نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه لرستان، خرمآباد، ایران
2 ایران، خرمآباد، دانشگاه لرستان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی
3 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه صنعتی خاتم الانبیاء بهبهان، بهبهان، ایران
چکیده
دمای پایین یکی از فاکتورهای مهم محدود کننده رشد، نمو و پراکنش گیاهان است. استویا (Stevia rebaudiana) یک گیاه علفی دارویی شیرین است که در بسیاری از مناطق جهان کشت میشود و ممکن است تنش دمای پایین را در زمستان تجربه کند. در این مطالعه، تغییرات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی که در گیاهان استویا تحت تنش دمای پایین رخ میدهد و باعث بقاء آنها میشود مورد بررسی قرار گرفت. استویا برای یک ماه تحت تیمارهای دمایی 5، 10 و 25 درجه سانتیگراد قرار داده شد و شاخصهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی در برگ و ساقه اندازهگیری شد. در دمای پایین محتوی کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها در برگ کاهش پیدا کرد. به علاوه، تجمع افزایش یافته پراکسید هیدروژن و مالون دآلدئید در برگ و ساقه استویا در معرض تنش دمای پایین مشاهده شد. تنش دمای پایین فعالیت آنزیمهای سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز، گایاکول پراکسیداز و پلیفنل اکسیداز را در برگ و ساقه استویا افزایش داد. تنش دمای پایین به تجمع متابولیتهای ثانویه (ترکیبات فنلی، فلاونوئیدها و آنتوسیانینها) و فعالیت افزایش یافته آنزیمهای کلید مسیر بیوسنتزشان (پلیفنیل آمونیالیاز و تیروزین آمونیالیاز) در برگ و ساقه استویا منجر شد. در پاسخ به تنش دمای پایین، استویا تجمع قند محلول کل، قند احیاء آمینواسید کل و پرولین را در برگ و ساقه افزایش دادند. به طور کلی، برای غلبه بر آسیبهای ناشی از تنش دمای پایین، مجموعهای از مکانیسمهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی در گیاه استویا فعال شد که این مکانیسمها میتوانند برای شناسایی رقمهای استویا مقاوم به دمای پایین استفاده شوند.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
the identification of physiological and biochemical changes in leave and shoot of stevia under low temperature
نویسندگان [English]
1 Biology Department, Faculty of Science, Lorestan University, Khorramabad, Iran
2 Dept. of Biology, Faculty of Science, Lorestan University, Khorramabad, I.R. of Iran.
3 2Plant Biology Department, Faculty of Science, Behbahan Khatam Alanbia University of Technology, Behbahan, Iran
چکیده [English]
Low temperature is one of the important limiting factors of growth, development and distribution of plants. Stevia (Stevia rebaudiana) is a sweet medicinal herb that is cultivated in many parts of world and may experiences low temperature in winter. In this study, we aimed to identify physiological and biochemical changes that occur in Stevia exposed to low temperature and enable the plants to survive at low temperature. Stevia grown in vitro and incubated under controlled conditions at 5, 10 and 25 ºC for one month and then physiological and biochemical indicators in leave and shoot were measured. Low temperature decreased the contents of chlorophyll a, chlorophyll b, total chlorophyll and carotenoids in the leaves. In addition, we observed increased accumulation of hydrogen peroxide and malondialdehyde in leaves and shoot of Stevia exposed to low temperature. Low temperature increased the activities of Superoxide dismutase, catalase, ascorbate peroxidase, polyphenol oxidase and guaiacol peroxidase in leaves and shoot of Stevia. Low temperature lead to increased accumulation of secondary metabolites (phenoloc compounds, flavonoids and anthocyanins) and also increased activities of the enzymes of their biosynthesis pathway (phenylalanine ammonia lyase and Tyrosine ammonia lyase) in leaves and shot of Stevia plants. In response to low temperature, Stevia plant increased the accumulation of total soluble sugar, reducing sugar, total amino acids and proline in their leaves and shoot. In general, to cope with low temperature, Stevia evolved a variety of physiological and biochemical mechanisms that can be suggested to use for identifying cold-tolerant stevia cultivars.
کلیدواژهها [English]
بررسی تغییرات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی در برگ و ساقه گیاه استویا تحت تنش دمای پایین
نسرین شیرزادی1، مریم نصراصفهانی1*و شکوفه حاجی هاشمی2
1 ایران، خرمآباد، دانشگاه لرستان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی
2 ایران، بهبهان، دانشگاه صنعتی خاتم الانبیاء بهبهان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی
تاریخ پذیرش: 07/06/1398 تاریخ دریافت: 05/09/1398
چکیده
دمای پایین یکی از فاکتورهای مهم محدود کننده رشد، نمو و پراکنش گیاهان است. استویا (Stevia rebaudiana) یک گیاه علفی دارویی شیرین است که در بسیاری از مناطق جهان کشت میشود و ممکن است تنش دمای پایین را در زمستان تجربه کند. در این مطالعه، تغییرات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی که در گیاهان استویا تحت تنش دمای پایین رخ میدهد و باعث بقاء آنها میشود مورد بررسی قرارگرفت. استویا برای یک ماه تحت تیمارهای دمایی 5، 10 و 25 درجه سانتیگراد قرار داده شد و شاخصهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی در برگ و ساقه اندازهگیری شد. در دمای پایین محتوی کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها در برگ کاهش پیدا کرد. به علاوه، تجمع افزایش یافته پراکسید هیدروژن و مالون دآلدئید در برگ و ساقه استویا در معرض تنش دمای پایین مشاهده شد. تنش دمای پایین فعالیت آنزیمهای سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز، گایاکول پراکسیداز و پلیفنل اکسیداز را در برگ و ساقه استویا افزایش داد. تنش دمای پایین به تجمع متابولیتهای ثانویه (ترکیبات فنلی، فلاونوئیدها و آنتوسیانینها) و فعالیت افزایش یافته آنزیمهای کلیدی مسیر بیوسنتزشان (پلیفنیل آمونیالیاز و تیروزین آمونیالیاز) در برگ و ساقه استویا منجر شد. در پاسخ به تنش دمای پایین، استویا تجمع قند محلول کل، قند احیاء آمینواسید کل و پرولین را در برگ و ساقه افزایش دادند. به طورکلی، برای غلبه بر آسیبهای ناشی از تنش دمای پایین، مجموعهای از مکانیسمهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی در گیاه استویا فعال شد که این مکانیسمها میتوانند برای شناسایی رقمهای استویا مقاوم به دمای پایین استفاده شوند.
