نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی مشهد

2 عضو هیئت علمی دانشگاه فردوسی مشهد

3 کروه فارماکوگنوزی، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی مشهد

4 گروه آموزش زیست شناسی، دانشگاه فرهنگیان، تهران

چکیده

گیاه برازمبل (Perovskia abrotanoides Kar.)، گونه‌ای چندساله از تیره نعناعیان (Lamiaceae) است که به خاطر غنی بودن ریشه‌ها از ترکیبات ترپنوئیدی به نام تانشینون‌ها، ویژگی‌های دارویی متعددی نظیر خاصیت ضد میکروبی، ضد دیابت، ضد التهاب و ضد سرطان دارد. در پژوهش حاضر، اثر تیمارهای انفرادی و ترکیبی نیترات نقره (Ag+) و عصاره مخمر (YE) بر رشد و تولید تانشینون‌ها در ریشه‌های نوپدید گیاه برازمبل بررسی شد. ریشه‌های نوپدید، در محیط کشت MS جامد حاوی mg/L NAA 2، از ریزنمونه‌های برگ القا و برای رشد بیش‌تر و تیمار با تازن‌ها، به محیط MS مایع منتقل شدند. در بخش اول پژوهش، پس از تیمار ریشه‌ها با (Mµ 25) Ag+، به مدت 24، 48 و 168 ساعت، تیمار یک هفته‌ای با این تازن، به‌عنوان بهترین تیمار برای رشد و تولید تانشینون‌ها انتخاب شد. در تیمارهای ترکیبی، افزودن (mg/L 200) YE به محیط، 12، 24 و 48 ساعت پس از پیش تیمار با Ag+ انجام شد و ریشه‌ها یک هفته پس از تیمار با اولین تازن، برداشت شدند. کاربرد انفرادی تازن‌ها رشد ریشه‌ها را بهبود بخشید ومحتوای تانشینون کل را حدود 6 برابر کنترل افزایش داد. نقره با افزایش 12 برابری در تجمع تانشینون II-A، بهترین تیمار برای تولید این متابولیت بود. تیمارهای ترکیبی، بسته به مدت زمان حضور YE، تاثیر متفاوتی بر محتوای تانشینون‌‌ها داشتند، اما در بهترین حالت (کاربرد YE دوازده ساعت بعد از Ag+)، مقدار کل تانشینون‌ها به 2 برابر تیمارهای انفرادی ارتقا یافت که ناشی از افزایش چشمگیر تانشینون I بود. هیچ‌کدام از تیمارها تاثیر معنی‌دار بر مقدار کریپتوتانشینون نداشتند.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

In vitro production of tanshinones in adventitious root cultures of Perovskia abrotanoides Kar. under Ag+ ion and yeast extract elicitation

نویسندگان [English]

  • Behnaz Bayesteh 1
  • Parvaneh Abrishamchi 2
  • Javad Asili 3
  • Arehzoo Zaker 4

1 Department of Biology, Faculty of Science, Ferdowsi University of Mashhad

2 Department of Biology, Faculty of Science, Ferdowsi University of Mashhad

3 Department of Pharmacognosy, School of Pharmacy, Mashhad University of Medical Sciences

4 Department of Biology, Farhangian University, Tehran

چکیده [English]

Perovskia abrotanoides Kar. is a perennial species, which belongs to Lamiaceae family. Some pharmaceutical properties (antimicrobial, anti-diabetes, anti-inflammatory and anti-cancer activities) attributed to this plant roots are related to the presence of diterpenoid tanshinones. This study was aimed to investigate the effect of single and combination treatments of AgNO3 (Ag+) and yeast extract (YE) on growth and tanshinone production in adventitious root cultures of P. abrotanoides. Leaf explants were induced to form adventitious roots on a solid MS medium containing 2 mg/L NAA. Regenerated roots were subsequently transferred to a liquid MS medium, for multiplication. In the first experiment, adventitious roots were treated with 25 μM Ag+ for 24, 48 and 168 hours (one week), and the one-week treatment was chosen as the best condition to promote root growth and tanshinone production. In combination treatments, 12, 24 and 48 hours after Ag+ pre-treatment, 200 mg/L YE was added to the cultures, and roots were harvested one week after the first elicitation. Single treatments improved root growth and tanshinone production (six-fold increase compared with the control). Maximum amount of tanshinone-IIA (12 times higher than control) was obtained after a one-week treatment with Ag+. Under the combination treatments, amount of different tanshinones varied depending the time period of YE elicitation. In the best case, two-fold increase in total tanshinone content (over the single treatments) was found 12 hours after addition of YE to Ag+-pre-treated cultures, which was due to the remarkable increase in tanshinone-I. No significant changes were measured in cryptotanshinone levels.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Perovskia abrotanoides
  • adventitious root
  • tanshinone
  • yeast extract
  • AgNO3

تولید درون شیشه­ای تانشینون­ها در ریشه­های نوپدید گیاه برازمبل

(Kar. abrotanoides Perovskia) با استفاده از نیترات نقره و عصاره مخمر

بهناز بایسته1، پروانه ابریشم چی1*، جواد اصیلی2 و آرزو ذاکر3

1 ایران، مشهد، دانشگاه فردوسی مشهد، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

2 ایران، مشهد، دانشگاه علوم پزشکی مشهد، دانشکده داروسازی، گروه فارماکوگنوزی

3 ایران، تهران، دانشگاه فرهنگیان، گروه آموزش زیست شناسی

تاریخ دریافت: 4/8/1398              تاریخ پذیرش: 5/9/1398

چکیده

گیاه برازمبل (Perovskia abrotanoides Kar.)، گونه­ای چندساله از تیره نعناعیان (Lamiaceae) است که به خاطر غنی بودن ریشه­ها از ترکیبات ترپنوئیدی به نام تانشینون­ها، ویژگی­های دارویی متعددی نظیر خاصیت ضد میکروبی، ضد دیابت، ضد التهاب و ضد سرطان دارد. در پژوهش حاضر، اثر تیمارهای انفرادی و ترکیبی نیترات نقره (Ag+) و عصاره مخمر (YE) بر رشد و تولید تانشینون­ها در ریشه­های نوپدید گیاه برازمبل بررسی شد. ریشه­های نوپدید، در محیط کشت MS جامد حاوی mg/L NAA 2، از ریزنمونه­های برگ القاء و برای رشد بیش­تر و تیمار با تازن­ها، به محیط MS مایع منتقل شدند. در بخش اول پژوهش، پس از تیمار ریشه­ها با (Mµ 25) Ag+، به مدت 24، 48 و 168 ساعت، تیمار یک هفته­ای با این تازن، به­عنوان بهترین تیمار برای رشد و تولید تانشینون­ها انتخاب شد. در تیمارهای ترکیبی، افزودن (mg/L 200) YE به محیط، 12، 24 و 48 ساعت پس از پیش تیمار با Ag+ انجام شد و ریشه­ها یک هفته پس از تیمار با اولین تازن، برداشت شدند. کاربرد انفرادی تازن­ها رشد ریشه­ها را بهبود بخشید ومحتوای تانشینون کل را حدود 6 برابر کنترل افزایش داد. نقره با افزایش 12 برابری در تجمع تانشینون II-A، بهترین تیمار برای تولید این متابولیت بود. تیمارهای ترکیبی، بسته به مدت زمان حضور YE، تأثیر متفاوتی بر محتوای تانشینون­ها داشتند، اما در بهترین حالت (کاربرد YE دوازده ساعت بعد از Ag+)، مقدار کل تانشینون­ها به 2 برابر تیمارهای انفرادی ارتقاء یافت که ناشی از افزایش چشمگیر تانشینون I بود. هیچ­کدام از تیمارها تأثیر معنی­دار بر مقدار کریپتوتانشینون نداشتند.

واژه های کلیدی:Perovskia abrotanoides ، تانشینون، ریشه نوپدید، نیترات نقره، عصاره مخمر.

* نویسنده مسئول: تلفن: 989151246726+، پست الکترونیک: [email protected]

مقدمه

 

کشور ایران به علت تنوع اقلیمی و جغرافیایی خاص خود، رویش­گاه بسیاری از گیاهان دارویی است که بخش بزرگی از آنان، بومی ایران هستند. برازمبل (Perovskia abrotanoides Kar.)، گیاه دارویی باارزشی است که در ایران (استان­های گلستان، مازندران، اصفهان، خراسان و سیستان و بلوچستان)، افغانستان، پاکستان، ترکمنستان، قرقیزستان، تبت و هیمالیا پراکنده شده است (1). این گونه، گیاهی معطر، بوته­ای-درختچه­ای و چند ساله متعلق به زیرتیره Nepetoideae از تیره نعناعیان (Lamiaceae) است که در سال 2017، براساس مطالعات فیلوژنتیک مولکولی، به عنوان گونه­ای از جنس مریم گلی (Salvia) و با نام علمی Salvia abrotanoides (مریم گلی روسی) معرفی شده است (12).

