نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه، ارومیه.

2 گروه علوم و صنایع غذایی دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه، ارومیه.

چکیده

مطالعه تنوع ژنتیکی با استفاده از نشانگرها برای حفظ مؤثر ژرم‌پلاسم و درک ساختار ژنتیکی آن ضروری است. تغییرات ژنتیکی در یک گونه سازگاری آن به محیط‌های مختلف را تسهیل می‌کند. در این مطالعه تنوع ژنتیکی 114 ژنوتیپ از 30 توده‌ی فلفل (Capsicum) با 11 آغازگر ISSR و همچنین 14 صفت مورفولوژیکی بررسی گردید. از 1653 جفت نشانگر ISSR، 04/7 درصد به طور معنی‌دار (P≤0.01) در عدم تعادل پیوستگی (LD) بودند. در تجریه ساختار جمعیت بر اساس داده‌های مولکولی و با استفاده از مدل بیزین، 5 زیرجمعیت (K=5) شناسایی گردید. در تجزیه ارتباط با استفاده از مدل خطی مخلوط و با لحاظ کردن ماتریس‌های Qst (ماتریس ساختار جمعیت) و K (ماتریس خویشاوندی افراد)، تعدادی از نشانگرهای تکثیر شده با 8 آغازگر ISSR با 13 صفت مورد بررسی پیوستگی نشان دادند. در بررسی حاضر، نشانگرهای مشترک برای برخی صفات شناسایی گردید که حاصل اثرات پلیوتروپی و یا پیوستگی نواحی ژنومی کنترل‌کننده صفات است. نشانگرهای تکثیر شده با آغازگر UBC834 بیشترین تعداد پیوستگی را با صفات مورد بررسی نشان دادند. نشانگرهای شناسایی شده در صورت تأیید می‌توانند در توسعه ارقام فلفل مفید باشند.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Assessment of genetic diversity and association analysis for agro-morphological traits in pepper (Capsicum spp.) using ISSR markers

نویسندگان [English]

  • Mohsen Salehian 1
  • Reza Darvishzadeh 1
  • Mahmoud Rezazad Bari 2

1 Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Urmia University, Urmia.

2 Department of Food Science and Technology, Faculty of Agriculture, Urmia University, Urmia.

چکیده [English]

Study of genetic diversity using genetic markers is necessary to effective conservation of germplasm and to understand its genetic structure. Genetic variability in a species facilitate its adaptation to various environmental conditions. In the present study, genetic variability among 114 genotypes from 30 Pepper accessions were studied suing 11 ISSR primers and 14 morphological traits. Of 1653 locus pairs of ISSR markers, 7.04% showed significant level (P≤0.01) of linkage disequilibrium (LD). By analyzing genetic structure of population based on molecular data and using Bayesian model, 5 subpopulations (K=5) were identified. Association analysis was conducted using mixed linear model by considering kinship and genetic structure matrices as covariates in the model. Some molecular markers multiplied by 8 ISSR primers were identified to be significantly associate with 13 studied traits (P ≤ 0.05). Some markers were common among some studied traits that can be due to pleiotropy or linkage between loci controlling traits. Among studied ISSR primers, molecular markers produced by UBC834 primer showed the most association with the studied traits. Identified markers after validation can be useful in the development of pepper cultivars.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Genetic diversity
  • Linkage Disequilibrium
  • Molecular markers
  • pepper
  • QTL identification

ارزیابی تنوع ژنتیکی و تجزیه ارتباط برای صفات آگرومورفولوژیکی فلفل

 (Capsicum spp.) با استفاده از نشانگرهای ISSR

محسن صالحیان1، رضا درویش­زاده1،2* و محمود رضازاد باری3

1 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه تولید و ژنتیک گیاهی

2 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، پژوهشکده زیست فناوری، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی

3 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی، گروه علوم و صنایع غذایی

تاریخ دریافت: 14/5/1398            تاریخ پذیرش: 30/7/1398

چکیده

مطالعه تنوع ژنتیکی با استفاده از نشانگرها برای حفظ مؤثر ژرم­پلاسم و درک ساختار ژنتیکی آن ضروری است. تغییرات ژنتیکی در یک گونه سازگاری آن به محیط­های مختلف را تسهیل می­کند. در این مطالعه تنوع ژنتیکی 114 ژنوتیپ از 30 توده­ی فلفل (Capsicum) با 11 آغازگر ISSR و همچنین 14 صفت مورفولوژیکی بررسی گردید. از 1653 جفت نشانگر ISSR، 04/7 درصد به طور معنی­دار (01/0P≤) در عدم تعادل پیوستگی (LD) بودند. در تجریه ساختار جمعیت براساس داده­های مولکولی و با استفاده از مدل بیزین، 5 زیرجمعیت (K=5) شناسایی گردید. در تجزیه ارتباط با استفاده از مدل خطی مخلوط و با لحاظ کردن ماتریس­های Qst (ماتریس ساختار جمعیت) و K (ماتریس خویشاوندی افراد)، تعدادی از نشانگرهای تکثیر شده با 8 آغازگر ISSR با 13 صفت مورد بررسی پیوستگی نشان دادند. در بررسی حاضر، نشانگرهای مشترک برای برخی صفات شناسایی گردید که حاصل اثرات پلیوتروپی و یا پیوستگی نواحی ژنومی کنترل­کننده صفات است. نشانگرهای تکثیر شده با آغازگر UBC834 بیشترین تعداد پیوستگی را با صفات مورد بررسی نشان دادند. نشانگرهای شناسایی شده در صورت تأیید می­توانند در توسعه ارقام فلفل مفید باشند.

