). با استفاده از رابطه­های زیر، میزان RWC محاسبه شد (38).

RWC (%) =

پراکسیداسیون لیپید و پراکسید هیدروژن (H₂O₂): با تعیین محتوای مالون دی آلدئید (MDA) با استفاده از روش اسید تیوباربیتوریک و ضریب خاموشی  mM^-1cm^-1155، میزان پراکسیداسیون لیپید غشا اندازه­گیری شد (18). پراکسید هیدروژن با هموژنیزه شدن 5/0 گرم برگ تازه گیاه با 3 میلی­لیتر بافر پتاسیم-فسفات 50 میلی­مولار در دمای 4 درجه و سانتریفیوژ شدن در 11500 دور به مدت 15 دقیقه عصاره‌گیری شد. سپس 3 میلی­لیتر از محلول رویی با یک میلی­لیتر از محلول TiCl₄ 1 درصد مخلوط و به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. بعد از سانتریفیوژ در 15000 دور به مدت 15 دقیقه، میزان جذب محلول رویی در طول موج 410 نانومتر خوانده شد (50).

آسکوربات و گلوتامات: نمونه تازه برگی (5/0 گرم) در سه میلی­لیتر بافر اسیدی (5% متا-فسفریک اسید شامل یک میلی­مولار EDTA) هموژن شد. بعد از سانتریفیوژ در 11500 دور به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد، از محلول رویی برای آنالیز آسکوربات و گلوتاتیون استفاده شد. بعد از خنثی­سازی محلول رویی با بافر پتاسیم-فسفات 5/0 میلی­مولار (pH 7)، جذب محلول با استفاده از اسپکتوفتومتر در طول موج 265 نانومتر خوانده شد و با استفاده از منحنی استاندارد آسکوربات، محتوای آسکوربات محاسبه گردید (22). محتوای گلوتاتیون با قرائت در طول موج 412 نانومتر مطابق روش قبلا توضیح داده شده، اندازه­گیری شد (50).

عصاره آنزیمی و سنجش فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدان: بافت تازه برگ (5/0 گرم) در یک میلی­لیتر از بافر پتاسیم-فسفات 50 میلی­مولار (pH 7) شامل KCl 100 میلی­مولار، آسکوربات 1 میلی­مولار، بتا-مرکاپتواتانول 5 میلی­مولار و گلیسرول 10 درصد هموژن شد. از محلول رویی بعد از سانتریفیوژ در 11500 دور به مدت 10 دقیقه برای تعیین فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان استفاده شد.

محلول واکنش شامل بافر پتاسیم-فسفات 50 میلی­مولار، آسکوربات 5/0 میلی­مولار، پراکسید هیدروژن 1/0 میلی­مولار، EDTA 1/0 میلی­مولار و عصاره آنزیمی در حجم نهایی 700 میکرولیتر می­باشد. فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز براساس میزان کاهش در جذب در طول موج 290 نانومتر به مدت یک دقیقه محاسبه شد (31).

فعالیت آنزیم مونودهیدروآسکوربات ردوکتاز با محلول واکنش شامل بافر Tris-HCl 50 میلی­مولار (pH 7.5)، NADPH  2/0 میلی­مولار، آسکوربات 5/2 میلی­مولار، 5/0 واحد آسکوربات اکسیداز و عصاره آنزیمی در حجم نهایی 700 میکرولیتر اندازه‌گیری شد. با توجه به تغییر در جذب 340 نانومتر به میزان یک دقیقه، فعالیت آنزیم مونودهیدروآسکوربات ردوکتاز محاسبه شد (19).

محلول واکنش برای اندازه­گیری فعالیت آنزیم دهیدروآسکوربات ردوکتاز شامل بافر پتاسیم-فسفات 50 میلی­مولار (pH 7)، گلوتاتیون 5/2 میلی­مولار و دهیدروآسکوربات 1/0 میلی­مولار اندازه­گیری شد. فعالیت آنزیم با قرائت جذب در طول موج 265 نانومتر به مدت 1 دقیقه محاسبه شد (31).

با استفاده از محلول واکنش شامل بافر پتاسیم-فسفات 50 میلی­مولار (pH 7)، EDTA 1 میلی­مولار، گلوتاتیون اکسید شده 1 میلی­مولار، NADPH  2/0 میلی­مولار و عصاره آنزیمی در حجم نهایی 1 میلی­مولار، فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز اندازه­گیری شد. با خواندن میزان کاهش در جذب طول موج 340 نانومتر به مدت 1 دقیقه، فعالیت آنزیم محاسبه شد (17).

فعالیت آنزیم گلوتاتیون S-ترانسفراز با قرائت میزان افزایش در جذب طول موج 340 نانومتر به مدت یک دقیقه محاسبه شد که محلول واکنش شامل بافر Tris-HCl 100 میلی­مولار (pH 6.5)، گلوتاتیون 5/1 میلی­مولار، 1-کلرو 2 و 4-دی‌نیتروبنزن 1 میلی­مولار و عصاره آنزیمی در حجم نهایی 700 میکرومولار بود (20).

فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز بر اساس محلول واکنش شامل بافر پتاسیم-فسفات 100 میلی­مولار (pH 7)، EDTA 1 میلی­مولار، سدیم‌آزید (NaN₃) 1 میلی­مولار، NADPH  12/0 میلی­مولار، گلوتاتیون 2 میلی­مولار، 1 واحد گلوتاتیون ردوکتاز، پراکسید هیدروژن 6/0 میلی­مولار و عصاره آنزیمی اندازه‌گیری گردید. با اندازه­گیری اکسیداسیون NADPH در طول موج 340 نانومتر به مدت 1 دقیقه فعالیت آنزیم محاسبه شد (6).

فعالیت آنزیم کاتالاز براساس میزان کاهش در جذب 240 نانومتر در یک دقیقه از تجزیه پراکسید هیدروژن محاسبه شد. محلول واکنش شامل بافر پتاسیم-فسفات 50 میلی­مولار (pH 7)، پراکسید هیدروژن 15 میلی­مولار و عصاره آنزیمی در حجم نهایی 700 میکرولیتر می­باشد (17).

فعالیت آنزیم گلی اکسالاز I با قرائت میزان افزایش در جذب طول موج 240 نانومتر و محلول واکنش شامل بافر پتاسیم فسفات 100 میلی­مولار (pH 7)، سولفات منیزیم 15 میلی­مولار، گلوتاتیون 7/1 میلی­مولار، متیل گلی‌اکسال 5/3 میلی­مولار در حجم نهایی 700 میکرولیتر محاسبه گردید (17).

فعالیت آنزیم گلی اکسالاز II با استفاده. محلول واکنش شامل بافر Tris-HCl  100 میلی­مولار (pH 7.2)، 5،´5-دی­تیو بیس (2-نیتروبنزوئیک اسید) (DTNB) 2/0 میلی­مولار و S-D-لاکتوگلوتاتیون در حجم نهایی 1 میلی­لیتر از اندازه­گیری شد (35).

تجزیه و تحلیل داده­ها: تجزیه واریانس داده­ها با استفاده از نرم افزار SAS و مقایسه میانگین داده­ها توسط آزمون حداقل تفاوت معنی‌داری (LSD) در سطح پنج درصد انجام شد و رسم نمودار با برنامه Excel صورت پذیرفت.

نتایج

تولید زیست­توده و محتوای نسبی آب برگ: نتایج تجزیه واریانس نشان داد اثر تیمار نیتروپروساید و آرسنیک بر روی وزن تر ریشه در سطح یک درصد معنی­دار بوده است (جدول 1). نتایج مقایسه میانگین نشان داد تیمار آرسنیک با غلظت 50 میکرومولار باعث کاهش وزن تر ریشه به میزان 2/11 درصد نسبت به تیمار شاهد (بدون آرسنیک و نیتروپروساید) شد. در تمام سطوح آرسنیک، نیتروپروساید باعث افزایش وزن تر ریشه شد که بیشترین تاثیر افزایشی تحت غلظت 100 میکرومولار مشاهده شد (جدول 2). آنالیز واریانس داده­ها نشان داد اثر تیمار آرسنیک و نیتروپروساید بر وزن تر اندام هوایی و وزن تر کل در سطح یک درصد و اثر متقابل تیمارها بر وزن تر اندام هوایی در سطح 5 درصد و بر وزن تر کل در سطح یک درصد معنی­دار بود (جدول 1). مقایسه میانگین تیمارها نشان داد هر دو غلظت آرسنیک باعث کاهش معنی­دار وزن تر اندام هوایی نسبت به تیمار شاهد شد و درحالی که نیتروپروساید باعث بهبود وزن تر اندام هوایی تحت سمیت آرسنیک شد. تیمار آرسنیک همچنین باعث کاهش وزن تر کل گیاه شد به طوری که بیشترین میزان کاهش تحت غلظت 50 میکرومولار مشاهده شد اما نیتروپروساید باعث افزایش وزن تر کل در تمام سطوح آرسنیک شد و بیشترین میزان وزن تر کل تحت تیمار آرسنیک 25 میکرومولار + نیتروپروساید 100 میکرومولار ثبت گردید (جدول 2). تیمار آرسنیک، نیتروپروساید و اثر متقابل آنها بر محتوای نسبی آب برگ نیز در سطح یک درصد معنی­دار بود (جدول 1). در گیاهان بدون تیمار آرسنیک، تیمار نیتروپروساید باعث کاهش محتوای نسبی آب برگ نسبت به شاهد شد. همچنین تیمار آرسنیک به ویژه در غلظت 50 میکرومولار باعث کاهش معنی­داری در محتوای نسبی آب برگ شد بطوریکه در غلظت 50 میکرومولار آرسنیک محتوای نسبی آب برگ 19 درصد کاهش نسبت به تیمار شاهد داشت. اما تحت تیمارهای 25 و 50 میکرومولار آرسنیک، استفاده از نیتروپروساید باعث بهبود محتوای نسبی آب برگ شد و که بیشترین افزایش تحت غلظت 100 میکرومولار مشاهده شد (جدول 2).

