نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه، ارومیه.
2 گروه علوم و صنایع غذایی دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه، ارومیه.
چکیده
مطالعه تنوع ژنتیکی با استفاده از نشانگرها برای حفظ مؤثر ژرمپلاسم و درک ساختار ژنتیکی آن ضروری است. تغییرات ژنتیکی در یک گونه سازگاری آن به محیطهای مختلف را تسهیل میکند. در این مطالعه تنوع ژنتیکی 114 ژنوتیپ از 30 تودهی فلفل (Capsicum) با 11 آغازگر ISSR و همچنین 14 صفت مورفولوژیکی بررسی گردید. از 1653 جفت نشانگر ISSR، 04/7 درصد به طور معنیدار (P≤0.01) در عدم تعادل پیوستگی (LD) بودند. در تجریه ساختار جمعیت بر اساس دادههای مولکولی و با استفاده از مدل بیزین، 5 زیرجمعیت (K=5) شناسایی گردید. در تجزیه ارتباط با استفاده از مدل خطی مخلوط و با لحاظ کردن ماتریسهای Qst (ماتریس ساختار جمعیت) و K (ماتریس خویشاوندی افراد)، تعدادی از نشانگرهای تکثیر شده با 8 آغازگر ISSR با 13 صفت مورد بررسی پیوستگی نشان دادند. در بررسی حاضر، نشانگرهای مشترک برای برخی صفات شناسایی گردید که حاصل اثرات پلیوتروپی و یا پیوستگی نواحی ژنومی کنترلکننده صفات است. نشانگرهای تکثیر شده با آغازگر UBC834 بیشترین تعداد پیوستگی را با صفات مورد بررسی نشان دادند. نشانگرهای شناسایی شده در صورت تأیید میتوانند در توسعه ارقام فلفل مفید باشند.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Assessment of genetic diversity and association analysis for agro-morphological traits in pepper (Capsicum spp.) using ISSR markers
نویسندگان [English]
1 Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Urmia University, Urmia.
2 Department of Food Science and Technology, Faculty of Agriculture, Urmia University, Urmia.
چکیده [English]
Study of genetic diversity using genetic markers is necessary to effective conservation of germplasm and to understand its genetic structure. Genetic variability in a species facilitate its adaptation to various environmental conditions. In the present study, genetic variability among 114 genotypes from 30 Pepper accessions were studied suing 11 ISSR primers and 14 morphological traits. Of 1653 locus pairs of ISSR markers, 7.04% showed significant level (P≤0.01) of linkage disequilibrium (LD). By analyzing genetic structure of population based on molecular data and using Bayesian model, 5 subpopulations (K=5) were identified. Association analysis was conducted using mixed linear model by considering kinship and genetic structure matrices as covariates in the model. Some molecular markers multiplied by 8 ISSR primers were identified to be significantly associate with 13 studied traits (P ≤ 0.05). Some markers were common among some studied traits that can be due to pleiotropy or linkage between loci controlling traits. Among studied ISSR primers, molecular markers produced by UBC834 primer showed the most association with the studied traits. Identified markers after validation can be useful in the development of pepper cultivars.
کلیدواژهها [English]
ارزیابی تنوع ژنتیکی و تجزیه ارتباط برای صفات آگرومورفولوژیکی فلفل
(Capsicum spp.) با استفاده از نشانگرهای ISSR
محسن صالحیان1، رضا درویشزاده1،2* و محمود رضازاد باری3
1 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه تولید و ژنتیک گیاهی
2 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، پژوهشکده زیست فناوری، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی
3 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی، گروه علوم و صنایع غذایی
تاریخ دریافت: 14/5/1398 تاریخ پذیرش: 30/7/1398
چکیده
مطالعه تنوع ژنتیکی با استفاده از نشانگرها برای حفظ مؤثر ژرمپلاسم و درک ساختار ژنتیکی آن ضروری است. تغییرات ژنتیکی در یک گونه سازگاری آن به محیطهای مختلف را تسهیل میکند. در این مطالعه تنوع ژنتیکی 114 ژنوتیپ از 30 تودهی فلفل (Capsicum) با 11 آغازگر ISSR و همچنین 14 صفت مورفولوژیکی بررسی گردید. از 1653 جفت نشانگر ISSR، 04/7 درصد به طور معنیدار (01/0P≤) در عدم تعادل پیوستگی (LD) بودند. در تجریه ساختار جمعیت براساس دادههای مولکولی و با استفاده از مدل بیزین، 5 زیرجمعیت (K=5) شناسایی گردید. در تجزیه ارتباط با استفاده از مدل خطی مخلوط و با لحاظ کردن ماتریسهای Qst (ماتریس ساختار جمعیت) و K (ماتریس خویشاوندی افراد)، تعدادی از نشانگرهای تکثیر شده با 8 آغازگر ISSR با 13 صفت مورد بررسی پیوستگی نشان دادند. در بررسی حاضر، نشانگرهای مشترک برای برخی صفات شناسایی گردید که حاصل اثرات پلیوتروپی و یا پیوستگی نواحی ژنومی کنترلکننده صفات است. نشانگرهای تکثیر شده با آغازگر UBC834 بیشترین تعداد پیوستگی را با صفات مورد بررسی نشان دادند. نشانگرهای شناسایی شده در صورت تأیید میتوانند در توسعه ارقام فلفل مفید باشند.