واژه­های کلیدی: تنوع ژنتیکی، شناسایی کیو.تی.ال، فلفل، عدم تعادل پیوستگی، نشانگرهای مولکولی.

* نویسنده مسئول، تلفن: 31942785(44)98+ ، پست الکترونیکی: r.[email protected]

مقدمه

 

جنس فلفل (Capsicum L.) به عنوان یکی از محصولات مهم کشاورزی در سراسر جهان (31) از خانواده Solanaceae و شامل 22 گونه وحشی و 5 گونه اهلی
(C. annuum L., C. frutescens L., C. chinese Jacq., C. baccatum L., C. pubescens R. & P) است (13). ارقام این گیاه دیپلوئید با عدد کروموزومی 2n=2x=24 می­باشند. ارقام تجاری امروزی، هیبریدهای F1 از گونه C. annuum L.  هستند. در طول 30 سال گذشته ارقام هیبرید فلفل محبوبیت فراگیر پیدا نموده­اند. از طرفی، پایه ژنتیکی محدود در ارقام زراعی آسیب­پذیری آن­ها در مقابل تنش­های زیستی و غیرزیستی را افزایش می­دهد (17). ژرم­پلاسم بومی یکی از منابع مهم برای انتخاب والدین و گسترش پایه ژنتیکی در پروژه­های اصلاح ارقام هیبرید فلفل می­باشد. نژادهای بومی علاوه بر سازگاری بهتر با شرایط محیطی، دارای تنوع زیاد برای صفات مورفولوژیکی مانند اندازه، شکل و رنگ میوه هستند (31). این تنوع فرصت توسعه ارقام منحصر به فرد در برنامه­های اصلاحی را فراهم می­نماید. نشانگرهای مولکولی در تکمیل ارزیابی­های مورفولوژیکی برای توصیف تنوع ژنتیکی موجود در مرکز تنوع و به منظور شناسایی منابع اضافی تنوع ژنتیکی برای بهبود محصول بسیار مفید هستند. نشانگرهای مولکولی DNA با توجه به تعداد زیاد آن­ها، عدم تأثیرپذیری از شرایط محیطی و قابلیت تکرارپذیری برای تعیین شباهت ژنتیکی در بین ژنوتیپ­ها، مفید هستند (19). این نشانگرها به عنوان ابزار ایده آل برای مطالعه تنوع ژنتیکی، نقشه­یابی ژن­ها، انتخاب لاین­های والدینی برای تلاقی، شناسایی تنوع و خلوص هیبریدها در صنعت تولید بذر می­باشند (16و23). در میان انواع نشانگرهای DNA توسعه یافته مبتنی بر واکنش­ زنجیره­ای پلیمراز (Polymerase chain reaction (PCR))، ISSR (Inter simple sequence repeat) به طور گسترده جهت مطالعه تنوع در گیاهان مورد استفاده قرارگرفته است. نشانگرISSR  نیازمند مقدار کمی از DNA الگو است (39) و برای اجرا نیاز به داشتن اطلاعات از توالی ژنوم ارگانیسم مورد مطالعه نمی­باشد.

بسیاری از صفات مهم زراعی از قبیل کیفیت و میزان محصول­دهی، تحمل به تنش­های محیطی و برخی از اشکال مقاومت در برابر بیماری ها چندژنی (Polygenes) بوده و بشدت تحت تأثیر محیط و اثرات متقابل ژنتیک × محیط قرار می­گیرند (11و30). یکی از اهداف عمده به­نژادگران گیاهی مطالعه ژنتیکی صفات کمّی است که از طریق نقشه­یابی مکان­های صفات کمّی (Quantitative trait loci (QTL)) (QTLs) صورت می­گیرد (34). شناساییQTL های با اهمیت زراعی و استفاده از آن­ها در بهبود محصول به نقشه­یابی از اینQTL ها در ژنوم گونه­های زراعی با استفاده از نشانگرهای مولکولی نیازمند است (11و 30). نقشه­یابی ژنتیکی می­تواند عمدتاً به دو صورت انجام گیرد: 1- تجزیه پیوستگی که با استفاده از جمعیت­های آزمایشی یا جمعیت­های نقشه­یابی"دو والدی (Biparental (BP))" انجام می­شود 2- تجزیه ارتباطی که با استفاده از لاین­های متنوعی از جمعیت­های طبیعی یا مجموعه­های ژرم­پلاسم انجام می­شود. در هر دو روش شناسایی ارتباطات بین فنوتیپ­ها و نشانگرهای مولکولی مبتنی بر عدم تعادل پیوستگی ناشی از پیوستگی مکان­های ژنی است (12). در مقایسه دو روش وضوح تجزیه ارتباطی به علت رخداد نوترکیبی­های زیاد بالا است (24). هدف از این تحقیق بررسی تنوع ژنتیکی و ساختار جمعیت و همچنین تجزیه ارتباط برای صفات مورفولوژیک در فلفل با استفاده از نشانگرهای مولکولی ISSR می باشد. شناسایی نواحی ژنومی کنترل­کننده صفات مورفولوژیک می تواند به اصلاح گران در پیشبرد برنامه های گزینش در طول برنامه های اصلاحی جهت معرفی ارقام با پتانسیل عملکرد بالا کمک اساسی نماید.

مواد و روشها

مواد گیاهی: تعداد 114 ژنوتیپ متعلق به 30 توده فلفل (جدول 1) در گلدان­های حاوی مخلوطی از خاک مزرعه و پیت­ماس کشت و در فضای گلخانه تحقیقاتی دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه چیده شدند. در طول فصل رشد بعد از هر 2 دور آبیاری با آب معمولی، یک دور آبیاری با آب حاوی نیم گرم در لیتر کود 20 -20 -20 (NPK) انجام شد و نهایتاً 14 صفت مورفولوژیک در گیاهان اندازه­گیری شدند (جدول 2).

