بررسی تیمارهای مختلف ضد‌عفونی بر روی ریزنمونه‌های قره‌قاط (Vaccinium arctostaphylos L.)

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 عضو هیات علمی/ دانشگاه محقق اردبیلی

2 گروه علوم باغبانی دانشگاه محقق اردبیلی

3 استادیار موسسه تحقیقات علوم باغبانی

چکیده

گیاه کرن‌بری با نام محلی قره‌قاط و نام علمی (Vaccinium arctostaphylos L.) ازخانواده‌ی اریکاسه می‌باشد. میوه گیاه قره‌قاط سته و کروی شکل بوده و به دلیل دارا بودن ترکیبات آنتوسیانینی، فلاونوئیدی، ضدسرطان و ضدمیکروبی از ارزش تجاری بالایی برخوردار است. این تحقیق به منظور بررسی روش‌های ضدعفونی ریزنمونه‌های گیاه قره‌قاط در قالب سه آزمایش مختلف صورت گرفت. در آزمایش اول ضدعفونی ریزنمونه‌های پنج اکوتیپ مختلف که شامل اکوتیپ‌های حوران، سوها، خلخال، لیسار و پره‌سر مورد بررسی قرار گرفتند. در آزمایش دوم تأثیر تغییرpH محلول ضدعفونی و آزمایش سوم به بررسی تأثیر تتراسایکلین و نیترات نقره در ضدعفونی ریزنمونه‌های قره‌قاط پرداخت. در آزمایش اول اکوتیپ لیسار به‌عنوان بهترین اکوتیپ در ریزنمونه‌های سالم، در آزمایش دوم 9=pH بهترین عملکرد، و در آزمایش سوم نیترات نقره بیشترین میزان ریزنمونه‌های سالم را داشت. بطور کلی عوامل متعددی در ضدعفونی ریزنمونه‌های گیاهی تاثیر دارند. نتایج این آزمایشات نشان داد که در ضدعفونی ریزنمونه‌های گیاه قره قاط، نوع اکوتیپ، مواد ضدعفونی کننده و pH نقش اساسی را دارند.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Investigation of different disinfection treatments on the explants of Cranberry (Vaccinium arctostaphylos L.)

نویسندگان [English]

  • Alireza Ghanbari 1
  • Behnaz Rezazadeh 2
  • Younes Pourberami Hir 2
  • Roohallah Haghjooyan 3

1 Dept. of Horticulture, University of Mohaghegh Ardabili

2 Dept. of Horticulture, University of Mohaghegh Ardabili

3 Horticultural Sciences Research institute

چکیده [English]

Cranberry (V. arctostaphylos L.) which locally named Shihard is belonging to Ericaceae family. The fruit is spherical and spicy and it has high commercial value because of the presence of the anthocyanin, flavonoids, anticancer and antimicrobial compounds. This research was conducted to investigate the disinfection methods of Cranberry in three different tests. The first experiment was to evaluate the disinfection of the explant of five different ecotypes including; Horan, Soha, Khalkhal, Lisar and Paresar. The second experiment examines the effect of changing the pH of the disinfectant solution and the third experiment investigated the effects of tetracycline and silver nitrate on disinfection of cranberry explants. In the first experiment, the Lisar ecotype was considered as the best ecotype for healthy samples, in the second experiment, pH = 9 was the best, and in the third experiment, silver nitrate had the highest percentage of healthy sputum samples. In general, many factors effects on disinfection of explants. The results of these experiments showed that type of ecotype, disinfectant materials and pH effects on disinfection of cranberry explants.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Ecotype
  • Flavonoid
  • Tetracycline
  • Silver nitrate

بررسی تیمارهای مختلف ضد­عفونی بر روی ریزنمونه­های قره­قاط

بهناز رضازاده1، علیرضا قنبری1*، یونس پور بیرامی­هیر1 و روح­اله حق جویان2

1 ایران، اردبیل، دانشگاه محقق اردبیلی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه علوم باغبانی

2 ایران، کرج، موسسه تحقیقات علوم باغبانی کرج

تاریخ دریافت: 7/7/97                  تاریخ پذیرش:28/1/98

چکیده

گیاه کرن­بری با نام محلی قره­قاط ازخانواده­ی اریکاسه (یا تیره قره­قاط) می­باشد. میوه گیاه قره­قاط سته و کروی شکل بوده و به دلیل دارا بودن ترکیبات آنتوسیانینی، فلاونوئیدی، ضدسرطان و ضد میکروبی از ارزش تجاری بالایی برخوردار است. این تحقیق به منظور بررسی روش­های ضدعفونی ریزنمونه­های گیاه قره­قاط در قالب سه آزمایش مختلف صورت گرفت. در آزمایش اول ضدعفونی ریزنمونه­های پنج اکوتیپ مختلف حوران، سوها، خلخال (استان اردبیل)، و لیسار و پره­سر (استان گیلان) طبق جدول 1 و آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح تصادفی مورد بررسی قرارگرفتند. در آزمایش دوم تأثیر تغییر pH محلول ضدعفونی شامل (5/6، 9، 5/11و14)، آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی و آزمایش سوم به بررسی تأثیر تتراسایکلین و نیترات نقره در ضدعفونی ریزنمونه­های قره­قاط، نیترات­نقره 50 میلی­گرم بر لیتر، تتراسایکلین 50 میلی­گرم بر لیتر و ترکیبی از تتراسایکلین و نیترات­نقره هرکدام به غلظت 50 میلی­گرم بر لیتر و آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی انجام شد. در آزمایش اول اکوتیپ لیسار بعنوان بهترین اکوتیپ در ریزنمونه­های سالم، در آزمایش دوم 9=pH بهترین عملکرد در ریزنمونه­های سالم، و در آزمایش سوم نیترات نقره بیشترین میزان ریزنمونه­های سالم را داشت.