رنگیزه­های فتوسنتزی، محتوای پرولین، مالون دی آلدئید و پراکسید هیدروژن: نتایج آنالیز واریانس نشان داد اثر آرسنیک، نیتروپروساید و اثر متقابل آنها بر محتوای کلروفیل a و b در سطح یک درصد معنی بود (جدول 1). نتایج مقایسه میانگین نشان داد در هر دو کلروفیل a و b، افزایش غلظت آرسنیک باعث کاهش محتوای آنها شد و کمترین میزان کلروفیل a و b تحت غلظت 50 میکرومولار آرسنیک مشاهده شد، با این حال تحت تیمار بدون آرسنیک، نیتروپروساید باعث کاهش میزان رنگیزه­های فتوسنتزی نسبت به تیمار شاهد شد اما در غلظت 25 میکرومولار آرسنیک، تیمار 50 میکرومولار نیتروپروساید باعث افزایش و تحت غلظت 50 میکرومولار آرسنیک، هر دو غلظت نیتروپروساید (25 و 50 میکرومولار) باعث افزایش و بهبود غلظت رنگیزه­های کلروفیل نسبت به تیمار آرسنیک بدون نیتروپروساید شد (جدول 2). نتایج مربوط به نسبت کلروفیل a/b نشان داد افزایش غلظت آرسنیک تاثیر معنی­داری بر نسبت کلروفیلی نداشت اما استفاده از نیتروپروساید تحت تیمار بدون آرسنیک باعث کاهش، تحت تیمار 25 میکرومولار آرسنیک باعث افزیش و تحت تیمار 50 میکرومولار آرسنیک تاثیر معنی­داری نداشت (جدول 2).

جدول 1- تجزیه واریانس تاثیر آرسنیک، نیتروپروساید و اثر متقابل آنها بر صفات مورفولوژی، محتوای نسبی آب، رنگیزه فتوسنتزی، پرولین، مالون دی آلدئید و پراکسید هیدروژن

* و ** به ترتیب معنی­دار در سطح 5 و 1 درصد، ns غیرمعنی­دار

جدول 2- اثر متقابل آرسنیک و نیتروپروساید بر صفات مورفولوژی، محتوای نسبی آب، رنگیزه فتوسنتزی، پرولین، مالون دی آلدئید و پراکسید هیدروژن

برای هر پارامتر در هر ستون، میانگین­های دارای حروف مشترک براساس آزمون LSD در سطح پنج درصد تفاوت معنی­داری با یکدیگر ندارند.

نتایج آنالیز واریانس نشان داد اثر تیمار آرسنیک، نیتروپروساید و اثر متقابل آنها بر صفات پرولین، مالون دی آلدئید و پراکسید هیدروژن در سطح یک درصد معنی­دار بود (جدول 1). نتایج مقایسه میانگین نشان داد تحت تیمار آرسنیک، محتوای پرولین افزایش یافت که بیشترین میزان افزایش در غلظت 50 میکرومولار مشاهده شد. همچنین تیمار نیتروپروساید باعث افزایش بیشتر پرولین شد به طوری که بیشترین میزان پرولین تحت تیمار آرسنیک 50 میکرومولار + نیتروپروساید 50 میکرومولار مشاهده شد (جدول 2). تیمار آرسنیک باعث افزایش تولید مالون دی آلدئید شد به طوری که تحت غلظت­های 25 و 50 میکرومولار آرسنیک به ترتیب به میزان 63 و 173درصد نسبت به تیمار شاهد افزایش یافت. اما استفاده از نیتروپروساید باعث کاهش محتوای مالون دی آلدئید در تمام سطوح آرسنیک شد (جدول 2). محتوای پراکسید هیدروژن که نشان دهنده میزان تنش اکسیداتیو در گیاه می­باشد، با افزایش غلظت آرسنیک افزایش معنی­داری نسبت به گیاهان شاهد داشتند با این حال تیمار نیتروپروساید باعث کاهش محتوای پراکسید هیدروژن شد که غلظت 100 میکرومولار تاثیر بیشتری در میزان کاهش پراکسید هیدروژن نسبت به غلظت 50 میکرومولار داشت (جدول 2).