در مرحله 4 برگی، نمونه برگی از هر ژنوتیپ انتخاب و پروفیل مولکولی آن­ها با 11 آغازگر ISSR تهیه گردید. دی. ان. آ (Deoxyribonucleic acid) (DNA) ژنومی ژنوتیپ­ها با روش ستیل­تری­متیل­آمونیوم­بروماید (Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)) استخراج گردید. جهت بررسی کمیت و کیفیت DNA ژنومی، به ترتیب از اسپکتروفتومتر و الکتروفورز ژل آگارز یک درصد استفاده گردید. آغازگرهای ISSR مورد استفاده شامل UBC809، UBC811، UBC812، UBC817، UBC823، UBC825، UBC826، UBC827، UBC834، UBC842 و UBC856 می­باشند. چرخه­های دمایی واکنش­های PCR عبارت بود از: یک چرخه شامل (°C)94 به مدت 4 دقیقه برای واسرشت­سازی اولیه DNA، 36 چرخه شامل (°C)94 به مدت 30 ثانیه برای واسرشت­سازی، دمای اختصاصی برای هریک از آغازگرها جهت اتصال آن­ها به DNA الگو به مدت 30 ثانیه و (°C)72 به مدت 2 دقیقه برای بسط آغازگر و در نهایت یک چرخه شامل (°C)72 به مدت 10 دقیقه برای بسط نهایی. در نهایت برای جداسازی محصولات  PCRاز ژل اگارز 8/1درصد در بافر TBE 0.5x استفاده شد.

 

 

 

جدول 1- اطلاعات توده­های فلفل مورد مطالعه

میانگین سالانه آب و هوا

بالاتر از سطح دریا (m)

طول جغرافیایی

عرض جغرافیایی

اسامی

کد

بارش (mm)

سرما (روز)

دما (°C)

188٫6

59

17٫1

981٫21

36-12

57-40

Sabzevar

1

212

65

15٫7

981٫90

36-15

59-37

Khorasan

2

341

120

10٫6

1344٫64

37-32

45-5

Urmia

3

310

104

11٫6

1365٫76

38-5

46-16

Tabriz

4

260

60

11٫5

1892٫09

34-41

50-0

Tafresh (Markazi)

5

280

60-120

13٫8

1373٫81

33-54

50-27

Mahallat (Markazi)

6

459

70

14٫6

1562٫02

33-53

48-46

Borujerd

7

337

29

18

1508٫14

29-35

52-35

Shiraz

8

500

30

16٫2

1572٫67

31-30

50-48

Lordegan 1 (Chaharmahal)

9

600

45

10٫15

1165٫36

30-43

50-50

Boyer Ahamd

10

500

30

16٫2

1572٫67

31-30

50-48

Lordegan 2 (Chaharmahal)

11

560

83

11٫5

1829٫19

31-59

50-39

Chaharmahal

12

196

0

12٫55

35

27-8

57-4

Minab (Hormozgan)

13

500

109

12٫8

2538

35-57

47-8

Kurdistan 1

14

500

109

12٫8

2538

35- 57

47-8

Kurdistan 2

15

500

109

12٫8

2538

35-57

47-8

Kurdistan 3

16

350

120

8٫9

1278

37-33

45-15

Keshtiban (Urmia)

17

274

105

26٫8

1070

37-28

47-18

Bojnord

18

310

104

11٫9

1344

38-5

46-13

Gharamalik (Tabriz)

19

250٫9

100

7٫20

1308

37-9

46-5

Ghale Jigh (Bonab)

20

714

98

12٫2

1526٫52

35-59

45-52

Bane

21

250

65

15٫6

1146٫01

35-6

59-6

Joghatay (Mashhad)

22

441

5

22٫5

728٫95

35-21

50-47

Ghachsaran

23

350

120

8٫9

1288٫98

37-38

45-7

Bash Ghala-Urmia

24

322٫4

81

12٫5

1472٫29

38-6

46-15

Maragheh

25

205

120

8٫9

1376٫03

34-32

45-2

Gharah Bagh (Urmia)

26

294٫2

88

18٫13

1870٫65

37-42

48-27

Tuyserkan (Hamadan)

27

350

120

8٫9

1298٫58

37-42

45-6

Nakhchivan (Urmia)

28

256

150

12٫9

1304

37-42

45-4

Gejalar (Urmia)

29

439

100

23٫2

528٫09

37-10

38-47

Urfa (Turkey)

30

منبع اطلاعات: سازمان هواشناسی کشور، اداره کل فناوری اطلاعات و ارتباطات.

 

جدول 2- صفات مورفولوژیکی مطالعه شده در جمعیت­های فلفل

صفت

کد

صفت

کد

صفت

کد

تعداد شاخه

NB

دور بوته (mm)

RS

قطر میوه (cm)

RF

طول برگ (cm)

LL

تعداد میوه

NF

دور میوه (cm)

FC

عرض برگ (cm)

LW

وزن تک میوه (gr)

SFW

وزن گوشت (gr)

PW

طول دمبرگ (cm)

PL

وزن کل (gr)

TFW

وزن بذر کل (gr)

TSW

ارتفاع بوته (cm)

PH

طول میوه (cm)

FL

 

 

 

 