واژه های کلیدی: آنتوسیانین،اکوتیپ، تتراسایکلین، فلاونوئید، نیترات نقره

* نویسنده مسئول، تلفن:  09122479233، پست الکترونیکی: [email protected]

مقدمه

 

آلودگی­های قارچی و باکتریایی در زمره شدید­ترین آلودگی­های محیط­کشت هستند و یک چالش اصلی برای انجام کشت درون­ شیشه­ای و تکثیر گیاهان به ویژه گیاهان چوبی با استفاده از کشت ­بافت و اندام می­باشد. این موجودات به ­سرعت و زودتر از مواد گیاهی رشد یافته و شرایط تعریف شده محیط­ کشت را تغییر داده و باعث رشد ضعیف یا مرگ ریزنمونه­ها می­شوند (18). با وجود گستردگی گونه­ها و پراکنش وسیع تیره قره­قاط و جنس وکسینیوم در جهان تنها گونه V. arctostaphylosv L از این جنس در ایران رویش دارند. گسترش طبیعی این گونه در دنیا محدود به مناطق خاص قفقاز و ایران بوده و این مناطق یکی از بهترین رویشگاه­های آن بشمار می­رود از جمله گونه­های مهم این جنس می­توان به V. arctostaphylos اشاره کرد که دراکثرنواحی جنگلی آسیای صغیر، قفقاز و بخشی­هایی از اروپا یافت می­شود. خاستگاه اصلی V. arctostaphylos مربوط به راشستان جنگل­های شمال ایران می­باشد که شامل اکوتیپ­های قره­قاط اردبیلی و کلیبری می­باشد. اکوتیپ اردبیلی آن در ارتفاعات استان اردبیل، تالش، اسالم و کلاردشت گسترش یافته است (1).

زمانی که از ریزنمونه­های رشد یافته در شرایط طبیعی برای کشت درون­شیشه­ای استفاده شود کنترل آلودگی آن بویژه آلودگی­های میکروبی داخلی اهمیت بسیاری پیدا می­کند. بطوری که اگر برای مقابله با این بیماری­ها راهکار­های مناسبی بکار گرفته نشود، بصورت آلودگی­های قارچی و باکتریایی بروز پیدا کرده و کل ریزنمونه­ها را از بین می­برد (23). منشأ آلودگی می­تواند سایر گیاهان و یا عوامل مربوط به شرایط محیطی باشد که بروز آن به نوع گونه، سن و منشأ ریزنمونه در شرایط آب و هوایی وابستگی زیادی دارد. از جمله مواردی که باعث کاهش میزان آلودگی ریزنمونه­های رشد یافته در شرایط آب و هوایی می­شود، انتخاب زمان مناسب برای تهیه ریزنمونه است که می­تواند میزان آلودگی را 3 الی 15 درصد کاهش دهد که در مقیاس تجاری و علمی بسیار اهمیت دارد. هر چند استفاده از آنتی بیوتیک­ها و آنتی میکروب­ها در کنترل آلودگی گیاهان چوبی استفاده می­شود ولی استفاده بیش از حد از آنتی­بیوتیک­ها و آنتی­میکروب­ها برای جلوگیری از بیماری، منجر به کاهش رشد گیاه و تقویت اندام­های سخت درون گیاهی می­شود (15). هم­چنین، یکی از مشکلاتی که در کشت­درون­شیشه­ای گیاهان جنگلی بخصوص در گیاهان چوبی مشاهده می­گردد عدم یکنواختی پاسخ به شرایط درون­شیشه­ای نسبت به زمان برداشت ریزنمونه می­باشد، که باتوجه به ساختار فیزیولوژیکی متفاوت در طی فصول مختلف سال این امر بدیهی است (5). در رابطه با استفاده از الکل 70 درصد عنوان شده است که باعث می شود لایه یمومی سطح کوتیکول حذف شده و محلول ضدعفونی کننده اصلی قدرت نفوذ و تأثیر بهتری بر بافت نمونه­ها داشته باشد (14). هیپوکلریت­سدیم جزء مواد ضدعفونی کننده مؤثری است که در اکثر روش­های ضدعفونی مورد استفاده قرارگرفته است. استفاده از این ترکیب بدلیل سمیت کمتر در مقایسه با کلرید­جیوه و نانو ذرات­نقره از کارآیی بالایی برخوردار است و در غلظت­های مختلفی و در انواع آزمایش­ها مورد استفاده قرارگرفته است. مطالعات متعدد نشان داده است که این ترکیب کمترین تأثیر را روی رشد ریزنمونه­ها دارد. سمیت کمتر این ترکیب باعث گردیده که از آن برای ضدعفونی بذر نیز استفاده شود. بذرهای گیاه H. niger L پس از ضدعفونی با اتانول 96 درصد به مدت 30 ثانیه و سپس محلول هیپوکلریت سدیم حاوی v/v% 1) کلرفعال( به همراه دو قطره توئین 80 به مدت 5 دقیقه، با آب مقطراستریل شستشو داده شدند (2). در کشت­بافت بسته به نوع ریزنمونه، چوبی یا علفی بودن ریزنمونه و زمان برداشت آن­ها از غلظت­های یک الی 5 درصد استفاده می­شود (15). روش­های مختلف ضدعفونی و استفاده از آنتی­بیوتیک­ها برای کنترل آلودگی در محیط درون­شیشه­ای مورد استفاده و توصیه شده است، ولی برخی از این­ها بهره­وری پایینی و برخی هم اثرات سمی زیادی روی ریزنمونه­ها دارند. ترکیب آنتی­بیوتیک استرپتومایسین با تیامین و جنتامایسین در محیط کشت، مانع از رشد باکتری­های داخلی ریزنمونه­های مرکبات و دیگر درختان مثمر گزارش شده است (23). کنترل آلودگی باکتریایی در ریز نمونه­های زیتون با استفاده از آنتی­بیوتیک سفوتاکسیم به­میزان 100 میلی­گرم در لیتر میسر گردید (6). ضد عفونی ریزنمونه­های ریزوم و نوک شاخساره گیاه موز برای کشت درون­شیشه­ای توسط آنتی­بیوتیک جنتامایسین، آلودگی باکتریایی درونی را حذف کرده، بهترین نتیجه با تیمار 160 میلی­گرم در لیتر آنتی­بیوتیک جنتامایسین در مدت یک ساعت و چهل دقیقه گزارش گردید (13). استفاده از کلرید جیوه با غلظت 1/0 درصد به همراه چند قطره تویین20 به مدت 4 دقیقه، به نتایج قابل توجهی در زمینه­ی ضدعفونی زغال اخته گونه ی Macrocarpa بدست آمد (12). سرشاخه­های پایه رویشی پسته قزوینی (“Ghazvini” .P. vera, cv) قطعات ساقه دارای 2-1 جوانه حدود 2 سـاعت در زیرآب جاری شستـشو، سـپس بـا الکـل 96 درصد بـه مـدت 4-3 ثانیـه و کلریـد جیـوه 5 درصد به مـدت 4-3 دقیقـه ضـدعفونی و در نهایت 3 مرتبه با آب مقطـراسـتریل شستـشو شدند (7). نانو ذرات­نقره مواد سمی هستند که از قابلیت بالایی برای از بین بردن میکروارگانیسم­ها، بعنوان مثال، قارچ و باکتری­ها برخوردار هستند. اثرات مضر نانو ذرات­نقره در بیش از 600 میکروارگانیسم گزارش شده است. این قابلیت نانو ذرات­نقره بعلت ذرات کوچک آزاد نقره می­باشد. این ذرات کوچک پس نه تنها قادر به از بین بردن باکتری­ها و قارچ­ها می­باشند، بلکه ویروس­ها را نیز نابود می­کنند (26). بنومیل در حالت محلول دو ترکیب مهم methyl-2-benzimidazolacarbanat  و butyl isocyanate را تولید می­کند که روی مسیر تنفسی و انرژی­زایی سلول­های قارچ اثر می­گذارد. استفاده از غلظت­های بالا برای ضدعفونی ریزنمونه­ها می­تواند روی ریزنمونه نیز اثر منفی بگذارد (21). استفاده از پیش تیمار بنومیل به دلیل خاصیت سیستماتیکی امکان کاهش درصد آلودگی را داشته ولی این امر بستگی زیادی به غلظت بنومیل درون محیط کشت و مدت زمان غوطه­وری ریزنمونه­ها در آن دارد به گونه­ای که در غلظت بالا و مدت زمان طولانی­تر به همان نسبت که میزان آلودگی کاهش می­یابد، میزان زنده­مانی و رشد ریزنمونه­ها به تأخیر افتاده و یا از بین می­رود (19). در این آزمایش برای اولین بار از نانونقره درجهت ضدعفونی یک گونه Vaccinium استفاده شده است و هیچ­گونه گزارش قبلی حتی روی گونه­های مشابه نیز وجود ندارد. این تحقیق به منظور بررسی تأثیر روش­های مختلف ضدعفونی برای حذف آلودگی­های میکروبی در ارزیابی استقرار و پرآوری ریزشاخساره­های گیاه V. arctostaphylos. انجام گردید.