محتوای آسکوربیک اسید، گلوتاتیون احیا شده، گلوتاتیون اکسید شده و نسبت گلوتاتیون احیا شده به اکسید شده: نتایج آنالیز واریانس نشان داد اثر تیمار آرسنیک و نیتروپروساید بر غلظت آسکوربیک اسید، گلوتاتیون احیا شده و اکسید شده و همچنین نسبت گلوتاتیون احیا شده به اکسید شده در سطح یک درصد و اثر متقابل تیمارها بر صفات آسکوربیک اسید و گلوتاتیون اکسید شده در سطح یک درصد و بر گلوتاتیون احیا شده و نسبت گلوتاتیون احیا شده به اکسید شده در سطح 5 درصد معنی­دار داشت (جدول 3). مقایسه میانگین نشان داد افزایش غلظت آرسنیک باعث کاهش غلظت آسکوربیک اسید نسبت به تیمار شاهد شد و تیمار نیتروپروساید باعث بهبود و افزایش آسکوربیک اسید در تمام سطوح آرسنیک شد (شکل 1 الف). گلوتاتیون احیا شده با افزایش غلظت آرسنیک افزایش معنی­داری نسبت به گیاه شاهد پیدا کرد به طوریکه بیشترین میزان گلوتاتیون احیا شده تحت غلظت 50 میکرومولار آرسنیک مشاهده شد. نیتروپروساید در تمام سطوح غلظت آرسنیک باعث افزایش بیشتز گلوتاتیون شد که بیشترین تاثیر تحت غلظت 100 میکرومولار نیتروپروساید مشاهده گردید (شکل 1 ب). افزایش غلظت آرسنیک باعث افزایش محتوای گلوتاتیون اکسید شده شد که تیمار 25 و 50 میکرومولار باعث افزایش گلوتاتیون اکسید شده به ترتیب به میزان 69 و 138 درصد نسبت به تیمار شاهد شد. نیتروپروساید در تیمار بدون آرسنیک باعث افزایش اما در سطوح 25 و 50 میکرومولار آرسنیک باعث کاهش محتوای گلوتاتیون اکسید شده شد (شکل 1 پ). غلظت­های 25 و 50 میکرومولار آرسنیک به ترتیب باعث کاهش نسبت گلوتاتیون احیا شده به اکسید شده به میزان 9/8 و 6/20 درصد نسبت به گیاه شاهد شد درحالی که تیمار نیتروپروساید باعث بهبود نسبت گلوتاتیونی در هر دو غلظت آرسنیک شد که غلظت 100 میکرومولار نیتروپروساید تاثیر بیشتری نسبت به غلظت 50 میکرومولار داشت (شکل 1 ت).

فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدان: اثر تیمار آرسنیک و اثر متقابل آنها در سطح یک درصد و اثر تیمار نیتروپروساید در سطح پنج درصد بر فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز معنی­دار بود (جدول 4). تجزیه واریانس نشان داد اثر تیمار آرسنیک، نیتروپروساید و اثر متقابل آنها بر فعالیت آنزیم­های گلوتاتیون ردوکتاز، گلوتاتیون S-ترانسفراز، گلوتاتیون پراکسیداز و کاتالاز درسطح یک درصد معنی­دار بود (جدول 4).

جدول 3- تجزیه واریانس تاثیر آرسنیک، نیتروپروساید و اثر متقابل آنها بر محتوای آسکوربیک اسید و گلوتاتیون

* و ** به ترتیب معنی­دار در سطح 5 و 1 درصد، ns غیرمعنی­دار

جدول 4- تجزیه واریانس تاثیر آرسنیک، نیتروپروساید و اثر متقابل آنها بر فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدان

* و ** به ترتیب معنی­دار در سطح 5 و 1 درصد، ns غیرمعنی­دار

شکل 1- اثر نیتروپروساید (NO0: 0، NO1: 50 و NO2: 100 میکرومولار) بر محتوای آسکوربیک اسید (الف)،  گلوتاتیون احیا شده (ب)، گلوتاتیون اکسید شده (پ) و نسبت گلوتاتیون احیا شده به اکسید شده (ت) در سطوح مختلف آرسنیک (As0: 0، As1: 25 و As2: 50 میکرومولار). میانگین­های دارای حروف مشترک براساس آزمون LSD در سطح پنج درصد تفاوت معنی­داری با یکدیگر ندارند.

نتایج مقایسه میانگین نشان داد افزایش غلظت آرسنیک باعث افزایش معنی­دار فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز نسبت به تیمار شاهد شد و بیشترین میزان فعالیت تحت غلظت 50 میکرومولار آرسنیک مشاهده شد. نیتروپروساید تاثیر معنی­داری تحت غلظت 25 میکرومولار آرسنیک نداشت اما غلظت 50 میکرومولار نیتروپروساید تحت غلظت 50 میکرومولار آرسنیک باعث افزایش بیشتر فعالیت آنزیم شد و در دیگر غلظت تاثیر معنی­داری نداشت (شکل 2 الف). اثر تیمار آرسنیک، نیتروپروساید و اثر متقابل آنها بر فعالیت دو آنزیم مونودهیدرو آسکوربات ردوکتاز و دهیدروآسکوربات ردوکتاز در سطح پنج درصد تاثیر معنی­داری داشت (جدول 4). اعمال تیمار آرسنیک در دو غلظت 25 و 50 میکرومولار باعث کاهش فعالیت هر دو آنزیم مونودهیدرو آسکوربات ردوکتاز و دهیدروآسکوربات ردوکتاز نسبت به تیمار شاهد شد و بیشترین کاهش تحت غلظت 50 میکرومولار مشاهده شد، اما تیمار نیتروپروساید باعث افزایش فعالیت این دو آنزیم در تمام سطوح آرسنیک شد که تحت غلظت 25 میکرومولار آرسنیک تیمار 100 میکرومولار و تحت غلظت 50 میکرومولار آرسنیک تیمار 50 میکرومولا نیتروپروساید بیشترین تاثیر را داشت (شکل 2 ب و 3 الف).