تجزیه و تحلیل داده­ها: امتیازدهی نشانگرهای ISSR به صورت بارز با کد یک و صفر به ترتیب برای وجود و عدم وجود قطعه موردنظر انجام گرفت. تجزیه خوشه­ای ژنوتیپ­های مورد مطالعه بر اساس داده­های مولکولی با روش Complete در نرم­افزارNTSYSpc version 2.0  ، تجزیه واریانس مولکولی (Analysis of molecular variance (AMOVA)) و برآورد میزان تنوع ژنتیکی در درون و بین جمعیت­ها در نرم­افزار GenAlex6.41 (28) و محاسبه تعداد و درصد مکان­های چندشکل در نرم­افزار PopGene32 انجام گرفت. میزان اطلاعات چندشکلی (Polymorphic information content (PIC)) برای هر آغازگر در ژرم پلاسم مورد مطالعه با استفاده از رابطه  محاسبه شد. در این فرمول P فراوانی i امین آلل و n تعداد آلل در مکان های ژنی می باشد. ساختار ژنتیکی جمعیت و دسته­بندی دقیق افراد به زیرجمعیت­های مناسب و تشخیص ژنوتیپ­های مختلط مبتنی بر مدل بیزین در نرم­افزار Structure 2.3.4 (29) انجام گرفت. بین 1 تا 10 زیرجمعیت­ فرضی (K) در نظر گرفته شد و برای افزایش دقت، 5 تکرار برای هریک از زیرجمعیت­های فرضی لحاظ گردید. منحنی حداکثر درست­نمایی با بکارگیری مدل ترکیبی Admixture و استقلال فراوانی آلل­ها با تعداد دوره گرم کردن (Burn-in) 100000 و تعداد تکرار MCMC (Markov Chain Monte Carlo) 100000 برآورد شد. ماتریس Qst (برآورد ضرایب احتمال عضویت هر ژنوتیپ به هریک از زیر جمعیت­ها) پس از تعیین مقدار K بهینه محاسبه شد. تجزیه ارتباط بین داده­های ISSR و داده­های فنوتیپی با لحاظ کردن ماتریس Qst (ماتریس ساختار جمعیت) و K (ماتریس خویشاوندی افراد) به عنوان کوواریت در مدل خطی مخلوط (Mixed linear model=MLM) با استفاده از نرم­افزار TASSEL3.0 (9) انجام شد. عدم تعادل لینکاژی (Linkage Disequilibrium) بین جفت نشانگرهای ISSR با نرم­افزار TASSEL3.0 برآورد شد.

نتایج

از میان آغازگرهای ISSR مورد بررسی، آغازگر UBC856، بیشترین تعداد نشانگر (11 عدد) و آغازگر UBC842، کمترین تعداد نشانگر (3 عدد) را تکثیر کردند (جدول 3). کمترین محتوای اطلاعات چند شکل (PIC) برای آغازگر UBC825 با 8/33 درصد و بیشترین میزان برای آغازگر UBC811 با 45 درصد مشاهده شد (جدول 3). تجزیه واریانس مولکولی با استفاده از نشانگرهای ISSR نشان داد که 26 درصد تنوع محاسبه شده به تنوع بین گروهی (Among pops) و 74 درصد به تنوع درون گروهی (Within pops) مربوط می‌شود (جدول 4). در تجزیه خوشه­ای بر اساس داده­های ISSR توده­های فلفل مورد مطالعه در 3 گروه اصلی قرار گرفتند (شکل 1).

 

 

 

شکل 1- تجزیه خوشه­ای توده های فلفل براساس داده­های مولکولی ISSR به روش Complete در نرم­افزار NTSYS.

جدول 3- محتوای اطلاعات چندشکل و درصد پلی مورفیسم آغازگرهای ISSR استفاده شده در مطالعه تنوع ژنتیکی توده های فلفل.

اسامی پرایمر

توالی پرایمر

PIC

باندهای مونومرفیک

باندهای پلی مورفیک

UBC809

(AG)8G

0٫416

2

7

UBC811

(GA)8C

0٫450

4

4

UBC812

(GA)8A

0٫382

3

5

UBC817

(CA)8A

0٫434

2

6

UBC823

(TC)8C

0٫399

2

7

UBC825

(AC)8T

0٫338

3

6

UBC826

(AC)8C

0٫382

2

7

UBC827

(AC)8G

0٫363

2

7

UBC834

(AG)8CTT

0٫341

4

6

UBC842

(GA)8CTT

0٫446

1

2

UBC856

(AC)8CTA

0٫387

10

1

کل

 

 

35

58

میانگین

 

394/0

18/3

27/5

انحراف معیار

 

04/0

44/2

10/2

 

جدول 4- تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) با استفاده از نشانگرهای ISSR در جمعیت­های فلفل

منابع

درجه آزادی

مجموع مربعات

میانگین مربعات

واریانس برآورد شده

درصد

بین جمعیت ها

29

672٫605

23٫193

3٫509

26%

درون جمعیت ها

84

830٫833

9٫891

9٫891

74%

کل

113

1503٫439

 

13٫400

100%

 

 

تجزیه مؤثر ساختار جمعیت و گروه­بندی دقیق افراد به زیرجمعیت­ها با استفاده از نشانگرهای تکثیر شده با 11 آغازگر ISSR در نرم­افزار Structure  انجام شد. باتوجه به این که حداکثر مقدار  ΔKدر K=5 بدست آمد، به احتمال قوی ژنوتیپ­های فلفل مورد بررسی دارای 5 زیر جمعیت می­باشند (شکل 2). براساس بارپلات حاصل و با آستانه تصمیم­گیری 70 درصد، از 114 ژنوتیپ مورد بررسی، 42/68 درصد افراد مورد مطالعه (78 فرد) بدون اختلاط و 57/31 درصد افراد (36 فرد) دارای ساختار مختلط می­باشند. از 1653 جفت نشانگر ISSR [(58×57)/2=1635]، 04/7 درصد به طور معنی­دار در سطح احتمال 1 درصد در عدم تعادل پیوستگی (LD) بودند (شکل 3).