مواد و روشها

آزمایش اول: ضدعفونی ریزنمونه­ها با استفاده از هیپوکلریت­سدیم، کلرید­جیوه و نانو نقره

ریزنمونه­های قره­قاط گونه­ی V. arctostaphylos تهیه شده، از پنج منطقه مختلف شامل سه منطقه سوها (اکوتیپ سوها)، خلخال (اکوتیپ خلخال) و حوران (اکوتیپ حوران) واقع در استان اردبیل و دو منطقه پره­سر (اکوتیپ پره­سر) و لیسار (اکوتیپ لیسار) واقع در استان گیلان جمع­آوری شده و به آزمایشگاه کشت­بافت گروه علوم باغبانی دانشگاه محقق اردبیلی انتقال یافت. از شاخه­های جمع­آوری شده، ریزنمونه­های حاوی یک تا دو جوانه شامل جوانه­های جانبی و انتهایی تهیه شد و بمدت یک ساعت در زیر آب­جاری قرار گرفته و سپس ریزنمونه­ها تحت تیمارهای مختلف ضدعفونی به شرح جدول 1 قرار داده شدند. از محیط­کشت پایه­ی WPM حاوی یک میلی­گرم­بر لیتر BAP همراه 1/0 میلی­گرم­ بر لیتر IBA و 3 درصد ساکارز و 7/0 درصد آگار جهت کشت ریزنمونه­های استریل شده استفاده گردید. pH محیط کشت روی 5/5 تنظیم و به مدت 20 دقیقه تحت دمای 121 درجه سانتی­گراد اتوکلاو گردید. ریزنمونه­ها در شیشه­های مربایی قابل اتوکلاو حاوی 25 سی­سی محیط تهیه شده، کشت گردیدند به­طوری­که در هر شیشه­ی آزمایش چهار ریزنمونه قرار داده شد. ریزنمونه­ها بعد از کشت در محیط­ کشت مذکور در اتاق رشد تحت شرایط محیطی با دمای c°2±25 و 8/16ساعت تاریکی/روشنایی با لامپ­های سرد- سفید (mol m-1S-1µ5/65) نگهداری شدند. شمارش تعداد ریزنمونه­های سالم و آلوده پس از چهار هفته انجام گرفت. آزمایش به صورت فاکتوریل بر پایه طرح تصادفی با 4 تکرار انجام گرفت.

آزمایش دوم: تأثیرپیش­تیمار با بنومیل و ضدعفونی با تغییر pH هیپوکلریت­سدیم بر میزان آلودگی ریزنمونه­های قره­قاط

ابتدا آزمایشی برای به دست آوردن مناسب­ترین pH برای هیپوکلریت سدیم طراحی گردید به این ترتیب که 4 سطح pH شامل (5/6، 9، 5/11و14) و هر سطح از pH در چهار تکرار همرا با تأثیر پیش تیمار ریزنمونه­ها با 3 گرم بر لیتر بنومیل به مدت 3 ساعت مورد ارزیابی قرارگرفت. تغییر pH با استفاده از اسید استیک و سدیم دو دسیل سولفات (Sodium dodecyl sulfate) صورت گرفت. نحوه ضدعفونی ریزنمونه­ها به شرح ذیل است.

ریزنمونه­های قره­قاط بحالت معمول ابتدا با محلول ظرف­شویی به مدت 30 دقیقه شست­و­شو داده شد و زیر آب جاری به مدت یک ساعت آبکشی شدند. سپس در محلول 3 گرم بر لیتر بنومیل به مدت 3 ساعت غوطه­ور شدند. بعد از آن ریزنمونه­ها با اتانول 70 درصد به مدت 50 ثانیه و هیپوکلریت­سدیم با pH (5/6، 9، 5/11و14) و حاوی 20Tween به مدت 15 دقیقه، تیمار شد. پس از سه بار آبکشی ریز نمونه­ها با آب مقطر استریل روی محیط­کشت 1/2 MS در ترکیب با 1 میلی­گرم بر لیتر BA همراه با 2/0 میلی گرم بر لیتر IAA که از طریق اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتی­گراد و فشار یک اتمسفر بمدت 15 دقیقه ضدعفونی شده بودند قرارگرفت.

