نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه علوم زیستی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه کردستان، سنندج، ایران.

2 دانشگاه کردستان، دانشکده علوم، گروه عتوم زیستی

چکیده

افزایش قندخون پس از صرف غذا برای افراد دیابتی یک مشکل جدی می‌باشد که یکی از راه‌های مقابله با این مشکل، ممانعت از شکستن کربوهیدرات‏های پلی‏مری به گلوکز در روده، از طریق مهار آنزیم آلفاگلوکوزیداز بوده است. نظر به فعالیت مهار بالای گزارش شده برای عصاره متانولی اندام‌های هوایی گیاهان سیلن‏حبابی Silene Ampullata Bioss و گل‏استکانی‏برگه‏دار Campanula involucrate Auch.ex DC، تعیین مکان اندامی این فعالیت هدف این مطالعه قرار گرفت. عصاره متانولی (گل، برگ، ساقه) این گیاهان از نظر فعالیت مهارکنندگی بر روی آلفاگلوکوزیداز و توان احیاکنندگی مورد بررسی قرار گرفتند. بیشترین میزان فعالیت مهارکنندگی گیاه سیلن‌حبابی مربوط به غلظت mg/ml2 عصاره متانولی اندام‏های گل و برگ (100%) و بیشترین میزان فعالیت مهارکنندگی گیاه گل‏استکانی‏برگه‏دار مربوط به غلظت mg/ml 40 عصاره متانولی برگ و گل (100%) بود. کمترین میزان IC50 مربوط به اندام‏های گل و برگ گیاه سیلن‌حبابی (mg/ml ۱۳/۰) بود. عصاره متانولی اندام‌های گل و برگ گیاه گل‏استکانی‌‏برگه‏دار به ترتیب الگوی مهار غیررقابتی و مرکب نارقابتی- غیررقابتی، و عصاره اندام‌های گل و برگ سیلن‌حبابی به ترتیب الگوی مهار مرکب نارقابتی- غیررقابتی و نارقابتی از خود نشان دادند. عصاره متانولی گل گیاهان سیلن-حبابی و گل‌استکانی‌برگه‌دار فعالیت آنتی‌اکسیدانی قابل توجهی نسبت به سایر اندام‌های هوایی از خود نشان دادند. عصاره متانولی اندام‏های گل و برگ گیاه سیلن‌حبابی و گل‌استکانی‌برگه‌دار، دارای مواد مهارکننده مؤثری می‌باشند، لذا جداسازی و خالص‌سازی آنها و بررسی تأثیر آن‌ها بر روی آنزیم آلفاگلوکوزیداز و مطالعه‌ی این اثرات در شرایط invivo می‌تواند به معرفی داروهای کم خطر و موثرتری در جلوگیری کننده از افزایش قند خون منجر گردد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

α-glucosidase inhibition activity and antioxidant properties of aerial parts methanol extract from Silene Ampullata Bioss and Campanula Involucrate Auch.ex Dc.

نویسندگان [English]

  • Hosna Almasi 1
  • Mohammad Ali Zarei 2

1 Department of Biol.Sci., Faculty of Science, University of Kurdistan, Sanandaj,IRAN.

2 Department of Biological sciences, Faculty of science, University of Kurdistan

چکیده [English]

An after meal increase in blood glucose for diabetics is a serious problem. One of the ways to cope with this problem is to inhibit the intestinal α-glucosidase. The inhibitory effect of methanol extract from aerial parts of Silene Ampullata Bioss and Campanula Involucrate Auch.ex Dc. previously has been reported, the purpose of this study was to determine the location of the organs of this activity. The maximum inhibitory activity of Silene Ampullata Bioss, was related to the 2 mg/ml concentration of the leaf organ and flower organ's methanol extract (100%), and again the 40 mg/ml concentration of the leaf organ and flower organ methanol extract produced the maximum inhibitory activity for Campanula involucrate Auch.ex Dc. (100%). The minimum amount of IC50 (0.13 mg/ml) was achieved for the flower and leaf of Silene Ampullata Bioss. According to the results of kinetic studies, the methanol extracts from flower and leaf organs of Campanula involucrate showed non-competitive and mixed pattern of inhibitory activity on alpha-glucosidase, respectively. While the extracts from flower and leaf of Silene Ampullata Bioss showed a mixed and uncompetitive inhibition pattern of inhibitory activity on alpha-glucosidase, respectively. The methanol extract of Silene Ampullata and Campanula Involucrate flower organs had a significant antioxidant activity in comparison with other aerial organs.The methanol extract of the leaf and flower organs of Campanula involucrate and Silene Ampullata possesses effective inhibitors, therefore isolation and purification of active components and in vivo study of their effects on alpha-glucosidase could be the subject of further studies.