 

 

شکل 2- گروه­بندی ژنوتیپ­های  فلفل بر اساس داده­های نشانگرهای ISSR مبتنی بر مدل Bayesian (شکل سمت راست) در نرم­افزار Structure. نمودار دو سویه برای تعیین تعداد مناسب زیر جمعیت (شکل سمت چپ) بر اساس داده­های نشانگرهای ISSR در نرم­افزار Structure (K=5).

 

شکل 3- پلات عدم تعادل پیوستگی (LD plot) بین جفت نشانگرهای ISSR در توده­های فلفل مورد مطالعه. قسمت بالای قطر نشان­دهنده میزان عدم تعادل پیوستگی با استفاده از آماره D' و قسمت پایین قطر، نشان­دهنده سطوح معنی­داری بین هر جفت نشانگرهای ISSR است.

 

در تجزیه ارتباطی، نشانگرهای تکثیر شده با 8 آغازگرآ ISSR مختلف با 13 صفت مورد بررسی پیوستگی نشان دادند که از این تعداد 2 مکان ژنی با تعداد شاخه، 2 مکان ژنی با عرض برگ، 2 مکان ژنی با طول دمبرگ، 2 مکان ژنی با ارتفاع بوته، 3 مکان ژنی با دور بوته، 4 مکان ژنی با تعداد میوه، 1 مکان ژنی با وزن تک میوه، 7 مکان ژنی با وزن کل میوه، 4 مکان ژنی با طول میوه، 4 مکان ژنی با قطر میوه، 3 مکان ژنی با دور میوه، 2 مکان ژنی با وزن گوشت و 4 مکان ژنی با وزن بذر کل پیوسته می­باشند (جدول 5). دامنه ضرایب تبیین فنوتیپی (R2) بین 3/3 تا 2/15 متغییر بود.

 

جدول 5- شناسایی نشانگرهای ISSR پیوسته با صفات مورد مطالعه در فلفل براساس مدل  MLMدر نرم­ا­فزار TASSEL.

صفت

نشانگر

F-marker

P-value

R2

صفت

نشانگر

F-marker

P-value

R2

NB

UBC826

9٫26109

0٫0029

0٫0650

 

UBC834

4٫9260

0٫0287

0٫04649

 

UBC842

4٫6977

0٫0326

0٫03364

 

UBC812

4٫5288

0٫0360

0٫0440

LW

UBC825

4٫7479

0٫0315

0٫0419

 

UBC825

4٫4654

0٫0371

0٫04131

 

UBC826

4٫5293

0٫0357

0٫0408

FL

UBC825

4٫0986

0٫0456

0٫03890

PL

UBC826

4٫1134

0٫0452

0٫0383

 

UBC834

6٫3605

0٫0132

0٫0611

 

UBC834

4٫8782

0٫0293

0٫0439

 

UBC834

4٫4873

0٫0366

0٫0431

PH

UBC817

6٫7302

0٫0108

0٫0566

 

UBC812

4٫7038

0٫0326

0٫0480

 

UBC825

6٫5401

0٫0119

0٫0547

RF

UBC812

15٫352

0٫0001

0٫1524

RS

UBC826

5٫0220

0٫0272

0٫0430

 

UBC834

4٫4503

0٫037

0٫0411

 

UBC825

4٫0935

0٫0455

0٫0373

 

UBC817

4٫24981

0٫0419

0٫0399

 

UBC812

7٫07162

0٫0091

0٫0617

 

UBC834

5٫5772

0٫0201

0٫05154

NF

UBC826

4٫8860

0٫0295

0٫0491

FC

UBC825

5٫2467

0٫0241

0٫0499

 

UBC834

6٫8226

0٫0104

0٫0659

 

UBC834

5٫5455

0٫0205

0٫0550

 

UBC842

3٫9869

0٫0488

0٫0408

 

UBC812

8٫5377

0٫0043

0٫0886

 

UBC812

8٫2282

0٫0051

0٫0841

PW

UBC834

5٫2007

0٫0247

0٫0516

SFW

UBC834

5٫2188

0٫024

0٫049

 

UBC817

5٫5096

0٫020

0٫0542

TFW

UBC826

4٫8443

0٫0302

0٫0469

TSW

UBC826

4٫2089

0٫0430

0٫0441

 

UBC817

4٫7675

0٫0314

0٫0443

 

UBC834

4٫1089

0٫0453

0٫0401

 

UBC825

6٫1174

0٫015

0٫0565

 

UBC826

4٫5090

0٫0363

0٫0473

 

UBC827

5٫58714

0٫0202

0٫0603

 

UBC812

7٫1109

0٫0090

0٫0725

MLM: mixed liner model; R2: coefficient of determination; P-value: probability value.

 

بحث و نتیجه گیری

تنوع ژنتیکی فلفل: در مطالعات مختلفی از شاخص PIC و تجزیه واریانس مولکولی برای ارزیابی تنوع ژنتیکی استفاده شده است (1،4 و5). محاسبه PIC مبتنی بر تعداد نشانگر­های شناسایی شده در جمعیت مورد مطالعه بوده، مقادیر بالای PIC اشاره بر چندشکلی بالا در جایگاه­های نشانگرها و کارایی بالای آن­ها در تمایز افراد جمعیت دارد (2). در این مطالعه متوسط PIC آغازگرهای مورد استفاده برابر 39/0 با انحراف معیار 04/0 بود. مقدار PIC 5 نشانگر از 11 نشانگر مورد استفاده بیشتر از متوسط بود. بنابراین در حدود نصف آغازگرهای مورد مطالعه قدرت تمایز بالاتری داشته که در تفکیک و تمایز افراد مهم است. در مطالعه­ی تنوع ژنتیکی جمعیت­های فلفل قرمز بلغارستان با نشانگرهای SSR، محتوای اطلاعات چندشکل نشانگرها بین 061/0 تا 639/0 با میانگین 349/0 گزارش شد (31). براساس تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) در توده­های فلفل با نشانگرهای ISSR، میزان تنوع در درون توده­ها بسیار بیشتر از بین توده­ها بود. تنوع کم بین توده­های فلفل حاکی از جریان ژنی کم در بین جمعیت­ها و همچنین وجود روش گزینشی متفاوت در هر جمعیت می باشد. در مطالعه­ی (25) بر روی فلفل (Capsicum annuum L.)، میزان تنوع در درون توده­ها 74/84 درصد و بین توده­ها 26/15 درصد گزارش گردید.