واژه های کلیدی: دمای پایین، استویا، تنش اکسیداتیو، سیستم آنتیاکسیدانت، گونهها فعال اکسیژن
* نویسنده مسئول، تلفن: 09131103870، پست الکترونیکی: Esfahani.m@lu.ac.ir
مقدمه
دمای پایین (سرمازدگی) که به دمای بین 0 تا 15 درجه سانتیگراد اطلاق میشود، یکی از مهمترین تنشهای محیطی است که باعث کاهش رشد و تولید محصول در بسیاری از گیاهان مهم از نظر اقتصادی میشود (18). گیاهان به عنوان موجودات بیحرکت تغییرات دمایی را در محیط اطرافشان تشخیص داده و سپس به آن تغییرات پاسخ میدهند و تعادل دمایی مناسب را در درون سلولهایشان برقرار میکنند. این تعادل سلولی از طریق تنظیمات مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی ایجاد میشود (18). دمای پایین تغییراتی را در ساختار غشاء سلولی و ترکیب لیپیدهای غشاء، نشت الکترولیتها و آمینواسیدها، محتوی پروتئینها و فعالیتهای آنزیمی و همچنین تغییرات در یک طیف گستردهای از اجزاء سلولی نظیر پلاستیدها، غشاءهای تیلاکوئیدی، فسفریلاسیون پروتئینهای تیلاکوئیدی و میتوکندریها ایجاد میکند (37). به علاوه، دمای پایین باعث ایجاد اختلال در فعالیتهای متابولیکی در گیاهان میگردد به عنوان مثال، میزان فتوسنتز در دماهای پایین کاهش مییابد که به تشکیل انرژی برانگیختگی اضافی در گیاهان منجر میشود (32). تنش سرمازدگی میزان تولید گونههای فعال اکسیژن (ROS) مانند رادیکالهای آنیون سوپراکسید (O2•−)، پراکسید هیدروژن (H2O2) و رادیکالهای هیدروکسیل (OH•) را در بخشهای مختلف سلول نظیر کلروپلاستها، پراکسیزوم و میتوکندری افزایش میدهد (11). اگرچه تولید پیوسته ROS در سطح غیرسمی به عنوان یک سیگنال برای ارتباطات سلول به سلول عمل میکند ولی تجمع مقادیر بالای ROS در محیط سلولی باعث تنش اکسیداتیو میشود که فعالیتهای متابولیکی ضروری برای سلول و نتیجتا بقاء سلول را تحتتأثیر قرار میدهد (11). گیاهان برای مقابله با تنش اکسیداتیو ایجاد شده به واسطه تنش دمای پایین مکانیسمهای محافظتی گوناگون شامل سیستم آنتی اکسیدانتی آنزیمی و غیرآنزیمی را فعال میکنند. از مهمترین آنزیمهای آنتی اکسیدانتی دخیل در حذف ROS می توان به سوپراکسید دیسموتاز ((SOD، گایاکول پراکسیداز ((GPX، پلی فنل اکسیداز (PPO)، کاتالاز (CAT) و آسکوربات پراکسیداز ((APX اشاره کرد. رادیکالهای آزادO2•− ابتدا توسط SOD به H2O2 که یک مولکول غیررادیکالی است تبدیل کرده و در نهایت H2O2 تولید شده توسط آنزیمهای CAT، APX، GPX وPPO به آب و اکسیژن تبدیل میشود (14). از سیستمهای آنتیاکسیدانتی غیرآنزیمی میتوان به متابولیتهای ثانویه مانند ترکیبات فنلی، فلاونوئیدها و آنتوسیانینها اشاره کرد که در نتیجه فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیا لیاز PAL)) و یا تیروزین آمونیا لیاز (TAL) به وجود میآیند و نقش بسزایی در سیستم دفاعی سلولهای گیاهی در مقابل ROS بازی میکنند (11). گیاهان مقادیر زیادی از انواع مختلف محلولهای سازگار را در پاسخ به تنشهای مختلف محیطی از جمله دمای پایین انباشته میکنند. محلولهای سازگار ترکیبات آلی محلول با وزن مولکولی پایین هستند که معمولاً در غلظتهای بالا در سلولهای گیاهی سمیت ایجاد نمیکنند. این محلولها از طریق تعدیل و تنظیم اسمتیک سلولی، پاکسازی ROS، محافظت از یکپارچگی غشاءها و ثبات آنزیمها و پروتئینها از گیاهان در مقابل تنشهای محیطی محافظت میکنند. از محلولهای سازگار میتوان به پرولین، سوکروز، پلیالها، ترهالوز، گلیسین بتائین و آلانین اشاره کرد (21). به هرحال، تغییرات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی که گیاهان برای مقابله با تنش دمای پایین استفاده میکند بسته به نوع گونه گیاهی، شدت تنش و دوره تنش متفاوت است و شناسایی این تغییرات برای هر گونه گیاهی میتواند به متخصصان بیوتکنولوژی کمک کند که بتوانند از طریق روشهای مهندسی ژنتیک گیاه مقاوم به تنش سرما ایجاد کنند.