کلیدواژه‌ها [English]

  • α-glucosidase
  • Campanula involucrate Auch.ex DC
  • Inhibitor
  • methanol extract
  • Silene Ampullata Bioss

خواص مهارکنندگی آلفاگلوکوزیداز و آنتی‏اکسیدانی عصاره متانولی اندام‏های هوایی گیاهان سیلن‏حبابی Silene Ampullata Bioss و گل‏استکانی‏برگه‏دار

 Campanula involucrate Auch.ex DC

حسنا الماسی و محمدعلی زارعی*

ایران، سنندج، دانشکده علوم، دانشگاه کردستان، گروه علوم زیستی

تاریخ دریافت: 8/12/1397            تاریخ پذیرش: 11/2/1398

چکیده

افزایش قندخون پس از صرف غذا برای افراد دیابتی یک مشکل جدی می‌باشد که یکی از راه‌های مقابله با این مشکل، ممانعت از شکستن کربوهیدرات‏های پلی‏مری به گلوکز در روده، از طریق مهار آنزیم آلفاگلوکوزیداز بوده است. نظر به فعالیت مهار بالای گزارش شده برای عصاره متانولی اندام‏های هوایی گیاهان سیلن‏حبابیSilene Ampullata Bioss و گل‏استکانی‏برگه‏دار Campanula involucrate Auch.ex DC، تعیین مکان اندامی این فعالیت هدف این مطالعه قرارگرفت. عصاره متانولی (گل، برگ و ساقه) این گیاهان از نظر فعالیت مهارکنندگی بر روی آلفاگلوکوزیداز و توان احیاکنندگی مورد بررسی قرارگرفتند. بیشترین میزان فعالیت مهارکنندگی گیاه سیلن‌حبابی مربوط به غلظت mg/ml 2 عصاره متانولی اندام‏های گل و برگ (100 درصد) و بیشترین میزان فعالیت مهارکنندگی گیاه گل‏استکانی‏برگه‏دار مربوط به غلظتmg/ml  40 عصاره متانولی برگ و گل (100 درصد) بود. کمترین میزان IC50 مربوط به اندام‏های گل و برگ گیاه سیلن‌حبابی (mg/ml۱۳/۰) بود. عصاره متانولی اندام‌های گل و برگ گیاه گل‏استکانی‌‏برگه‏دار به ترتیب الگوی مهار غیررقابتی و مرکب نارقابتی- غیررقابتی و عصاره اندام‌های گل و برگ سیلن‌حبابی به ترتیب الگوی مهار مرکب نارقابتی- غیررقابتی و نارقابتی از خود نشان دادند. عصاره متانولی گل گیاهان سیلن‏حبابی و گل‏استکانی‏برگه‏دار فعالیت آنتی‏اکسیدانی قابل توجهی نسبت به سایر اندام‏های هوایی از خود نشان دادند. عصاره متانولی اندام‏های گل و برگ گیاه سیلن‌حبابی و گل‏استکانی‏برگه‏دار، دارای مواد مهارکننده مؤثری می‏باشند، لذا جداسازی و خالص‏سازی آنها و بررسی تأثیر آن‏ها بر روی آنزیم آلفاگلوکوزیداز و مطالعه‏ی این اثرات در شرایط invivo می‏تواند به معرفی داروهای کم­خطر و موثرتری در جلوگیری از افزایش قند خون منجر گردد.