گیاه برازمبل در ایران و سایر کشورهای آسیایی، به­طور سنتی برای درمان مالاریا، سالک، بیماری­های انگلی، تیفوس، تهوع، تصلب شرائین، بیماری­های قلبی و عروقی، فیبروز کبدی، سرفه، عفونت ادراری و به عنوان ضدعفونی کننده آرام­بخش، تب­بر و مسکن درد و التهاب مورد استفاده قرار می­گیرد (19، 33و 45). بخش عمده­ای از خواص بیولوژیکی و دارویی این گونه را، به حضور ترکیبات فنلی و ترپنوئیدی مختلف در آن، نسبت داده­اند (5و 38).

تانشینون­ها، دی ترپن­های کینونی هستند که در گیاهان زیرتیره Nepetoidae از تیره نعنائیان و برخی از گیاهان متعلق به تیره گاوزبان (Boraginaceae) یافت می­شوند و اولین بار از ریشه گیاه مریم گلی چینی (Salvia miltiorrhiza Bunge) جداسازی شدند. گونه فوق که تاکنون به عنوان غنی­ترین منبع تانشینون در نظر گرفته شده است، حاوی بیش از 40 نوع مختلف از این متابولیت­ها از جمله کریپتوتانشینون (CT)، تانشینون I (T-I) و تانشینون II-A (T-IIA) می­باشد (22). مقدار تانشینون در ریشه­ گونه­های مریم گلی چینی رشد یافته در طبیعت، در گزارش­های مختلف، تا حدی متفاوت است. در گزارش ژونگ و همکاران (2009)، مجموع مقدار سه تانشینون ذکر شده در بالا، در 74 نمونه از ریشه­های این گونه که از مناطق مختلف چین جمع­آوری شده بودند، بین 037/0 تا 41/1 درصد وزن خشک ریشه متغیر بود (62). در حالی که در دو بررسی دیگر، این مقدار، معادل 51/0 (8) و 43/0 (52) درصد وزن خشک برآورد شد. وجود CT، T-I، T-IIA و انواع دیگری همانند هیدروکسی کریپتوتانشینون، اکسوکریپتوتانشینون و اکسومیلتیرون در ریشه گیاه برازمبل نیز تائید شده است (39و 55). در گزارش ذاکر و همکاران (2015)، مجموع مقدار CT و T-IIA در ریشه گیاهان خودروی برازمبل، معادل 08/0 درصد وزن خشک ریشه بود (54).

تانشینون­ها تأثیر محافظت کننده بر سیستم قلب و عروق دارند (15)، ضد دیابت (25)، ضد ­میکروب، ضد التهاب و آنتی­اکسیدان (14و 60) هستند و موجب سمیت سلولی و القا­ی آپوپتوز در رده­های مختلف سلول­های سرطانی می­شوند (54و 58).

مراحل بیوسنتز تانشینون­ها را می­توان در سه بخش معرفی نمود. در ابتدا پیش­سازهای سازنده اسکلت ترپنوئیدی یعنی ایزوپنتنیل­پیروفسفات (IPP) یا دی­متیل­آلیل­دی­فسفات (DMAPP) از طریق مسیر موالونات (MVA) در سیتوسل و یا از مسیر متیل­اریتریتول­فسفات (MEP) در پلاستیدها ساخته می­شوند. در پائین دست مسیر MVA و MEP، این پیش­سازها ابتدا تبدیل به میلتیرادی­ان (miltiradiene) شده و سپس، به دنبال واکنش­های هیدروکسیلی شدن، دکربوکسیلی شدن و اکسیداسیون-احیای متوالی، به ترتیب CT، T-IIA، تانشینون T-IIB (T-IIB) و T-I به ­وجود می­آیند (22).

تولید متابولیت­های ثانوی مختلف نظیر ترکیبات فنلی و ترپنوئیدها، در مقیاس تجاری، از طریق کشت­ ریشه­های نوپدید گیاهان دارویی، انجام شده است (11و 16). ریشه­های نوپدید، یکنواختی ژنتیکی دارند و هنگامی­که در معرض تنظیم کننده­های رشد گیاهی مناسب قرار گیرند، به­خوبی رشد می­کنند. استفاده از محرک­های زیستی و غیرزیستی که تحت نام تازن (elicitor) نیز معرفی می‍شوند، تولید متابولیت­های ثانوی را در ریشه­های نوپدید تحریک می­کند (31و 41).

پژوهش­های انجام شده با هدف تولید تانشینون­ها در ریشه­های نوپدید و موئین گیاه برازمبل بسیار اندک و محدود به دو گزارش است. ذاکر و همکاران (2015)، با استفاده از تازن­های زیستی و غیرزیستی مختلف از جمله عصاره مخمر (YE) و نیترات نقره (Ag+) تولید CT و T-IIA را در ریشه­های نوپدید برازمبل افزایش دادند (55). بنابر گزارش فرج تبار (1396)، تیمار ریشه­های موئین برازمبل با غلظت مناسبی از IAA و NAA، منجر به افزایش معنی­دار CT شد، در حالی که مقادیر T-I و T-IIA تغییر معنی­دار نداشتند یا نسبت به کنترل کاهش یافتند (3). لازم به ذکر است که اغلب بررسی­های انجام شده برای بهینه­سازی تولید تانشینون­ها در شرایط درون شیشه، مربوط به گیاه S. miltiorrhiza است و تأثیر مثبت تازن­ها و تنظیم کننده­های رشد در تولید این متابولیت­ها در کشت­های سلول (61) و ریشه مویین (20، 27، 48و 51) آن گزارش شده است.

باتوجه به این که ایران، به­ویژه استان­های خراسان، از رویشگاه­های اصلی گیاه برازمبل در جهان هستند و این گونه یکی از معدود گیاهانی است که مقادیر قابل توجهی از تانشینون­ها را در ریشه های خود ذخیره می کند، پژوهش حاضر، ضمن پایدارسازی کشت ریشه­های نوپدید این گیاه در شرایط درون شیشه، برای اولین بار تأثیر کاربرد هم­زمان دو تازن Ag+و YE را جهت ارتقای کمی و کیفی تانشینون­ها مورد بررسی قرار داد. بدیهی است که این نوع از تحقیقات پایه، با بررسی شرایط لازم برای تولید بهینه تانشینون­ها در مقیاس تجاری، نه­تنها امکان بهره­برداری از آن­ها را بدون آسیب رساندن به محیط زیست فراهم می­کند، بلکه زمینه­ساز توسعه و گسترش صنعت گیاهان دارویی، به­عنوان یک منبع درآمد ملی خواهد بود.

مواد و روشها

جمع­آوری نمونه گیاهی: بذرهای رسیده گیاه برازمبل از منطقه کلات در استان خراسان رضوی، با طول جغرافیایی "98/7 '52 °59، عرض جغرافیایی "22/3 '38 °36 و ارتفاع 1748 متر از سطح دریا جمع­آوری شدند. یک نمونه از گیاه نیز پس از شناسایی، در هرباریوم دانشگاه فردوسی مشهد با شماره 90123 FUMH نگهداری شد.

تولید گیاهچه­ی سترون و القای ریشه نوپدید از ریزنمونه برگ: برای تولید گیاهچه سترون، از محیط کشت MS 2/1 جامد (30) فاقد هورمون، حاوی 5/0 درصد آگار و 3 درصد ساکارز استفاده شد. ریزنمونه­های برگ از گیاهچه­های سترون 60-50 روزه، در اندازه cm 1×1، جدا شدند و پس از کشت بر روی محیط­کشت MS جامد حاوی 7/0درصد آگار، 3 درصد ساکارز و mg/L NAA 2، در تاریکی و دمای ˚C 25±2 قرارگرفتند. پس از ظهور ریشه­های نوپدید (16-14 روز پس از کشت)، قطعاتی به اندازه تقریبی mm 3 از ریشه­ها جدا و به محیط­کشت MS مایع، حاوی mg/L NAA 2 و 3 درصد ساکارز منتقل شدند. نمونه­ها بر روی شیکر انکوباتور با سرعت rpm 80، دمای ˚C 25±2 و تاریکی قرارگرفتند و هر سه هفته یک ­بار واکشت شدند.