شکل 2- اثر نیتروپروساید (NO0: 0، NO1: 50 و NO2: 100 میکرومولار) بر فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (الف) و آنزیم مونودهیدرو آسکوربات ردوکتاز (ب) در سطوح مختلف آرسنیک (As0: 0، As1: 25 و As2: 50 میکرومولار). میانگین­های دارای حروف مشترک براساس آزمون LSD در سطح پنج درصد تفاوت معنی­داری با یکدیگر ندارند.

تیمار آرسنیک باعث افزایش فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز نسبت به تیمار شاهد شد بطوریکه بیشترین افزایش تحت غلظت 25 میکرومولار آرسنیک مشاهده شد. استفاده از نیتروپروساید نیز باعث افزایش بیشتر فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز در تمام سطوح آرسنیک شد (شکل 3 ب). فعالیت آنزیم گلوتاتیون S-ترانسفراز با افزایش غلظت آرسنیک روند افزایشی نشان داد که بیشترین فعالیت تحت غلظت 50 میکرومولار آرسنیک مشاهده شد و تیمار نیتروپروساید در غلظت 50 میکرومولار باعث کاهش فعالیت آنزیم شد درحالیکه غلظت 100 میکرومولار تاثیر معنی­داری در فعالیت آنزیم گلوتاتیون S-ترانسفراز نداشت (شکل 3 پ). فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز نیز با اعمال تیمار آرسنیک کاهش یافتند که افزایش غلظت آرسنیک باعث کاهش بیشتر فعالیت آن شد. با این حال، تیمار نیتروپروساید باعث افزایش فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز در سطوح مختلف آرسنیک شد که بیشترین افزایش در غلظت 50 میکرومولار نیتروپروساید مشاهده شد (شکل 3 ت). غلظت 25 میکرومولار آرسنیک باعث افزایش فعالیت کاتالاز به میزان 6/8 درصد و غلظت 50 میکرومولار آرسنیک باعث کاهش فعالیت کاتالاز به میزان 8/13 درصد نسبت به تیمار شاهد شد. درحالیکه نیتروپروساید در تمام سطوح آرسنیک باعث بهبود و افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز شد (شکل 4 الف).

بحث و نتیجه گیری

همان طور که گزارش شده بود، افزایش تجمع آرسنیک خاک، حتی در غلظت کم، بر روی رشد و عملکرد گیاه گندم تاثیر می­گذارد (15). تیمار آرسنیک به خصوص در غلظت 50 میکرومولار باعث کاهش وزن تر ریشه و اندام هوایی و همچنین وزن تر کل گیاه نسبت به گیاه شاهد شد که مطابق نتایج به دست آمده از تاثیر آرسنیک بر گیاه کاهوی آبی (Pistia stratiotes) (7) و گیاه لادن (32) می­باشد.

شکل 3- اثر نیتروپروساید (NO0: 0، NO1: 50 و NO2: 100 میکرومولار) بر فعالیت آنزیم دهیدروآسکوربات ردوکتاز (الف)، آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز (ب)، گلوتاتیون S-ترانسفراز (پ) و گلوتاتیون پراکسیداز (ت) در سطوح مختلف آرسنیک (As0: 0، As1: 25 و As2: 50 میکرومولار). میانگین­های دارای حروف مشترک براساس آزمون LSD در سطح پنج درصد تفاوت معنی­داری با یکدیگر ندارند.

شکل 4- اثر نیتروپروساید (NO0: 0، NO1: 50 و NO2: 100 میکرومولار) بر فعالیت آنزیم کاتالاز (الف)، آنزیم  گلی اکسالاز I (ب) و گلی اکسالاز II (پ) در سطوح مختلف آرسنیک (As0: 0، As1: 25 و As2: 50 میکرومولار). میانگین­های دارای حروف مشترک براساس آزمون LSD در سطح پنج درصد تفاوت معنی­داری با یکدیگر ندارند.

افزایش تجمع آرسنیک با افزایش تولید انواع رادیکال­های آزاد، باعث برهم زدن تعادل پتانسیل ردوکس سلولی و افزایش ظرفیت اکسیداسیون سلول می­شود که به طور منفی بر روی چندین فرآیند فیزیولوژیکی گیاه تاثیر گذاشته و حتی باعث مرگ گیاه می­شود (42). اثرات سمی آرسنیک در حضور یک ترکیب آزاد کننده NO کاهش می­یابد که می­تواند به خاطر افزایش ظرفیت آنتی اکسیدان گیاه باشد. در حقیقت، NO به عنوان یک پیامبر سلولی با فعال­سازی سیستم­های آنتی اکسیدان در سلول­ها و همچنین به عنوان یک آنتی اکسیدان با حذف مستقیم رادیکال­های آزاد سلولی عمل می­کند که می‌تواند باعث بهبود تحمل گیاه تحت سمیت آرسنیک شود (42، 46).