واژه های کلیدی: آلفاگلوکوزیداز، گل‏استکانی‏برگه‏دار، سیلن‏حبابی، عصاره‏ متانولی، مهار آنزیمی

* نویسنده مسئول، تلفن:    09188710632، پست الکترونیکی: [email protected] 

مقدمه

 

بیماری دیابت، در واقع به مجموعه اختلالاتی گفته می‏شود که با عدم تنظیم یا تنظیم ناقص در مسیرهای متابولیسمی کربوهیدرات‏ها، پروتئین‏ها و لیپیدها همراه است (18). همچنین دیابت می‏تواند یک اختلال در تولید انسولین، عمل انسولین یا هر دو باشد (28). اختلال در ترشح انسولین باعث افزایش در سطح گلوکز خون می‏شود که این افزایش قندخون می‏تواند منجر به عوارض میکروواسکولار رتینوپاتی (نابینایی)، نفروپاتی (آسیب‌های گلومرول و دفع آلبومین) و نوروپاتی (کاهش یا از دست دادن حس درد) است. دیابت همچنین با بیماری‏های ماکروواسکولار به خصوص بیماری عروق کرونر قلب مرتبط می‏باشد (7). دیابت نوع یک در نتیجه تخریب خود ایمنی سلول بتا ایجاد می‏گردد، که معمولاً موجب کمبود انسولین خواهد شد. مشخصه دیابت نوع دو مقاومت محیطی نسبت به عمل انسولین و به درجاتی کاهش ترشح انسولین است (29). روش‏های بسیاری توسط مطالعات داروشناختی شامل تحریک آزاد شدن انسولین، مهار گلوکونئوژنز، افزایش تعداد انتقال دهنده‏های گلوکز و کاهش جذب گلوکز از روده به منظور بهبودی بیماری دیابت مورد استفاده قرار گرفته است. اولین قدم درمانی برای دیابت نوع II، رعایت رژیم غذایی، کاهش وزن و فعالیت‌های ورزشی است (4). در برخی از موارد این اقدام‌ها نمی‌تواند بیماری را کنترل کند و نیاز به مصرف دارو پیدا می‌شود، که از جمله این داروها می‏توان به سولفونیل اوره‏آز، بی‏گوانیدها، تیازولیدین‏دیونزها، مهارکننده‏های آلفاگلوکوزیداز اشاره کرد (20). آنزیم آلفا گلوکوزیداز (EC 3.2.1.20) یک آنزیم کلیدی در هضم کربوهیدرا‏ت‏ها در انسان می‏باشد که باعث هیدرولیز پلی‏ساکاریدها می‏شود. روند هیدرولیز کربوهیدرات‏ها توسط این آنزیم به این صورت است که کربوهیدرات‏ها (الیگوساکاریدها و دی‏ساکاریدها) در روده‏ی کوچک به آنزیم آلفا گلوکوزیداز متصل و با فعالیت‏های این آنزیم به واحدهای کوچک‏تر (مونوساکاریدها) تجزیه می‏شوند (26). کنترل سطح گلوکز خون پس از صرف غذا می‏تواند یک فاکتور مهم برای درمان دیابت باشد. بنابراین امروزه استفاده از مهارکننده‏های آنزیم آلفا گلوکوزیداز نقش بسزایی در درمان دیابت دارند. این مهارکننده‏ها باعث تأخیر عمل آنزیم آلفاگلوکوزیداز برای شکستن کربوهیدرات‏های پیچیده به قندهای ساده می‏شوند. بنابراین ورود گلوکز به خون را کاهش می‏دهند (6). در گذشته از داروهای ضددیابتی زیادی مانند آکاربوز، ووگلیبوز، میگلیتول و نوجیرومایسین برای درمان دیابت استفاده شده است اما این داروها باعث اثرات جانبی متعددی مانند سمیت کبدی، درد شکم، نفخ شکم، اسهال و هیپوگلیسمی شدید می‏شوند. همچنین پس از درمان طولانی مدت با این داروها، مقاومت انسولین در برابر این داروها گزارش شده است (33).

