ارزیابی تغییرات شاخص­های فیزیولوژیک در ارقام گلرنگ القا شده تحت تنش زیستی

سید مظفر منصوری^۱*، محسن مهرپرور^۱، مطهره امیری دوماری^۱و حسین مظفری^۲

¹ ایران، کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی،گروه تنوع زیستی

² ایران، کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، گروه اکولوژی

تاریخ دریافت: 4/10/1397            تاریخ پذیرش: 8/6/1398

چکیده

گیاهان دارای مکانیسم­های دفاعی متنوعی هستند که اغلب تحت تنش­های غیرزنده و زنده در آنها القاء می شوند. مقاومت القایی سبب می­شود که کارایی یا ترجیح میزبانی گیاهخوارانی که به گیاه حمله می­کنند، کاهش یابد. در پژوهش حاضر، در مرحله اول چهار رقم تجاری گلرنگ شامل صفه، گلدشت، فرامان، محلی اصفهان و گونه وحشی گلرنگ، Carthamus oxyacantha، مورد تغذیه لارو کرم قوزه پنبه Helicoverpa armigera (Lep.: Noctuidae) قرار گرفتند. سپس لاروها حذف شد و این گیاهان به مدت 72 ساعت بدون آلودگی نگهداری شدند. در مرحله بعدی تعداد چهار شته بالغ بی­بال شته گلرنگ Uroleucon carthami (Hem.: Aphididae) روی گیاهان از قبل مورد تغذیه لارو قرار گرفته و همان تعداد گیاهان شاهد بدون تغذیه قبلی قرار داده شدند و اجازه داده شد که به مدت 15 روز تغذیه و تولیدمثل کنند. نتایج نشان داد که تغذیه لارو کرم قوزه به عنوان عامل القاکننده مقاومت در گیاه گلرنگ تاثیر معنی داری بر شاخص­های فیزیولوژیک گیاه داشته است. شاخص­هایی مانند پراکسید هیدروژن، آمینواسیدهای کل، میزان پروتئین کل، پرولین و قندهای احیا کننده در گیاه گلرنگ به خوبی تحت تاثیر تنش زیستی تغذیه لارو در مقایسه با گیاهان شاهد قرار گرفتند. این تغییرات نشان می دهد که پاسخ ارقام مختلف گلرنگ به پیش تغذیه توسط لارو کرم قوزه پنبه یکسان نبوده و ارقامی مانند محلی اصفهان سازگاری بهتری در جهت مقاومت القایی و تجمع متابولیت­های مهم مانند آب اکسیژنه، پرولین، قند و پروتئین از خود نشان داده اند.