محتوای نسبی آب گیاه به عنوان یک فاکتور کارآمد برای ارزیابی تحمل گیاه به تنش اسمزی حاصل از سمیت آرسنیک مورد بررسی قرار گرفت. نتایج ما نشان داد آرسنیک به خصوص در غلظت 50 میکرومولار منجر کاهش چشمگیر محتوای نسبی آب برگ گیاه گندم شد که نتایج مشابهی بر روی گیاه لوبیا گزارش شده است (43). با اینحال، نیتروپروساید تا اندازه­ای باعث بهبود محتوای نسبی آب برگ تحت سطوح مختلف آرسنیک شد که مطابق نتایج بدست آمده در مطالعات قبلی می­باشد (26). محتوای کلروفیل برگ یک فاکتور مهم می­باشد که نشان دهنده میزان فتوسنتز در گیاهان می­باشد و یکی از مهمترین معیارهای سلامت گیاه می­باشند (12). یکی از مهمترین اثرات فلزات سمی بر گیاهان، کاهش رنگیزه­های فتوسنتزی برگ می­باشد (10). نتایج نشان داد که محتوای کلروفیل برگ تحت سمیت آرسنیک کاهش معنی­داری یافت که این کاهش می­تواند دلایل مختلفی از جمله پراکسیداسیون غشاهای کلروپلاست، افزایش فعالیت کلروفیلاز و میان­کنش فلز سنگین با گروه سولفید (-SH) آنزیم­های درگیر در سنتز کلروفیل داشته باشد (44). با این حال، گزارش شده است که NO توانایی کاهش این اثرات تحت شرایط تنش­زا از جمله فلزات سنگین را دارد (40) که مطابق نتایج به دست آمده در این تحقیق می­باشد. در گزارش دیگری بیان شد که اثرات کلروزه شدن فلزات سنگین توسط ترکیبات آزاد کننده NO کاهش می­یابد (21). نتایج این تحقیق همچنین نشان داد محتوای پرولین تحت سمیت آرسنیک افزایش یافت و نیتروپروساید باعث افزایش بیشتر پرولین در گیاهچه­های گندم شد. این نتایج بیان می­کند که کاربرد نیتروپروساید باعث افزایش تولید پرولین و کاهش تنش اکسیداتیو شد که در نتیجه باعث بهبود تحمل گیاهچه‌های گندم به سمیت آرسنیک می­شود. گزارش شده است که نیتروپروساید (به عنوان آزاد کننده NO) با افزایش بیان آنزیم سنتزکننده پرولین (P5CS) باعث افزایش تجمع پرولین تحت تنش در گیاه گندم می­شود (27). نتایج مشابهی از افزایش محتوای پرولین تحت تیمار نیتروپروساید قبلا گزارش شده است (9، 47).

مشابه دیگر تنش­های محیطی، غلظت­های سمی آرسنیک نیز باعث افزایش تولید انوع اکسیژن فعال در گیاه می­شود (14). در این تحقیق، افزایش غلظت آرسنیک باعث افزایش محتوای مالون دی آلدئید شد که می­تواند به علت افزایش در فعالیت آنزیم­های مسئول در تجزیه پراکسیدهای لیپید باشد. افزایش در محتوای مالون دی آلدئید توسط محققان دیگری نیز گزارش شده است (41، 42). آرسنیک همچنین باعث افزایش محتوای پراکسید هیدروژن شد. افزایش تولید مالون دی آلدئید و پراکسید هیدروژن نشان دهنده سیستم دفاعی ناکارآمد از آنزیم­های آنتی اکسیدان می­باشد. با این حال، استفاده از نیتروپروساید باعث کاهش قابل توجه­ای در محتوای مالون دی آلدئید و پراکسید هیدروژن در مقایسه با تیمارهای آرسنیک بدون نیتروپروساید شد. این کاهش محتوای مالون دی آلدئید و نیتروپروساید می­تواند ناشی از فعالیت پایدار بالای آنزیم­های آنتی اکسیدان خنثی­کننده رادیکال­های آزاد در گیاهچه­های گندم تیمار شده با نیتروپروساید باشد. بیان شده است که که NO یک مهارکننده قوی پراکسیداسیون لیپید می­باشد (36). همچنین گزارش شده است که NO به صورت غیر مستقیم باعث خنثی­سازی انواع رادیکال­های آزاد می­شود و با تعدیل فرآیندهای مختلف فیزیولوژیکی، باعث کاهش آسیب اکسیداتیو و در نتیجه محافظت از مرگ سلول­های گیاهی می­شود (17، 23). این نتایج مطابق نتایج به دست آمده از این مطالعه می­باشد که افزایش غلظت نیتروپروساید باعث کاهش محتوای پراکسیدهیدروژن شد. نتایج مشابه از نقش محافظتی NO در کاهش تنش اکسیداتیو حاصل از آرسنیک یا دیگر فلزات سنگین توسط محقیق دیگری گزارش شده است (25، 41، 42).