ارزیابی ساختار ژنتیکی فلفل: در گروه بندی براساس روش سلسله مراتبی Complete و مبتنی بر مدل بیزین، افراد مورد مطالعه به ترتیب در 3 و 5 گروه ژنتیکی قرار گرفتند که حاکی از وجود زیر ساختار در جمعیت فلفل مورد مطالعه می باشد که بایستی در تجزیه ارتباطی در نظر گرفته شود. در مطالعه­ی (10) بر روی فلفل با نشانگرهای AFLP، توده­ها در دو خوشه اصلی قرارگرفتند. در مطالعه­ی دیگر (37) بر روی توده های فلفل چین، افراد جمعیت مورد مطالعه در نرم­افزار Structure به سه گروه ژنتیکی تفکیک شدند. در مطالعه­ی (25) بر روی ارقام فلفل با نشانگرهای SSR، 5 زیر جمعیت (K=5) با نرم­افزار Structure شناسایی شد.

تجزیه ارتباطی: پایه و اساس تجزیه ارتباطی عدم تعادل پیوستگی (Linkage disequilibrium (LD)) می باشد که نشان­دهنده همبستگی غیرتصادفی آلل­ها در مکان­های ژنتیکی مختلف بر روی یک تک کروموزوم (گروه پیوستگی) یا کروموزوم های مختلف می­باشد (7 و 21). گستره LD در گیاهان از صدها جفت باز تا صدها جفت کیلوباز بسته به گونه و نوع جمعیت مورد بررسی دیده شده است (22و 26). چندین عامل نقش مهمی در ایجاد بلوک­های هاپلوتایپ LD در ژنوم دارند (27و 32) که از آن­ها می­توان به نوترکیبی، انتخاب، جهش و مهاجرت اشاره کرد (14). از میان عوامل، جهش و نوترکیبی عوامل کلیدی تأثیرگذار بر LD هستند. نقشه­یابیLD  به واسطه وقوع نوترکیبی اجدادی (Ancestral recombination) که در جمعیت اتفاق می­افتد تمام آلل­های موجود در جمعیت را در شناسایی ارتباط معنی­دار صفت- نشانگر در نظر می­گیرد (15). در مطالعه­ی (25) بر روی ارقام فلفل با نشانگرهای SSR، طیف وسیعی از عدم تعادل پیوستگی بین مکان­ها در طول ژنوم شناسایی گردید که استفاده از تجزیه ارتباطی برای شناسایی نشانگرهای مرتبط را امکان­پذیر می­نماید.

در اصلاح نبات مبتنی بر گزینش به کمک نشانگر، تنها همبستگی غیرتصادفی آلل­ها که ناشی از پیوستگی فیزیکی مکان های ژنی است ارزش کاربردی داشته و عوامل دیگر از قبیل وجود ساختار در جمعیت و خویشاوندی نسبی افراد هرچند ممکن است باعث ایجاد همبستگی غیرتصادفی آلل­ها یا LD شوند ولی از دید اصلاحی ارزشی ندارد و حتی وجود چنین عواملی منجر به سطح بالایی از نتایج مثبت دروغین در تجزیه ارتباطی می­شوند (36) و در نتیجه قابلیت اعتماد به نتایج بدست آمده کاهش می­یابد. منظور از نتایج مثبت دروغین، نشانگرهای غیرپیوسته­ای است که به اشتباه به عنوان نشانگر پیوسته با ژن های کنترل صفات شناسایی می شوند؛ به عبارت دیگر پیوستگی کاذب نشانگر با ژن کنترل کننده صفت است. لذا لازم است اثر چنین عواملی کنترل شوند. مدل مخلوط با در نظر گرفتن ماتریس ساختار جمعیت (Q) و ماتریس خویشاوندی نسبی (K) به عنوان کوواریت در پروسه تجزیه ارتباطی یک سیستم قوی و قابل اعتماد جهت شناسایی QTL یا نشانگرهای پیوسته با ژن های کنترل کننده صفات فراهم می­نماید (35و 38).

در بررسی حاضر، نشانگرهای مولکولی مختلفی برای صفات مورد شناسایی شد. تعدادی از نشانگرهای شناسایی شده برای برخی صفات مشترک بود که عمدتاً نتیجه اثرات پلیوتروپی و یا پیوستگی نواحی ژنومی کنترل­کننده صفات است (18). نشانگرهای تکثیر شده با آغازگر UBC834 بیشترین تعداد پیوستگی را با صفات مورد بررسی نشان داد. نشانگرهای مشترک در صورت تأیید با آزمایش­های تکمیلی، می­توانند به نشانگرهای اختصاصی ((SCAR) Sequence-characterized amplified region) تبدیل و برای غربال جمعیت­ها و انتخاب به کمک نشانگر (MAS) مورد استفاده قرار گیرند. در مطالعه­ی (25) بر روی ارقام فلفل با نشانگرهای SSR در تجزیه ارتباطی، 8 نشانگر از هفت کروموزوم مختلف به طور معنی­داری با وزن میوه ارتباط داشتند و در کل 15 درصد از تغییرات صفت را توجیه می­نمودند. در مطالعه­ی (3)، از نشانگرهای ISSR برای تجزیه ارتباط در یونجه استفاده شد و نشانگر  ISSR14-4 با 8 صفت مختلف پیوسته بود. در سایر محصولات مانند ذرت (8)، گندم (20)، جو (33) و توتون (6) نیز از نشانگرهای ISSR برای تجزیه QTL استفاده شده است.