از سوی دیگر تحقیقات نشان داده، استرس اکسیداتیو که حاصل عدم توازن میان تولید رادیکالهای آزاد و دفاع آنتی اکسیدانهای بدن می‏باشد، در بیماری دیابت افزایش یافته است، در واقع یکی از عواملی که منجر به افزایش استرس اکسیداتیو می‏گردد، هیپرگلیسمی است (3). باتوجه به اثر استرس اکسیداتیو بر تسریع عوارض میکروواسکولر و ماکروواسکولر دیابت، مطالعات گستردهای جهت بررسی نحوه کاهش اکسیدانهای بدن و افزایش و استفاده بهینه از آنتی اکسیدان‏های سنتتیک و غیرسنتتیک صورت گرفته است (22). در بدن سیستم‌های آنتی‌اکسیدانی مانند آنزیم‌های سوپراکسیددیسموتاز، کاتالاز، ماکرومولکول‌هایی مثل آلبومین، سرولوپلاسمین و سایر مولکول‌های کوچک مانند آسکوربیک‌اسید، آلفاتوکوفرول و بتاکاروتن وجود دارند که می‌توانند با رادیکال‌های آزاد مقابله کنند (16). اگرچه آنتی‌اکسیدان‌ها در بدن وجود دارند اما برای از بین بردن رادیکال‌های آزاد در بدن باید از آنتی‌اکسیدان‌های اگزوژن هم که از طریق مواد غذایی به دست می‌آیند، استفاده شود (11). اخیراً علاقه بسیاری در جهت یافتن آنتی اکسیدانهای طبیعی از مواد و عصاره­های گیاهی برای جایگزینی آنتی اکسیدانهای سنتتیک ایجاد شده است. اطلاعات جمع آوری شده چه از مقالات علمی و چه از مطالعات آزمایشگاهی نشان داده است که گیاهان حاوی مقادیر زیاد و متنوعی از آنتی اکسیدانها می باشند. مواد آنتی اکسیدان در گیاهان شامل ترکیبات اسیدها سینامیک، کومارین­ها، دی‏ترپن‏ها و فلاونوئیدها می‏باشند. فلاونوئیدهای موجود در گیاهان با داشتن گروه‌های هیدروکسیل و متوکسیل دارای خواص کاهنده استرس اکسیداتیو‌ها هستند، که این اثرات احتمالاً مربوط به توانایی فلاونوئیدها در مهار پراکسیداسیون لیپیدها، کلاته کردن فلزات فعال، افزایش سطح گلوتاتیون احیا و یا افزایش بیان ژنهای آنزیم­های آنتی اکسیدانی مانند کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز می باشد (14).

مطابق نتایج یک مطالعه غربالگری برای فعالیت آنزیم آلفاگلوکوزیداز در میان عصاره متانولی 60 گیاه بومی استان کردستان، چندین گیاه با فعالیت بالا معرفی شدند، که دو گیاه گل‏استکانی‏برگه‏دار (Campanula involucrate) و سیلن‏حبابی (Silene Ampullata) از آن جمله‏اند (32). در مطالعه اخیر اندامی از گیاهان فوق‏الذکر که دارای فعالیت مهارکنندگی بر روی آنزیم آلفاگلوکوزیداز باشند، مشخص نشده است، همچنین باتوجه به اینکه توان بالقوه آنتی‏اکسیدانی برای هر دو گیاه گزارش شده است اما هیچ گزارشی برای بررسی خاصیت آنتی‏اکسیدانی در بخش‏های هوایی دو گیاه صورت نگرفته است. بنابراین، مطالعه حاضر با هدف تعیین اندامی از دو گیاه مذکور که دارای بیشترین فعالیت مهارکنندگی آلفاگلوکوزیداز هستند و مطالعه سنتیک مهار جهت تعیین نوع مهار برای عصاره‏های دارای درصد مهار بالا، صورت گرفت. همچنین خاصیت آنتی‏اکسیدانی عصاره‏های متانولی اندام‏های هوایی دو گیاه فوق نیز به عنوان بخش تکمیلی مطالعات، مورد سنجش قرارگرفت. 

مواد و روشها

مواد شیمیایی و بیوشیمیایی: متانول، KH2PO4 و K2HPO4.3H2O (نمک‌های خریداری شده برای تهیه بافر فسفات 1/0 میلی مولار 6/6=pH)، آنزیم آلفاگلوکوزیداز مخمری استخراج شده از Saccharomyces cerevisiae (خریداری شده از شرکت سیگما)،HCL ، KOH، DPPH (دی فنیل پیکریل هیدرازیل)، آکاربوز، اسید آسکوربیک، کوئرستین، استات پتاسیم، کلرید آلومینیوم، فولین سیوکالتو، اسید گالیک، کربنات‏سدیم، فری‌سیانید پتاسیم، اسید تری‌کلرو استیک، کلرید آهن (III) از شرکت مرک خریداری شدند.