استویا (Stevia rebadiana Bertoni) یک گیاه چندساله دارویی شیرین متعلق به خانواده آستراسه و بومی مناطق پاراگوئه، برزیل و آرژانتین با آب و هوایی نیمه گرمسیری با زمستانهای ملایم است. برگهای استویا دارای گلیکوزیدهای دیترپن یا گلیکوزیدهای استویول شیرین است که محلول در آب بوده و تقریباً 150 تا 300 مرتبه شیرینتر از شکر هستند. علاوه بر مزه شیرین برای این گیاه فعالیتهای آنتی اکسیدانی گزارش شده است (20). امروزه استویا به دلیل ارزش داروییاش در سراسر جهان کشت میشود و احتمالاً این گیاه در مناطقی با زمستانهای سرد تنش سرما را تجربه میکند بنابراین در این مطالعه پاسخهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه استویا در مواجهه با دمای پایین مورد بررسی قرارگرفت. شناسایی شاخصهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی که توسط تنش سرما در گیاه استویا تحت تاثیر قرار میگیرد به محققان کمک میکند که رقمهای استویای حساس و مقاوم به سرما را شناسایی کنند. به علاوه، شناسایی این شاخصها مسیر را برای تولید رقمهای استویای مقاوم به سرما توسط روشهای بیوتکنولوژی مدرن و یا دستکارهای ژنتیکی تسهیل میکند.
مواد و روشها
به منظور بررسی تأثیر تنش دمای پایین روی پاسخهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه استویا (S. rebaudiana) رقم 1 که از بانک ژن استویا، کشور بلژیک (EUSTAS Stevia Gene Bank) تهیه شد، این تحقیق به صورت یک طرح کاملاً تصادفی با چهار تکرار اجرا شد. ابتدا بذرهای استویا را چندین مرتبه با آب معمولی شسته و سپس با الکل 70 درصد (برای مدت 30 ثانیه) و محلول 20 درصد حجمی وایتکس (هیپوکلریت سدیم) (برای مدت 15 دقیقه) ضدعفونی کرده و مجدداً در زیر دستگاه لامینار ایرفلو سه مرتبه با آب مقطر استریل شستشو داده شدند. بذرهای ضدعفونی شده در ظرفهای حاوی محیط کشت پایه MS (30) کشت شدند و در اتاق کشت با دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی، دمای 2±25 درجه سانتیگراد و نور µmol m-2 s-1 90 نگهداری شدند. برای ریزازدیادی و تولید انبوه گیاه استویا در شرایط استریل از گیاهان کامل ایجاد شده از کشت بذر استفاده شد. گیاهان دو ماهه حاصل از مرحله ریز ازدیادی به مدت یک ماه در اتاقک های رشد با شرایط دمایی یکسان شب و روز تحت تأثیر تیمارهای دمایی 5 و 10 درجه سانتیگراد قرارگرفتند و گیاهان رشد یافته در دمای 25 درجه سانتیگراد به عنوان شاهد استفاده شدند (21). برگ و ساقه گیاهان نگهداری شده به مدت یک ماه تحت تیمارهای دمایی 5، 10 و 25 درجه سانتیگراد جدا شده و در فریزر ºC 80- برای اندازهگیری شاخصهای فیزیولوژیکی و بیوشیمایی نگهداری شدند.
اندازهگیری میزان قند کل، قند احیاء و پرولین و آمینواسیدهای آزاد: میزان قند کل و احیاء در نمونهها به ترتیب مطابق روشهای البالاسمه و همکاران (2013) و دابیوس و همکاران (1956) اندازهگیری شد (4و 13). برای اندازهگیری میزان پرولین از روش باتس و همکاران (1973) استفاده شد (5). مقدار آمینواسیدهای آزاد براساس رنگ سنجی با نین هیدرین در طول موج 570 نانومتر اندازهگیری شد (21).
اندازهگیری پراکسید هیدروژن (H2O2)، مالوندآلدئید ((MDA و ظرفیت آنتیاکسیدانت کل: میزان H2O2 و MDA در نمونهها مطابق روش ولیکوا و همکاران (2000) اندازهگیری شد (39). برای اندازهگیری ظرفیت آنتیاکسیدانت کل از معرفferric reducing antioxidant power (FRAR) شامل بافر استات 300 میلیمولار (6/3(pH=، 10 میلیمولار 2 و 4 و 6-تریپریدیل-s-تریازین (TPTZ)، 40 میلیمولار هیدروکلرواستیک اسید و 20 میلیمولار کلرید آهن استفاده شد. جذب نمونهها در طول موج 593 نانومتر خوانده شد (35).
اندازهگیری میزان فنل کل و فلاونوئیدها: میزان فنل کل با استفاده از روش رنگسنجی فولین-سیوکالتو در طول موج 725 نانومتر اندازهگیری شد (33). میزان فلاونوئیدها توسط اسپکتووفتومتر در سه طول موج 270، 300، 330 نانومتر اندازهگیری شد (23).
اندازهگیری کلروفیلها، کاروتنوئیدها و آنتوسانین: کلروفیلها و کاروتنوئیدها به وسیله اتانول 96 درصد استخراج و با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتری اندازهگیری شدند (26). میزان آنتوسیانین براساس روش واگنر (1979) در طول موج 530 نانومتر اندازهگیری شد (40).