تیمار ریشه­های نوپدید با تازن­ها: برای استفاده از نقره به عنوان تازن، محلول پایه mM 5/2 نیترات نقره (Merck, K41210612) در آب بدون یون، تهیه شد. بخش کربوهیدراتی عصاره مخمر (Sigma, Y4250) از رسوب آن در اتانل به روش هان و آلبرشیم (1978) به دست آمد (21).

براساس نتایج حاصل از پژوهش­ قبلی (55)، غلظت µM 25 از نیترات نقره و mg/L 200 از عصاره مخمر، به عنوان بهترین غلظت از این تازن­ها، برای تحریک تولید تانشینون­ها در ریشه­های نوپدید انتخاب شدند. برای تیمار با تازن­ها، دو آزمایش طراحی شد. در آزمایش اول، ریشه­های نوپدید 21 روزه، با Ag+ تیمار و پس از گذشت 24، 48 و 168 ساعت (یک هفته)، برداشت شدند تا رشد و محتوای تانشینون آن­ها اندازه­گیری شود. پس از آنالیز داده­ها، بهترین مدت زمان تیمار با Ag+ (168 ساعت یا یک هفته) تعیین شد و برای آزمایش دوم مورد استفاده قرارگرفت.

در آزمایش دوم، تیمار ترکیبی از این دو تازن انجام شد. ابتدا ریشه­های 21 روزه با Ag+  تیمار شدند. سپس 12، 24 و 48 ساعت بعد از افزودن Ag+، YE به محیط کشت وارد شد. در این تیمارها، ریشه­ها به ترتیب به مدت 5/6 روز (Ag7d+YE6.5d)، 6 روز (Ag7d+YE6d) و 5 روز (Ag7d+YE5d) در معرض YE بودند، ولی مدت زمان تیمار با Ag+  همان هفت روز بود. در یک تیمار هم، Ag+ و YE هم­زمان به محیط کشت افزوده شدند، یعنی ریشه­ها به مدت یک هفته، از ابتدا در معرض هر دو تازن بودند (Ag7d+YE7d). در تمام تیمارها، ریشه­ها یک هفته بعد از اعمال اولین تازن (Ag+) برداشت شدند.

جداسازی و تعیین مقدار ترکیبات تانشینونی در ریشه­های نوپدید: جداسازی تانشینون­ها با حلال متانل به روش فراصوت انجام شد (55). شناسایی تانشینون­ها توسط دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) (Smartline, Germmany Kenuer) مجهز به پمپ­های چهارگانه و ستون فاز معکوس Eurospher-100 C18 (mm 4×mm  125، اندازه ذرات mµ 5) و آشکارساز (D14163) UV-VIS در طول موج  nm270 انجام شد. استونیتریل و آب اسیدی شده با اسید استیک 1/0 درصد با زمان-بندی گرادیانی، به عنوان فاز متحرک انتخاب شدند. میزان جریان، mL 1 در دقیقه و حجم تزریق، µL 20 بود. تزریق نمونه­ها به دستگاه، در دمای محیط انجام شد و سه با تکرار گردید. پس از تهیه غلظت­های مختلف از سه استاندارد مورد استفاده شامل T-I (محدوده غلظت µg/ml80-20)، T-IIA (محدوده غلظت µg/ml30-10) و CT (محدوده غلظت µg/ml80-20) در اتانل مطلق، و تزریق آن­ها به دستگاه، منحنی­های استاندارد براساس سطح زیر قله کروماتوگرام در برابر غلظت رسم شدند. سپس، مقدار سه تانشینون مورد بررسی در نمونه­ها، به ترتیب با استفاده از معادلات خط X22523Y=، X106175Y= و X109103Y= محاسبه شدند.

طرح آزمایش و تحلیل آماری­ داده­ها: آزمایش اول در قالب طرح بلوک­های کامل تصادفی و آزمایش دوم در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار برای هر تیمار انجام شدند. تحلیل آماری داده­ها در آزمایش اول با استفاده از آزمون T-Student و در آزمایش دوم، با آزمون­ واریانس یک طرفه (ANOVA) در سطح احتمال 05/0 توسط نرم افزارSPSS  (ویرایش 25) انجام شد. میانگین­ها توسط آزمون چند دامنه­ای دانکن (DMRT) با سطح اطمینان 95 درصد مقایسه شدند.

نتایج

القا­ و رشد ریشه­های نوپدید: تشکیل ریشه­های نوپدید از ریزنمونه­ برگ، در محیط کشت MS جامد حاویNAA  mg/L 2، دو هفته بعد از کشت آغاز گردید و پس از 40 روز، بر روی 60 درصد از ریزنمونه­ها، ریشه­های نوپدید تشکیل شدند (شکل 1).

آزمایش اول

تأثیر مدت زمان تیمار با تازن غیرزیستی Ag+ بر رشد و محتوای تانشینون ریشه­های نوپدید: براساس آزمون تی (t-student)، مدت زمان تیمار با غلظت ثابتی (µM 25) از Ag+،  بر رشد و محتوای ریشه­های نوپدید تأثیر معنی­دار (05/0P<) داشت (جدول 1). اگرچه تیمارهای 24 و 48 ساعته با Ag+ اثر مثبتی بر وزن ریشه­ها در مقایسه با شاهد نداشتند، تیمار یک هفته­ای با تازن، موجب افزایش معنی­دار وزن تر و خشک ریشه­ها، نسبت به کنترل شد. بیشترین وزن تر (g 772/11) و وزن خشک (g 657/0) برای ریشه­ها در تیمار اخیر مشاهده شد، در حالی­که کمترین وزن تر و خشک (به ترتیب 326/ 6 و 44/0 گرم) مربوط به ریشه­هایی بود که 48 ساعت با تازن تیمار شدند (جدول 1).

با افزایش زمان حضور تازن در محیط کشت، محتوای CT در ریشه­ها افزایش یافت، اما از نظر آماری معنی­دار نبود. بیشترین مقدار CT (µg/g DW 56/5)، متعلق به ریشه­هایی بود که یک هفته در معرض تازن بودند. حضور Ag+ در محیط کشت ریشه­های نوپدید، به مدت 48 و 168 ساعت، منجر به افزایش معنی­دار مقدار T-I در مقایسه با کشت­های کنترل شد. بیشترین (µg/g DW 973/26) و کمترین (µg/g DW 31/23) مقدار این متابولیت، به ترتیب مربوط به تیمارهای 48 و 168 ساعته با تازن بود. یک هفته پس از حضور Ag+ در محیط کشت، محتوای T-IIA (µg/g DW 223/18) به­طرز چشمگیری بیشتر از ریشه­های کنترل (µg/g DW 486/1) بود، اما در تیمارهای کوتاه مدت 24 و 48 ساعته، تغییرات مشاهده شده در مقدار T-IIA، معنی­دار نبودند. مطابق جدول 1، با افزایش مدت زمان تیمار با Ag+، مجموع مقدار سه نوع تانشینون مورد بررسی در ریشه­های نوپدید افزایش یافت و این افزایش مقدار، 48 و 168 ساعت پس از تیمار، نسبت به کنترل، معنی­دار بود. مقدار کل تانشینون­ها، پس از یک هفته تیمار، به حداکثر (µg/g DW 103/47) رسید.

 

 

شکل1- ریشه­های نوپدید باززایی شده از ریزنمونه برگ گیاه P. abrotanoides، الف: 30روز پس از کشت در محیط MS جامد حاویNAA  mg/L 2 (بزرگ نمایی4/1 ×) و ب: 50 روز پس از واکشت در محیط MS مایع حاویNAA  mg/L 2 (بزرگ نمایی3/1 ×)، فلش نشان­دهنده ریشه­های نوپدید است.

 

جدول 1- نتایج آزمون تی داده­های حاصل از بررسی تاثیر زمان تیمار با تازن غیرزیستی نیترات نقره (µM 25)، بر رشد و مقدار تانشینون­ ریشه­های نوپدید P. abrotanoides

مقادیر تی

تیمار

وزن تر

(g)

وزن خشک

(g)

کریپتوتانشینون

(g/g DWµ)

تانشینون I

(g/g DWµ)

تانشینون IIA

(g/g DWµ)

مجموع سه تانشینون

(g/g DWµ)

Control 24h

AgNO3 24h

05/8

ns 11/7

54/0

 ns47/0

77/1

ns 11/2

69/26

ns 57/23

4/2

ns 98/2

86/30

ns 66/28

Control 48h

AgNO3 48h

61/6

*33/6

49/0

 ns44/0

37/3

ns 57/2

78/11

*97/26

66/6

ns 03/10

80/21

*59/39

Control 168h

AgNO3 168h

66/7

*77/11

51/0

*66/0

06/4

ns 56/5

43/1

*31/23

49/1

*22/18

98/6

*10/47

ns و * به ترتیب، بیانگر عدم معنی­داری و معنی­داری در سطح اطمینان 95 درصد هستند.