جمع‏آوری گیاهان و تهیه پودر: در اواخر فصل بهار گیاهان گل‏استکانی‏برگه‏دار و سیلن‌حبابی از نواحی معینی از مراتع استان کردستان گرد‌آوری و ضمن ثبت سیستماتیک به آزمایشگاه تحقیقاتی منتقل گردیدند. سپس اندام‌های هوایی هر دو گیاه فوق‌الذکر شامل گل، برگ و ساقه از همدیگر تفکیک شدند. این اندام‌های تفکیک شده در شرایطی امن از نظر آلودگی میکروبی، قارچی و در سایه، به مدت چندین روز به طور کامل خشک گردیدند. سپس به وسیله قیچی باغبانی به قطعات کوچکی خرد شدند و بوسیله آسیاب خانگی به صورت پودر نرم درآورده شدند. پودرهای به دست آمده از اندام‏های هوایی گیاه پس از توزین در بانکه های شیشه­ای و به دور از نور تا زمان عصاره‏گیری، در دمای اتاق نگه‏داری شدند.

تهیه عصاره متانولی از نمونه‌های گیاهی: به منظور تهیه‏ی عصاره متانولی، 6۰ گرم پودر تهیه شده از هریک از اندام‏های هوایی گیاه در ۲۰۰ میلی‏لیتر حلال متانول به مدت 72 ساعت خیسانده شد در این مدت به فواصلی هم‏زده می‏شدند. پس از زمان طی شده مخلوط حلال و پودر توسط کاغذ صافی واتمن شماره ۴۲ صاف شد. مایع صاف شده توسط دستگاه روتاری اواپریتور در دمای 68 درجه سانتی‏گراد تغلیظ شده و پس از تخلیه از مخزن دستگاه، جهت خشک شدن کامل، روی شیشه ساعت به قطر ۱۵ سانتی‏متر، پخش شده و در زیر هود شیمیایی و در دمای محیط قرارگرفت. عصاره‏های خشک شده از روی سطح شیشه ساعت جمع‏آوری و در میکروتیوب ۵/۱ میلی‏لیتری تا زمان انجام مراحل بعدی در دمای ۲۰- درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شدند.

اصول و دستور کار سنجش فعالیت آنزیم آلفا گلوکوزیداز: در اثر هیدرولیز سوبسترای پارانیتروفنیل‏آلفا-دی-گلوکوپیرانوزید (p-NPG) و آزاد شدن عامل فسفات توسط آنزیم آلفاگلوکوزیداز، ماده‏ی رنگی پارا-نیتروفنل تولید می‏شود که زرد رنگ و دارای جذب حداکثری در طول موج ۴۰۵ نانومتر است. هرچه فعالیت آنزیم آلفاگلوکوزیداز بیش‏تر باشد، شدت رنگ تولیدی و به دنبال آن جذب نوری نیز بیش‏تر خواهد بود. در حضور عصاره گیاهی به دلیل کاهش فعالیت آنزیم آلفاگلوکوزیداز مقدار کم‏تری سوبسترا تجزیه شده و در نتیجه ماده رنگی کم‏تری تولید شود، که منجر به کاهش جذب نوری می‏شود.