واژه های کلیدی: آب اکسیژنه، شته گلرنگ، لارو کرم قوزه پنبه، مکانیسم دفاعی گیاهان

^*نویسنده مسئول، تلفن: 09131973505، پست الکترونیکی: m.mansouri.89@gmail.com

مقدمه

گیاه گلرنگ، Crathamus tinctorius L. از تیره کاسنیان (Asteraceae) و بومی خاورمیانه بوده که در بیشتر کشورهای جهان به عنوان گیاهی با خواص برجسته، کشت می­شود (4). گلرنگ گیاهی یک ساله علفی و خود گرده ­افشان است که بذر آن حاوی روغن با کیفیت بالا و غنی از اسیدهای چرب غیر اشباع اولوئیک اسید و لینولوئیک اسید است. این گیاه جدا از آنکه به عنوان یک گیاه روغنی شناخته می­شود دارای خواص دارویی نیز می­باشد. به دلیل قابلیت­هایی نظیر قدرت سازگاری بالا، مقاومت به سرما، مقاومت نسبی به خشکی، شوری خاک و موارد مصرف متعدد در بسیاری از کشورها به طور گسترده کشت می­شود (4، 5، 15 و 44). این گیاه در طول دوره­های مختلف رشدی ممکن است توسط آفات حشره­ای مختلفی مورد تغذیه قرار گیرد. از مهم­ترین آفات گلرنگ می­توان به مگس گلرنگ Acanthiophilus helianthi Rossi (Dip: Tephritidae)، سنک تخم گلرنگ Oxycarneus pallens (Herrich-Schäffer) (Hem: Lygaeidae)، زنجرک گلرنگEmpoasca decipiens Paoli(Hem: Cicadellidae)، سن گلخوار (Lygus pratensis (L.) (Hem: Miridae، سرخرطومی گلرنگ Larinus flavescens Germar(Col: Curculionidae)، کرم قوزه پنبه (Lep: Noctuidae) Helicoverp armigera (Hübner) و شته گلرنگ  Uroleucon carthami (Hille Ris Lambers, 1948) (Hem.: Aphididae)  اشاره نمود که در اثر تغذیه به گلرنگ خسارت قابل توجهی وارد می­سازند (2). شته­ها به عنوان آفات مهم کشاورزی شناخته شده­ و یکی از مهمترین گروه­های حشرات گیاه­خوار هستند. شته­ها به دلیل بکرزایی، توانایی تولید مثل بالایی داشته و همچنین به دلیل اینکه اکثر آن­ها چند میزبانه هستند قدرت زنده­مانی بالایی دارند. از این رو می­توانند خسارت اقتصادی قابل توجهی را وارد آورند. شته­ها به کمک قطعات دهانی زننده- مکنده خود از شیره پرورده گیاهی در آوندهای آبکش تغذیه می_­کنند. همچنین شته­ها عامل انتقال برخی از بیماری­های ویروسی می­باشد (3). شته گلرنگU. carthami,  به رنگ قهوه­ای متمایل به قرمز تا قهوه­ای متمایل به مشکی می­باشد. اندازه ­آن­ها بین 1/2 تا 3/3 میلی متر می­باشد (3).

