اثر نانوذرات اکسیدآلومینیوم بر اسپورزایی و تکوین گامتوفیت

در لوبیا (Phaseolus vulgaris L.)

عبدالکریم چهرگانی راد^*، سمانه معتبرنیا و مهسا جعفری انواری

ایران، همدان، دانشگاه بوعلی سینا، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 9/12/98                تاریخ پذیرش: 22/4/99

چکیده

پژوهش حاضر با هدف شناخت مراحل تکوین اندام­های تولیدمثلی و بررسی  اثر نانو ذره اکسید آلومینیوم بر مراحل تکوین تخمک، کیسه رویانی، پرچم و دانه­های گرده در گیاه لوبیا به عنوان یکی از عمده­ منابع غذایی انسان، طراحی شد. بذرهای لوبیا در شرایط گلخانه­ای کشت شده و با غلظت­های مختلف نانو ذره اکسید آلومینیوم (.۰۰۱/۰، ۰۱/۰ و ۱/۰ گرم بر لیتر) تیمار شدند. گل­ها در ابعاد مختلف جمع­آوری شده و پس از تثبیت، آبگیری و قالب­گیری با میکروتوم برشگیری شدند. رنگ آمیزی برش­ها از طریق هماتوکسیلین - ائوزین انجام شد. مراحل تکوین تخمک و دانه­های گرده در نمونه­های گیاهان شاهد و تحت تیمار با میکروسکوپ نوری مطالعه و عکسبرداری شد. نتایج نشان داد الگوی تکوینی در گیاهان شاهد همسو با گزارشهای پیشین بود. تخمک از نوع واژگون، کیسه رویانی از تیپ علف هفت بند (پلی گونوم)، آرایش تتراد مگاسپور اغلب خطی و به ندرت T شکل بود. تعداد پرچمها ۱۰ عدد، بساک از نوع چهار کیسه گرده ای، لایه تاپی در ابتدا از نوع ترشحی و در مراحل پایانی تکوین پرچم از نوع پلاسمودیال، آرایش تترادها از نوع تتراهدرال بود. دانه های گرده گرد تا بیضی مشاهده شد. نتایج نشان داد که در گروههای تیماری تکوین تخمک و کیسه رویانی تحت تاثیر قرار نگرفته است، اما در پرچمها کاهش زیست پذیری دانه های گرده، افزایش ضخامت لایه انتین، بی نظمی در آرایش تترادها و بی نظمی ساختاری دانه­های گرده، برخی از اثرات تیمار با نانوذره اکسید آلومینیوم بودند.

واژه های کلیدی: نانوذرات، اکسید آلومینیوم، تکوین، تخمک، دانه­های گرده

* نویسنده مسئول، تلفن:08138271541 ، پست الکترونیکی: Chehregani@basu.ac.ir

مقدمه

نانو ذرات اتم­ها یا ملکول­هایی  با ابعاد 1تا 100 نانومتر هستند که خصوصیات فیزیکی و شیمیایی متفاوتی نسبت به درشت ملکول­ها از خود بروز می­دهند. فناوری نانو بهره­برداری از ویژگی­های فیزیکی، شیمیایی و زیستی موادی با ابعاد نانو در علوم و صنایع مختلف می­باشد(1). امروزه نانوفناوری با سرعت زیادی درحال رشد است و عرصه­های مختلف علوم را تحت تاثیر قرار می­دهد. به عنوان مثال، نانوذرات در صنایع الکتریکی، بیوسنسورها، صنایع غذایی، رنگرزی، کرم­های ضدآفتاب و به­ ویژه در کشاورزی کاربرد گسترده­ای دارند (2). در عرصه کشاورزی، عرضه کودهای شیمیایی به صورت نانو ذرات به تازگی مورد توجه قرار گرفته است. البته نتایج تحقیقات نشان­دهنده واکنش­های مختلفی در گیاهان نسبت به نانو ذرات بوده ­است (3،4).

ازطرفی، با توجه به کاربرد روز افزون این ذرات در علوم و صنایع مختلف، آن­ها به صورت آزاد در طبیعت و درتماس با انسان می­باشند و دارای پتانسیل به­خطر اندازی سلامتی و زندگی انسان هستند. گیاهان در معرض محیط­های آبی و خاکی و حتی اتمسفر می­باشند، بنابراین ذرات نانو به درون گیاهان نفوذ کرده، در آن­ها باقی می­مانند و از طریق گیاهان وارد چرخه غذایی انسان می شوند(5).