باتوجه به نتایج حاصل از این آزمایش، که برای بررسی نحوه ضدعفونی ریزنمونه­ها در مرحله استقرار استفاده گردید بعد از این مرحله باتوجه به نتایج این آزمایش اولیه آزمایشی دیگر طراحی شد با هدف حفظ ریزنمونه­های مادری و تنها از سطح (9pH=) برای بدست آوردن ریزنمونه برای مرحله پرآوری استفاده شد.

آزمایش اولیه بررسی 4 سطح pH در قالب طرح کاملاً تصادفی با چهار تکرار (پنج ریزنمونه در هر تکرار) انجام گرفت. تعداد ریزنمونه­های با آلودگی قارچی و باکتریایی و تعداد ریزنمونه­های زنده و رشد کرده حدود 28 روز پس از کشت باتوجه به آلودگی­های مشخص شده که در تصاویر مربوط به این تیمار نیز مشخص می­باشد ثبت گردید.

آزمایش سوم: تأثیر نیترات­نقره و تتراسایکلین بعنوان پیش تیمار و روش استریل در ضدعفونی ریز­نمونه­های قره­قاط

در ابتدا به منظور تشخیص عوامل آلودگی نمونه­هایی به آزمایشگاه گروه گیاهپزشکی انتقال داده شد با توجه به نتایج آزمون­های تشخیصی (با استفاده از میکروسکوپ )، با توجه به علائم در زیر میکروسکوپ، باکتری تشخیص داده شد و بعد بصورت کشت­باکتری ریزنمونه­ها و استفاده از دیسک­های آنتی باکتریال مختلف که شامل جنتامایسین، استرپتومایسین، کوآموکسی­کلاو، تتراسایکلین، سفالکسین و پنی­سیلین صورت گرفت. بدین ترتیب که ابتدا ریزنمونه آلوده در زیر هود میکروبیولوژی خرد شده و در داخل ظروف پتری سترون ستریل به همراه آب مقطر اتوکلاو شده به مدت یک ساعت قرارگرفت سپس با استفاده از لوپ از این سوسپانسیون درون محیط­کشت باکتری (Nutrient Agar) کشت داده شد باکتری رشد یافته در این محیط بعد از 4 روز به محیط­کشت (Nutrient Agar) و بصورت خالص سازی انتقال داده شد. سپس مرحله افزودن دیسک­های آنتی باکتریال بعد از 4 روز صورت گرفت. بعد از یک هفته چرخه رشدی باکتری در ظروف پتری حاوی تتراسایکلین متوقف گردید (شکل 1).

تأثیر پیش تیمار نیترات­نقره 50 میلی­گرم در لیتر، تتراسایکلین 50 میلی­گرم بر لیتر و ترکیبی از تتراسایکلین و نیترات­نقره هر کدام به غلظت 50 میلی­گرم بر لیتر بمدت 24ساعت و ریز نمونه­های شاهد به همین مدت و در آب خالی مورد ارزیابی قرارگرفت. در این روش میزان سوختگی در ریزنمونه نسبت به زمانی که از این ترکیبات به صورت مستقیم در ضدعفونی ریزنمونه­ها استفاده می شد به طور چشم­گیری کاهش یافت. نحوه ضدعفونی ریزنمونه­ها به شرح زیر است: ابتدا ریزنمونه­ها درون آب دیونیزه با قیچی باغبانی برش داده شد و درون ترکیب تتراسایکلین، نیترات­نقره و ترکیب تتراسایکلین و نیترات­نقره به مدت 24 ساعت قرارگرفت. ریزنمونه­ها بمدت 30 دقیقه با محلول ظرف­شویی شست­و­شو داده شد. سپس بمدت یک ساعت زیر آب آبکشی شدند. در مرحله بعد ریزنمونه­های هر تیمار در محلول 5/1گرم بر لیتر بنومیل بمدت 30 دقیقه غوطه­ور شدند. بعد از این مرحله ریزنمونه­ها با اتانول 70 درصد به مدت 50 ثانیه استریل شده و یک بار بمدت یک دقیقه آبکشی گردید و سپس با هیپوکلریت ­سدیم 5/2 درصد حاوی Tween20 درصد به­مدت 15 دقیقه، تیمار شده و پس از سه بار آبکشی با آب مقطر استریل روی محیط­کشت قرارگرفتند. آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی با 8 تکرار (5 ریزنمونه در هر تکرار) در تیمار انجام گرفت. تعداد ریزنمونه­های دارای آلودگی قارچی و باکتریایی و تعداد ریزنمونه­های رشد کرده حدود 28 روز پس از کشت ثبت گردید.

نتایج

آزمایش اول

نتایج حاصل از تجزیه واریانس داده­ها (جدول 2) نشان داد که اختلاف معنی­داری بین اکوتیپ­ها از نظر درصد ریزنمونه های سالم، آلوده و سوخته وجود دارد. همچنین نتایج مقایسه میانگین­ها با استفاده از آزمون دانکن نشان داد که درصد ریزنمونه­های سالم در اکوتیپ لیسار بیشترین میزان بود و بعد از آن اکوتیپ خلخال، حوران، سوها و پره سر قرار داشتند.

همچنین براساس نتایج حاصل از تجزیه واریانس، در سطح احتمال 1 درصد اختلاف معنی­داری بین تیمارهای ضدعفونی مشاهده گردید. بطوری­که آزمون مقایسه میانگین دانکن نشان داد تیمار T7 (الکل 70 درصد + نانونقره 100 میلی­گرم بر لیتر) با 60 درصد ریز نمونه سالم عملکرد بهتری در مقایسه با سایر تیمارها داشتد. در این آزمایش نتایج حاصل از تجزیه واریانس نشان داد تیمارT5 (الکل 70 درصد + کلرید جیوه 2/0درصد + هیپوکلریت 20 درصد حجمی) بیشترین میزان آلودگی 5/12 درصد و تیمار T6 (الکل 70 درصد +کلرید جیوه 2/0 درصد+ نانونقره 100 میلی­گرم در لیتر) بیشترین میزان ریزنمونه­های سوخته با 75/48 درصد را داشتند.