چرخه آسکوربیک اسید-گلوتاتیون نقش کلیدی در متابولیسم پراکسیدهیدروژن در گیاهان دارد. آسکوربیک اسید، به عنوان یک آنتی اکسیدان اولیه در گیاهان، به طور مستقیم باعث احیا و خنثی­سازی رادیکال هیدروکسیل، اکسیژن منفرد و سوپراکسید می­شود (8). نتایج ما اثبات کرد که محتوای آسکوربیک اسید با افزایش سطح غلظت آرسنیک، کاهش یافت که این کاهش عمدتاً به خاطر کاهش فعالیت مونودهیدروآسکوربات ردوکتاز یا افزایش فعالیت آسکوربات پراکسیداز می­باشد. کاهش محتوای آسکوربیک اسید در گیاهان تحت تنش فلزات سنگین توسط محقیقن دیگر گزارش شده است (24). با این حال، استفاده از نیتروپروساید باعث افزایش محتوای آسکوربیک اسید نسبت به تیمار آرسنیک بدون نیتروپروساید شد. اگرچه فعالیت آسکوربیک پراکسیداز در گیاهان تیمار شده با نیتروپروساید بالاتر بود، افزایش فعالیت آنزیم­های مونودهیدروآسکوربات ردوکتاز و دهیدروآسکوربات ردوکتاز به طور موثری باعث بازیافت و افزایش سطح آسکوربیک اسید شد. این نتایج نشان می­دهد NO نقش مهمی در احیای آسکوربیک اسید ایفا می­کند که مطابق گزارشات قبلی می­باشد (14).

گزارش شده است که تحت سمیت فلزات سنگین، گلوتاتیون عملکرد سیگنالیگ دارد (39). نتایج پژوهش حاضر نشان داد تیمار آرسنیک باعث افزایش معنی­دار در محتوای گلوتاتیون احیا شده و گلوتاتیون اکسید شده شد درحالی که، نسبت گلوتاتیون احیا شده به اکسید شده کاهش پیدا کرد. افزایش در محتوای گلوتاتیون احیا شده تحت سمیت آرسنیک می­تواند ناشی از تنظیم افزایشی فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز باشد که مطابق نتایج قبلا گزارش شده می­باشد (29). تشکیل گلوتاتیون اکسید شده در گیاهان تحت تیمار آرسنیک ممکن است ناشی از واکنش گلوتاتیون با رادیکال­های آزاد تولید شده توسط تنش اکسیداتیو و یا ناشی از افزایش فعالیت آنزیم گلوتاتیون S-ترانسفراز باشد که پراکسید و هیدروپراکسیدهای آلی را تجزیه می­کند. افزایش در گلوتاتیون اکسید شده تحت تنش فلز سنگین در گیاه لوبیا (1) و برنج (29) گزارش شده است. تیمار نیتروپروساید باعث افزایش گلوتاتیون احیا شده و کاهش گلوتاتیون اکسید شده در گیاهان گندم تحت تیمار آرسنیک شد که نشان دهنده آن است که NO می­تواند باعث افزایش سنتز گلوتاتیون شود (23). علاوه بر این، تیمار نیتروپروساید باعث حفظ سطح پایین گلوتاتیون اکسید شده از طریق افزایش فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز و در نتیجه کاهش سمیت شد. نتایج نشان داد NO باعث نسبت بالاتری از گلوتاتیون احیا شده به گلوتاتیون اکسید شده تحت سمیت آرسنیک شد که نقش NO در تنظیم حالت ردوکس سلول گیاهی را نشان می‌دهد.

چرخه  آسکوربیک  اسید-گلوتاتیون  باعث  کاهش  تجمع

پراکسید هیدروژن می­شود، جایی که آسکوربات پراکسیداز باعث احیای آن به آب می­شود. افزایش غلظت آرسنیک تا اندازه­ای باعث افزایش فعالیت آسکوربات پراکسیداز شد که مشابه نتایج محققان دیگر می­باشد (1، 41). با این حال، تیمار نیتروپروساید تغییر چندانی در فعالیت این آنزیم ایجاد نکرد. مونودهیدرو آسکوربات ردوکتاز و دهیدرور آسکوربات ردوکتاز دو آنزیم مهم در بازسازی آسکوربیک اسید هستند که برای حفظ ظرفیت آنتی اکسیداتیوی آسکوربیک اسید ضروری هستند. مطابق مطالعات قبلا گزارش شده (29)، فعالیت دو آنزیم مونودهیدرو آسکوربات ردوکتاز و دهیدروآسکوربات ردوکتاز تحت سمیت آرسنیک کاهش یافتند، درحالی که تیمار نیتروپروساید باعث بهبود فعالیت این دو آنزیم تحت سمیت آرسنیک شد. گلوتاتیون ردوکتاز آنزیمی مهم در چرخه آسکوربیک اسید-گلوتاتیون می­باشد که باعث حفظ حالت احیا شده گلوتاتیون می­شود و نقش مهمی را در حفظ گروه سولفیدریل (-SH) ایفا می­کند و به عنوان سوبسترا برای گلوتاتیون S-ردوکتاز عمل می­کند (49). نتایج ما نشان داد فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز در گیاهچه­های گندم تحت تیمار آرسنیک افزایش معنی­داری یافتند که مطابق نتایج محققان دیگر است (29).