از جمله مطالعاتی که در این زمینه صورت­گرفته­­است، می­توان به مطالعهYu  و همکاران در سال2011 اشاره کرد که تاثیر نانوذره آلومینیوم بر Caenorhabditis elegansرا مطالعه و نشان دادند که القای شدید پاسخ­های تنشی، تولید رادیکال­های آزاد اکسیژن و آسیب­های اکسیداتیو در اثر تیمار نانوذره آلومینیوم ایجاد شده است (۶). در جلبک­ها مکانیسم­های مختلفی برای القای سمیت، توسط نانوذرات گزارش شده­است. ازجمله، برهم­کنش شیمیایی بین ذرات (7،8)، تنشهای اکسیداتیو که منجر به مرگ سلول می­شود (9،10) و سمیت یونی (11).

برخی مطالعات نشان داده که نانوذره اکسیدآلومینیوم مانع رشد ریشه در ذرت، خیار و کلم شد؛ اما باعث افزایش رشد ریشه در تربچه گردید (12،13). گزارش شده که نانوذره­ی اکسید آهن باعث افزایش دانه های گرده ناموفق در تشکیل لوله گرده و کاهش در زیست پذیری دانه­های گرده در گیاه Arabidopsis thalianaگردید (۱۴).

در سال­های اخیر، بررسی مراحل مختلف تکوین گل شامل تکوین مادگی، تخمک، گامتوفیت ماده، پرچم و دانه گرده به طور گسترده­ای مورد توجه قرار گرفته­ است (۱۵). مطالعه­ی مراحل تکوین اندام­های تولید مثلی برای درک چگونگی حفظ بقای گیاهان نادر، گیاهان درحال انقراض و همچنین گیاهان حائز اهمیت در کشاورزی و باغبانی ضروری است (15).

باتوجه به کاربرد روزافزون نانوذرات، به ویژه نانوذره اکسید آلومینیوم در شاخه­های مختلف علوم و صنایع احتمال بروز آلودگی­های زیست محیطی وجود دارد. همچنین این ذرات دارای ابعاد ریز و سطح فعالیت بالایی هستند و در عبور از سدهای بیولوژیک بدن با مشکل چندانی مواجه نمی­شوند؛ به طورگسترده در واکنش­های زیست محیطی شرکت کرده و اثرات متفاوتی بر محیط­زیست، گیاهان و انسان دارند. پژوهش حاضر با هدف بررسی اثرنانوذره اکسیدآلومینیوم بر مراحل مختلف تکوین تخمک و دانه­های گرده در گیاه لوبیا که دارای ارزش غذایی بالایی است، طراحی و اجرا شد.

مواد و روشها

مواد گیاهی و تیمارها: گونه گیاهی Phaseolus vulgaris از تیره Fabaceae به عنوان یک مدل گیاهی در این پژوهش مورد استفاده قرارگرفت. بذرهای گیاه لوبیا رقم شکوفا، از مرکز تحقیقات کشاورزی همدان تهیه و در گلخانه پژوهشی دانشگاه بوعلی سینا همدان، به صورت کشت گلدانی در چهار گروه دوازده­تایی کاشته شدند. گیاهان در سه گروه تیماری (شامل ۵ گلدان و هر گلدان دارای ۳ دانه رست همانند) با سه غلظت 0۰۱/۰، ۰1/۰ و ۱/۰ گرم بر لیتر از نانوذره اکسیدآلومینیوم در آب مقطر به صورت اسپری برگی تیمارشد و یک گروه هم به عنوان شاهد انتخاب شد. بعد از گذشت یک ماه از رشد دانه رستها، محلول ­پاشی شروع  و هفته ای یکبار انجام و تا بعد از گلدهی ادامه پیداکرد. در هر بار اسپری هر گیاه به طور تقریبی ۵ میلی لیتر از محلولهای تیماری را دریافت می کرد.  نانوذرات مورد استفاده، از شرکت پیشگامان مشهد تهیه شد. نانوذره اکسید آلومینیوم مورد استفاده، از نوع گاما با درجه خلوص %9/99  و ابعاد 10 تا 20 نانومتر بود (شکل 1).