واژههای کلیدی: تنوع ژنتیکی، شناسایی کیو.تی.ال، فلفل، عدم تعادل پیوستگی، نشانگرهای مولکولی.
* نویسنده مسئول، تلفن: 31942785(44)98+ ، پست الکترونیکی: r.darvishzadeh@urmia.ac.ir
مقدمه
جنس فلفل (Capsicum L.) به عنوان یکی از محصولات مهم کشاورزی در سراسر جهان (31) از خانواده Solanaceae و شامل 22 گونه وحشی و 5 گونه اهلی
(C. annuum L., C. frutescens L., C. chinese Jacq., C. baccatum L., C. pubescens R. & P) است (13). ارقام این گیاه دیپلوئید با عدد کروموزومی 2n=2x=24 میباشند. ارقام تجاری امروزی، هیبریدهای F1 از گونه C. annuum L. هستند. در طول 30 سال گذشته ارقام هیبرید فلفل محبوبیت فراگیر پیدا نمودهاند. از طرفی، پایه ژنتیکی محدود در ارقام زراعی آسیبپذیری آنها در مقابل تنشهای زیستی و غیرزیستی را افزایش میدهد (17). ژرمپلاسم بومی یکی از منابع مهم برای انتخاب والدین و گسترش پایه ژنتیکی در پروژههای اصلاح ارقام هیبرید فلفل میباشد. نژادهای بومی علاوه بر سازگاری بهتر با شرایط محیطی، دارای تنوع زیاد برای صفات مورفولوژیکی مانند اندازه، شکل و رنگ میوه هستند (31). این تنوع فرصت توسعه ارقام منحصر به فرد در برنامههای اصلاحی را فراهم مینماید. نشانگرهای مولکولی در تکمیل ارزیابیهای مورفولوژیکی برای توصیف تنوع ژنتیکی موجود در مرکز تنوع و به منظور شناسایی منابع اضافی تنوع ژنتیکی برای بهبود محصول بسیار مفید هستند. نشانگرهای مولکولی DNA با توجه به تعداد زیاد آنها، عدم تأثیرپذیری از شرایط محیطی و قابلیت تکرارپذیری برای تعیین شباهت ژنتیکی در بین ژنوتیپها، مفید هستند (19). این نشانگرها به عنوان ابزار ایده آل برای مطالعه تنوع ژنتیکی، نقشهیابی ژنها، انتخاب لاینهای والدینی برای تلاقی، شناسایی تنوع و خلوص هیبریدها در صنعت تولید بذر میباشند (16و23). در میان انواع نشانگرهای DNA توسعه یافته مبتنی بر واکنش زنجیرهای پلیمراز (Polymerase chain reaction (PCR))، ISSR (Inter simple sequence repeat) به طور گسترده جهت مطالعه تنوع در گیاهان مورد استفاده قرارگرفته است. نشانگرISSR نیازمند مقدار کمی از DNA الگو است (39) و برای اجرا نیاز به داشتن اطلاعات از توالی ژنوم ارگانیسم مورد مطالعه نمیباشد.
بسیاری از صفات مهم زراعی از قبیل کیفیت و میزان محصولدهی، تحمل به تنشهای محیطی و برخی از اشکال مقاومت در برابر بیماری ها چندژنی (Polygenes) بوده و بشدت تحت تأثیر محیط و اثرات متقابل ژنتیک × محیط قرار میگیرند (11و30). یکی از اهداف عمده بهنژادگران گیاهی مطالعه ژنتیکی صفات کمّی است که از طریق نقشهیابی مکانهای صفات کمّی (Quantitative trait loci (QTL)) (QTLs) صورت میگیرد (34). شناساییQTL های با اهمیت زراعی و استفاده از آنها در بهبود محصول به نقشهیابی از اینQTL ها در ژنوم گونههای زراعی با استفاده از نشانگرهای مولکولی نیازمند است (11و 30). نقشهیابی ژنتیکی میتواند عمدتاً به دو صورت انجام گیرد: 1- تجزیه پیوستگی که با استفاده از جمعیتهای آزمایشی یا جمعیتهای نقشهیابی"دو والدی (Biparental (BP))" انجام میشود 2- تجزیه ارتباطی که با استفاده از لاینهای متنوعی از جمعیتهای طبیعی یا مجموعههای ژرمپلاسم انجام میشود. در هر دو روش شناسایی ارتباطات بین فنوتیپها و نشانگرهای مولکولی مبتنی بر عدم تعادل پیوستگی ناشی از پیوستگی مکانهای ژنی است (12). در مقایسه دو روش وضوح تجزیه ارتباطی به علت رخداد نوترکیبیهای زیاد بالا است (24). هدف از این تحقیق بررسی تنوع ژنتیکی و ساختار جمعیت و همچنین تجزیه ارتباط برای صفات مورفولوژیک در فلفل با استفاده از نشانگرهای مولکولی ISSR می باشد. شناسایی نواحی ژنومی کنترلکننده صفات مورفولوژیک می تواند به اصلاح گران در پیشبرد برنامه های گزینش در طول برنامه های اصلاحی جهت معرفی ارقام با پتانسیل عملکرد بالا کمک اساسی نماید.