آزمایش دوم

نتایج حاصل از تجزیه واریانس (جدول 3) نشان داد که اختلاف معنی­داری در سطح احتمال 1 درصد بین تیمارهای مختلف (سطح pH) در ضدعفونی ریز نمونه­های قره­قاط وجود دارد بطوری که (جدول 4) تیمار pH2 (9pH=) با 80 درصد ریز نمونه سالم بهترین عملکرد را در ریزنمونه­های سالم، تیمار pH4 (14=pH) بعنوان شاهد با 45 درصد ریزنمونه آلوده بیشترین میزان ریزنمونه­ها با آلودگی باکتری را دارا بودند و تیمار (5/6=pH) با 75 درصد ریزنمونه سوخته بیشترین درصد ریزنمونه­های سوخته را داشتند در آلودگی قارچی تفاوت معنی­داری در بین تیمارها مشاهده نشد.

آزمایش سوم

نتایج حاصل از تجزیه واریانس (جدول 5) نشان داد که اختلاف معنی­داری در بین تیمارهای مختلف (نیترات­نقره، تتراسایکلین و تتراسایکلین + نیترات­نقره) وجود دارد بطوری­که بیشترین تعداد ریز نمونه­های سالم مربوط به تیمار نیترات­نقره و بیشترین تعداد ریزنمونه­های دارای آلودگی باکتریایی مربوط به شاهد بود و تیمار (تتراسایکلین + نیترات­نقره) دارای بیشترین آلودگی قارچی در ریزنمونه­ها بود.

 

جدول 1- تیمارهای مورد استفاده در ضدعفونی ریزنمونه­های قره­قاط در پنج منطقه مختلف (حوران، سوها، خلخال، لیسار و پره­سر)

کدتیمار

موادضدعفونی کننده

T1

الکل 70 درصد +کلرید جیوه 2/0 درصد+هیپوکلریت 5/1 درصد + نانونقره 100 میلی­گرم در لیتر

T2

الکل 70 درصد +هیپوکلریت 5/1 درصد + نانونقره 100 میلی گرم در لیتر

T3

الکل 70 درصد +کلرید جیوه 2/0 درصد+ هیپوکلریت 5/1 درصد + نانونقره 100 میلی­گرم در لیتر

T4

الکل 70 درصد +کلرید جیوه 2/0 درصد+ هیپوکلریت 5/1 درصد + نانونقره 100 میلی­گرم در لیتر

T5

الکل 70 درصد +کلرید جیوه 2/0 درصد+ هیپوکلریت5/1 درصد

T6

الکل 70 درصد +کلرید جیوه 2/0 درصد+ نانونقره 100 میلی­گرم در لیتر

T7

الکل 70 درصد + نانونقره 100 میلی­گرم در لیتر

جدول 2-تجزیه واریانس تیمارها و مناطق مختلف بر ریزنمونه­های قره­قاط

میانگین مربعات

 

سوخته

آلوده

سالم

درجه­آزادی

منابع تغییرات

**89/1200

*64/419

**60/2361

4

محیط

*13/796

ns96/191

*92/633

6

تیمار

**95/1489

ns64/169

**91/1431

24

تیمار×محیط

75/324

36/120

61/257

105

خطا

 *، **، ns معنی دار در سطح احتمال 5 درصد، 1 درصد و غیرمعنی دار

جدول 3-تجزیه واریانس اثر  pHهای مختلف در ضد عفونی قره­قاط

میانگین مربعات

 

سوخته

قارچ

باکتری

سالم

درجه­آزادی

منابع تغییرات

**5225

ns66/166

**33/1958

**33/2558

3

تیمار

33/58

33/83

75

225

12

خطا

  *، **، ns معنی دار در سطح احتمال 5 درصد، 1 درصد و غیر معنی دار

جدول 4- مقایسه میانگین تأثیر سطوح مختلف pH محلول ضدعفونی در شاخص های تیمار ضد عفونی قره­قاط

تیمار

سالم

باکتری

سوخته

PH1

20c

5b

75a

PH2

80a

0b

10b

PH3

55b

35a

0b

PH4

40bc

45a

0b

          اعداد با حروف مشترک در هر ستون دارای اختلاف معنی‌دار (05/0P<) نمی‌باشند

جدول5- تجزیه واریانس اثر تیمارهای (نیترات­نقره، تتراسایکلین و تتراسایکلین + نیترات­نقره) در ضد عفونی گیاه قره­قاط

میانگین مربعات

 

 

سوخته

آلوده

سالم

درجه آزادی

منابع تغییرات

*43/945

4745/83**

**33/8283

35

تیمار

07/216

133/92

85/267

28

خطا

  *، **، ns معنی­دار در سطح احتمال 5 درصد، 1 درصد و غیر­معنی­دار

 

           
   

پ

 
   

ب

 
 

الف

 
 
 

 

 

 

 

شکل1- کشت باکتری: الف) باکتری در مرحله کشت ب) باکتری در مرحله خالص سازی پ) باکتری در مرحله اضافه کردن دیسک آنتی باکتریال

 

 

بحث و نتیجه گیری

باتوجه به نتایج آزمایش اول از بین پنج اکوتیپ مورد بررسی لیسار بهترین عملکرد را از نظر ریزنمونه­های سالم داشت. که ممکن است به­دلیل کم­تر آلوده بودن منطقه نمونه­گیری باشد (شکل 2). از عوامل مؤثر در آلودگی ریزنمونه­ها منشأ ریزنمونه، روش جمع­آوری ریزنمونه­ها ، نوع بافت و مورفولوژی ریزنمونه­ها می­باشد. همچنین در بین تیمارهای ضدعفونی تیمارT7 (الکل 70 درصد + نانونقره 100 میلی­گرم بر لیتر) بهترین عملکرد را در میزان ریز نمونه­های سالم داشت که ممکن است بخاطر اثرات مخرب کمتر ناشی از استفاده از نانو نقره بر روی جوانه­ها در مقایسه با کاربرد کلرید جیوه و هیپوکلریت سدیم باشد (شکل های 3 و 4).