استخراج عصاره جهت اندازهگیری فعالیت آنزیمها: بافت تازه (09/ گرم) در یک هاون چینی سرد با 5/1 میلی لیتر بافر استخراجی سرد که شامل 50 میلی مولار بافر فسفات پتاسیم با (7pH=)، 1 میلی مولار اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA)، 2-1 درصد پلی وینیل پلی پیرولیدون (PVPP) سابیده شده و در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه با دور rpm 14000 سانتریفیوژ شد. محلول رویی برای اندازهگیری فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان و میزان پروتئینهای محلول استفاده گردید. میزان پروتئین محلول با استفاده از روش برادفورد (1976) در طول موج 595 نانومتر اندازهگیری شد (8). فعالیت CAT توسط کاهش غلظت H2O2 در طول موج 240 نانومتر بر انجام گرفت (2). فعالیت APX توسط میزان جذب در طول موج 290 نانومتر براساس اکسیداسیون آسکوربات و کاهش غلظت آسکوربات انجام گرفت (31). فعالیت PPO توسط افزایش در میزان جذب به واسطه اکسیداسیون وابسته به H2O2 پیروگالل در طول موج 430 نانومتر اندازهگیری شد (39). فعالیت GPX براساس افزایش جذب در طول موج 470 نانومتر به واسطه اکسیداسیون گایاکول انجام گرفت (39). فعالیت آنزیم SOD براساس بازدارندگی نوری نیتروبلو تترازولیوم در طول موج 560 نانومتر اندازهگیری شد (15). فعالیت آنزیم PAL در طول موج 290 نانومتر براساس میزان تولید سینامیک اسید اندازهگیری شد (6). فعالیت آنزیم TAL در طول موج 333 نانومتر واکنش براساس تبدیل تیروزین به کوماریک اسید اندازهگیری شد (6).
تحلیل دادهها: برای تحلیل داده ها از نرم افزار آماری SPSS نسخه 16 استفاده شد. مقایسه میانگین داده ها براساس آزمون دانکن در سطح آماری 5 درصد) 05/0(P≤ و رسم نمودارها با نرم افزار Excel انجام شد.
نتایج
تأثیرات دمای پایین روی میزان کلروفیلها، کاروتنوئیدها و آنتوسیانینها در برگ و ساقه گیاه استویا: نتایج نشان داد که در تنشهای دمایی 5 و 10 درجه سانتیگراد، میزان کلروفیلa برگ به ترتیب 42، 27 درصد، میزان کلروفیلb برگ به ترتیب 69 و 46 درصد و میزان کلروفیل کل برگ به ترتیب 61 و 32 درصد در مقایسه با شاهد کاهش نشان دادند (شکل C-A 1). میزان کاروتنوئیدهای برگ در دمای 5 درجه سانتیگراد 49 درصد نسبت به شاهد کاهش نشان داد (شکل D-1). میزان آنتوسیانینها در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد به ترتیب 264 و 82 درصد افزایش را در برگ و به ترتیب 125 و 87 درصد افزایش را در ساقه در مقایسه با شاهد نشان داد (شکل E-1).
شکل1- تأثیر تیمارهای دمایی 5، 10 و 25 درجه سانتیگراد روی میزان (A) کلروفیل a ، (B) کلروفیل b ، (C) کلروفیل کل و (D)کاروتنوئید برگ و (E) میزان آنتوسیانین برگ و ساقه گیاه استویا. مقادیر میانگین چهار تکرار ± SE. مقایسه میانگینها در برگ و ساقه به طور مجزا انجام گرفت. حروف غیرمشابه در برگ و ساقه نشان دهنده اختلاف معنیدار در سطح 5 درصد بر اساس آزمون دانکن بین تیمارها است. FW: وزن تازه بافت
تأثیرات دمای پایین روی میزان H2O2 و MDA در برگ و ساقه گیاه استویا: میزان H2O2 در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد به ترتیب 244 و 65 درصد در برگ و به ترتیب 29 و 30 درصد در ساقه در مقایسه با شاهد افزایش نشان داد (شکل A-2). میزان MDA برگ در تیمار دمایی 5 درجه سانتیگراد 87 درصد افزایش را در مقایسه با شاهد نشان داد و میزان آن در ساقه در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد نسبت به شاهد به ترتیب 62 و 82 درصد افزایش نشان داد (شکلB-2).
شکل2- تأثیر تیمارهای دمایی 5، 10 و 25 درجه سانتیگراد روی میزان (A) پراکسید هیدروژن (H2O2) و (B) مالوندآلدئید (MDA) برگ و ساقه گیاه استویا. مقادیر میانگین چهار تکرار ± SE. مقایسه میانگینها در برگ و ساقه به طور مجزا انجام گرفت. حروف غیر مشابه در برگ و ساقه نشان دهنده اختلاف معنیدار در سطح 5 درصد بر اساس آزمون دانکن بین تیمارها است. FW: وزن تازه بافت
تأثیرات دمای پایین روی میزان پرولین، آمینواسید کل، قند محلول کل، قند احیاء و پروتئین محلول کل در برگ و ساقه گیاه استویا: میزان پرولین برگ در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد نسبت به شاهد به ترتیب 1265 و 464 درصد و در ساقه به ترتیب 289 و135 درصد در مقایسه با شاهد افزایش پیدا کرد (شکل A-3). نتایج حاصل از سنجش اسیدهای آمینه کل در برگ و ساقه گیاه استویا نشان داد که میزان اسید آمینه کل برگ در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد به ترتیب 91 و 109 درصد و در ساقه به ترتیب 451 و 207 درصد نسبت به شاهد افزایش نشان داد (شکل B-3). میزان قند محلول کل برگ در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد به ترتیب 326 و 233 درصد و در ساقه به ترتیب 480 و 240 درصد در مقایسه با شاهد افزایش نشان داد (شکل C-3). همچنین، در تیمارهای دمایی 5 و 10 درجه سانتیگراد، میزان قند احیا در برگ به ترتیب 482 و 307 درصد و در ساقه به ترتیب 456 و 421 درصد نسبت به شاهد افزایش نشان داد (شکل D-3). نتایج این مطالعه نشان داد که میزان پروتئین محلول برگ در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد تفاوت معنیداری را با میزان آن در شاهد نشان نداد ولی میزان آن در ساقه در دمای 5 درجه سانتیگراد 102 درصد در مقایسه با شاهد افزایش نشان داد (شکل E-3).