 

در مجموع، آزمایش اول نشان داد که تیمار ریشه­ها با غلظت µM 25 از Ag+، به مدت یک هفته، بهترین شرایط از نظر رشد ریشه­ و محتوای تانشینون­ بود. در ادامه کار، این شرایط برای انجام آزمایش دوم انتخاب شد تا تأثیر تیمار ترکیبی  YE+Ag+که در آن YE با فواصل زمانی متفاوت به کشت­های حاویAg+ اضافه می­شد، بر رشد و محتوای تانشینون­ ریشه­ها بررسی شود.

آزمایش دوم

تأثیر تیمار ترکیبی YE+Ag+ و مدت زمان تیمار با YE بر رشد و محتوای تانشینون ریشه­های نوپدید: تیمار ترکیبی YE+Ag+ و مدت زمان حضور (mg/L 200 )YE  در محیط کشت، تأثیر معنی­داری (05/0P<) بر رشد و محتوای تانشینون ریشه­ها داشت.

کروماتوگرام HPLC تانشینون­های استاندارد و عصاره متانلی ریشه­های نوپدید در حضور (µM 25) Ag+ و (mg/L 200)YE  مربوط به تیمار ترکیبی Ag7d+YE6.5d (بهترین تیمار از نظر رشد و تولید تانشینون در ریشه) در شکل 2 نشان داده شده است.

 

 

1

2

3

الف

 

1

2

3

ب

 

شکل 2- الف: کروماتوگرام HPLC متعلق به تانشینون­های استاندارد و ب: کروماتوگرام HPLC عصاره متانلی ریشه­های نوپدید گیاه P. abrotanoides، متعلق به تیمار ترکیبی Ag7d+YE6.5d. Ag: نیترات نقره با غلظت µM 25، YE: عصاره مخمر با غلظت mg/L 200،d : مدت زمان حضور تازن در محیط کشت (روز)، قله شماره 1: کریپتوتانشینون، قله شماره 2: تانشینون I و قله شماره 3: تانشینون IIA

 

در حضور Ag+، با طولانی شدن زمان تیمار با YE از 5 روز تا 5/6 روز، وزن تر و خشک ریشه­ها نسبت به کنترل افزایش معنی­دار داشت، اما پس از هفت روز، مجدداً وزن ریشه­ها کاهش یافت. بیشترین وزن تر و خشک ریشه (به ترتیب 727/12 و 781/0 گرم) مربوط به کشت­های حاوی YE به تنهایی (YE7d) بود که تفاوت معنی­داری با تیمار ترکیبی  Ag7d+YE6.5dنداشت. کم­ترین وزن تر و خشک (به ترتیب 661/7 و 506/0 گرم) در کشت­های کنترل فاقد تازن اندازه­گیری شد (شکل 3 الف و ب).

تیمارهای انفرادی Ag+ و YE، تأثیر معنی­داری بر محتوایCT  در ریشه­های نوپدید نداشتند. حضور هم­زمان این دو تازن در محیط کشت نیز نتوانست افزایش معنی­داری در مقدار این متابولیت ایجاد کند (شکل 4 الف). به­طور کلی، YE به­صورت انفرادی و توام با Ag+، اثر تحریکی بر تولید T-I داشت (به استثنای تیمار Ag7d+YE5d) و این تأثیر با افزایش زمان تیمار از 5 تا 5/6 روز، چشمگیرتر شد، اگرچه در پایان هفتمین روز (تیمار Ag7d+YE7d) مقدار آن تا حدی کاهش یافت. بنابراین بیشینه تراز T-I (µg/g DW 55/82) در تیمار (Ag7d+YE6.5d) و کمینه تراز آن (µg/g DW 763/1) در کشت­های کنترل فاقد تازن سنجش شد (شکل 4 ب).

 

الف

ب

 

شکل 3- تأثیر تیمارهای انفرادی و ترکیبی نیترات نقره و عصاره مخمر بر وزن تر (الف) و وزن خشک (ب) ریشه­های نوپدیدP .abrotanoides، داده­ها میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. براساس آزمون دانکن، حروف یکسان نشان دهنده عدم تفاوت معنی­دار (05/0<P) می­باشند. Ag: نیترات نقره با غلظت µM 25، YE: عصاره مخمر با غلظت mg/L 200، d: مدت زمان حضور تازن در محیط کشت (روز)

 

حضور توأم YE و Ag+، در مقایسه با تیمار انفرادی Ag+، موجب کاهش معنی­دار در محتوای T-IIA شد. به علاوه، با افزایش زمان حضور YE در محیط (از 6 تا 7 روز)، کاهش معنی­داری در مقدار این تانشینون مشاهده شد. به این ترتیب، بیشترین مقدار این متابولیت (µg/g DW 223/18) مربوط به ریشه­هایی بود که به مدت یک هفته فقط با Ag+ تیمار شده بودند (شکل 4 ج).

 

الف

ب

  

ج

 

شکل 4- تاثیر تیمارهای انفرادی و ترکیبی نیترات نقره و عصاره مخمر بر محتوای کریپتوتانشینون (الف)، تانشینون I (ب) و تانشینون IIA (ج) در ریشه­های نوپدید P .abrotanoides، داده­ها میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. براساس آزمون دانکن، حروف یکسان نشان دهنده عدم تفاوت معنی­دار (05/0<P) می­باشند. Ag: نیترات نقره با غلظت µM 25، YE: عصاره مخمر با غلظت mg/L 200، d: مدت زمان حضور تازن در محیط کشت (روز)

 

اگرچه Ag+ و YE به تنهایی تأثیر مثبت و معنی­داری بر مجموع مقدار سه تانشینون مورد بررسی داشتند (در مقایسه با کنترل فاقد تازن)، اما افزایش قابل ملاحظه در مقدار کل این ترکیبات (نسبت به تیمارهای انفرادی و کنترل­ فاقد تازن) فقط در تیمار Ag7d+YE6.5d مشاهده شد که در آن، بیشینه تراز تانشینون­ها معادل µg/g DW 133/92 بود. حداقل مقدار تانشینون­ کل (µg/g DW 309/7) متعلق به کشت­های کنترل فاقد تازن بود (شکل 5).

 

شکل 5- تأثیر تیمارهای انفرادی و ترکیبی نیترات نقره و عصاره مخمر بر مجموع محتوای سه نوع تانشینون در ریشه­های نوپدید P .abrotanoides، داده­ها میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. براساس آزمون دانکن، حروف یکسان نشان دهنده عدم تفاوت معنی­دار می­باشند (05/0<P). Ag: نیترات نقره با غلظت µM 25، YE: عصاره مخمر با غلظت mg/L 200، d: مدت زمان حضور تازن در محیط کشت (روز)

بحث

فلزات سنگین، تولید ROS را تحریک می­کنند و موجب القای تنش اکسیداتیو می­شوند و این امر در شرایط کنترل شده، می­تواند راهبرد موثری برای تولید متابولیت­های ثانوی گیاهی باشد (2). نیترات نقره به دلیل جلوگیری از عملکرد اتیلن تولید شده در بافت­ها و ممانعت از بروز پاسخ­های وابسته به آن (نظیر به تأخیر انداختن یا کند کردن رشد، تسریع پیری)، در کشت بافت و اندام­های گیاهی مورد استفاده قرار می­گیرد. یون نقره با تداخل در عملکرد اتیلن، بیوسنتز متابولیت­های ثانوی را نیز، با یک روش وابسته به غلظت، تحت تأثیر قرار می­دهد (4). در دسترس بودن، حلالیت در آب، پایداری و فقدان سمیت در غلظت­های موثر بر باززایی گیاهان، موجب شده است که این ماده به­طور گسترده توسط بسیاری از محققان برای تحریک رشد، ریخت­زایی و باززایی گیاهان به­کار گرفته شود (4و 26). تأثیر مثبت نیترات نقره، بر باززایی و رشد ریشه­های نوپدید، در کشت­های درون شیشه­ای گیاهان مختلف، گزارش شده و در این رابطه، غلظت بهینه نیترات نقره و گستردگی و شدت پاسخ گونه­های گیاهی مختلف، متفاوت بوده است (13، 29، 34و 42).