مواد و روشها
مواد گیاهی: تعداد 114 ژنوتیپ متعلق به 30 توده فلفل (جدول 1) در گلدانهای حاوی مخلوطی از خاک مزرعه و پیتماس کشت و در فضای گلخانه تحقیقاتی دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه چیده شدند. در طول فصل رشد بعد از هر 2 دور آبیاری با آب معمولی، یک دور آبیاری با آب حاوی نیم گرم در لیتر کود 20 -20 -20 (NPK) انجام شد و نهایتاً 14 صفت مورفولوژیک در گیاهان اندازهگیری شدند (جدول 2).
در مرحله 4 برگی، نمونه برگی از هر ژنوتیپ انتخاب و پروفیل مولکولی آنها با 11 آغازگر ISSR تهیه گردید. دی. ان. آ (Deoxyribonucleic acid) (DNA) ژنومی ژنوتیپها با روش ستیلتریمتیلآمونیومبروماید (Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)) استخراج گردید. جهت بررسی کمیت و کیفیت DNA ژنومی، به ترتیب از اسپکتروفتومتر و الکتروفورز ژل آگارز یک درصد استفاده گردید. آغازگرهای ISSR مورد استفاده شامل UBC809، UBC811، UBC812، UBC817، UBC823، UBC825، UBC826، UBC827، UBC834، UBC842 و UBC856 میباشند. چرخههای دمایی واکنشهای PCR عبارت بود از: یک چرخه شامل (°C)94 به مدت 4 دقیقه برای واسرشتسازی اولیه DNA، 36 چرخه شامل (°C)94 به مدت 30 ثانیه برای واسرشتسازی، دمای اختصاصی برای هریک از آغازگرها جهت اتصال آنها به DNA الگو به مدت 30 ثانیه و (°C)72 به مدت 2 دقیقه برای بسط آغازگر و در نهایت یک چرخه شامل (°C)72 به مدت 10 دقیقه برای بسط نهایی. در نهایت برای جداسازی محصولات PCRاز ژل اگارز 8/1درصد در بافر TBE 0.5x استفاده شد.
جدول 1- اطلاعات تودههای فلفل مورد مطالعه
میانگین سالانه آب و هوا |
بالاتر از سطح دریا (m) |
طول جغرافیایی |
عرض جغرافیایی |
اسامی |
کد |
||
بارش (mm) |
سرما (روز) |
دما (°C) |
|||||
188٫6 |
59 |
17٫1 |
981٫21 |
36-12 |
57-40 |
Sabzevar |
1 |
212 |
65 |
15٫7 |
981٫90 |
36-15 |
59-37 |
Khorasan |
2 |
341 |
120 |
10٫6 |
1344٫64 |
37-32 |
45-5 |
Urmia |
3 |
310 |
104 |
11٫6 |
1365٫76 |
38-5 |
46-16 |
Tabriz |
4 |
260 |
60 |
11٫5 |
1892٫09 |
34-41 |
50-0 |
Tafresh (Markazi) |
5 |
280 |
60-120 |
13٫8 |
1373٫81 |
33-54 |
50-27 |
Mahallat (Markazi) |
6 |
459 |
70 |
14٫6 |
1562٫02 |
33-53 |
48-46 |
Borujerd |
7 |
337 |
29 |
18 |
1508٫14 |
29-35 |
52-35 |
Shiraz |
8 |
500 |
30 |
16٫2 |
1572٫67 |
31-30 |
50-48 |
Lordegan 1 (Chaharmahal) |
9 |
600 |
45 |
10٫15 |
1165٫36 |
30-43 |
50-50 |
Boyer Ahamd |
10 |
500 |
30 |
16٫2 |
1572٫67 |
31-30 |
50-48 |
Lordegan 2 (Chaharmahal) |
11 |
560 |
83 |
11٫5 |
1829٫19 |
31-59 |
50-39 |
Chaharmahal |
12 |
196 |
0 |
12٫55 |
35 |
27-8 |
57-4 |
Minab (Hormozgan) |
13 |
500 |
109 |
12٫8 |
2538 |
35-57 |
47-8 |
Kurdistan 1 |
14 |
500 |
109 |
12٫8 |
2538 |
35- 57 |
47-8 |
Kurdistan 2 |
15 |
500 |
109 |
12٫8 |
2538 |
35-57 |
47-8 |
Kurdistan 3 |
16 |
350 |
120 |
8٫9 |
1278 |
37-33 |
45-15 |
Keshtiban (Urmia) |
17 |
274 |
105 |
26٫8 |
1070 |
37-28 |
47-18 |
Bojnord |
18 |
310 |
104 |
11٫9 |
1344 |
38-5 |
46-13 |
Gharamalik (Tabriz) |
19 |
250٫9 |
100 |