 

شکل 2- مقایسه میانگین اثر متقابل مناطق (حوران، سوها، خلخال، لیسار و پره­سر) و تیمار بر ریزنمونه­های سالم گیاه قره­قاط

شکل3- مقایسه میانگین اثر متقابل مناطق (حوران، سوها، خلخال، لیسار و پره­سر) و تیمار بر ریزنمونه­های سوخته گیاه قره­قاط

شکل 4- مقایسه میانگین اثر مناطق (حوران، سوها، خلخال، لیسار و پره­سر) بر ریزنمونه­های آلوده گیاه قره­قاط

 

پ

 

ب

 

الف

 

شکل 5-تأثیرpHهای مختلف هیپوکلریت­ سدیم بر روی درصدآلودگی و درصد قهوه­ای شدگی و درصد رشد ریزنمونه­های قره­قاط در کشت درون­شیشه­ای، الف: 5/6=pH ب: 14=pH پ: 9=pH

شکل6- تأثیر تیمارهای (نیترات نقره و تتراسایکلین) در ضد عفونی ریز نمونه­های گیاه قره­قاط

الف

 

ب

 

پ

 

ا

شکل7- تأثیر تیمارهای (نیترات نقره و تتراسایکلین) در ضد عفونی ریز نمونه­های گیاه قره­قاط

 

تحت چنین شرایطی باید به دنبال ماده­ای گشت که علاوه بر تأثیر مناسب روی آلودگی ریزنمونه­ها، مخاطرات کمتری هم برای انسان و هم برای محیط­زیست داشته باشد. کمترین مقدار آلودگی در ریزنمونه­های استریل شده­ی قره­قاط بمیزان 43 درصد در تیمار کلرید جیوه 03/0 درصد بمدت دو دقیقه، اتانول 70 درصد به مدت دو دقیقه و هیپوکلریت سدیم 5/1 درصد کلر فعال به مدت 15 دقیقه و 3 بار شستشو با آب مقطر بدست آمد (3). در مطالعه انجام گرفته روی گونه R. nigrum شستشوی ریزنمونه­ها در آب جاری بمدت 5/1 تا 2 ساعت و قرار دادن در الکل 70 درصد به­مدت یک دقیقه و سفیدکننده 10 درصد بمدت 10 دقیقه و در نهایت سه مرتبه شستشو در آب مقطر استریل بعنوان تیمار ضدعفونی مناسب برای این گونه معرفی شد (25). در مورد قره­قاط قرمز حذف برگ­های توسعه یافته و فروبردن در محلول تازه کلرید جیوه 15/0 درصد بمدت یک دقیقه که چند قطره محلول Tween 20 افزوده شده را بعنوان تیمار ضد عفونی مناسب معرفی کردند (27). در گونه magellanicumR.. نیز استفاده از هیپوکلریت سدیم یک درصد کلر فعال که تنها 12 درصد آلودگی داشتند و 70 درصد ریزنمونه­ها زنده ماندند (10).

ضدعفونی ریزنمونه­های گیاه Citrus grandis­ با استفاده از کلرید جیوه 1/0، 2/0، 3/0 و 4/0 درصد بمدت 3 الی 10 دقیقه 100 درصد ریزنمونه­ها آلودگی قارچی را مشاهده گردید (22). ولی در این آزمایش وقتی از کلرید­جیوه استفاده گردید درصد آلودگی کمتری را نسبت به آزمایش راستگو مشاهده نمودیم که این امر نشان می­دهد نوع ژنوتیپ هم روی درصد نمونه­های سالم تأثیر به­سزایی دارد. کلرید جیوه به طور گسترده برای کنترل آلودگی گیاهان چوبی استفاده شده است ولی این ماده بسیار سمی بوده و باید با دقت بالایی مورد استفاده قرارگیرد. چنین مواد شیمیایی نه­تنها برای ریزنمونه بیش از حد سمی است برای محیط­زیست نیز مخاطره ­آمیز است (17).

در آزمایش دوم به بررسی تأثیر تغییرpH محلول ضدعفونی پرداخته شد به طور کلی تنظیم pH هیپوکلریت­سدیم برای افزایش کارآیی ضدعفونی و کنترل آلودگی ریزنمونه­های قره­قاط در شرایط درون­شیشه­ای تأثیر معنی­داری داشت. بطوری­که استفاده از هیپوکلریت­سدیم 5/2 درصد بدون تنظیم pH (14pH=) حتی به مدت 15 دقیقه قادر به کنترل مؤثر آلودگی ریزنمونه­های قره­قاط نبود و در تیمار هیپوکلریت­سدیم همراه با چند قطره Tween20 بدون تنظیم pH بمدت 15 دقیقه بیشترین درصد آلودگی باکتریایی و قارچی بدست آمد. کمترین درصد آلودگی قارچی مربوط به تیمار ضدعفونی هیپوکلریت­سدیم با 5/6pH= بود ولی از لحاظ درصد قهوه­ای­شدگی و سوختگی بیشترین درصد ریزنمونه­ها را در برگرفت. از نظر درصد رشد ریزنمونه­ها بهترین عملکرد در ریزنمونه­های سالم در ریزنمونه­های مربوط به تیمار pH (9pH= ) بدست آمده و با تغییر pH هیپوکلریت­سدیم (9 و 5/11pH=) درصد آلودگی نسبت به هیپوکلریت­سدیم بدون تنظیم pH (14pH=) کاهش نشان داد (شکل 5). اثر تغییر pH محلول استریل کننده (هیپوکلریت­سدیم) با غلظت­های مختلف و مدت زمان متفاوت بر کنترل آلودگی درونی ریزنمونه­های بافت گره Eupatorium odoratum بررسی گردید و نشان داده شد که پس از ضدعفونی سطحی ریزنمونه­های گره با هیپوکلریت­سدیم 5% با 7pH=  میزان آلودگی تا 84 درصد در مقایسه با عدم تنظیم pH کاهش یافته است در آزمایش بعدی روی گره گیاه Andrographis paniculata با استفاده از هیپوکلریت­سدیم 10 و 20% بمدت 20 دقیقه در 7 و5/12pH= نیز بیان کردند که در 7pH=  درصد آلودگی قارچی در مقایسه با 5/12pH= کمتر است (19) که این نتایج با یافته­های پژوهش حاضر مطابقت دارد. به نظر می‌رسد که در اثر کاهش میزان pH هیپوکلریت­سدیم، یون­های­ OCl- فعال بیشتری از ترکیبO­NaCl، آزاد شده و روی ساختار پمپ­های انتقال الکترون و سایر اندامک­های حیاتی اثر می­گذارد (15). بنابراین با کاهشpH هیپوکلریت­سدیم به 5/6pH=، میزان یون­های فعال بسیار زیاد بوده و در نتیجه علاوه بر، از بین بردن آلودگی سطحی و درونی ریزنمونه­ها به خود سلول­های ریزنمونه نیز آسیب جبران ناپذیری وارد کرده و آنها را نیز از بین می­برد. بطوری­که بخش عمده­ای از ریزنمونه­های قره­قاط در تیمار ضدعفونی هیپوکلریت­سدیم 5/2 درصد با 5/6pH= قهوه­ای شده و از بین رفتند. ولی به نظر می­رسد که محلول هیپوکلریت­سدیم با 9pH= تعادل مناسبی از نظر یون­های فعال Ocl ایجاد شده که علاوه­بر کنترل مؤثر آلودگی قارچی و باکتریایی ریزنمونه­های قره­قاط، زنده­مانی و رشد آن­ها را هم در مقایسه با هیپوکلریت­سدیم بدون تنظیم pH کاهش نداده است.