یون­ نقره به علت شباهتی که از نظر اندازه و حالت اکسیداسیون با یون­ مس دارد، برای اتصال به پذیرنده های هورمون اتیلن، با مس، که نقش کوفاکتور را در اتصال هورمون/پذیرنده دارد، رقابت می­کند و به عنوان پادکردار (آنتاگونیست) با عملکرد اتیلن، موجب عدم حساسیت سلول­ها و فروتنظیمی پاسخ­ به این هورمون می­شود (26و 44). به علاوه، تحریک بیوسنتز پلی­آمین­ها در سلول (7و 29) و کنترل برون شارش و حرکت قطبی اکسین در بافت­ها (43) نیز، به عنوان مکانیسم­های احتمالی تأثیر مثبت نیترات نقره بر باززایی و رشد اندام­های گیاهی گزارش شده اند.

مطالعه تأثیر Ag+ به عنوان یک تازن غیرزیستی، و YE به عنوان یک تازن زیستی، بر رشد و تولید تانشینون در ریشه­های نوپدید گیاه برازمبل، محدود به گزارش ذاکر و همکاران (2015) و نتایج پژوهش حاضر است. این محققان، تأثیر معنی­داری از کاربرد انفرادی این دو تازن را بر رشد ریشه­ها گزارش نکردند (55)، اما بررسی پیش رو نشان داد که Ag+ و YE، هرکدام به تنهایی، رشد ریشه­ها را به­طرز معنی­داری بهبود بخشیدند و کاربرد توأم این دو تازن نیز، بسته به مدت زمان حضور YEدر محیط کشت، تأثیر مثبتی بر رشد ریشه­های نوپدید داشت و در بهترین حالت، (تیمار Ag7d+YE6.5d) وزن خشک ریشه­ها 5/1 برابر ریشه­های کنترل بود. سایر گزارش­ها نیز، حاکی از نتایج متفاوت درمورد تأثیر این دو تازن بر رشد ریشه­های نوپدید یا ریشه­های موئین می­باشند. برای مثال، طبق گزارش ژانگ و همکاران (2004)، تیمار ریشه­های مویین گیاه S. miltiorrhiza با (µM40-15) Ag+ ، به­صورت وابسته به غلظت، رشد ریشه­ها را کاهش داد (56). به­طور مشابه، کاهش زیتوده ریشه­های موئینS. castanea Diels f. tomentosa Stib نیز در غلظت­های µM45-15 از این تازن گزارش شد (27). در مقابل، طبق یافته­های یانگ و همکاران (2018)، تیمار با (µM 15) Ag+ اثر معنی­داری بر وزن خشک ریشه مویین S. miltiorrhiza نداشت، اما یک روز بعد از تیمار، باعث افزایش وزن خشک ریشه­های مویین در گونه S. castanea شد (51). به گزارش چن و همکاران (2001)، اثر تحریکی YE بر رشد ریشه موئین
S. miltiorrhiza موجب شد که تولید زیتوده از g/L9/3 به g/L 3/7 بهبود یابد (9). بهبود رشد ریشه موئین S. miltiorrhiza وS. castanea در تیمار mg/L 200 از این تازن نیز گزارش شده است (51). برخلاف موارد فوق، شی و همکاران (2007)، کاهش وزن تر و خشک ریشه­های موئین S. miltiorrhiza را در غلظت mg/L 100 از YE گزارش کردند (40). کاهش رشد ریشه­های موئین این گونه، تحت تأثیر تیمارهای انفرادی و یا ترکیبی از (µM30) Ag+ و (mg/L 100) YE توسط محققان دیگر نیز گزارش شده است (18و 47).

بررسی منابع نشان می­دهد که استفاده از انواع تازن های زیستی نظیر YE و تازن­های غیرزیستی مانند Ag+ موجب بهبود تولید تانشینون در برخی گونه­های Salvia می­شود و بسته به نوع و غلظت تازن، دوره زمانی تیمار با تازن و همچنین حضور انفرادی یا توام آن­ها، درجات متفاوتی از افزایش تولید برای انواع مختلف تانشینون­ گزارش شده است (27، 51و 61). در پژوهش حاضر، محتوای انواع تانشینون­ در ریشه­های نوپدید گیاه برازمبل، تحت تأثیر تیمارهای انفرادی و ترکیبی YE و Ag+ به­طور متفاوتی تغییر کرد. در کاربرد انفرادی تازن­ها، Ag+ محتوای تانشینون کل (مجموع CT، T-I و T-IIA) را تا 4/6 و YE تا 2/6 برابر ریشه­های کنترل افزایش داد. ذاکر و همکاران (2015) نیز، درحضورغلظت های مشابه از Ag+ و YE، دریافتند که مجموع مقدار CT و T-IIA در ریشه های نوپدید برازمبل، به ترتیب تا حدود 3 و 5/3 برابر کشت­های کنترل بهبود می­یابد (55). بخش اعظم تحقیقات انجام شده در مورد تأثیر تازن­ها بر کمیت و کیفیت تانشینون­ها، مربوط به گونه S. miltiorrhiza می­باشد که جهت مقایسه با نتایج مطالعه حاضر، در ادامه به آن­ها اشاره می­شود. تیمارهای انفرادی (µM 25) Ag+ و (mg/L 100) YE، توسط ژائو و همکاران (2010)، محتوای تانشینون (مجموع CT، T-Iو T-IIA) را در کشت­های سلولی این گونه، تا 5/11 برابر مقدار کشت­های کنترل ارتقا دادند (61). به گزارش کای و همکاران (2012)  نیز، غلظت µM 30 از Ag+ ، پس از 9 روز، مقدار کل تانشینون­ (CT+T-IIA) ریشه­های موئین را تا 2/2 برابر کنترل افزایش داد، در حالی­که غلظت mg/L 100 از YEدر مدت زمان کوتاه­تر (6 روز) تأثیر بیشتری (9/3 برابر کنترل)، بر انباشت تانشینون داشت (23). در یک بررسی دیگر، (mg/L 100) YE، تأثیر قوی­تری بر مجموع مقدار CT، T-I و T-IIA در کشت ریشه موئین داشت و محتوای تانشینون کل را تا 1/3 برابر کنترل افزایش داد، اما در حضور (µM 30) Ag+، مقدار کل تانشینون به 2/1برابر ریشه های کنترل رسید (18). اخیرا در یک تحقیق مشابه، افزایش 3/2 و 5/2 برابری در تراز تانشینون کل (مجموع CT، T-I، D-TI و T-IIA)، به ترتیب در حضور (mg/L 100) YE و (µM 30) Ag+ گزارش شده است (47). در مقابل، در گزارش زینگ و همکاران (2015)، بالاترین تراز برای مجموع تانشینون­های فوق، در غلظت کمتری از (µM 15) Ag+ به دست آمد (48).

در بررسی حاضر، تأثیر Ag+ بر T-IIA (31/12 برابر کنترل)، بسیار بیشتر از تأثیر YE (2/4 برابر کنترل) بود. در حالی­که، هر دو تازن تأثیر افزاینده مشابهی بر محتوای T-I داشتند. مقادیر مربوط به CT به­طور مشخصی کمتر از دو تانشینون دیگر بود و تیمارها، تأثیر معنی­داری بر تولید آن نداشتند. تأثیر بهتر Ag+ بر تجمع T-IIA و YE بر انباشت CT در ریشه های نوپدید برازمبل (55)، ریشه های موئین S. castanea (27) و ریشه­های موئین S. miltiorrhiza (51) نیزگزارش شده است. یافته­های پژوهش پیش رو، مشابه با نتایج گزارش یانگ و همکاران (2018) در گونه S. miltiorrhiza (51) نشان داد که T-I به یک میزان تحت تأثیر Ag+ و YE قرار می­گیرد. در مقابل، به گزارش جی و وو (2005)، (mg/L 100) YE، در مقایسه با (µM 30) Ag+، تأثیر قوی­تری بر تجمع CT، T-I و T-IIA در ریشه­های موئین S. miltiorrhiza داشت (18).