در پژوهش حاضر کمترین محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC) برای آغازگر UBC825 با 8/33 درصد و بیشترین میزان برای آغازگر UBC811 با 45 درصد مشاهده شد. در ارزیابی ساختار جمعیت ژنوتیپ­های فلفل با نشانگرهای ISSR در نرم­افزار Structure، افراد در 5 زیر جمعیت قرارگرفتند. در تجزیه ارتباط بین داده­های مولکولی و صفات فنوتیپی مورد مطالعه با لحاظ کردن ماتریس­های Qst (ماتریس ساختار جمعیت) و K (ماتریس خویشاوندی افراد) در مدل MLM به عنوان کوواریت، نشانگرهای تکثیر شده با 8 آغازگر ISSR با 13 صفت مورد بررسی پیوستگی نشان دادند. این مطالعه پتانسیل نشانگر مولکولی ISSR در تجزیه ارتباطی صفات کمّی در توده­های فلفل را نشان می­دهد. چندین نشانگر مولکولی به طور قابل توجهی با بیش از یک صفت فنوتیپی ارتباط داشتند، که بیانگر حضور احتمالی اثرات پلیوتروپیک یا پیوستگی مکان­های کنترل­کننده صفات می­باشد. نتایج حاصل از این مطالعه در صورت تأیید و تبدیل نشانگرهای شناسایی شده به نشانگرهای هم بارز SCAR می­توانند در گزینش به کمک نشانگر برای صفات پیچیده در C. annuum مفید باشند. همچنین نشانگرهای با پیوستگی قوی می­توانند برای اشباع نمودن نقشه­های پیوستگی استفاده شوند.

سپاسگزاری

از دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی و همچنین پژوهشکده زیست فناوری دانشگاه ارومیه به خاطر فراهم­نمودن امکانات لازم برای انجام پژوهش و همچنین از معاونت پژوهش و فناوری دانشگاه به خاطر تامین منابع مالی پژوهش تشکر و قدردانی می شود.

 