علاوه بر مقاومت ذاتی درگیاهان که شامل عدم رجحان، آنتی بیوز و تحمل که به صورت ارثی بروز می­کنند، یکی از انواع مقاومت گیاهان به گیاهخواران، القای مقاومت یا مقاومت القا شده در گیاهان است. اصطلاح مقاومت القایی به منظور توصیف دفاع گیاهانی که در اثر خسارت حشرات القا می­شوند، بکار می­رود برای آن­که معمولا گیاهان کمتر در معرض طغیان­های بعدی توسط حشرات یا بیماری­ها قرار می­گیرند (20 و 22). به عبارت دیگر، این تغییرات می­توانند مقاومت گیاهان را در برابر طغیان­های بعدی گیاه­خواران از طریق کاهش کارایی و کاهش رجحان گیاه­خواران روی گیاهان خسارت دیده افزایش دهند. گیاهان القا شده اثرات گوناگونی روی زیست­شناسی، فیزیولوژی و رفتار حشرات مرتبط با خود می­گذارند. به عنوان مثال مقاومت القایی روی کارایی یک حشره آفت به وسیله کاهش یا افزایش تعداد کل حشرات و یا روی کیفیت غذایی گیاه میزبان اثر می­گذارد (6 و 7 و 17). مطالعات بسیاری نشان داده­اند که تولید متابولیت­های شیمیایی ثانویه در گیاهان در اثر آلودگی­های قبلی آفات روی فیزیولوژی حشرات تاثیر منفی گذاشته و موجب مرگ و میر و یا به تاخیر افتادن طول دوره­ی نشو و نمای آن­ها می­شود (39). به­طورکلی می­توان گفت مقاومت القایی ایجاد شده در گیاه باعث کاهش نرخ بقاء در مرحله نابالغی حشره، کاهش نرخ نشو و نما، کاهش تخمریزی و همچنین کاهش رشد جمعیت می­شود (36 و 42). مقاومت القایی می­تواند به عنوان یک ابزار افزایش دهنده مکانیسم­های دفاع طبیعی گیاه در مقابل انواع حشرات و پاتوژن­ها مطرح گردد که توسط طیفی از فاکتورها برانگیخته می­شود. دراین سیستم، گیاه یا به صورت مستقیم در مرحله­ای از رشد تحت تاثیر عوامل استرس­زا و خسارت­زای زنده شامل، تغذیه حشرات آفت و یا حمله عوامل بیماری­زا قرار می­گیرد و یا به صورت غیرمستقیم تحت تاثیر عوامل غیر زنده مانند تنش­های محیطی، صدمات فیزیکی و یا از گیاه مجاوری که تحت اثر تنش، القای مقاومت درآن صورت گرفته است، مقاومت القا می­شود (21). این نوع مقاومت می­تواند نسبت به باکتری­ها، ویروس­ها، نماتدها، حشرات و پستانداران گیاه­خوار ایجاد ­شود (8). این واکنش­های القایی زمانی در کنترل یک آفت مفید خواهند بود که موجب افزایش حساسیت گیاهان نسبت به سایر حشرات گیاه­خوار، عوامل بیمارگر و شرایط غیرزنده نشوند (6). القای مقاومت در سیستم سه­گانه متقابل، گیاه- حشره آفت- دشمن طبیعی آفت، می­تواند به دو روش مستقیم و غیرمستقیم ایجاد گردد. در روش مستقیم، مقاومت القایی توسط پروتئین­های رها شده جهت محافظت گیاهان در مقابل حشرات ایجاد می­شود و یا گیاه ممکن است برای کاهش تغذیه، تخمریزی و نشو و نما گیاه­خوار مواد شیمیایی دفاعی تولید کند (32 و 31). در روش غیر مستقیم، مقاومت القایی در اثر رهاسازی ترکیبات فرار جهت جلب دشمنان طبیعی گونه­های گیاه­خوار که روی گیاهان تغذیه می­کنند، ایجاد می­شود (12). واکنش گیاهان در اثر خسارت وارد شده توسط حشرات گیاه­خوار اغلب موجب افزایش تولید متابولیت­های ثانویه زیان­بار برای حشرات خسارت­زا می­شود (8). به عنوان مثال، افزایش میزان تولید جاسمونیک اسید، سالیسیلیک اسید، آمینوبوتریک اسید (16، 18 و 28) و پروتئین­های بازدارنده­ی تغذیه (29) می­توانند به عنوان مکانیسم دفاع القایی میزان خسارت حشرات گیاه­خوار را کاهش دهند. واکنش­های دفاعی گیاهی مانند تولید ترکیبات فنلی و هورمون­های گیاهی از جمله سالیسیلیک اسید و جاسمونیک اسید بوسیله­ی سیگنال­هایی در اثر خسارت قبلی حشرات القا می­شود (14 و 26). علاوه بر عوامل القا کننده که ذکر شده است پروتئین­های مهارکننده (باز دارنده­های پروتئینی) نیز در القای مقاومت نقش دارند. عملکرد بازدارنده‌های پروتئیناز، مسدود کردن پروتئاز‌های گوارشی در سیستم گوارشی گیاه­خوار است (28). در یک پژوهش تاثیر سالیسیلیک اسید به عنوان یک ترکیب القا کننده جهت القای مقاومت در پنبه نسبت به کرم قوزه پنبه بررسی شد (10). مقاومت القایی نسبت به گیاه­خواران در سایر گیاهان از جمله گندم، سویا، گوجه فرنگی، ذرت، پنبه و سیب زمینی مشاهده شده است (17 و 40). مطالعات انجام گرفته روی گیاه تربچه و رفتار گیاه­خواری لاروهای Trichoplusia ni (Hübner)  روی کلم نشان داده است که دفاع شیمیایی القایی در گیاه تربچه باعث کاهش قابل توجهی در نرخ رشد جمعیت این آفت می­شود، به طوری­که مقاومت القایی ایجاد شده در گیاه باعث کاهش نرخ بقاء در مرحله نابالغ حشره، به تاخیر افتادن نشو ونما، کاهش تخم­گذاری و همچنین توقف رشد جمعیت می­شود (31). در مطالعه­ای مشخص شد که گیاهان تریتیکاله مورد تغذیه قرار گرفته توسط شته غلات، Sitobiom avenae Mordvilko ، سبب افزایش میزان تولید آسکوربات و همچنین فعالیت آنزیم آسکوربات پروکسیداز شده است(24). در بررسی مقاومت القایی در برگ­های گیاهان ذرت و سیب دیده شده است که برگ­های این گیاهان ترکیبات فرار و متفاوتی در واکنش به خسارت گیاه­خواران به بیرون تراوش می­کنند (38). در بررسی دیگر آلوده­سازی پیشین دو رقم هلو به وسیله شته­ی سبز هلو مورد مطالعه قرار گرفته است (30). در آزمایشی دیگر پیش آلوده سازی گیاه گوجه فرنگی به شته سیب­زمینی، Macrosiphum euphorbiae Thomas انجام گرفته است (20). هچنین آلودگی­های پیشین گیاه گوجه فرنگی به سفید بالک Bemisia argentifolii Bellows & Perring بررسی شده است (25). آلودگی­های پیشین گیاه پنبه به شته سبز جالیز،Aphis gossypii Glover  نیز مورد مطالعه قرار گرفت است (44).