برتری تیمارهای ترکیبی از تازن­ها، به­ویژه ترکیب تازن­های زیستی با انواع غیر­زیستی، نسبت به تیمارهای انفرادی، در جهت بهبود تولید تانشینون­ها در منابع مطرح شده است و در اغلب موارد، کاربرد YE به عنوان تازن زیستی در کنار یک تازن غیرزیستی نظیر نقره، کبالت یا کادمیم، اثر هم­کرداری (سینرژیسم) بر تولید تانشینون­ها دارد (32و 61). برای مثال، در کشت­های ریشه موئین S. miltiorrhiza، تیمار ترکیبی YE+Ag+ با ثابت سینرژیسم 3، بیشترین تأثیر را بر T-I داشت و ترکیب YE+Co، با ثابت سینرژیسم 1/2، موجب تقویت تولید T-IIA شد (50). در یک بررسی دیگر، تیمار ترکیبی YE+Ag+، مجموع مقدار CT و T-IIA در ریشه های موئین همین گیاه را تا حدود 6 برابر تیمار Ag+ به تنهایی و بیش از 3 برابر تیمار انفرادی YE، ارتقا داد (23). قابل ذکر است که در این نوع مطالعات، همه ترکیب­های ممکن از تازن­ها، لزوماً اثر تحریک کننده بر تجمع تانشینون ندارند. به­کارگیری ترکیب­های دوتایی و سه­تایی از Ag+، YE و متیل­جاسمونات (MeJA) در کشت ریشه موئین S. miltiorrhiza، توسط چنگ و همکاران (2013) نشان داد که فقط تیمارهای ترکیبی واجد Ag+، به­صورت هم­کردار انباشت تانشینون را افزایش می­دهند. به­علاوه، در برخی تیمارهای ترکیبی، در مقایسه با تیمارهای انفرادی، تولید انواعی از تانشینون­ها ممانعت شد (10). در بررسی پیش رو، هنگامی که YE، 12 ساعت پس از Ag+ (Ag7d+YE6.5d) به کشت ریشه­های نوپدید برازمبل اضافه شد، مقدار تانشینون کل به 2 برابر تیمارهای انفرادی این دو تازن ارتقا یافت که ناشی از افزایش قابل­توجه T-I (5/3 برابر تیمار Ag+ و 4/2 برابر تیمار YE) بود اما، هیچ­کدام از تیمارهای ترکیبی ، تیمار بهینه برای انباشت CT و T-IIA نبودند.

تأثیر تازن­ها بر تولید تانشینون  در  ریشه­ها،  تابع  زمان

حضور آنان در محیط کشت است (27و 32). بررسی منابع نشان داد که در اغلب موارد، هنگام کاربرد ترکیبی تازن­ها، این مواد به­طور هم­زمان به کشت­های ریشه افزوده شده­اند. در تحقیق حاضر، تأثیر فاصله زمانی بین تیمار با دو نوع تازن مختلف نیز مورد بررسی قرارگرفت و مشخص شد که هم­زمان یا غیر هم­زمان بودن تیمارهای ترکیبی، اثر متفاوتی بر پروفایل تانشینونی ریشه­ها دارد. استفاده از YE، 12 ساعت پس از کاربرد Ag+ (Ag7d+YE6.5d)، مقدار T-I را بشدت افزایش داد اما موجب کاهش T-IIA شد. طبق گزارش جی و وو (2005)، افزودن (µg/ml100) YE به کشت ریشه­های مویین S. miltiorrhiza پس از پیش تیمار با (µM 30) Ag+، تولید CT، T-I و T-IIA را بهبود بخشید و با افزایش فاصله زمانی بین کاربرد دو تازن، (از 12 تا 48 ساعت) محتوای تانشینون­ها به­طرز پیش­رونده­ای افزایش یافت. به عقیده آنان، پیش تیمار با Ag+ که مانند یک تنش غیرزیستی عمل می­کند، سلول­ها را برای پاسخ به YE، به عنوان یک عامل تنش­زای زیستی، حساس­تر کرده، پاسخ متابولیکی قوی­تری را به راه می­اندازد (18).

تفاوت در پاسخ­های متابولیکی داده شده به تازن­ها، آن­چنان که در نتایج پژوهش حاضر نیز مشاهده شد، احتمالاً ناشی از تأثیر متفاوت این عوامل بر بیان ژن آنزیم­های کلیدی مسیر بیوسنتز تانشینون­ها می­باشد. براساس تحقیقات متعدد، ژن­هایی از مسیر که تحت تأثیر تازن غیرزیستی Ag+ قرار می­گیرند، لزوماً همان ژن­های پاسخ دهنده به تازن زیستی YE نیستند و شدت تأثیر پذیری آن­ها نیز در مواجهه با این دو نوع محرک متفاوت، یکسان نمی­باشد (23، 24و 51). برای مثال، به گزارش جی و وو در سال 2005، پیش ­تیمار ریشه­های موئین S. miltiorrhiza با Ag+ موجب افزایش فعالیت آنزیم­های مسیر MVA شد و افزودن YE یک و دو روز پس از تیمار Ag+ (تیمار ترکیبی)، با القای فعالیت آنزیم­های مسیر MEP، محتوای تانشینون ریشه­­ها را بهبود بخشید (18). مطابق با یافته­های ژائو و همکاران (2014)، تحت تیمار ترکیبی YE+Ag+، ابتدا یک فراتنظیمی اولیه ولی موقتی در ژن­های مسیر MVA و به دنبال آن، افزایش تدریجی اما پایدار ژن­های مسیرMEP، و­ آنزیم­های پائین دست مسیر که بعد از تولید GGPP عمل می­کنند، روی داد که با افزایش محتوای تانشینون­ها درریشه­های موئین S. miltiorrhiza، منطبق بود (17). افزایش محتوای CT توسط YE، در مقایسه با انباشتT-IIA  تحت تاثیر Ag+، در ریشه­های موئین
S. castanea، به تفاوت در نحوه تأثیر این دو تازن بر بیان دو ژن متوالی مسئول سنتز GGPP نسبت داده شد (27).

تغییر محتوای تانشینون­ها (افزایش یا حتی کاهش) تحت تأثیر تنش­های زیستی و غیرزیستی طبیعی یا القاء شده توسط تازن­ها، نتیجه فراتنظیمی (یا فروتنظیمی) هماهنگ ژن­های خاصی در مسیر است که با دخالت عوامل رونویسی (TFs) انجام می­شود. در سال­های اخیر، TFs مرتبط با مسیر بیوسنتز تانشینون­ها تا حد زیادی در
S. miltiorrhiza  وS. castanea شناسایی شده و رابطه میان طرح بیان آن­ها با بیوسنتز تانشینون­ها مورد مطالعه قرارگرفته است. این مطالعات نشان داده­اند که در پاسخ به نقره و عصاره مخمر، فراتنظیمی یا فروتنظیمی TFs متعلق به خانواده­های WRKY (17)، bZIP (59)، MYB و bHLH (49، 57)، بیان ژن­های کلیدی مسیر و محتوای انواع تانشینون را در ریشه­های موئین تحت تأثیر قرار می­دهد.

تازن­های زیستی و غیرزیستی در حقیقت از تنش­های محیطی واقعی تقلید می­کنند و کاربرد هم­زمان آن­ها در کشت­های درون شیشه­ گیاهان، به­صورتی مشابه با عوامل محیطی زنده و غیرزنده، مسیرهای علامتی متعدد و متفاوتی را به­راه می­اندازد (36). تأثیر تحریکی YE بر تولید متابولیت­های ثانوی، ناشی از حضور اجزای پپتیدی و پلی ساکاریدی مختلف از جمله کیتین، الیگومرهای N-استیل گلوکزآمین، بتاگلوگان­ها، گلیکوپپتیدها، ارگوسترول و کاتیون­هایی مانند کلسیم، کبالت و روی در آن است (6و 37) که پاسخ­های دفاعی را در گیاهان القا می­نمایند. تیمار ریشه­های موئین S. miltiorrhiza با YE، تولید گونه­های واکنش­گر اکسیژن (ROS) و نیتروژن (RNS) را به­عنوان مولکول­های علامتی تحریک می­کند. نقش نیتریت اکسید در تحریک بیان ژن­های مسیر MVA و MEP و انباشت تانشینون­ها به­ویژه CT و T-IIA (28) و میانجی­گری H2O2 و آنیون سوپراکسید به عنوان مولکول­های علامتی در تجمع تانشینون­ها اثبات شده است (53). طبق گزارش وانگ و همکاران (2016)، 3 تا 5 دقیقه پس از اعمال تیمار ترکیبی YE+Ag+، غلظت کلسیم سیتوپلاسمی در ریشه­های موئین S. miltiorrhiza بشدت زیاد شد و با القای مسیر علامت رسانی وابسته به کلسیم و کالمودولین و تحریک تولید ROS، سنتز تانشینون­ها و اسید­های فنلی بهبود یافت (46). بررسی­ مکانیسم تأثیر Ag+ و YE بر تولید متابولیت­های ثانوی، مسیر­های علامت­دهی وابسته به ROS، کلسیم و آبشارهای پروتئین کینازی (MAPKs) را به­عنوان اصلی­ترین وقایع مولکولی در پاسخ­ به تازن­ معرفی کرده است (36). از طرف دیگر، مسیرهای علامتی به­راه افتاده توسط این دو تازن، با ترارسانی علامت هورمون­های گیاهی، نظیر جاسمونیک اسید و اتیلن، نیز برهم­کنش دارند (35، 36). بنابراین، ترارسانی علامت القاء شده توسط تازن­ها، شبکه­ایی چندجزیی از مسیرهای متعدد موازی و متقاطع است که با اثرات هم­کردار و یا پادکردار خود، بیان ژن­ها و پاسخ­های متابولیکی متنوعی را هدف­گیری و تنظیم می­کند. این احتمال وجود دارد که تحریک تولید تانشینون­ها توسط YE و Ag+، در ریشه­های نوپدید گیاه برازمبل نیز، از طریق القای مسیرهای علامت­دهی و بیان ژن­های بیوسنتزی، مشابه با آن چه برای گیاه S. miltiorrhiza شناخته شده است، میانجی­گری ­شود.