مطالعات میکروسکوپی: جهت مطالعات تکوینی گیاه  P. vulgaris تحت تیمار با نانو ذرات آلومینیوم، از گیاهان گروههای مختلف تیماری و شاهد، به طور جداگانه غنچه­ها و گل­ها در ابعاد متفاوت و در زمانهای مختلف از گلدهی تا کامل شدن میوه ها جمع­آوری شد. نمونه­ها در محلول FAA تثبیت شده و در الکل 70% نگهداری شدند. نمونه­ها با عبور از محلول­های الکلی با درجات افزایشی آبگیری شده و در پارافین قالب­گیری شدند(۱۶).

شکل 1- تصویر نانوذرات اکسیدآلومینیوم (سمت راست) توسط میکروسکوپ SEM و طیف اشعه X نانوذرات اکسیدآلومینیوم (سمت چپ)

قالب­ها به کمک میکروتوم دستی مدل Micro DS 4055 rotary (دید سبز، ارومیه، ایران) برش­گیری شده و با روش رنگ­آمیزی مضاعف هماتوکسیلین- ائوزین رنگ شدند (۱۵). عکس­برداری به کمک میکروسکوپ نوری Zeiss مدل Axiostar Plus (Germany) و دوربین دیجیتال Cannon مدل G11 (Japan) در بزرگنمایی­های مختلف صورت گرفت.  برای محاسبه درصد تترادهای با شکل غیر معمول، درصد دانه های گرده با انتین ضخیم و تعیین درصد آنها، حداقل در  ۱۰ لام متعلق به ۱۰ نمونه تیماری، و از هر لام حداقل ۵ بساک و ۵۰ دانه گرده مورد شمارش و بررسی قرار گرفت.

زیست­پذیری دانه­های گرده: به منظور ارزیابی زیست پذیری دانه های گرده، از ده غنچه در هر گروه تیماری دانه­های گرده جمع­آوری شده و توسط رنگ استوکارمن رنگ­آمیزی شدند. درنهایت زیست­پذیری دانه­های گرده توسط میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرار گرفت. دانه های گرده سالم، توپر و رنگ پذیر به عنوان دانه گرده زنده و دانه های گرده توخالی، شکسته و بی رنگ به عنوان دانه گرده غیر زنده منظور شدند (۱۶) که دانه های گرده غیرزیست پذیر به شکل درصدی از کل دانه های گرده محاسبه شدند

آنالیزهای آماری: آزمایش در قالب یک طرح کاملا تصادفی با پنج تکرار انجام شد. مقایسه میانگینها با آزمون دانکن توسط نرم افزار SAS انجام و مورد تجزیه و تحلیل قرارگرفت. نمودارهای مربوطه با استفاده از نرم­افزار Excel 2007  رسم شد.

نتایج

اسپورزایی و تکوین گامتوفیت در نمونه­های شاهد: پس از طی مرحله رویشی، در شرایط مناسب گلدهی، گل­ها از تحولات عده­ای از جوانه­های جانبی شروع به تشکیل می­کنند. از فعالیت سلول­های تونیکا و بخش فوقانی کورپوس، چند لایه سلول به وجود می­آید که تشکیل پرومریستم هاگزا را می­دهد. این بخش در آینده خاستگاه اندام­های زایشی گل خواهد بود( شکلA2). با افزایش تقسیمات سلولی در سلول­های تحتانی کورپوس  و سلول­های بالای مریستم مرکزی، لایه­های فشرده­ای به نام مریستم نهنج­زا تشکیل می­شوند که خاستگاه دمگل، نهنج و برخی بخش­های غیر زایشی گل است. به تدریج بخشی از مریستم زایشی اولین پریموردیوم­های پرچمی را به وجود آورده و بقیه نیز به­تدریج صرف تشکیل سایر پرچم­ها وبرچه­ها خواهد شد. گلبرگ­ها با تاخیر بیشتر از مجاور پرچم­ها تشکیل می­شوند (شکل B,C,D ۲). 