شکل3- تأثیر تیمارهای دمایی 5، 10 و 25 درجه سانتیگراد روی میزان (A) پرولین، (B) آمینواسید کل، (C) قند محلول کل، (D) قند احیاء و (E) پروتئین محلول کل برگ و ساقه گیاه استویا. مقادیر میانگین چهار تکرار ± SE. مقایسه میانگینها در برگ و ساقه به طور مجزا انجام گرفت. حروف غیرمشابه در برگ و ساقه نشان دهنده اختلاف معنیدار در سطح 5 درصد بر اساس آزمون دانکن بین تیمارها است. FW: وزن تازه بافت
تأثیرات دمای پایین روی میزان فنل کل و فلاونوئیدها و فعالیت آنزیم های PAL و TAL در برگ و ساقه گیاه استویا: نتایج آزمایشات این تحقیق نشان داد که میزان فنل کل برگ در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد به ترتیب 108 و 61 درصد و در ساقه به ترتیب 318 و 246 درصد در مقایسه با شاهد افزایش پیدا کرد (شکل A-4). میزان فلاونوئیدهای برگ در طول موج 300 و 330 نانومتر در دمای 5 درجه سانتیگراد نسبت به شاهد به ترتیب 114 و 165 درصد افزایش یافته و میزان فلاونوئیدهای ساقه در طول موج 300 و 330 نانومتر در دمای 5 درجه سانتیگراد نسبت به شاهد به ترتیب 170 و 230 درصد افزایش نشان داده است (شکل B-4).
نتایج نشان داده که میزان آنزیم PAL برگ در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد نسبت به شاهد به ترتیب 308 و 173 درصد افزایش یافته و فعالیتش در ساقه در دمای 5 درجه سانتیگراد 21 درصد در مقایسه با شاهد افزایش نشان داد (شکل C-4). میزان فعالیت آنزیم TAL برگ در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد به ترتیب 161 و 237 درصد و در ساقه به ترتیب82 و 73 درصد نسبت به شاهد افزایش نشان داد (شکل D-4)
شکل4- تأثیر تیمارهای دمایی 5، 10 و 25 درجه سانتیگراد روی میزان (A) فنل کل (میکروگرم/گرم بافت تازه)، (B) فلاونوئید، (C) فنیل آلانین آمونیا لیاز (PAL) (میکرومول ترانس سینامیک اسید/گرم بافت تازه/ساعت) و (D) تیروزین آلانین آمونیا لیاز (میکرومول p- کوماریک اسید/گرم بافت تازه/ساعت) (TAL) برگ و ساقه گیاه استویا. مقادیر میانگین چهار تکرار ± SE. مقایسه میانگینها در برگ و ساقه به طور مجزا انجام گرفت. حروف غیرمشابه در برگ و ساقه نشان دهنده اختلاف معنیدار در سطح 5 درصد بر اساس آزمون دانکن بین تیمارها است. FW: وزن تازه بافت
تأثیرات دمای پایین روی فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانت و ظرفیت آنتیاکسیدانت کل در برگ و ساقه گیاه استویا: نتایج مقایسه دادهها در مورد تأثیر تیمار دمای پائین نشان داد که میزان آنزیم سوپر SOD برگ در دمای 5 درجه سانتیگراد نسبت به شاهد به ترتیب 52 درصد افزایش نشان داد و میزان فعالیت این آنزیم در ساقه در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد به ترتیب 55 و 64 درصد نسبت به شاهد افزایش نشان داد (شکل A-5). فعالیت آنزیم CAT برگ در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد به ترتیب 4473 و 491 درصد و در ساقه به ترتیب 6028 و 520 درصد در مقایسه با شاهد افزایش پیدا کرد (شکل B-5). نتایج مقایسه میانگینها نشان داد که فعالیت آنزیم APX برگ در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد به ترتیب 176 و 264 درصد و در ساقه به ترتیب 750 و 600 درصد نسبت به شاهد افزایش نشان داد (شکل C-5). تحت تیمارهای دمایی 5 و 10 درجه سانتیگراد، فعالیت GPX در برگ به ترتیب 844 و 635 درصد و در ساقه به ترتیب663 و 352 درصد در مقایسه با شاهد افزایش پیدا کرد (شکل D-5). به علاوه، فعالیت PPO در برگ تحت تیمارهای 5 و 10 درجه سانتیگراد به ترتیب 255 و 238 درصد و در ساقه به ترتیب 113 و 138 درصد در مقایسه با شاهد افزایش پیدا کرد (شکل E-5). اندازهگیری ظرفیت آنتیاکسیدانت کل در پاسخ به تیمارهای 5 و 10 درجه سانتیگراد نشان داد که ظرفیت آنتی اکسیدانت کل در برگ به ترتیب 1785 و 1014 درصد و در ساقه به ترتیب 1066 و 333 درصد در مقایسه با شاهد افزایش نشان داد (شکل F-5).