مطالعه مقاومت القایی، میزان و مدت زمان القای مقاومت و تاثیر آن روی آلودگی گیاه به وسیله گیاهخواران دیگر و تاثیر مقاومت بر تغییرات جمعیت و فیزیولوژی این گیاهخواران و همچنین مطالعه تغییرات ایجاد شده در اثر القای مقاومت در میزان تجمع ترکیبات بیوشیمیایی گیاه مانند متابولیت­های اولیه (قند و پروتئین) و حتی ترکیبات ثانویه مانند آب اکسیژنه (H₂O₂) در گیاهان از اهمیت زیادی برخوردار است، این پژوهش جهت مطالعه مقاومت القایی در برخی ارقام گلرنگ در اثر تغذیه  قبلی لارو کرم قوزه پنبه به عنوان یک آفت با نوع تغذیه جونده روی جمعیت شته گلرنگ پرورش یافته روی گیاهان از قبل آلوده و گیاهان شاهد بدون آلودگی قبلی انجام شد. بحث ایجاد یا عدم ایجاد مقاومت القایی در گیاه گلرنگ و مقایسه میزان القای مقاومت در ارقام مختلف گلرنگ یکی از فاکتورهای مهمی است که در اینجا مورد مطالعه و مقایسه قرار می­گیرد. بنابراین اهداف اصلی این مطالعه شامل بررسی ایجاد مقاومت القایی توسط تغذیه لارو کرم قوزه پنبه در ارقام مختلف گیاه گلرنگ و گونه وحشی و اثر متقابل آن­ها بر رشد و تولید مثل شته گلرنگ و همچنین بررسی پاسخ فیزیولوژیک پنج رقم گیاه گلرنگ (صفه، گلدشت، فرامان، محلی اصفهان و گونه وحشی) مورد آزمایش به عامل القا کننده مقاومت بودند.

مواد و روشها

تهیه بذرها و پرورش گیاهان: بذرهای چهار رقم گلرنگ شامل ارقام صفه، گلدشت، فرامان، محلی اصفهان از شرکت توسعه کشت دانه­های روغنی واقع در اصفهان تهیه شدند. بذرهای گلرنگ وحشی Carthamus oxyacantha از محوطه دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته کرمان جمع‌آوری شدند. برای کشت گیاه گلرنگ از گلدان­‌های پلاستیکی به قطر 14 و ارتفاع 18 سانتی­متر استفاده شد. بذرهای گلرنگ در عمق نیم سانتی­متری از سطح خاک کشت شدند. خاک مورد استفاده جهت کشت گیاهان با نسبت 40 درصد خاک رس، 40 درصد ماسه و 20 درصد مواد آلی به عنوان بستر کشت بود. ابتدا در هر گلدان پنج بذر در عمق نیم سانتی­متری از سطح خاک کشت شدند. به دلیل تاخیر در زمان جوانه­زنی بذرهای گونه­ی وحشی، این بذرها پنج روز زودتر از سایر ارقام گلرنگ کاشته شدند. پس از سبز شدن بذرها دو عدد از گیاهچه­ها نگه داشته شده و بقیه حذف شدند و به منظور مشخص بودن ارقام گلدان­ها کدگذاری شدند. آبیاری گیاهان با توجه به نیاز گیاه انجام شد. در مرحله چهار برگی، زمانی که از بقای گیاه اطمینان حاصل شد تنها یک گیاه در گلدان باقی گذاشته شد.