7٫20 |
1308 |
37-9 |
46-5 |
Ghale Jigh (Bonab) |
20 |
714 |
98 |
12٫2 |
1526٫52 |
35-59 |
45-52 |
Bane |
21 |
250 |
65 |
15٫6 |
1146٫01 |
35-6 |
59-6 |
Joghatay (Mashhad) |
22 |
441 |
5 |
22٫5 |
728٫95 |
35-21 |
50-47 |
Ghachsaran |
23 |
350 |
120 |
8٫9 |
1288٫98 |
37-38 |
45-7 |
Bash Ghala-Urmia |
24 |
322٫4 |
81 |
12٫5 |
1472٫29 |
38-6 |
46-15 |
Maragheh |
25 |
205 |
120 |
8٫9 |
1376٫03 |
34-32 |
45-2 |
Gharah Bagh (Urmia) |
26 |
294٫2 |
88 |
18٫13 |
1870٫65 |
37-42 |
48-27 |
Tuyserkan (Hamadan) |
27 |
350 |
120 |
8٫9 |
1298٫58 |
37-42 |
45-6 |
Nakhchivan (Urmia) |
28 |
256 |
150 |
12٫9 |
1304 |
37-42 |
45-4 |
Gejalar (Urmia) |
29 |
439 |
100 |
23٫2 |
528٫09 |
37-10 |
38-47 |
Urfa (Turkey) |
30 |
منبع اطلاعات: سازمان هواشناسی کشور، اداره کل فناوری اطلاعات و ارتباطات.
جدول 2- صفات مورفولوژیکی مطالعه شده در جمعیتهای فلفل
صفت |
کد |
صفت |
کد |
صفت |
کد |
تعداد شاخه |
NB |
دور بوته (mm) |
RS |
قطر میوه (cm) |
RF |
طول برگ (cm) |
LL |
تعداد میوه |
NF |
دور میوه (cm) |
FC |
عرض برگ (cm) |
LW |
وزن تک میوه (gr) |
SFW |
وزن گوشت (gr) |
PW |
طول دمبرگ (cm) |
PL |
وزن کل (gr) |
TFW |
وزن بذر کل (gr) |
TSW |
ارتفاع بوته (cm) |
PH |
طول میوه (cm) |
FL |
|
|
تجزیه و تحلیل دادهها: امتیازدهی نشانگرهای ISSR به صورت بارز با کد یک و صفر به ترتیب برای وجود و عدم وجود قطعه موردنظر انجام گرفت. تجزیه خوشهای ژنوتیپهای مورد مطالعه بر اساس دادههای مولکولی با روش Complete در نرمافزارNTSYSpc version 2.0 ، تجزیه واریانس مولکولی (Analysis of molecular variance (AMOVA)) و برآورد میزان تنوع ژنتیکی در درون و بین جمعیتها در نرمافزار GenAlex6.41 (28) و محاسبه تعداد و درصد مکانهای چندشکل در نرمافزار PopGene32 انجام گرفت. میزان اطلاعات چندشکلی (Polymorphic information content (PIC)) برای هر آغازگر در ژرم پلاسم مورد مطالعه با استفاده از رابطه محاسبه شد. در این فرمول P فراوانی i امین آلل و n تعداد آلل در مکان های ژنی می باشد. ساختار ژنتیکی جمعیت و دستهبندی دقیق افراد به زیرجمعیتهای مناسب و تشخیص ژنوتیپهای مختلط مبتنی بر مدل بیزین در نرمافزار Structure 2.3.4 (29) انجام گرفت. بین 1 تا 10 زیرجمعیت فرضی (K) در نظر گرفته شد و برای افزایش دقت، 5 تکرار برای هریک از زیرجمعیتهای فرضی لحاظ گردید. منحنی حداکثر درستنمایی با بکارگیری مدل ترکیبی Admixture و استقلال فراوانی آللها با تعداد دوره گرم کردن (Burn-in) 100000 و تعداد تکرار MCMC (Markov Chain Monte Carlo) 100000 برآورد شد. ماتریس Qst (برآورد ضرایب احتمال عضویت هر ژنوتیپ به هریک از زیر جمعیتها) پس از تعیین مقدار K بهینه محاسبه شد. تجزیه ارتباط بین دادههای ISSR و دادههای فنوتیپی با لحاظ کردن ماتریس Qst (ماتریس ساختار جمعیت) و K (ماتریس خویشاوندی افراد) به عنوان کوواریت در مدل خطی مخلوط (Mixed linear model=MLM) با استفاده از نرمافزار TASSEL3.0 (9) انجام شد. عدم تعادل لینکاژی (Linkage Disequilibrium) بین جفت نشانگرهای ISSR با نرمافزار TASSEL3.0 برآورد شد.