شکل5- تأثیر تیمارهای دمایی 5، 10 و 25 درجه سانتیگراد روی فعالیت (A) سوپراکسیددیسموتاز (SOD) (واحد/گرم بافت تازه)، (B) کاتالاز (CAT) (میکرومول H2O2/دقیقه/گرم بافت تازه)، (C) آسکوربات پراکسیداز (APX) (میکرومول آسکوربات/دقیقه/گرم بافت تازه)، (D) گایاکول پراکسیداز (GPX) (میکرومول تتراگایاکول/دقیقه/گرم بافت تازه)، (E) پلی فنل اکسیداز (PPO) (میکرومول purpurogallin/دقیقه/گرم بافت تازه( و (F) آنتیاکسیدانت کل (میلیگرم/ گرم بافت تازه) برگ و ساقه گیاه استویا. مقادیر میانگین چهار تکرار ± SE. مقایسه میانگینها در برگ و ساقه به طور مجزا انجام گرفت. حروف غیرمشابه در برگ و ساقه نشان دهنده اختلاف معنیدار در سطح 5 درصد بر اساس آزمون دانکن بین تیمارها است
بحث
نتایج ما در این مطالعه نشان داد که محتوی کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها در برگ گیاه استویا رشد یافته در دمای پایین به میزان قابل ملاحظهای در مقایسه با میزان این رنگیزهها در برگ گیاه شاهد کاهش پیدا کرد. در یک مطالعه اخیراً نشان داده شده است که سرعت فتوسنتز در ارقام مختلف گیاه استویا در دمای 5 درجه سانتیگراد به شدت کاهش پیدا میکند که البته میزان کاهش سرعت فتوسنتز بسته به رقم استویا متفاوت گزارش شده است (20). کاهش میزان رنگیزههای فتوسنتزی و کاهش انتقال الکترون در تیلاکوئیدها و تثبیت کربن میتواند یکی از دلایل مهم کاهش سرعت فتوسنتز در گیاهان تحت تنش دمای پایین است (30 و 37). از جمله عواملی که باعث کاهش محتوی رنگیزههای فتوسنتزی برگ در تنشهای محیطی میشوند میتوان به تخریب ساختمان کلروپلاست و دستگاه فتوسنتزی، فتواکسیداسیون کلروفیلها، تخریب و ویرانی پیش مادههای تولید کننده کلروفیل و همچنین افزایش فعالیت آنزیمهای تجزیه کننده کلروفیل از جمله کلروفیلاز اشاره نمود (29). به هرحال، در پاسخ به تنش دمای پایین، محتوی کاهش یافته کارتنوئیدهای برگ استویا در مقایسه با سطح کاهش یافته کلروفیل کل برگ کمتر بود که میتوان به نقش کاروتنوئیدهای چرخه گزانتوفیل در آزاد کردن انرژی گرمایی و محافظت کردن از مراکز واکنش فتوسیستم II میشود اشاره کرد (13).
در این مطالعه، تنش دمای پایین تجمع افزایش یافته H2O2 را در برگ و ساقه گیاه استویا را تحریک کرداز سوی دیگر میزان H2O2 در برگ نسبت به ساقه با شدت گرفتن میزان تنش افزایش قابل توجهی نشان داد که با گزارش مشابهی مبنی بر افزایش میزان H2O2 تحت دمای پایین در گیاهانی مانند گندم مطابقت داشت (23). تنش دمای پایین تولید و تجمع ROS مانند H2O2 را در گیاهان تحت تنش از طریق به هم خوردن تعادل بین جذب نور و استفاده از نور به واسطه بازداشته شدن فعالیت سیکل کالوین، افزایش یافتن جریان انتقال الکترون فتوسنتزی به O2 و احیاء بیش از اندازه زنجیره انتقال الکترون تنفسی افزایش میدهد و در نتیجه منجر به تنش اکسیداتیو از طریق اکسیداسیون لیپیدها، پروتئینها و اسیدهای نوکلئیک میشود که به ساختارها و ماکرومولکولهای سلولی آسیب وارد کرده و باعث مرگ سلولها میشود (34). نتایج این تحقیق نشان داد که میزان MDA در برگ و ساقه گیاه استویا تحت تنش دمای پایین به میزان قابل ملاحظهای در مقایسه با شاهد افزایش پیدا کرد که تأیید کننده لیپید پراکسیداسیون غشاءهای سلولی در گیاه استویا در پاسخ به تنش دمای پایین است. به علاوه، میزان MDA در برگ نسبت به ساقه با تشدید تنش سرما افزایش نشان داد. در توافق با این نتایج، مطالعات انجام شده روی گیاهچههای ماش (Vigna radiate) به افزایش میزان MDAتحت تنش دمای پایین اشاره شده است (33). H2O2 و سایر رادیکالهای فعال اکسیژن ترکیبات سمی برای سلولها هستند که باید در کمترین زمان و به سرعت توسط سیستم دفاع آنتی اکسیدانی جاروب شوند. در صورتی که توان دفاع آنتی اکسیدانتی سلولها اعم از آنزیمی یا غیرآنزیمی برای از بین بردن رادیکالهای فعال اکسیژن کافی نباشد، این رادیکالها که بسیار واکنشگرند با خارج کردن H+ از فسفولیپیدها موجب تشکیل رادیکال فعال اسید چرب شوند و رادیکال اسید چرب در حضور اکسیژن با سنتز پراکسید اسید چرب میتواند ضمن تخریب چربیها و پروتئینها رادیکالهای بیشتری تولید نماید. آلدئیدهایی مانند مالوندیآلدئید از جمله محصولات واکنشهای پراکسیداسیون لیپیدها هستند که به عنوان شاخصی برای ارزیابی این واکنشها در نظر گرفته میشوند. در گیاهانی که قادر به سازگاری نباشند روند تولید MDA با افزایش پراکسیداسیون چربیهای غشاء ادامه مییابد و تداوم این وضعیت موجب از هم گسیختگی ساختار غشاء و خروج آب و یونها از سلول میشود و تداوم این شرایط تنش در نهایت به مرگ سلول منجر میشود (25). پاسخ گیاه به تنش اکسیداتیو القاء شده توسط دمای پایین شامل افزایش فعالیت آنزیمهای سیستم دفاع آنتیاکسیدانتی مانند