تکوین تخمک: تخمک از نوع واژگون است (شکلD ۴) . پوسته­های تخمک در طرفین جسم تخمک تقارن ندارند و معمولا پوسته­ای که در جهت خمیدگی تخمک ایجاد می­شود، در سطح پایین­تری شکل می­گیرد. کمی بعد پوسته­های تخمکی به صورت برجستگی­هایی در طرفین تخمک پدیدار می­شوند. سپس پوسته درونی در زیر پوسته بیرونی شروع به تشکیل می­­کند (شکلB ۳). ضمن تشکیل پوسته­های تخمک، توده مرکزی سلول­ها با تقسیمات و تمایز خود، بافت خورش با سلول­های دیپلوئید راتشکیل می­دهد. از رشد سریع و تحولات یکی از این سلو­ل­ها، مگاگامتوسیت تمایز می­یابد. این سلول تقریبا موقعیت مرکزی دارد و با حجم زیاد خود، درشتی هسته، هسته متراکم و حجیم وشکل چند وجهی که دارد به خوبی از سایر سلول­های خورش قابل تشخیص است (شکلA,B3).

اولین تقسیم میوزی مگاگامتوسیت (شکل C ۳) موجب تشکیل دو سلول هاپلویید یا دیاد (شکل D ۳) و دومین تقسیم میوزی موجب تشکیل تتراد می­شود. بررسی تعداد زیادی ازلام­ها نشان می­دهد که تترادها از نوع خطی و به ندرت Tشکل می­باشند. به طور معمول وقتی میوز با تشکیل تترادها به پایان می­رسد، پوسته­های تخمک به خوبی قابل تشخیص هستند و حدود 4/3 از جسم تخمک را می­پوشانند. در بسیاری از نمونه­های مورد بررسی قرار گرفته تعداد لایه­های پوسته درونی شامل دو و تعداد لایه­های پوسته بیرونی شامل چهار ردیف سلولی می­باشد (شکل E,F3).

از چهار سلول حاصل از تقسیم میوز، سه سلول تحلیل می­روند و سلول بنی یا شالازی با افزایش حجم و رشد هسته و سیتوپلاسم خود به صورت سلولی حجیم درآمده و به سمت مجرای سفت مهاجرت می­کند (شکل G3). درتمام طول تقسیم میوز تا مرحله حجیم شدن یکی از مگاسپورها، تقسیمات سلول­های سازنده خورش موجب افزایش تعداد این سلول­ها می­شود و این سلول­ها به صورت لایه­های کم و بیش مرتبی اطراف سلول سازنده کیسه رویانی که مادر کیسه رویانی نامیده می­شود را می­پوشانند. سلول مادر کیسه رویانی در نمونه­های مورد بررسی ما موقعیت چهار لایه زیر اپیدرمی دارد (تترازونیت می­باشد) و اصولا در چهارمین لایه زیر پوسته تخمک تشکیل می­شود (شکل A4). نخستین تقسیم میتوزی سلول مادر کیسه رویانی موجب تشکیل دو هسته هاپلوئید می­گردد. هر هسته به نسبت حجیم ودارای هستک یا هستک­های مشخص است (شکل B4). دومین تقسیم میتوزی موجب تشکیل چهار هسته در کیسه رویانی(شکلC,D4) و تقسیم سوم موجب تشکیل کیسه رویانی هشت هسته­ای می­شود. کیسه رویانی کشیده و کم و بیش شکلی نامنظم دارد ( شکل E4). اطراف کیسه رویانی با سلول­های خورش پوشیده شده است. درونی­ترین لایه پوسته که فرش­کننده خورش است با نام آندوتلیوم در تصاویر مشهود است  ( شکل E4)؛ این لایه به صورت شعاعی امتداد یافته و سلولهای آن دارای هسته کاملا واضح و سیتوپلاسمی متراکم هستند.

هسته­های کیسه رویانی آرایش ویژه­ای پیدا کرده و سه هسته در قطب مجاور سفت، سه هسته در قطب دور از سفت و دو هسته در مرکز کیسه رویانی قرار می­گیرند. جدار بندی هر هسته به همراه مقداری سیتوپلاسم موجب تشکیل سه سلول در قطب مجاور سفت و سه سلول دور از سفت و یک سلول دیپلوئید در قسمت مرکزی می­گردد. سلول­های مجاور سفت که دستگاه تخمزا نیز نامیده می­شود شامل دو سلول قرینه در طرفین و یک سلول میانی به نام تخمزا می­گردد. این سه سلول قبل از دیگر سلول­ها تمایز می­یابند. سلول­های دور از سفت یا متقاطرها خیلی سریع و بلا فاصله بعد از تشکیل تحلیل می­روند. دوهسته میانی کیسه رویانی سیتوپلاسم مشترکی دارند و اغلب با هم تلفیق شده و هسته دیپلوئیدی را تشکیل می­دهند. در تصاویر برش طولی تخمدان در این مرحله پوسته­های تخمک، مجرای سفت، بقایای بافت خورش وکیسه رویانی قابل تشخیص است (شکلF4). جسم تخمک با بند زاویه زیادی پیدا کرده و مجرای سفت به تدریج به پایه تخمک نزدیک می­شود و در نهایت تخمک واژگون می­شود. با تشکیل کیسه رویانی و سلول­های قابل لقاح شامل تخمزا (هاپلوئید) و سلول مرکزی (دیپلوئید) تکوین تخمک به پایان می­رسد(شکلF4).