نتایج
از میان آغازگرهای ISSR مورد بررسی، آغازگر UBC856، بیشترین تعداد نشانگر (11 عدد) و آغازگر UBC842، کمترین تعداد نشانگر (3 عدد) را تکثیر کردند (جدول 3). کمترین محتوای اطلاعات چند شکل (PIC) برای آغازگر UBC825 با 8/33 درصد و بیشترین میزان برای آغازگر UBC811 با 45 درصد مشاهده شد (جدول 3). تجزیه واریانس مولکولی با استفاده از نشانگرهای ISSR نشان داد که 26 درصد تنوع محاسبه شده به تنوع بین گروهی (Among pops) و 74 درصد به تنوع درون گروهی (Within pops) مربوط میشود (جدول 4). در تجزیه خوشهای بر اساس دادههای ISSR تودههای فلفل مورد مطالعه در 3 گروه اصلی قرار گرفتند (شکل 1).
شکل 1- تجزیه خوشهای توده های فلفل براساس دادههای مولکولی ISSR به روش Complete در نرمافزار NTSYS.
جدول 3- محتوای اطلاعات چندشکل و درصد پلی مورفیسم آغازگرهای ISSR استفاده شده در مطالعه تنوع ژنتیکی توده های فلفل.
اسامی پرایمر |
توالی پرایمر |
PIC |
باندهای مونومرفیک |
باندهای پلی مورفیک |
UBC809 |
(AG)8G |
0٫416 |
2 |
7 |
UBC811 |
(GA)8C |
0٫450 |
4 |
4 |
UBC812 |
(GA)8A |
0٫382 |
3 |
5 |
UBC817 |
(CA)8A |
0٫434 |
2 |
6 |
UBC823 |
(TC)8C |
0٫399 |
2 |
7 |
UBC825 |
(AC)8T |
0٫338 |
3 |
6 |
UBC826 |
(AC)8C |
0٫382 |
2 |
7 |
UBC827 |
(AC)8G |
0٫363 |
2 |
7 |
UBC834 |
(AG)8CTT |
0٫341 |
4 |
6 |
UBC842 |
(GA)8CTT |
0٫446 |
1 |
2 |
UBC856 |
(AC)8CTA |
0٫387 |
10 |
1 |
کل |
|
|
35 |
58 |
میانگین |
|
394/0 |
18/3 |
27/5 |
انحراف معیار |
|
04/0 |
44/2 |
10/2 |
جدول 4- تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) با استفاده از نشانگرهای ISSR در جمعیتهای فلفل
منابع |
درجه آزادی |
مجموع مربعات |
میانگین مربعات |
واریانس برآورد شده |
درصد |
بین جمعیت ها |
29 |
672٫605 |
23٫193 |
3٫509 |
26% |
درون جمعیت ها |
84 |
830٫833 |
9٫891 |
9٫891 |
74% |
کل |
113 |
1503٫439 |
|
13٫400 |
100% |
تجزیه مؤثر ساختار جمعیت و گروهبندی دقیق افراد به زیرجمعیتها با استفاده از نشانگرهای تکثیر شده با 11 آغازگر ISSR در نرمافزار Structure انجام شد. باتوجه به این که حداکثر مقدار ΔKدر K=5 بدست آمد، به احتمال قوی ژنوتیپهای فلفل مورد بررسی دارای 5 زیر جمعیت میباشند (شکل 2). براساس بارپلات حاصل و با آستانه تصمیمگیری 70 درصد، از 114 ژنوتیپ مورد بررسی، 42/68 درصد افراد مورد مطالعه (78 فرد) بدون اختلاط و 57/31 درصد افراد (36 فرد) دارای ساختار مختلط میباشند. از 1653 جفت نشانگر ISSR [(58×57)/2=1635]، 04/7 درصد به طور معنیدار در سطح احتمال 1 درصد در عدم تعادل پیوستگی (LD) بودند (شکل 3).