در آزمایش سوم نیز به بررسی تأثیر نیترات نقره و تتراسایکلین در ضدعفونی ریز نمونه­های قره قاط پرداخته شد (شکل 6). با استفاده از نانو­نقره در ضدعفونی گیاه فندق نشان داده شد که تیمار نانو ذرات در کنترل آلودگی­های ریزنمونه­های فندق مؤثر بود اما غلظت­های بالا باعث صدمات شدید به ریزنمونه می­شود (4). تیمار مختلف نانو ذرات نقره بیش­ترین تأثیر را در کنترل آلودگی باکتریایی و قارچی گیاه فندق داشتند. بهترین تیمار برای حذف آلودگی باکتریایی در این گیاه غلظت 100 میلی­گرم در لیتر به مدت 120 دقیقه بود. بطوری که درصد آلودگی قارچی و باکتریایی 33/83 درصد کاهش یافت و 66/66 درصد ریزنمونه­ها رشد کرده و شاخه تولید کردند (9). اثرات نانوذرات­نقره را بر کنترل آلودگی داخلی سنبل­الطیب (Valeriana afficinalis L.) نشان داده شد این محققان بهترین تیمار برای رفع آلودگی سطحی ریزنمونه سنبل­الطیب در محلول 100 میلی­گرم­بر­لیتر نانو ذرات­نقره به مدت 60 دقیقه را گزارش نمودند. فرو­بردن ریزنمونه زیتون در نانو ذرات­نقره پس از استریل سطحی نیز نشان داده که نانو ذرات­نقره در کنترل آلودگی باکتریایی و قارچی بسیار مؤثر است. با این­حال، این روش قابل اجرا برای ریزنمونه­های زیتون به دلیل صدمات شدید نیست (24). از لحاظ پایین بودن درصد سوختگی و آلودگی ریزنمونه­ها با حمام آنتی­بیوتیک تتراسایکلین در غلظت­های 500 میلی­گرم در لیتر به­مدت چهار ساعت و 100میلی گرم در لیتر بمدت یک و چهار ساعت در گیاه انگور بدست آمد (8). در این آزمایش بیشترین ریزنمونه­های سالم مربوط به تیمار نیترات نقره بود. مکانیسم عمل ذرات نانو­نقره در از بین بردن میکروارگانیسم­ها به وضوح شناخته نشده است. با این حال نشان داده شده است یون­های مثبت نقره آزاد به آرامی می­تواند ساختار سلولی میکروارگانیسم ها را از بین برد. (16). اثرات Ag++ روی میکرو ارگانیسم­ها ممکن است بدلیل فعالیت در بخش Chemosmotic باشد. این محققان نشان دادند که یون­های Ag++ از طریق تحت تأثیر قرار دادن فسفو لیپیدها، غشا سلولی میکروارگانیسم­ها را نابود می­کنند. علاوه بر­این، یون های Ag++ممکن است، جایگزین گروه گوگرد (SH-) در غشای سلول شده وسلول­های میکروارگانیسم­ها را نابود کند (11). موقع استفاده از نانو نقره سطح تماس با میکروب­ها به­مقدار زیادی افزایش یافته در نتیجه اثرات ضدمیکروبی آن تقویت می­شود، اگر چه نحوه عمل نانو نقره روی میکروب­ها بخوبی مشخص نشده ولی فرضیه­هایی مبنی بر لیز شدن سلول و همچنین مهار رشد میکروب­ها توسط نانو نقره پیشنهاد شده است (20).

نتیجه کلی

به دلیل این که ریزنمونه­های قره­قاط از محیط بیرونی و جنگلی جمع­آوری شدند و از آن جهت که ریزنمونه­های مورد نظر از درصد آلودگی بالایی در محیط­کشت برخوردار بودند. بنابراین اولویت اول این آزمایش استفاده از روش­های مختلف ضدعفونی جهت از بین بردن بیماری­های درونی بخصوص باکتری­ها بود تا ریزنمونه­هایی با کمترین درصد آلودگی و با بیشترین درصد زنده­مانی و بیشترین پتانسیل رشد و در نهایت استقرار مطلوب به دست آید. بهترین پاسخ از نظر درصد آلودگی کمتر و درصد زنده­مانی و رشد بیشتر مربوط به تیمار ضدعفونی ریزنمونه­ای با الکل 70 درصد+ نانوسیلور 100 میلی­گرم بر لیتر بدست آمد. تنظیم pH هیپوکلریت­سدیم راهکار مناسبی برای رفع آلودگی ریزنمونه­های قره­قاط جهت کشت درون شیشه­ای بود. بدین صورت که تغییر pH هیپوکلریت سدیم از14 به 9، درصد آلودگی را بسیار کاهش داد (صفر درصد) اما درصد زنده­مانی را در 5/6pH= نیز بسیار کاهش داد در 14pH= عملکرد بسیار ضعیفی از نظر رفع آلودگی درونی و زنده­مانی ریزنمونه مشاهده شد. استفاده از تیمار نیترات­نقره، تتراسایکلین و نیترات­نقره+تتراسایکلین برای ضد عفونی ریزنمونه­های قره­قاط به­عنوان بهترین تیمار ارزیابی شد به­نحوی که میزان آلودگی باکتری با استفاده از نیترات­نقره به صفر کاهش یافت.

سپاسگزاری

بدینوسیله نویسندگان مراتب تشکر و امتنان خود را از زحمات و تلاش انجام شده توسط مهندس حمیدرضا حیدری را در طی اجرای پروژه ابراز میدارند.