پرورش  شب­پره کرم قوزه پنبه: برای پرورش شب پره کرم قوزه پنبه Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) ، تعدادی بلال ذرت و میوه گوجه فرنگی آلوده به لارو آفت از مزارع اطراف ماهان در استان کرمان جمع آوری شدند و با قرار دادن در ظروف پلاستیکی با درب توری به آزمایشگاه منتقل شدند. در آزمایشگاه لاروها در ظرف­ مخصوصی به طول 100 و عرض 70 سانتی متری که کف آن­ حاوی مقداری خاک اتوکلاو شده بود، قرار داده شدند. سپس شفیره های تشکیل شده از قفس خارج و در ظروف جداگانه­ای قرار داده شدند. پس از ظهور حشرات کامل هر جفت از آن­ها را داخل ظروف شیشه­ای با درب توری جهت جفتگیری نگهداری شدند. سپس حشرات ماده جفت گیری کرده به داخل قفس های توری منتل شدند و تخم­های خود را روی برگ های بوته های گلرنگ قرار داده شده داخل قفس قرار می­دادند. روزانه برگ­های حاوی تخم حشره داخل پتری ظروف کوچک پلاستیکی روی پنبه مرطوب قرا داده شدند. تخم­ها سه تا پنج روز بعد تفریخ شدند. در این تحقیق از تخم­های همسن برای آزمایش استفاده شد. لاروهای خارج شده از تخم به طور جداگانه روی بوته­های گلرنگ پرورش داده شدند و از لاروهای سن سوم جهت انجام آزمایش­ها استفاده شد.

پرورش شته‌ها: در این تحقیق از شته  Aphididae) (Hemiptera:  carthami  Uroleucon استفاده شد. برای تهیه کلنی این شته، از افراد بی بال بالغ از کلنی موجود در گلخانه پژوهشی دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته کرمان استفاده شد. کلونی شته‌ها روی گیاه گلرنگ در قفس­هایی به طول 48 و عرض 32 سانتی­متر که با توری با بافت ریز پوشیده شده ‌بودند در گلخانه تحت شرایطی مشابه با شرایط پرورش گیاهان پرورش داده شدند. به ‌منظور حفظ کلنی شته­ها هر هفته گیاهان آلوده به شته­ با گیاهان جدید جایگزین می‌شدند.

بررسی میزان القای مقاومت در ارقام مختلف گلرنگ و گلرنگ وحشی در اثر تغذیه لارو کرم قوزه پنبه: گیاهان کشت شده پس از رشد و رسیدن به مرحله شش برگی در 10 بلوک به صورت طرح بلوک­های کامل تصادفی قرار گرفتند. بدین صورت که در هر بلوک آزمایشی پنج تیمار و پنج شاهد وجود داشت که شامل چهار رقم و یک گونه گلرنگ وحشی بود. در مجموع 50 بوته به عنوان تیمار به طور تصادفی انتخاب و کدگذاری شدند. در هر بلوک آزمایشی یک بوته از هر رقم گلرنگ به عنوان تیمار و یک بوته از هر رقم به عنوان شاهد در نظر گرفته شدند. تعداد یک عدد لارو سن سوم کرم قوزه پنبه بعد از 12 ساعت گرسنگی روی هریک از بوته­های مربوط به تیمار قرار داده شد و به مدت یک هفته ، هر لارو روی هر بوته­ روزانه یک ساعت جهت تغذیه قرار داده شد و بعد از تغذیه به مدت 72 ساعت به گیاهان استراحت داده شد. بوته­های شاهد در هر بلوک بدون آلودگی به لارو نگهداری شدند. گیاهان با طلق­های شفاف استوانه­ای با قطر 5/12 و ارتفاع 34 سانتی­متر که در انتهای آن توری ظریفی جهت تبادل هوا قرار داده شده بود پوشیده شدند. سپس در مرحله بعد تعداد چهار شته بالغ بی­بال روی همه بوته­های آزمایشی شامل بوته­های تیمار شده و بوته­هایی که به عنوان شاهد از ابتدا بدون تغذیه لارو بودند قرار داده شدند. پس از گذشت 15 روز تمام شته­ها روی کلیه بوته­ها جمع­آوری شدند. سپس شته­های هر گیاه به طور مجزا در ظروف شیشه­ای حاوی الکل اتیلیک (اتانول) 75 درصد ریخته شدند. در زمان مناسب با استفاده از استریومیکروسکوپ شته­ها مورد شمارش قرارگرفتند.