نتیجه­گیری

استفاده از نیترات نقره به مدت یک هفته بدون ایجاد علائم سمیت، توانست رشد و زیتوده ریشه­های نوپدید برازمبل را بهبود بخشد و افزودن عصاره مخمر به محیط کشت، 12 ساعت پس از شروع تیمار با نقره، این تأثیر را تقویت نمود و مقدار T-I و مجموع محتوای سه نوع تانشینون مورد بررسی را به حداکثر رساند. نتایج پژوهش حاضر، ضمن تائید تأثیر مثبت تازن­ غیرزیستی نیترات نقره و تازن زیستی عصاره مخمر، بر تولید تانشینون در گیاه برازمبل، نشان داد که با به­کارگیری روشی مشابه با پرایمینگ بذر، یعنی پیش تیمار ریشه­ها با تازن غیرزیستی و به­دنبال آن افزودن تازن زیستی، با فواصل زمانی متفاوت، می­توان علاوه بر افزایش محتوای کل تانشینون­ها، پروفایل تانشینونی ریشه­ها را نیز متناسب با اهداف پژوهشی و کاربردی تغییر داد و تراز نوع (انواع) خاصی از تانشینون را به­طور ویژه بهبود بخشید.

سپاسگزاری

پژوهش حاضر، در دانشگاه فردوسی مشهد انجام شد و اعتبار آن از محل طرح 40432/3 تأمین گردید. شناسایی تانشینون­ها توسط دستگاه HPLC در آزمایشگاه شیمی دانشکده علوم دانشگاه شاهد انجام شد.

  • جم­زاد، ز.، 1391. فلور ایران، شماره 76 تیره نعناع، انتشارات موسسه تحقیقات جنگل­ها و مراتع کشور، چاپ اول، صفحات 289-279.
  • شبانی، ل.، و صغیرزاده، ب.، 1396. بررسی پاسخ­های دفاع آنتی اکسیدانی در کشت ساقه (Artemisia annua) تحت تنش نیترات نقره، مجله پژوهش­های گیاهی، جلد 30، شماره 1، صفحات 131-119.
  • فرج تبار، ف.، 1396. القای ریشه­های مویین در گیاه دارویی برازمبل (Perovskia abrotanoides ) و بررسی تولید تانشینون­ها در آن­ها تحت تاثیر تنظیم کننده­های رشد، پایان نامه جهت اخذ درجه کارشناسی ارشد رشته فیزیولوژی گیاهی، دانشگاه شاهد، دانشکده علوم، گروه زیست­شناسی، صفحات 90-87..
  • یوسفی، ک.، ریاحی مدوار، ع.، و باقی­زاده، ا.، 1394. بررسی تأثیر الیسیتورهای نقره و مس بر بیان ژن فلاون سینتاز 1 برخی پارامترهای بیوشیمیایی در گیاهچه­های زیره سبز (Cuminum cyminum) بومی ایران، مجله پژوهش­های گیاهی، جلد 28، شماره 1، صفحات 210-223.

 