شکل 2- گروهبندی ژنوتیپهای فلفل بر اساس دادههای نشانگرهای ISSR مبتنی بر مدل Bayesian (شکل سمت راست) در نرمافزار Structure. نمودار دو سویه برای تعیین تعداد مناسب زیر جمعیت (شکل سمت چپ) بر اساس دادههای نشانگرهای ISSR در نرمافزار Structure (K=5).
شکل 3- پلات عدم تعادل پیوستگی (LD plot) بین جفت نشانگرهای ISSR در تودههای فلفل مورد مطالعه. قسمت بالای قطر نشاندهنده میزان عدم تعادل پیوستگی با استفاده از آماره D' و قسمت پایین قطر، نشاندهنده سطوح معنیداری بین هر جفت نشانگرهای ISSR است.
در تجزیه ارتباطی، نشانگرهای تکثیر شده با 8 آغازگرآ ISSR مختلف با 13 صفت مورد بررسی پیوستگی نشان دادند که از این تعداد 2 مکان ژنی با تعداد شاخه، 2 مکان ژنی با عرض برگ، 2 مکان ژنی با طول دمبرگ، 2 مکان ژنی با ارتفاع بوته، 3 مکان ژنی با دور بوته، 4 مکان ژنی با تعداد میوه، 1 مکان ژنی با وزن تک میوه، 7 مکان ژنی با وزن کل میوه، 4 مکان ژنی با طول میوه، 4 مکان ژنی با قطر میوه، 3 مکان ژنی با دور میوه، 2 مکان ژنی با وزن گوشت و 4 مکان ژنی با وزن بذر کل پیوسته میباشند (جدول 5). دامنه ضرایب تبیین فنوتیپی (R2) بین 3/3 تا 2/15 متغییر بود.
جدول 5- شناسایی نشانگرهای ISSR پیوسته با صفات مورد مطالعه در فلفل براساس مدل MLMدر نرمافزار TASSEL.
صفت |
نشانگر |
F-marker |
P-value |
R2 |
صفت |
نشانگر |
F-marker |
P-value |
R2 |
NB |
UBC826 |
9٫26109 |
0٫0029 |
0٫0650 |
|
UBC834 |
4٫9260 |
0٫0287 |
0٫04649 |
|
UBC842 |
4٫6977 |
0٫0326 |
0٫03364 |
|
UBC812 |
4٫5288 |
0٫0360 |
0٫0440 |
LW |
UBC825 |
4٫7479 |
0٫0315 |
0٫0419 |
|
UBC825 |
4٫4654 |
0٫0371 |
0٫04131 |
|
UBC826 |
4٫5293 |
0٫0357 |
0٫0408 |
FL |
UBC825 |
4٫0986 |
0٫0456 |
0٫03890 |
PL |
UBC826 |
4٫1134 |
0٫0452 |
0٫0383 |
|
UBC834 |
6٫3605 |
0٫0132 |
0٫0611 |
|
UBC834 |
4٫8782 |
0٫0293 |
0٫0439 |
|
UBC834 |
4٫4873 |
0٫0366 |
0٫0431 |
PH |
UBC817 |
6٫7302 |
0٫0108 |
0٫0566 |
|
UBC812 |
4٫7038 |
0٫0326 |
0٫0480 |
|
UBC825 |
6٫5401 |
0٫0119 |
0٫0547 |
RF |
UBC812 |
15٫352 |
0٫0001 |
0٫1524 |
RS |
UBC826 |
5٫0220 |
0٫0272 |
0٫0430 |
|
UBC834 |
4٫4503 |
0٫037 |
0٫0411 |
|
UBC825 |
4٫0935 |
0٫0455 |
0٫0373 |
|
UBC817 |
4٫24981 |
0٫0419 |
0٫0399 |
|
UBC812 |
7٫07162 |
0٫0091 |
0٫0617 |
|
UBC834 |
5٫5772 |
0٫0201 |
0٫05154 |
NF |
UBC826 |
4٫8860 |
0٫0295 |
0٫0491 |
FC |
UBC825 |
5٫2467 |
0٫0241 |
0٫0499 |
|
UBC834 |
6٫8226 |
0٫0104 |
0٫0659 |
|
UBC834 |
5٫5455 |
0٫0205 |
0٫0550 |
|
UBC842 |
3٫9869 |
0٫0488 |
0٫0408 |
|
UBC812 |
8٫5377 |
0٫0043 |
0٫0886 |
|
UBC812 |
8٫2282 |
0٫0051 |
0٫0841 |
PW |
UBC834 |
5٫2007 |
0٫0247 |
0٫0516 |
SFW |
UBC834 |
5٫2188 |
0٫024 |
0٫049 |
|
UBC817 |
5٫5096 |
0٫020 |
0٫0542 |
TFW |
UBC826 |
4٫8443 |
0٫0302 |
0٫0469 |
TSW |
UBC826 |
4٫2089 |
0٫0430 |
0٫0441 |
|
UBC817 |
4٫7675 |
0٫0314 |
0٫0443 |
|
UBC834 |
4٫1089 |
0٫0453 |
0٫0401 |
|
UBC825 |
6٫1174 |
0٫015 |
0٫0565 |
|
UBC826 |
4٫5090 |
0٫0363 |
0٫0473 |
|
UBC827 |
5٫58714 |
0٫0202 |
0٫0603 |
|
UBC812 |
7٫1109 |
0٫0090 |
0٫0725 |
MLM: mixed liner model; R2: coefficient of determination; P-value: probability value.