  • اسدی، م.، فلور ایران، جهادسازندگی، شماره23، 29 صفحه.
  • پارسا، م.، و زینالی، ا.، 1395. تأثیر الیسیتورهای جاسمونیک اسید و متیل جاسمونات بر میزان تروپان آلکالوئیدهای آتروپین و اسکوپولامین در ریشه­های مویین و ریشه­های حاصل از کشت بافت گیاهHyoscyamus niger L.، مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)، جلد 30، شماره 4، صفحات 791-778..
  • درودی، ه.، و اکبری­نیا، م.، 1394. ریزازدیادی گونه قره­قات (Ribes khorasanicum) از طریق کشت ­بافت، دو فصلنامه علمی-پژوهشی تحقیقات ژنتیک و اصلاح گیاهان مرتعی و جنگلی ایران، جلد 23، شماره 1، صفحات 76-65.
  • دریانی، پ.، و زارع، ن.، 1394. تأثیر نانو­ذرات نقره بر کنترل آلودگی میکروبی و استقرار ریزنمونه­های جوانه انتهایی و جانبی فندق در شرایط درون­شیشه­ای، اولین کنفرانس ملی نانو فناوری و کاربرد آن در کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران.
  • فارسی، م.، 1385. اصول اصلاح نباتات، انتشارات جهاد دانشگاهی مشهد، صفحات234-239.
  • کیانی فریز، م.، زمانی، ذ.، عبادی، ع.، 1384. استقرار درون شیشه­ای سه رقم زیتون، مجله علوم کشاورزی و منابع طبیعی، سال دوازدهم، شماره 4، صفحات 37-29.
  • گروسی، ق.، ملکی، س.، و نظامی آلانق، ا.، 1395. بهبود محیط کشت و تنظیم کننده­های رشدی در ریزازدیادی پایه رویشی پسته قزوینی، مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)، جلد 31، شماره2، صفحات 395-383.
  • گوران، ع.، مظفری، ع. ا.، و قادری، ن.، 1392. بررسی اثر ترکیبات مختلف ضد میکروبی روی ضد عفونی سطحی ریز نمونه­های انگور Vitis vinifera L. در شرایط درون شیشه­ای، هفتمین همایش یافته­های پژوهشی کشاورزی – دانشگاه کردستان 25و 26 اردیبهشت.

 

  • Abdi, G., Salehi, H., and Khoush-Khoi, M., Nano silver, a novel Nano material for removal of bacterial contaminants in valerian (Valeriana officinalis L.) tissue culture, Acta Physiologia Plantarum, 30, PP: 709-714.
  • Arena, M. E., and Pastur, G. J. M., 1995. In vitro propagation of Ribes magellanicum Poiret. Scientia Horticulturae, 62, PP: 139–134.
  • Dibrov, P. J., Dzioba, K. K., and Gosink, C. C., 2002. Chemiosmotic mechanism of antimicrobial activity of Ag+ in vibrio cholera, Antimicrob Agents chemother, 46, PP: 2668-2670.
  • Durkovic, J., 2008. Micropropagation of mature Cornus mas ‘Macrocarpa’, Trees, 22(4), PP: 597-602.‏
  • Habiba, V., Reza, S. H., Saha, M. L., and Rkhan, M., and Hadiuzzaman, S., 2002. Endogenous bacterial contamination during in vitro culture of table banana identification and prevention.plant Tissue calture, 12, PP: 117-124.
  • Harum, N., 2013. Surface sterilization procedures for leaves explants of rhododendron (Rhododendron javanicum (Blume) Benn) cultured in vitro, The Third Basic ScienceInternational Conference, B 21, PP: 1-4.
  • Leifert, C., Waites, W. M., and Nicholas, J. R., 1989. Bacterial contaminants of micropropagated plant cultures. Journal Applied Microbiology, 67, PP: 353-361.
  • Lubick, N., 2008. Nanosilver toxicity. Ions, nano particlessor both. Environ, Sci Technol, 42, PP: 8617-8617.
  • Martino, K., 1990. Plant regeneration through somatic embryogenesis in medicinally important Centella asiatica, In Vitro Cell, Development Biology Plant, 40, PP: 586-591.
  • Manole, C. G., Balan, V., Mencinicopschi, I. C., Golea, D., Rodino, S., and Butu, A., 2012. The influence of growth regulators concentrations on in vitro micro propagation of Ribes rubrum, Scientific Bulletin, Series, F., Biotechnologies. 16, PP: 26- 29.
  • Mitchell, S. A., Asemota, H. N., and Ahmad, M. H., 1995. Effects of explants source, culture medium strength, and growth regulators on the in vitro propagation of three Jamaican yams (Dioscorea cayenensis, D. trifida and rotundata), Journal Sciences Food Agriculture, 67: 173-180.
  • Prabhu, S., and Poulose, E. K., 2012. Silver nanoparticles, mechanism of antimicrobial action, synthesis, medical applications, and toxicity effects.International Nano Letters a Springer open journal, PP: 2-10.
  • Pence, V. C., 2005. In vitro collecting, The effect of collecting method and antimicrobial agents on contamination in temperate and tropical collections. In Vitro Cell Development Biology Plant, 41, PP: 324-332.
  • Rastgoo, S., 2008. Studies on in vitro regeneration in pummel (citrus grandis) phD thesis, university of Agricultural Science, Banglore, India, PP: 101- 104.
  • Reed, B. M., and Abdelnour-Esquivel, A., 1991. The use of zeatin to initiate in vitro cultures of Vaccinium species and cultivars. Horticultural Science, 26, PP: 1320-1322.
  • Rostami, A. A., and Shahsavar, A., 2009. Nano-silver particles eliminate the in vitro Contaminations of Oliver Mission Explant. Asian journal of plant Sciences, 8, PP: 505-509.
  • Ruzic, D., and Lazic, T., 2006. Micropropagation as means of rapid multiplication of newly developed blackberry and black currant cultivars. Agriculturae Conspectus Scientificus, 79, PP:149-153.
  • Sanders, J., Pithie, A., Ganly, P., Surgenor, L., Wilson, R., and Merriman, E., 2008. Aprospective double-blind randomized trial comparing intraluminal ethanol with91heparinized saline for the prevention of catheter-associated bloodstream infection in immune suppressed hematology patients. Juornal Antimicrob Chemother, 62, PP: 809–815.
  • Sedlak, J., and Paprstein, F., 2012. In vitro establishment and proliferation of red currant cultivars. Hort. Science (Prague), 39, PP: 21-25.
دوره 34، شماره 1
فروردین 1400
صفحه 81-97
  • تاریخ دریافت: 08 مهر 1397
  • تاریخ بازنگری: 03 اسفند 1397
  • تاریخ پذیرش: 11 اردیبهشت 1398
  • تاریخ اولین انتشار: 01 فروردین 1400