شکل 2- مراحل بنیان­گذاری گل:(A برش عرضی جوانه رویشی لوبیا، تونیکا و کورپوس قابل مشاهده است. (B برش طولی جوانه زایشی لوبیا: کاسبرگ،  پریموردیوم پرچم و پریموردیوم مادگی. C):جوانه زایشی لوبیا با بزرگنمایی و نمو بیشتر:کاسبرگ، پریموردیوم پرچم، پریموردیوم مادگی. D) :  غنچه درحال تشکیل اندامهای گل،  کاسبرگ، پرچم که به دلیل اختلاف ارتفاع فقط ۵ پرچم در سطح برش دیده می شود، پریموردیوم مادگی به صورت توده بیضی شکل بدون تمایز زیادی در سلول­ها و گلبرگ­ها که در این شکل آنان نیز شروع به تشکیل کرده­اند. (بزرگنمایی شکلها X400).

مخفف ها: T: تونیکا، :C کورپوس.:Caکاسبرگ،:Stپریموردیوم پرچم،Pi: پریموردیوم مادگی. ،Pe :گلبرگ­ها

شکل 3- مراحل تقسیم میوز در تخمک: A)تشکیل و رشد پوسته بیرونی تخمک(Oi) و نمایی از سلول حجیم مگاگامتوسیت (Meg) .B) رشد بیشتر پوسته بیرونی (Oi) و تشکیل پوسته درونی(Ii)، سلول مگاگامتوسیت (Meg) حجیم شده و برای تقسیم میوز آماده می­شود. C) سلول مگاگامتوسیت(Meg)  در مرحله پروفاز D) رشد و تمایز بیشتر پوسته درونی(Ii) و بیرونی(Oi) و بروز اولین تقسیم میوز و تشکیل دیاد (Di) .E ) تقسیم دوم میوز شروع شده و تتراد(Te)  تشکیل می­شود. اکثرا تترادها خطی است. F) تتراد از نوع Tشکل در تصویر رویت می­شود.G ) سلول بنی باقی مانده و سه سلول دیگر تحلیل می­رود. در تصویر آثار باقی مانده سه سلول تحلیل رفته دیده می­شود وسلول بنی به سمت سفت مهاجرت می­کند. (بزرگنمایی شکلها X400).

شکل 4- مراحل تشکیل کیسه­رویانی: A) کیسه رویانی تک هسته­ای که در آن مادر کیسه رویانی(Cm)، پوسته بیرونی (Oi) و پوسته درونی(Ii) علامت­گذاری شده است. B) اولین تقسیم میتوزی رخ داده و دو هسته هاپلوئید N1 و N2 را تشکیل می­دهد (کیسه­رویانی دو هسته­ای). کیسه رویانی رشد کرده و دو هسته به وسیله یک واکوئل از هم جدا می­شوند.C) تقسیم دوم میتوزی به وقوع می­پیوندد و ۴ هسته هاپلوئید تشکیل می­شود. D) نمایی از کیسه رویانی هشت هسته­ای همراه با نمایی از نحوه قرار گرفتن  تخمک و پوسته­ها ( تخمک واژگون). E) کیسه رویانی هشت هسته­ای که درآن هسته­ها در حال مهاجرت بوده و جداربندی سلول­ها نیز درحال انجام است.  تخمزا(O) ، سلول­های سینرژید(S) ، سلول قطبی.(P) F)کیسه رویانی بالغ با هفت سلول، تخمزا  (O)، سلول­های سینرژید(S) ، سلولـهای آنتی پود(A) ، سلول قطبی(P)، لایه اندوتلیوم(E) . (بزرگنمایی شکلها X400).