سنجش شاخص های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی گیاهان تحت تنش زیستی: سنجش میزان قند های احیا کننده: برای سنجش میزان قند های احیا کننده از روش Somogy (34) استفاده شد. 2/0 گرم از اندام هوایی گیاه با 10 میلی لیتر آب مقطر در هاون چینی سائیده شد. عصاره حاصل پس از حرارت سانتریفیوژ شد و عصاره گیاهی حاوی قند ها به دست آمد. مقدار 2 میلی لیتر از هر یک از عصاره های تهیه شده به لوله آزمایش منتقل شد و پس از افزودن 2 میلی لیتر محلول سولفات مس به آنها، سر لوله ها با پنبه بسته شد و به مدت 20 دقیقه در حمام آب گرم ( بن ماری ) با دمای 100 درجه سانتی گراد قرار داده شدند. سپس 2 میلی لیتر محلول فسفو مولیبدیک اسید به آنها اضافه شد و پس از چند لحظه رنگ آبی پدیدار شد. شدت جذب محلول ها در طول موج 600 نانومتر توسط دستگاه اسپکترو فتومتر تعیین شد و با استفاده از منحنی استاندارد گلوکز غلظت قند های احیا کننده محاسبه شد. مقدار قند های احیا کننده بر حسب میلی گرم بر گرم وزن تر محاسبه و گزارش شدند.

سنجش اسیدآمینه پرولین: برای اندازه گیری پرولین از روش Bates و همکاران (9) استفاده شد. 02/0 گرم از بافت فریز شده گیاه (ساقه و برگ) در 10 میلی لیتر محلول 3 درصد سولفوسالیسیلیک اسید سائیده و عصاره حاصل به مدت 5 دقیقه در 10000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد. سپس 2 میلی لیتر از مایع رویی را با 2 میلی لیتر معرف نین هیدرین و 2 میلی لیتر استیک اسید خالص مخلوط کرده و یک ساعت در دمای 100 درجه سانتی گراد در حمام آب گرم قرار گرفت. سپس بلافاصله لوله های محتوی مخلوط در حمام یخ، سرد شدند. سپس 4 میلی لیتر تولوئن به مخلوط اضافه شد و لوله ها به خوبی تکان داده شدند. با ثابت نگه داشتن لوله ها به مدت 15 تا 20 ثانیه دو لایه مجزا تشکیل شد. میزان جذب لایه ی رنگی فوقانی که حاوی تولوئن و پرولین بود در 518 نانومتر تعیین شد و برای محاسبه مقدار پرولین از منحنی استاندارد پرولین استفاده شد و نتایج بر حسب میلی گرم بر گرم وزن تر محاسبه شد.

اندازه­گیریآمینواسیدهایآزاد(FAA) در اندام هوایی:  با استفاده از روشHwang و  Ederer (19) میزان آمینواسیدهای آزاد به روش رنگ سنجی و با استفاده از معرف نین هیدرین مربوطه اندازه گیری شد. ابتدا بافت تازه گیاهی در بافر پتاسیم فسفات سرد 50 میلی مولار(8/6= pH) سائیده شد. سپس مخلوط حاصل به مدت 30 دقیقه در 10000 دور در دقیقه سانتریفوژ گردید.  از محلول رویی برای سنجش میزان آمینواسیدهای آزاد استفاده شد. جذب نمونه ها با دستگاه اسپکتروفتومتر در 570 نانومتر خوانده شد. برای محاسبه مقدار آمینواسیدهای آزاد از منحنی استاندارد گلیسین استفاده شد.