بحث و نتیجه گیری
تنوع ژنتیکی فلفل: در مطالعات مختلفی از شاخص PIC و تجزیه واریانس مولکولی برای ارزیابی تنوع ژنتیکی استفاده شده است (1،4 و5). محاسبه PIC مبتنی بر تعداد نشانگرهای شناسایی شده در جمعیت مورد مطالعه بوده، مقادیر بالای PIC اشاره بر چندشکلی بالا در جایگاههای نشانگرها و کارایی بالای آنها در تمایز افراد جمعیت دارد (2). در این مطالعه متوسط PIC آغازگرهای مورد استفاده برابر 39/0 با انحراف معیار 04/0 بود. مقدار PIC 5 نشانگر از 11 نشانگر مورد استفاده بیشتر از متوسط بود. بنابراین در حدود نصف آغازگرهای مورد مطالعه قدرت تمایز بالاتری داشته که در تفکیک و تمایز افراد مهم است. در مطالعهی تنوع ژنتیکی جمعیتهای فلفل قرمز بلغارستان با نشانگرهای SSR، محتوای اطلاعات چندشکل نشانگرها بین 061/0 تا 639/0 با میانگین 349/0 گزارش شد (31). براساس تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) در تودههای فلفل با نشانگرهای ISSR، میزان تنوع در درون تودهها بسیار بیشتر از بین تودهها بود. تنوع کم بین تودههای فلفل حاکی از جریان ژنی کم در بین جمعیتها و همچنین وجود روش گزینشی متفاوت در هر جمعیت می باشد. در مطالعهی (25) بر روی فلفل (Capsicum annuum L.)، میزان تنوع در درون تودهها 74/84 درصد و بین تودهها 26/15 درصد گزارش گردید.
ارزیابی ساختار ژنتیکی فلفل: در گروه بندی براساس روش سلسله مراتبی Complete و مبتنی بر مدل بیزین، افراد مورد مطالعه به ترتیب در 3 و 5 گروه ژنتیکی قرار گرفتند که حاکی از وجود زیر ساختار در جمعیت فلفل مورد مطالعه می باشد که بایستی در تجزیه ارتباطی در نظر گرفته شود. در مطالعهی (10) بر روی فلفل با نشانگرهای AFLP، تودهها در دو خوشه اصلی قرارگرفتند. در مطالعهی دیگر (37) بر روی توده های فلفل چین، افراد جمعیت مورد مطالعه در نرمافزار Structure به سه گروه ژنتیکی تفکیک شدند. در مطالعهی (25) بر روی ارقام فلفل با نشانگرهای SSR، 5 زیر جمعیت (K=5) با نرمافزار Structure شناسایی شد.
تجزیه ارتباطی: پایه و اساس تجزیه ارتباطی عدم تعادل پیوستگی (Linkage disequilibrium (LD)) می باشد که نشاندهنده همبستگی غیرتصادفی آللها در مکانهای ژنتیکی مختلف بر روی یک تک کروموزوم (گروه پیوستگی) یا کروموزوم های مختلف میباشد (7 و 21). گستره LD در گیاهان از صدها جفت باز تا صدها جفت کیلوباز بسته به گونه و نوع جمعیت مورد بررسی دیده شده است (22و 26). چندین عامل نقش مهمی در ایجاد بلوکهای هاپلوتایپ LD در ژنوم دارند (27و 32) که از آنها میتوان به نوترکیبی، انتخاب، جهش و مهاجرت اشاره کرد (14). از میان عوامل، جهش و نوترکیبی عوامل کلیدی تأثیرگذار بر LD هستند. نقشهیابیLD به واسطه وقوع نوترکیبی اجدادی (Ancestral recombination) که در جمعیت اتفاق میافتد تمام آللهای موجود در جمعیت را در شناسایی ارتباط معنیدار صفت- نشانگر در نظر میگیرد (15). در مطالعهی (25) بر روی ارقام فلفل با نشانگرهای SSR، طیف وسیعی از عدم تعادل پیوستگی بین مکانها در طول ژنوم شناسایی گردید که استفاده از تجزیه ارتباطی برای شناسایی نشانگرهای مرتبط را امکانپذیر مینماید.