  • Abdurakhmonov, I. Y., and Abdukarimov, A., 2008. Application of Association Mapping to Understanding the Genetic Diversity of Plant Germplasm Resources, International Journal of Plant Genomics, 574927, 18 p.
  • Andersen, J. R., Zein, I., Wenzel, G., Krützfeldt, B., Eder, J., Ouzunova, M., and Lübberstedt, T., 2007. High levels of linkage disequilibrium and associations with forage quality at a phenylalanine ammonia-lyase locus in European maize (Zea mays ) inbreds. Theoretical and Applied Genetics, 114 (2), PP: 307–319.
  • Bradbury, P. J., Zhang, Z., Kroon, D. E., Casstevens, T. M., Ramdoss, Y. and Buckler, E. S., 2007. TASSEL, software for association mapping of complex traits in diverse samples, Bioinformatics, 23, 2633-2635.
  • Cavagna, P., Camerini, G., Fibiani, M., Andreani, L., Cella, R., Concia, L., and Lo Scalzo, R., 2012. Characterization of the rescued ‘Voghera’ sweet pepper landrace grown in northern Italy, Spanish Journal of Agricultural Research, 10(4), PP: 1059-1069.
  • Collard, B. C. Y., Jahufer, M. Z. Z., Brouwer, J. B., and Pang, E. C. K., 2005. An introduction to markers, quantitative trait loci (QTL) mapping and marker-assisted selection for crop improvement: the basic concepts. Euphytica, 142(1-2), PP: 169-196.
  • Ersoz, E. S., Yu, J., and Buckler, E. S., 2007. Applications of linkage disequilibrium and association mapping in crop plants, Genomics- assisted crop improvement. Springer, Dordrecht, PP: 97-120.
  • Eshbaugh, W. H., 1980. The taxonomy of the genus Capsicum (Solanaceae), Phytologia, 47, PP: 153-165.
  • Flint-Garcia, S. S., Thornsberry, J. M., and Buckler, E. S. I., 2003. Structure of linkage disequilibrium, Annual Review of Plant Biology, 54, PP: 357–374.
  • George, A. W., and Cavanagh, C., 2015. Genome-wide association mapping in plants, Theoretical and Applied Genetics, 128, 1163-1174.
  • Hammer, K., Arrowsmith, N., and Gladis, T., 2003. Agrobiodiversity with emphasis on plant genetic resources, Naturwissenschaften, 90, 241-250, In: Ruane, J., Sonnino, A., (Eds.), The role of biotechnology in exploring and protecting agricultural genetic resources, Rome: FAO, PP: 55-66.
  • Hanif U., Alipour H., Gul A., Jing L., Darvishzadeh R., Amir R., Munir F., Siddiqui S., Ghafoor A., Ilyas M., Bernando A., Amand P.St., Bai G, Sonder K., He Z., Rasheed A. & Li H. (2021). Characterization of the genetic basis of local adaptation of wheat landraces from Iran and Pakistan using GWAS. The Plant Genome. DOI: 10.1002/tpg2.20096.
  • Jun, T. H., Van, K., Kim, M. Y., Lee, S. H., and Walker, D. R., 2008. Association analysis using SSR markers to find QTL for seed protein content in soybean. Euphytica, 62, 179-191.
  • Lanteri, S., and Barcaccia, G., 2006. Molecular marker-based analysis for crop germplasm preservation. In: Ruane, J., Sonnino, A. (Ed.)., The role of biotechnology in exploring and protecting agricultural genetic resources, Rome: FAO, PP: 55-66.
  • Liu, L., Wang, L., Yao, J., Zheng, Y., and Zhao, C., 2010. Association mapping of six agronomic traits on chromosome 4a of wheat (Triticum aestivum ), Molecular Plant Breeding, 1(5), PP: 1–10.
  • Mackay, I., and Powell, W., 2007. Methods for linkage disequilibrium mapping in crops, Trends in Plant Science, 12(2), PP: 57-63.
  • Mather, K. A., Caicedo, A. L., Polato, N. R., Olsen, K. M., McCouch, S. & Purugganan M. D. (2007). The extent of linkage disequilibrium in rice (Oryza sativa), Genetics, 177, 2223-2232.
  • Mathew, D., 2006. Molecular markers in improvement of Capsicum spp, a review, Journal of Spices and Aromatic Crops, 15, PP: 1-13.
  • Moose, S. P., and Mumm, R. H., 2008. Molecular plant breeding as the foundation for 21st century crop improvement. Plant Physiology, 147, PP: 969-977.
  • Nimmakayala, P., Abburi, V. L., Abburi, L., Alaparthi, S. B., Cantrell, R., Hankins, G., Malkaram, S., and Reddy, U. K., 2014. Linkage disequilibrium and population‑structure analysis among Capsicum annuum cultivars for use in association mapping. Molecular Genetics and Genomics, 289, PP: 513-521.
  • Nordborg, M., Borevitz, J. O., Bergelson, J., Berry, C. C., Chory, J., Hagen-blad, J., Kreitman, M., Maloof, J. N., Noyes, T., Oefner, P. J., Stahl, E. A., and Weigel, D., 2002. The extent of linkage disequilibrium in Arabidopsis thaliana, Nature Genetics, 30, PP: 190–193.
  • Oraguzie, N. C., Wilcox, P. L., Rikkerink, E. H. A., and de Silva, H. N., 2007. Linkage disequilibrium, association mapping in plants. Springer, PP: 11–39.
  • Peakall, R., and Smouse, P. E., 2006. GenAlEx 6: Genetic Analysis in Excel, Population genetic software for teaching and research, Molecular Ecology Notes, 6, PP: 288-295.
  • Pritchard, J. K., Stephens, M., and Donnelly, P., 2000. Inference of population structure using multilocus genotype data, Genetics, 155, PP: 945–959.
  • Ross-Ibarra, J., Morrell, P. L., and Gaut, B. S., 2007. Plant domestication, a unique opportunity to identify the genetic basis of adaptation, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104 (supplement 1), PP: 8641–8648.
  • Se-Jong, O. H, Song Jae, Y., Jeongran, L., Gi-An, L., Ho-Cheol, K., Stoilova, T., Krasteva, L., Yeon-Gyu, K., Ju-Hee, R., Jae-Gyun, G., Na-Young, R., On-Sook, H., and Myung-Chul, L., 2012. Evaluation of Genetic Diversity of Red Pepper Landraces (Capsicum annuum) from Bulgaria Using SSR Markers. The Journal of the Korean Society of International Agriculture, 24(5), PP: 547-556.
  • Stich, B., Melchinger, A. E., Frisch, M., Maurer, H. P., Heckenberger, M., and Reif, J. C., 2005. Linkage disequilibrium in European elite maize germplasm investigated with SSRs, Theoretical and Applied Genetics, 111(4), PP: 723–730.
  • Wang, M., Jiang, N., Jia, T., Leach, L., Cockram, J., Comadran, J., Shaw, P., Waugh, R., and Luo, Z., 2012. Genome-wide association mapping of agronomic and morphologic traits in highly structured populations of barley cultivars, Theoretical and Applied Genetics, 124(2), PP: 233–246.
  • Xiao, Y., Cai, D., Yang, W., Ye, W., Younas., M., Wu, J., and Liu, K., 2012. Genetic structure and linkage disequilibrium pattern of a rapeseed (Brassica napus) association mapping panel revealed by microsatellites, Theoretical and Applied Genetics, 125, PP: 437–447.
  • Yu, J., and Buckler, E. S., 2006. Genetic association mapping and genome organization of maize, Current Opinion in Biotechnology, 17(2), PP:155-160.
  • Yu, J., Pressoir, G., Briggs, W. H., Bi, I. V., Yamasaki, M., Doebley, J. F., McMullen, M. D., Gaut, B. S., Nielsen, D. M., and Holland, J. B., 2006. A uni­fied mixed-model method for association mapping that accounts for multiple levels of relatedness, Nature Genetics, 38, PP: 203–208.
  • Xiao-Min, Z., Zheng-Hai, Z., Xiao-Zhen, G., Sheng-Li, M., Xi-Xiang, L., Chadoeuf, J., Palloix, A., Li-Hao, W., and Bao-Xi, Z., 2016. Genetic diversity of pepper (Capsicum ) germplasm resources in China reflects selection for cultivar types and spatial distribution, Journal of Integrative Agriculture, 15(9), PP: 1991-2001.
  • Zhao, K., Aranzana, M. J., Kim, S., Lister, C., Shindo, C., Tang, C., Toomajian, C., Zheng, H., Dean, C., Marjoram, P., and Nordborg, M., 2007. An Arabidopsis example of association mapping in structured samples. PLoS Genetics, 3(1), e4 p.
  • Zietkiewicz, E., Rafalski, A., and Labuda, D., 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics, 20(2), PP: 176-183.