تکوین پرچم: پرچم­های لوبیا ۱۰ عدد می­باشد که در دو حلقه ۵ تایی پدیدار می­گردند و به دلیل اختلاف ارتفاع فقط پنج پرچم در برش عرضی قابل مشاهده است (شکل D ۲). پرچم­های حلقه اول زودتر وحلقه دوم به صورت متناوب با حلقه اول وبا کمی تاخیر به وجود می­آیند. سپس این دو حلقه خیلی سریع با هم ادغام شده و تشکیل لوله پرچمی متشکل از 9 پرچم به هم پیوسته و یک پرچم آزاد را می­دهند (نافه از نوع دیادلف است).

سلول حاشیه­ای زیر اپیدرمی خاستگاه لایه­های بساک شامل: اپیدرم، لایه مکانیکی، لایه موقت و لایه تاپی می­باشد که هر چهار لایه در این گیاه،  فقط از یک ردیف سلولی تشکیل شده بود. سلول­های لایه موقت ناپایدار بوده ودر طی مراحل میوز از بین می­روند (شکل A5).

سلول هاگزای از طریق تقسیم میتوزی تکثیر شده و توده سلول­های مادر گرده که دارای هسته حجیم هستند را به وجود می­آورد. هریک از این سلول­ها شروع به تقسیم میوز کرده که مراحل آن از این قرار است: ابتدا میوزI با مرحله پروفازI آغاز می­شود و سلول شروع به از دست دادن پوشش هسته کرده و وارد تقسیم میوزی می­شود (شکل B5)، سپس در مرحله متافاز I تترادها در یک ردیف مرتب شده و در آنافازI این تترادها شروع به جدایی از یکدیگر می­کنند (شکل C5)، در مرحله تلوفازI تقسیم هسته­ها بدون سیتوکینز تکمیل می­گردد و دو هسته هاپلوئید تشکیل می‍گردد (شکل D5). سپس میوزII آغاز می­شود بدین صورت که در مرحله پروفازII پوشش هسته مجددا تخریب شده و در مرحله متافازII کروموزوم­ها دریک ردیف مرتب می‍شوند (E5) اما در آنافازII  این بار کروماتیدهای خواهری جدا شده (شکل F5) و در تلوفازII چهار هسته تشکیل می­شود و در آخر چهار سلول n کروموزومی هاپلوئید به نام تتراسپور به وجود می­آیند (شکل G5). آرایش تترادها در این نمونه اغلب از نوع تتراهدرال (آرایش تترادها به صورت هرمی است و میکروسپورها در یک سطح قرار ندارند) است (شکل H,I5).

کمی قبل آز آغاز میوز در سلول­های مادر دانه گرده، دیواره­ ویژه با ماهیت عمدتا کالوزی توسط همین سلول­ها به اطراف ترشح می­شود و آنها را احاطه می­کند که حجم آن در ابتدا کم ولی بعدا زیادتر می­شود. این دیواره در انتهای میوز شروع به تخریب می­کند (شکل  I5).

لایه تاپی داخلی ترین لایه بساک است و مجاور تتراسپورها قرار دارد که نقش تغذیه­ای و ترشحی را بر عهده دارد. این سلول­ها به دو دسته ترشحی و پلاسمودیال تقسیم می­شوند که هر دو نوع آن در بساک لوبیا دیده می­شوند. به این صورت که سلول­های این لایه تا مرحله میکروسپور جوان پایدار بوده (ترشحی) (شکل A,B,C ۵) و بعد از آن شروع به تخریب می­نمایند (پلاسمودیومی) (شکل A,B,C ۶). از طرفی لایه تاپی در لام­های مورد بررسی ما تک هسته­ای رویت شد. لایه مکانیکی اولین لایه زیر اپیدرمی است که در بساک تکوین پیدا می کند و در بساک بالغ تنها لایه است که باقیمانده و قابل مشاهده است (شکل D ۶)

در انتهای میوز دیواره کالوزی اطراف تتراسپورها به صورت مرکزرو (سانتری پت) و همزمان فرو رفته، و ۴ میکروسپور جوان از هم جدا می­شوند. چهار میکروسپور آزاد شده هنوز واکوئله نشده­اند (شکل A6) و در گام بعدی ابتدا واکوئله شده وهسته این سلول­ها به تدریج به کنار مهاجرت می­کند.