  • Ashraf, S. N., Zubair, M., Rizwan, k., Bakhsh Tareen, R., Rasool, N., Zia-Ul-Haq, M., and Ercisli, S., 2014. Compositional studies and biological activities of Perovskia abrotanoides oils. Biological Research, 47 (1), PP: 12, doi:10.1186/0717-6287-47-12.
  • Batista, D. S., Dias, L. L. C., Macedo, A. F., Rego, M. M., Rego, E. R., Floh, E. I. S., and Otoni, W. C., 2013. Suppression of ethylene levels promotes morphogenesis in pepper (Capsicum annuum), In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant, 49 (6), PP: 759–764.
  • Buchwald, W., and Mrozikiewics, P. M., 2007. Influence of development stage on the content of biologically active compounds of Salvia miltiorrhiza Bunge roots, Herba Polonica, 53 (4), PP: 15–
  • Chen, H., Chena, F., Chiu, F. C., and Lo, C. M., 2001. The effect of yeast elicitor on the growth and secondary metabolism of hairy root cultures of Salvia miltiorrhiza, Enzyme and Microbial Technology, 28 (1), PP: 100–105.
  • Cheng, Q., He, Y., Li, G., Liu, Y., Gao, W., and Huang, L., 2013. Effects of combined elicitors on tanshinone metabolice profiling and SmCPS expression in Salvia miltiorrhiza hairy root cultures. Molecules, 18 (7), PP: 7473–7485.
  • Cui, X. H., Chakrabarty, D., Lee, E. J., and Paek, K. Y., 2010. Production of adventitious roots and secondary metabolites by Hypericum perforatum, in a bioreactor, Bioresource Technology, 101 (12), PP: 4708–4716.
  • Drew, B. T., Gonzales-Gallegos, J. G., G., Xiang, C. L., Kriebel, R., Drummond, C. P., Walked, J. B., and Sytsma, K. J., 2017. Salvia united: The greatest good for the greatest number, Taxon, 66 (1), PP: 133–145.
  • El-Ashry, A. A., Gabr, A. M. M., Girgis, N. D., and El-Bahr, M. K., 2018. Influence of silver nitrate on enhancing in vitro rooting of Gardenia jasminoides Journal of Environmental Science and Technology, 11 (5), PP: 238–245.
  • Fan, G. W., Gau, X. M., Wang, H., Zhu, Y., Zhang, J., Hu, L. M., Su, Y. F., Kang, L. Y., and Zhang, B. L., 2009. The anti-inflammatory activities of tanshinone IIA, an active component of TCM, are mediated by estrogen receptor activation and inhibition of Inos, Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 113(3–5), PP: 275–280.
  • Fang, J., Xu, S. W., Wang, P., Tang, F. T., Zhou, S. G., Gao, J., Chen, J. W., Huang, H. Q., and Liu, P. Q., 2010. Tanshinone II-A attenuates cardiac fibrosis and modulates collagen metabolism in rats with renovascular hypertension. Phytomedicine, 18 (1), PP: 58–64.
  • Fazal, H., Abbasi, B. H., and Ahmad, N., 2014. Optimization of adventitious root culture for production of biomass and secondary metabolites in Prunella vulgaris Applied Biochemistry and Biotechnology, 174 (6), PP: 2086–2095.
  • Ge, X., and Wu, J., 2005. Tanshinone production and isoprenoid pathways in Salvia miltiorrhiza hairy roots induced by Ag+ and yeast elicitor, Plant Science, 168 (2), PP: 487–491.
  • Ghafourian, M., and Mazandarani, M., 2017. Ethnopharmacology, ecological requirements, antioxidant and antimicrobial activities of Perovskia abrotanoides extract for vaginal infections from Semnan province. International Journal of Womens Health and Reproduction Sciences, 5 (4), PP: 295–300.
  • Gupta, S. K., Liu, R. B., Liaw, S. Y., Chan, H. S., and Tsay, H. S., 2011. Enhanced tanshinone production in hairy roots of ‘Salvia miltiorrhiza Bunge’ under the influence of plant growth regulators in liquid culture. Botanical Studies, 52 (4), PP: 435–443.
  • Hahn, M. G., and Albersheim, P., 1978. Host-Pathogen Interactions XIV., Isolation and partial characterization of an elicitor from yeast extract, Plant Physiology, 62 (1), PP: 107–111.
  • Jiang, Z., Gao, W., and Huang, L., 2019. Tanshinones, critical pharmacological components in Salvia miltiorrhiza, Frontiers in Pharmacology, 10, article 202, doi: 3389/fphar.2019.00202.
  • Kai, G. Y., Liao, P., Xu, H., Wang, J., Zhou, C. C., Zhou, W., Qi, Y. P., Xiao, J. B., Wang, Y. L., and Zhang, L., 2012. Molecular mechanism of elicitor-induced tanshinone accumulation in Salvia miltiorrhiza hairy root cultures, Acta Physiologiae Plantarum, 34 (4), PP: 1421–1433.
  • Kim, E. J., Jung, S. N., Son, K. H., Kim, S. R., Ha, T. Y., Park, M. G., Jo, I. G., Park, J. G., Choe, W., Kim, S. S., and Ha, J., 2007. Antidiabetes and antiobesity effect of cryptotanshinone via activation of AMP-activated protein kinase, Molecular Pharmacology, 72 (1), PP: 62–
  • Kumar, V., Parvatam, G. and Ravishankar, G.A. (2009) AgNO3-A potential regulator of ethylene activity and plant growth modulator. Electronic Journal of Biotechnology, 12 (2), doi: 10.2225/vol12-issue2-fulltext-1.
  • Mahmoud, O., and Kosar, M., 2014. In vitro achievement of strawberry roots formation using Ag (NO3), American-Eurasian Journal of Agricultural and Environmental Sciences, 14 (11), PP: 1281–
  • Murashige, T., and Skoog, F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15 (3), PP: 473–479.
  • Murthy, H. N., Hahn, E. J., and Paek, K. Y., 2008. Adventitious roots and secondary metabolism. Chinese Journal of Biotechnology, 24 (5), PP: 711–716.
  • Nassiri-Asl, M., Parvardeh, S., Niapour, M., and Hosseinzadeh, H., 2002. Antinociceptive and antiinflammatory effects of Perovskia abrotanoides aerial part extracts in mice and rats, Journal of Medicinal Plants, 1 (3), PP: 294–295.
  • Petrova, M., Zayova, E., and Vitkova, A., 2011. Effect of silver nitrate on in vitro root formation of Gentiana lutea. Romanian Biotechnological Letters, 16 (6), PP: 53-58.
  • Rahimi, S., Devi, B. S. R., Khorolragchaa, A., Kim, Y. J., Kim, J. H., Jung, S. K., and Yang, D. C., 2014. Effect of salicylic acid and yeast extract on the accumulation of jasmonic acid and sesquiterpenoids in Panax ginseng adventitious roots, Russian Journal of Plant Physiology, 61 (6), PP: 811–817.
  • Ramirez-Estrada, , Vidal-Limon, H., Hidalgo, D., Moyano, E., Golenioswki, M., Cusidó, R. M., and Palazon, K., 2016. Elicitation, an effective strategy for the biotechnological production of bioactive high-added value compounds in plant cell factories. Molecules, 21 (2), PP: 182, doi: 10.3390/molecules21020182.
  • Rhee, H. S., Cho, H. Y., Son, S. Y., Yoon, S. Y. H., and Park, J. M., 2010. Enhanced accumulation of decursin and decursinol angelate in root cultures and intact roots of Angelica gigas Nakai following elicitation, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 101 (3), PP: 295–302.
  • Safaei-Ghomi, J., and Batooli, H., 2010. Determination of bioactive molecules from flowers, leaves, stems and roots of Perovskia abrotanoides Karel growing in central Iran by nano scale injection, Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures, 5 (2), PP: 551–556.
  • Sairafianpour, M., Christensen, J., Staerk, D., Budnik, B. A., Kharazmi, A., Bagherzadeh, K., and Jaroszewski, G. W., 2001. Lishmanicidal, antiplasmodial and cytotoxic activity of novel diterpenoid 1,2-quinones from Perovskia abrotanoides: new source of tanshinones. Journal of Natural Products, 64 (11), PP: 1398–
  • Shilpa, K., Varun, K., and Lakshmi, B. S., 2010. An alternate method of natural drug production, elciting secondary metabolite production using plant cell culture, Journal of Plant Sciences, 5 (3), PP: 222–
  • Steinitz, B., Barr, N., Tabib, Y., Vaknin, Y., and Bernstein, N., 2010. Control of in vitro rooting and plant development in Corymbia maculata by silver nitrate, silver thiosulfate and thiosulfate ion. Plant Cell Reports, 29 (11), PP: 1315–1323.
  • Strader, L. C., Beisner, E. R., and Bartel, B., 2009. Silver ions increase auxin efflux independently of effects on ethylene response. The Plant Cell, 21(11), PP: 3585–3590.
  • Taha, R. A., and Hassan, S. A. M., 2016. Studies on silver nitrate impact on jojoba in vitro culture, International Journal of PharmTech Research 9 (8), PP: 77–
  • Tareen, R. B., Bib, T., Khan, M. A., Ahmad, M., and Zafar, M., 2010. Indigenous knowledge of folk medicine by the women of Kalat and Khuzdar Regions of Balochistan, Pakistan, Pakistan Journal of Botany, 42 (3), PP: 1465–1485.
  • Wang, Y., Shen, Y., Shen, Z., Zhao, L., Ning, D., Jiang, C., Zhao, R., and Huang, L., 2016. Comparative proteomic analysis of the response to silver ions and yeast extract in Salvia miltiorrhiza hairy root cultures, Plant Physiology and Biochemistry 107, PP: 364–373.
  • Wei, T., Gao, Y., Deng, K., Zhang, L., Yang, M., Liu, X., Qi, C., Wang, C., Song, W., Zhang, Y., and Chen, C., 2019. Enhancement of tanshinone production in Salvia miltiorrhiza hairy root cultures by metabolic engineering, Plant Methods, 15, article 53, doi: 1186/s13007-019-0439-3.
  • Xing, B., Yang, D., Guo, W., Liang, Z., Yan, X., Zhu, Y., and Liu, Y., 2015. Ag+ as a more effective elicitor for production of tanshinones than phenolic acids in Salvia miltiorrhiza hairy roots. Molecules, 20 (1), PP: 309–
  • Xing, B., Yang, D., Yua, H., Zhang, B., Yan, K., Zhang, X., Hana, R., and Liang, Z., 2018. Overexpression of SmbHLH10 enhances tanshinones biosynthesis in Salvia miltiorrhiza hairy roots, Plant Science, 276, PP: 229–238.
  • Zaker, A., Asili, J., Abrishamchi, P., Tyarani-Najaran, Z., and Mousavi, S. H., 2017. Cytotoxic and apoptotic effects of root extract and tanshinones isolated from Perovskia abrotanoides kar, Iranian Journal of Basic Medical Sciences, 20 (12), PP: 1377–
  • Zaker, A., Sykora, C., Gössnitzer, F., Abrishamchi, P., Asili, J., Mousavi, H., and Wawrosch, C. H., 2015. Effects of some elicitors on tanshinone production in adventitious root cultures of Perovskia abrotanoides Karel, Industrial Crops and Product, 67, PP: 97–
  • Zhang, C. H., Yan, Q., Cheuk, W. K., and Wu, j., 2004. Enhancement of tanshinone production in Salvia miltiorrhiza hairy root culture by Ag+ elicition and nutrient feeding. Planta Medica, 70 (2), PP: 147–151.
  • Zhang, Y., Jiang, P., Ye, M., Kim, S. H., Jiang, C., and Lu, J., 2012. Tanshinones: Sources, pharmacokinetics and anti-cancer activities. International Journal of Molecular Sciences, 13 (10), PP: 13621–
  • Zhao, J., Lou, J., Mou, Y., Li, P., Wu, J., and Zhou, L., 2011. Diterpenoid tanshinone and phenolic acids from cultured hairy roots of Salvia miltiorrhiza Bunge and their antimicrobial activities. Molecules, 16 (3), PP: 2259–2267.
  • Zhong, G. X., Li, P., Zeng, L. J., Guan, J., Li, D. Q., and Li, S. P., 2009. Chemical characteristics of Salvia miltiorrhiza (Danshen) collected from different locations in China. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57 (15), PP: 6879–6887.