گلوتاتیون S-ترانسفراز اتصال الکتروفیل­های مختلف به گلوتاتیون و همچنین خنثی­سازی ترکیبات سمی داخلی و خارجی را کاتالاز می­کند (4). مطالعات انجام شده بر روی گیاه گندم (15) نشان داد که فعالیت آنزیم گلوتاتیون S-ترانسفراز در پاسخ به فلزات سنگین افزایش یافته بود که مطابق نتایج به دست آمده در این تحقیق می­باشد که هر دو غلظت آرسنیک باعث افزایش فعالیت این آنزیم شد. با این حال، تیمار نیتروپروساید تاثیر چندانی بر فعالیت این آنزیم نداشت. آنزیم­های گلوتاتیون پراکسیداز یک خانواده از ایزوزیم­های آنزیمی هستند از گلوتاتیون برای احیای پراکسیدهای مختلف شامل پراکسید هیدروژن استفاده می­کنند. در این تحقیق، کاهش معنی­داری در فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز تحت غلظت­های مختلف آرسنیک مشاهده شده است، با این حال، تیمار نیتروپروساید باعث افزایش بیشتر این آنزیم در مقایسه با تیمارهای آرسنیک به تنهایی شد. نتایج مشابهی از افزایش فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز بعد از تیمار نیتروپروساید تحت سمیت فلزات سنگین گزارش شده است (25). مطالعات مختلف از بررسی پاسخ گیاهان مختلف به تنش­های محیطی نشان داد آنزیم کاتالاز یکی از مهمترین و کارآمدترین آنزیم خنثی­سازی پراکسید هیدروژن می­باشد (11). نتایج ما نشان داد تیمار آرسنیک تاثیر چندانی بر فعالیت آنزیم کاتالاز نداشت حتی غلظت 50 میکرومولار باعث کاهش فعالیت کاتالاز شد که نشان می­دهد آنزیم کاتالاز نقش چندانی در کاهش پراکسید هیدروژن تحت سمیت آرسنیک نداشت که ممکن است به خاطر سنتز غیر موثر آنزیم یا تغییر در جمع شدن زیرواحدهای آنزیم باشد (13). در مقابل، تیمار نیتروپروساید تحت غلظت­های مختلف آرسنیک باعث افزایش فعالیت کاتالاز شد که نشان دهنده نقش موثر نیتروپروساید در خنثی­سازی پراکسید هیدروژن تحت سمیت آرسنیک می­باشد.

سیستم گلی اکسالاز شامل دو آنزیم گلی اکسالاز I و II می­باشد که باعث تبدیل متیل گلی اکسال به اسیدهای هیدروکسی غیر سمی مانند لاکتات می­شود (33، 48). در چندین گونه گیاهی افزایش بیان ژن این آنزیم­ها باعث افزایش تحمل گیاه به تنش­های غیرزیستی شده است (37). نتایج این تحقیق نشان داد تیمار آرسنیک باعث کاهش شدید فعالیت آنزیم گلی اکسالاز I شد در حالی که فعالیت آنزیم گلی اکسالاز II فقط تحت غلظت 50 میکرومولار آرسنیک کاهش یافت. این تغییرات در فعالیت آنزیم­های مسیر اکسالاز نشان داد که سمیت زدایی متیل اکسال توسط سیستم گلی اکسالاز تحت تنش آرسنیک کارآمد نبوده است. در مقابل، فعالیت آنزیم­های گلی اکسلاز I و II در تمام سطوح آرسنیک با استفاده از نیتروپروساید افزایش یافتند که نشان دهنده سمیت زدایی کارآمد متیل اکسال در گیاهان تحت تیمار نیتروپروساید می­باشد. نتایج مشابهی از تاثیر نیتروپروساید و فلزات سنگین بر فعالیت آنزیم سیستم گلی اکسالاز توسط محققین دیگر گزارش شده بود (14).

نتایج کلی ما در این تحقیق نشان داد که افزایش غلظت آرسنیک باعث ایجاد تنش اکسیداتیو درگیاهچه­های گندم شد که با افزایش محتوای مالون دی آلدئید و پراکسید هیدروژن همراه با ممانعت یا القای ناکارآمد آنتی‌اکسیدان­های آنزیمی و غیرآنزیمی و سیستم­های خنثی­سازی متیل اکسال نشان داده شد. با این حال، تیمار نیتروپروساید به عنوان یک ترکیب آزاد کننده NO، به طور چشمگیری باعث بهبود محتوای نسبی آب، رنگیزه­های فتوسنتزی و پرولین شد. نیتروپروساید همچنین باعث افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان و آنتی اکسیدان­های غیرآنزیمی شد که در نهایت باعث کاهش تنش اکسیداتیو (کاهش سطح پراکسید هیدروژن و مالون دی آلدئید) شد. علاوه بر این، نیتروپروساید باعث افزایش فعالیت آنزیم­های گلی اکسالاز و در نتیجه کاهش سطح ترکیب سمی متیل اکسال تحت سطوح مختلف آرسنیک و افزایش تحمل گیاه به تنش آرسنیک شد.