اطراف هر میکروسپور را دیواره اگزین در بر گرفته است. این دیواره ابتدا پلی ساکاریدی و سپس اسپوروپولنینی است. از طرفی، وقتی که دیواره کالوزی تحلیل می­رود و میکروسپورهای جوان آزاد می­شوند؛ دیواره پکتوسلولزی دیگری به نام انتین در مجاورت غشای سیتوپلاسمی تشکیل می­شود (شکل B6). علاوه بر لایه­های اگزین و انتین، منافذ سه­گانه رویشی بر روی دیواره گرده جوان به چشم می­خورد که محل خارج شدن لوله گرده در زمان رویش دانه گرده هستند.

از تقسیم نامساوی هسته در گرده جوان، دو هسته رویشی و زایشی حاصل می­شود. هسته زایشی دوکی شکل ومتراکم است اما هسته رویشی بزرگ و غیر متراکم است که بعد سیتوکینز انجام می شود. بنابراین دانه­های گرده­ای که از بساک­ها رها خواهند شد، دارای دو سلول، رویشی و زایشی هستند (شکل C,D6).

شکل5 - A) برش عرضی یک بساک لوبیا. سلول­های مادر دانه­گرده  (PMC) که چند وجهی و دارای هسته­های بزرگ هستند و برای تقسیم  میوز آماده می­شوند. همچنین لایه­های بساک به وضوح  مشاهده می­شوند. B) مرحله پروفازI ، C) مرحله آنافاز I، D) مرحله تلوفاز I،  E) مرحله متافازII، F) مرحله آنافازII ، G) مرحله تلوفازII ، H) سیتوکینز همزمان و تشکیل تترادها به صورت تتراهدرال، I) در مرحله سیتوکینز لایه موقت از بین رفته و جای آن خالی است بنابراین لایه موقت ناپایداراست. (بزرگنمایی شکلها X400).

مخففها: (Ep)اپیدرم، (En) لایه مکانیکی،(Tr) لایه موقت، (Ta) لایه تاپی

شکل 6 : A - سلول­های میکروسپور نابالغ که هنوز واکوئله نشده و به تازگی با تحلیل لایه کالوزی آزاد شده­اند. B) سلول­های میکروسپورجوان که واکوئله شده، برای تقسیم میتوز آماده شده­اند. C) دانه گرده بالغ که در حال انباشت مواد هستند و اگزین واینتین تشکیل شده است.D  ) دانه گرده کاملا بالغ که به خاطر انباشت مواد رنگ تیره داشته، سه منفذ رویشی مشهود است. در این مرحله لایه تاپی تحلیل رفته و فقط لایه مکانیکی باقی مانده است. (بزرگنمایی شکلها X400).

اسپورزایی و تکوین گامتوفیت در گیاهان تحت تیمار: بررسی دقیق لام­های میکروسکوپی تهیه شده از گیاهان تحت تیمار، نشان داد در مراحل مختلف تکوین تخمک،  ناهنجاری مشهودی وجود ندارد. در بررسی مراحل تکوین دانه گرده در برش­های متعدد میکروسکوپی، ناهنجاری­هایی در گیاهان تحت تیمار غلظت­های مختلف نانوذره ­اکسیدآلومینیوم مشاهده شد. در این نمونه­ها، هیچ­ یک از مراحل تقسیم میوز دچار اختلال نشد، اما در مراحل بعدی بلوغ میکروسپورجوان ناهنجاری­هایی مشاهده شد. بعد از تقسیم میوز، چهار سلول هاپلویید به نام تتراسپور به وجود می­آیند. آرایش تترادها در این گیاه اغلب از نوع تتراهدرال است؛ اما درگیاهان تحت تیمار به ویژه در غلظت 1/0 گرم برلیتر نانوذره اکسید آلومینیوم، به هم خوردن آرایش تترادها مشاهده شد (شکل A7). حدود 12 درصد از دانه­های گرده در غلظت 1/0  گرم برلیتر و 2 درصد در غلظت 01/0 گرم بر لیتر نانوذره اکسید آلومینیوم به صورت معنی­داری دچارتغییر در آرایش تترادها شدندکه این تغییر در سطح احتمال یک درصد (01/0P≤) معنی دار است. اما در غلظت 001/0 گرم بر لیتر نانوذره اکسیدآلومینیوم مراحل تکوینی مشابه شاهد بوده و تفاوت معنی­داری نسبت به گروه شاهد رویت نشد. بیشترین تغییرات در بالاترین غلظت نانوذره ­اکسید آلومینیوم (1/0 گرم بد لیتر) مشاهده شد (شکل ۸).