در اصلاح نبات مبتنی بر گزینش به کمک نشانگر، تنها همبستگی غیرتصادفی آللها که ناشی از پیوستگی فیزیکی مکان های ژنی است ارزش کاربردی داشته و عوامل دیگر از قبیل وجود ساختار در جمعیت و خویشاوندی نسبی افراد هرچند ممکن است باعث ایجاد همبستگی غیرتصادفی آللها یا LD شوند ولی از دید اصلاحی ارزشی ندارد و حتی وجود چنین عواملی منجر به سطح بالایی از نتایج مثبت دروغین در تجزیه ارتباطی میشوند (36) و در نتیجه قابلیت اعتماد به نتایج بدست آمده کاهش مییابد. منظور از نتایج مثبت دروغین، نشانگرهای غیرپیوستهای است که به اشتباه به عنوان نشانگر پیوسته با ژن های کنترل صفات شناسایی می شوند؛ به عبارت دیگر پیوستگی کاذب نشانگر با ژن کنترل کننده صفت است. لذا لازم است اثر چنین عواملی کنترل شوند. مدل مخلوط با در نظر گرفتن ماتریس ساختار جمعیت (Q) و ماتریس خویشاوندی نسبی (K) به عنوان کوواریت در پروسه تجزیه ارتباطی یک سیستم قوی و قابل اعتماد جهت شناسایی QTL یا نشانگرهای پیوسته با ژن های کنترل کننده صفات فراهم مینماید (35و 38).
در بررسی حاضر، نشانگرهای مولکولی مختلفی برای صفات مورد شناسایی شد. تعدادی از نشانگرهای شناسایی شده برای برخی صفات مشترک بود که عمدتاً نتیجه اثرات پلیوتروپی و یا پیوستگی نواحی ژنومی کنترلکننده صفات است (18). نشانگرهای تکثیر شده با آغازگر UBC834 بیشترین تعداد پیوستگی را با صفات مورد بررسی نشان داد. نشانگرهای مشترک در صورت تأیید با آزمایشهای تکمیلی، میتوانند به نشانگرهای اختصاصی ((SCAR) Sequence-characterized amplified region) تبدیل و برای غربال جمعیتها و انتخاب به کمک نشانگر (MAS) مورد استفاده قرار گیرند. در مطالعهی (25) بر روی ارقام فلفل با نشانگرهای SSR در تجزیه ارتباطی، 8 نشانگر از هفت کروموزوم مختلف به طور معنیداری با وزن میوه ارتباط داشتند و در کل 15 درصد از تغییرات صفت را توجیه مینمودند. در مطالعهی (3)، از نشانگرهای ISSR برای تجزیه ارتباط در یونجه استفاده شد و نشانگر ISSR14-4 با 8 صفت مختلف پیوسته بود. در سایر محصولات مانند ذرت (8)، گندم (20)، جو (33) و توتون (6) نیز از نشانگرهای ISSR برای تجزیه QTL استفاده شده است.
در پژوهش حاضر کمترین محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC) برای آغازگر UBC825 با 8/33 درصد و بیشترین میزان برای آغازگر UBC811 با 45 درصد مشاهده شد. در ارزیابی ساختار جمعیت ژنوتیپهای فلفل با نشانگرهای ISSR در نرمافزار Structure، افراد در 5 زیر جمعیت قرارگرفتند. در تجزیه ارتباط بین دادههای مولکولی و صفات فنوتیپی مورد مطالعه با لحاظ کردن ماتریسهای Qst (ماتریس ساختار جمعیت) و K (ماتریس خویشاوندی افراد) در مدل MLM به عنوان کوواریت، نشانگرهای تکثیر شده با 8 آغازگر ISSR با 13 صفت مورد بررسی پیوستگی نشان دادند. این مطالعه پتانسیل نشانگر مولکولی ISSR در تجزیه ارتباطی صفات کمّی در تودههای فلفل را نشان میدهد. چندین نشانگر مولکولی به طور قابل توجهی با بیش از یک صفت فنوتیپی ارتباط داشتند، که بیانگر حضور احتمالی اثرات پلیوتروپیک یا پیوستگی مکانهای کنترلکننده صفات میباشد. نتایج حاصل از این مطالعه در صورت تأیید و تبدیل نشانگرهای شناسایی شده به نشانگرهای هم بارز SCAR میتوانند در گزینش به کمک نشانگر برای صفات پیچیده در C. annuum مفید باشند. همچنین نشانگرهای با پیوستگی قوی میتوانند برای اشباع نمودن نقشههای پیوستگی استفاده شوند.
سپاسگزاری
از دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی و همچنین پژوهشکده زیست فناوری دانشگاه ارومیه به خاطر فراهمنمودن امکانات لازم برای انجام پژوهش و همچنین از معاونت پژوهش و فناوری دانشگاه به خاطر تامین منابع مالی پژوهش تشکر و قدردانی می شود.