SOD، CAT، APX و GPX میباشد که با جاوب کردن ROS از تجمعشان جلوگیری میکند (44). نتایج پژوهش اخیراً نشان داد که دمای پایین فعالیت آنزیم SOD را در برگ و ساقه گیاه استویا افزایش داد و میزان فعالیت آن در ساقه نسبت به برگ با شدید شدن تنش سرما افزایش بیشتری نشان داد در توافق با این نتایج، مطالعات انجام شده روی تنباکو نیز تأیید کرده است که فعالیت SOD در پاسخ به دمای پایین افزایش مییابد (43). سوپراکسید دیسموتاز اولین آنزیم پاکسازی کننده ترکیبات ROS به شمار میرود که باعث تبدیل O2•− به H2O2 میشود، میزان H2O2 تولید شده به وسیله آنزیمهای زیادی کنترل میشود که CAT و APX از جمله مهمترین آنها هستند (9). نتایج نشان داد که فعالیت آنزیمهای CAT، APX، GPX و PPO که در مهار و پاکسازی کردن H2O2 دخالت دارند (11) در پاسخ به تنش دمای پایین در برگ و ساقه گیاه استویا در مقایسه با شاهد افزایش پیدا کرد. میزان فعالیت آنزیم GPX و PPO در برگها نسبت به ساقههای تحت تنش سرما افزایش بیشتری نشان داد در حالیکه آنزیمهای APX و CAT در ساقه نسبت به برگ افزایش بیشتری را نشان دادند. به هرحال، اگرچه دمای پایین باعث شد که فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانتی (SOD، CAT، APX، GPX و PPO) در برگ و ساقه استویا افزایش پیدا کند و ظرفیت آنتیاکسیدانتی در برگ و ساقه گیاه استویا در شرایط تنش دمای پایین بالاتر از ظرفیت آنتی اکسیدانتی در گیاه شاهد بود، ولی میزان تجمع H2O2 و MDA در برگ و ساقه استویا تحت تنش دمای پایین هنوز در مقایسه با میزان آنها در گیاه شاهد بالاتر بود که نشان میدهد افزایش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانت به اندازه کافی بالا نبوده که بتواند H2O2 تولید شده تحت تنش دمای پایین را به طور کارآمد پاکسازی کند و از پراکسیداسیون لیپیدهای غشاءهای سلولی جلوگیری کند.
آنزیمهای PAL و TAL اولین مرحله مسیر فنیل پروپانوئید را کاتالیز میکنند که برای سنتز چندین متابولیت ثانویه مرتبط با سیستم دفاعی مانند فلاونوئیدها و فنلها دخالت دارند و سلولهای گیاهی را در مقابل لیپید پراکسیداسیون توسط ROS محافظت میکنند (17). نتایج این تحقیق نشان داد که به موازات افزایش فعالیت آنزیمهای PAL و TAL در گیاه استویا تحت تنش دمای پایین، میزان تجمع ترکیبات فنلی و فلاونوئیدها نیز در گیاه استویا در پاسخ به دمای پایین در مقایسه با میزان این ترکیبات در گیاه شاهد افزایش پیدا کرد که احتمالاً با تجمع بیشتر ROS در این گیاه در دمای پایین مرتبط میباشد. میزان ترکیبات فنل کل و فلاونوئیدها در ساقه نسبت به برگ با شدت گرفتن میزان تنش، افزایش بیشتری نشان دادند و میزان فعالیت آنزیمهای PAL و TAL در برگ نسبت به ساقه در تنش شدیدتر سرما افزایش قابل ملاحظهای نشان دادند. در یک مطالعه انجام شده روی گیاه استویا تحت تنش خشکی مشخص شد که میزان تجمع ترکیبات فنلی در گیاه استویا در پاسخ به تنش خشکی افزایش نشان داد (19). به علاوه، در گزارشاتی بیان شده است که میزان تولید ترکیبات فنلی و فلاونوئیدها که از مشتقات مسیر فنیل پروپانوئید سلولها هستند در پاسخ به تنشهای محیطی نظیر خشکی (38) و کمبود عناصر غذایی (16) افزایش مییابد به طوری که افزایش غلظت این ترکیبات سبب جاروب کردن ROS و مهار پراکسیداسیون لیپیدها میشوند (7). در شرایطی محیطی مانند دمای پایین که فعالیت فتوسنتزی گیاه کاهش پیدا میکند، جریان فوتونی وارد شده به درون برگ بیش از توانایی گیاه برای مصرف فوتون میباشد و بنابراین انرژی برانگیختگی اضافی در درون دستگاه فتوسنتزی ممکن است به عملکرد کلروپلاست آسیب وارد کرده و باعث کاهش سریع کارآیی کوانتومی فتوسیستم II و تولید مقادیر زیادی ROS و نتیجتاً اکسیداسیون نوری میشود. نتایج مطالعه اخیراً نیز نشان داد که میزان آنتوسیانین در برگ و ساقه گیاه استویا در پاسخ به تنش دمای پایین به میزان قابل ملاحظهای در مقایسه با میزان آن در گیاه شاهد افزایش نشان داد.نتایج این تحقیق نشان داد که آنتوسیانین در برگ در مقایسه با ساقه در پاسخ به تنش سرما به میزان بیشتری تجمع پیدا کرد آنتوسیانینها که به گروه متابولیتهای ثانویه فلاونوئیدی تعلق دارند، با از بین بردن بخشی از فوتونهای اضافی وارد شده به درون برگ قادرند کلروپلاستها را آسیبهای ناشی از فوتون اضافی محافظت کنند (25). به علاوه، یک ارتباط قوی بین تنش دمای پایین و تجمع آنتوسیانیها در گیاهان وجود دارد (39). آنتوسیانینها از مسیر فنیل پروپانوئید سنتز میشوند و سنتزشان توسط آنزیمهای کلیدی این مسیر مانند آنزیم PAL کنترل میشود (3). به این ترتیب، افزایش در تجمع آنتوسیانین در گیاه استویا رشد یافته تحت تنش دمای پایین به فعالیت افزایش یافته آنزیم PAL در این گیاه مرتبط میباشد.