بعد از میوز، تترااسپورها با از بین رفتن دیواره کالوزی از هم جدا شده، میکروسپورهای جوان آزاد می­شوند و دیواره پکتوسلولزی دیگری به نام انتین در مجاورت سیتوپلاسم تشکیل می­شود. در هر سه گروه تیماری، ضخیم شدن لایه انتین نسبت به گروه شاهد، به صورت معنی داری در سطح احتمال (01/0P≤) مشهود بود (شکل B,C7). بیشترین درصد تغییر ضخامت لایه انتین در تیمار 1/0 گرم بر لیتر نانوذره اکسیدآلومینیوم با 23 درصد رویت شد. در غلظت 01/0 و 001/0 گرم برلیتر نانوذره اکسید آلومینیوم به ترتیب 6 و 7 درصد دانه­های گرده با تفاوت کمتری نسبت به شاهد به صورت معنی دار، دچار ضخامت در لایه اینتین شدند (شکل ۹).

با انجام رنگ­آمیزی استوکارمن بر روی دانه­های گرده لوبیا، میزان تغییر در زیست­پذیری آن­ها تحت تاثیرنانوذره اکسید آلومینیوم بررسی شد. نتایج نشان داد، تیمار 1/0 گرم بر لیتر نانوذره اکسید آلومینیوم  بیشترین درصد افزایش دانه­های گرده زیست­ناپذیر (۲۵درصد) را نشان داد (D,E7). درحالی که این درصد در گیاهان شاهد سه درصد بوده و از این نظر تفاوت معنی­دار و حائز اهمیتی در سطح احتمال یک درصد(01/0P≤) وجود داشت. سایر غلظت­های به کار رفته نانوذره اکسید آلومینیوم حدود پنج درصد زیست ناپذیری در دانه­های گرده را نشان داده که نسبت به گروه شاهد این تفاوت معنی­دار بود اما مقایسه بین دو گروه تیماری با هم تفاوت معنی­داری را نشان نداد. در واقع زیست پذیری دانه­های گرده از ۹۷درصد در شاهد به ۷۵ درصد در بالاترین غلظت کاربردی کاهش یافته­است (شکل ۱۰).

باتوجه به آنالیز­های صورت گرفته، هر سه ویژگی ذکر شده، تحت تاثیر تیمارهای نانوذره اکسید آلومینیوم به صورت معنی­داری دچار تغییر شده است اما میزان این تغییرات متفاوت بوده و حتی در بعضی تیمارها تفاوت معنی­داری نسبت به شاهد مشاهده نشد.

شکل7- (A برهم خوردن آرایش تترادها (B,C  . ضخیم شدگی لایه اینتین(D,E  دانه­های گرده زیست ­ناپذیر (پیکانها) از جمله اثرات تیماری است که کم و بیش در اغلب تیمارها مشاهده شد.

شکل ۸- اثر غلظت­های مختلف نانوذره اکسیدآلومینیوم (001/0، 01/0 و 1/0 گرم بر لیتر) بر آرایش تترادها. هرستون معرف میانگین چهار تکرار± انحراف معیاراست.

شکل ۹ - اثر غلظت­های مختلف نانوذره اکسیدآلومینیوم (001/0، 01/0 و 1/0 گرم بر لیتر) بر ضخامت لایه اینتین. هرستون معرف میانگین چهار تکرار± انحراف معیاراست.

بحث

با توسعه روزافزون کاربردهای صنعتی نانوذرات، نگرانی­ها درمورد سرنوشت زیست­ محیطی و اثرات بیولوژیکی این ذرات تشدید شده است(۱۸،۱۷). اندامهای تولید مثلی نر و ماده در گیاهان عالی دارای پوشش­هایی هستند و ترشحات آن­ها باعث پذیرش و جذب ذرات معلق در هوا می­شود.

شکل ۱۰-  اثر غلظت­های مختلف نانوذره اکسیدآلومینیوم (001/0، 01/0 و 1/0 گرم بر لیتر) بر زیست­پذیری دانه­های گرده.