سنجش پروتئین کل در اندام هوایی: جهت سنجش مقدار پروتئین کل از روش Bradford (11) استفاده شد. برای این منظور، ابتدا پروتئین ها از اندام هوایی گیاه در بافر استخراج با دمای بین 0 تا 4 درجه سانتی گراد در آب یخ استخراج شدند. برای این منظور بافت فریز شده گیاهی در یک هاون چینی حاوی بافر فسفات 50 میلی مولار با 5/7pH =  که دارای اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) 1 میلی مولار، فنیل متان سولفونیل فلورید (PMSF) 1 میلی مولار و پلی وینیل پیرولیدین (PVP) 1% بود، سائیده شد. عصاره حاصل به مدت 15 دقیقه در سانتریفیوژ یخچال دار در 14000 دور و دمای 4 درجه سانتی گراد قرار گرفت. از محلول رویی برای سنجش پروتئین کل نمونه های مورد مطالعه استفاده شد. به این منظور به لوله های آزمایش مقدار 1/0 میلی لیتر عصاره پروتئینی، 5 میلی لیتر معرف بیوره افزوده و سریعا ورتکس شد. پس از دو دقیقه و قبل از یک ساعت جذب محلول ها با دستگاه اسپکترو فتومتر در طول موج 595 نانومتر خوانده شد و غلظت پروتئین با استفاده از منحنی استاندارد آلبومین محاسبه و بر حسب میلی گرم بر گرم وزن تر محاسبه شد.

تجمع پراکسید هیدروژن (H₂O₂) در اندام هوایی: سنجش میزان تجمع پراکسید هیدروژن با استفاده از روش Velikova و همکاران (41) به صورت رنگ­سنجی  انجام پذیرفت. بافت­های اندام هوایی گیاه در حمام یخ با تری­کلرواستیک اسید سائیده شدند و عصاره با استفاده از یک سانتریفوژ یخچال­دار (Centrifuge 5804R, Germany ساخت شرکت Eppendorf ) در 10000 دور در دقیقه برای مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شد. سپس 5/0 میلی­لیتر از محلول رویی  به 5/0 میلی­لیتر بافر فسفات پتاسیم 10  میلی مولار (7= pH)  و یک میلی­لیتر یدید پتاسیم یک مولار اضافه شد و جذب محلول­ها در طول موج 390 نانومتر خوانده شد. مقدار پراکسید هیدروژن در هر نمونه با استفاده از ضریب خاموش M^-1cm^-128/0 محاسبه شد و بر حسب میکرومول بر گرم وزن تر گزارش شد.

تجزیه و تحلیل آماری: این آزمایش در قالب طرح بلوک های کامل تصادفی با 10 تکرار انجام گرفت. تحلیل آماری داده­های بدست آمده پارامترهای مختلف در این پژوهش، با نرم­افزار آماری SPSS نسخه 22 انجام شد. قبل از تجزیه داده­ها نرمال بودن آن­ها مورد آزمون قرار گرفت. مقایسه کلی میانگین ها هم با استفاده از روش آنالیز واریانس (ANOVA) صورت گرفت. مقایسه دقیق و جفتی میانگین­های بین گروهی فاکتورهای آزمایش با استفاده از آزمون توکی در سطح احتمال پنج درصد انجام پذیرفت.

نتایج

بررسی میزان القای مقاومت در ارقام مختلف گیاه گلرنگ و گلرنگ وحشی در اثر تغذیه لارو کرم قوزه پنبه: نتایج تجزیه واریانس نشان داد که  بین تیمار­ بدون آلودگی قبلی و تیمار از قبل آلوده به لارو که تحت تغذیه لارو کرم قوزه پنبه قرار گرفتند از نظر تعداد کل شته تفاوت معنی داری وجود داشته است. در بلوک و اثر متقابل رقم و تیمار القای مقاومت نسبت به این شاخص اختلاف معنی­داری مشاهده نشد (جدول 1).  با مقایسه تعداد کل شته روی ارقام مختلف گیاه گلرنگ مشخص شد که بیشترین پاسخ متعلق به رقم محلی اصفهان و گلرنگ وحشی به دست آمد (شکل 1).

جدول 1- جدول تجزیه واریانس میانگین تعداد کل شته گلرنگ روی ارقام مختلف گلرنگ و گلرنگ وحشی تحت تنش زیستی تغذیه لارو کرم قوزه پنبه