یکی دیگر از تنشهایی که به دنبال تنش دمای پایین در گیاهان تحت تنش ایجاد میشود تنش اسمتیک است که استراتژی مهم گیاهان در مقابل تنش اسمتیک تجمع محلولهای سازگار یا اسمولیتها مانند قندها، آمینواسیدها و مشتقات دیگر مانند بتایین است که از تشدید تنش اسمتیک جلوگیری میکند (37). در این مطالعه، تجمع قابل ملاحظه قندهای محلول و احیاء در برگ و ساقه گیاه استویا در پاسخ به تنش دمای پایین مشاهده شد که با گزارشی مبنی بر تجمع افزایش یافته قندهای محلول در برگ گونههای گیاهی مختلف در پاسخ با دمای پایین مطابقت داشت (1). تجمع قندها در برگ ممکن است به دلیل بهم خوردن تعادل بین بافتهای منبع و مخزن باشد و سرعت تولید قند از سرعت صادرات قند به برگهای مخزن تجاوز کند (1).به علاوه، نتایج این تحقیق نشان داد که میزان تجمع قندهای محلول و احیاء در ساقه نسبت به برگ در پاسخ به تنش سرما افزایش بیشتری نشان داد که میتواند با نقش ساقه به عنوان جایگاهی برای ذخیره کوتاه مدت کربوهیدراتها در حین تنش مطابقت داشته باشد (12). همچنین، تجمع قندهای محلول در گیاهان در پاسخ به تنشهای محیطی در تنظیم اسمزی و نیز در ثبات و استحکام غشاءها و ذخیره کربن نقش بازی میکنند (36).
تنش دمای پایین تجمع آمینواسیدها را در برگ و ساقه گیاه استویا افزایش داد که احتمالاً یک پاسخ به تنش اسمتیک است که به دنبال در معرض قرارگرفتن گیاه استویا در تنش سرما ایجاد میشود آمینواسیدها یکی دیگر از محلولهای سازگار است که به عنوان اسمولیت در گیاهان تحت تنشهای غیرزیستی نظیر تنش سرما تجمع مییابد (31). از میان آمینواسیدها، پرولین مهمترین آمینواسیدی است که به عنوان یک محافظت کننده اسمزی نقش مهمی در حفظ تعادل اسمتیک و ثبات ساختارهای سلولی در گیاهان بازی میکند و گیاهان را از آسیبهای ناشی از تنش اسمتیک محافظت میکند (10) و با عملکردش برای جاروب کردن رادیکالهای آزاد و عمل آنتی اکسیدانتی برای محافظت از گیاه در مقابل تنش اکسیداتیو عمل می کند (22). نتایج ما در این مطالعه نشان داد که دمای پایین باعث شد که پرولین در برگ و ساقه استویا به میزان قابل ملاحظهای تجمع پیدا کند که با گزارش ارائه شده برای گیاه Zoysiagrass تحت تنش دمای پایین مطابقت دارد (26). از آنجایی که برگها همواره به عنوان جایگاه اصلی فرایندهای متابولیسمی هستند روند افزایشی در تجمع پرولین در برگ نسبت به ساقه با تشدید تنش سرما مشاهده شد.
نتیجهگیری
محتوای رنگیزههای (کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل
و کاروتنوئید) در گیاه استویا تحت شرایط تنش سرما (5 و 10 درجه سانتیگراد) کاهش پیدا کرد که احتمالاً به کاهش در سرعت فتوسنتز منجر میگردد. تنش سرما باعث شد که گیاه استویا با تنش اکسیداتیو هم روبرو گردد به طوری که افزایش تجمع H2O2 ونیز تجمع MDA در برگ و ساقه مشاهده شد. بنابراین، فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانت (SOD، CAT، APX، GPX و PPO)، متابولیتهای ثانویه (ترکیبات فنلی، فلاونوئیدها و آنتوسیانینها) و ظرفیت آنتیاکسیدانت کل در برگ و ساقه گیاه استویا در معرض تنش سرما افزایش پیدا کرد. به علاوه، تجمع قند محلول کل، قند احیاء، آمینواسید کل و پرولین در برگ و ساقه گیاه استویا در معرض تنش دمای پایین افزایش پیدا کرد که احتمالاً یک پاسخ گیاه به تنش اسمتیک است که به واسطه تنش سرما به وجود آمده است. این تغییرات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی که در گیاه استویا در پاسخ به تنش سرما به وجود میآید یک استراتژی مهم برای به حداقل رساندن آسیبهای حاصل از دمای پایین است به طوری که گیاه بتواند در شرایط تنش زنده باقی بماند و با برطرف شدن شرایط تنش مجدداً رشد اولیه خود را به دست آورد. نتایج این تحقیق اطلاعاتی را فراهم کرد که میتواند برای شناسایی رقمهای استویای حساس و مقاوم به تنش دمای پایین استفاده شود ضمناً متخصصان بیوتکنولوژی میتواند از نتایج این تحقیق برای ایجاد رقمهای استویای مقاوم به تنش دمای پایین از طریق دستکاریهای ژنتیکی استفاده کنند.
سپاسگزاری
نویسندگان مقاله از معاونت پژوهشی و تحصیلات تکمیلی دانشگاه لرستان به دلیل حمایت مالی از انجام این پژوهش تشکر میکنند.