دراین مطالعه جهت سنجش قدرت مهارکنندگی عصاره‌های اندام‏های هوایی گیاه بر روی فعالیت آنزیم آلفاگلوکوزیداز، از روش اصلاح شده‏ی پیستیا-براگمن با مختصر تغییراتی استفاده شد (21). سنجش‏ها در میکروپلیت‏های ۹۶ چاهکی و در حجم کل ۱۵۰ میکرولیتر و با استفاده از دستگاه میکروپلیت‏خوان (Tecan sunrise) به ترتیب زیر انجام شد. ۵۰ میکرولیتر بافر فسفات، ۲۰ میکرولیتر از عصاره محلول در متانول و۱۰میکرولیترآنزیم آلفاگلوکوزیداز ساکارومایسس سرویزیه (U/ml۱محلول در بافر فسفات) وارد چاهک شده، به منظور مخلوط شدن این اجزا با هم میکروپلیت در درون دستگاه به مدت ۳ ثانیه مرتعش شد. پس از 10 دقیقه انکوبه کردن در دمای اتاق، برای شروع واکنش ۲۰ میکرولیتر سوبسترا به مخلوط فوق اضافه شد. آنگاه پس از ۳۰ دقیقه انکوباسیون در دمای ۳۷ درجه سانتی‏گراد، جهت توقف واکنش، ۵۰ میکرولیتر هیدروکسیدسدیم (NaOH) به آن اضافه شد. سپس میکروپلیت در داخل دستگاه میکروپلیت قرارگرفته و پس از ۳ ثانیه هم‏زدن، جذب آن به مدت ۳ دقیقه و هریک دقیقه یکبار در طول موج ۴۰۵ نانومتر اندازه‏گیری شد. سنجش عصاره‏های گیاهی در سه تکرار انجام شد. به دلیل امکان حضور برخی عوامل دیگر غیر از محصول واکنش، که دارای جذب در ۴۰۵ نانومتر بودند و یا هیدرولیز خودبه‏خودی سوبسترا، برای هر کدام از عصاره‏ها یک چاهک بلانک نیز تعریف شد. چاهک بلانک حاوی تمام مواد به غیر از آنزیم بود. همچنین در چاهک کنترل مثبت به جای عصاره از آکاربوز و در چاهک کنترل منفی به جای عصاره از بافر فسفات استفاده شد.

آنالیز سنتیکی برای عصاره‌های دارای بیشترین درصد مهار: به منظور تعیین نوع مهار اعمال شده توسط عصاره‌های دارای بیش‌ترین درصد مهار بر روی آنزیم، نمودار معکوس مضاعف لینویور‌-‌ برک براساس واکنش آنزیمی در حضور غلظت‌های مختلف عصاره و بدون حضور عصاره (کنترل) در غلظت‌های مختلف سوبسترا، رسم شد. غلظت‌های تهیه شده سوبسترا براساس ضرایب تصحیح کننده معادله لینویور- برک (1/V0 = Km/Vmax[S0] + 1/Vmax)  انتخاب، و عملاً سوبسترا در شش غلظت ۱۱/۳، ۴۸/۲، ۸۷/۱، ۲۴/۱، ۶۲۲/۰ و ۳۱۱/۰ میلی‌مولار تهیه گردید (23). برای رسم این نمودارها از یکی از غلظت‌های عصاره متانولی اندام مربوطه استفاده شد. برای کنترل و هریک از غلظت‌های مهارکننده Vmax و Km تعیین، و Ki با استفاده از نمودارهای ثانویه در غلظت‌های مختلف مهارکننده به دست آمد.

روش محاسبات: پس از پایان سنجش، جذب پلیت خالی از جذب چاهک‌های متناظرش کسر شده و سپس با تفریق جذب چاهک بلانک از جذب چاهک تست، جذب نهایی محاسبه شد. با استفاده از فرمول مهار، درصد مهار آنزیم آلفاگلوکوزیداز به وسیله عصاره به دست آمد (معادله 1). درصد مهار برای سه تکرار هر عصاره محاسبه و در پایان میانگین گرفته شده و انحراف استاندارد محاسبه شد. تمام این مراحل با استفاده از نرم‌افزار Excel، نسخه‌ی 2010 انجام شده است.

معادله (1)    100×  = %مهار

تمام مراحل گفته شده برای غلظت‌های مختلف عصاره انجام شده و میانگین درصد مهار به دست آمد. از طریق رسم نمودار درصد مهار بر علیه غلظت نهایی عصاره، IC50 که بیان کننده مقدار غلظتی از عصاره‌ها است که ۵۰ درصد مهار می‌دهد، تعیین شد. فعالیت مهارکنندگی نسبی (RIA) نشان دهنده نسبت IC50 مهارکننده استاندارد (آکاربوز) به IC50 مهارکننده مورد نظر (عصاره‌ها) می‌باشد. از فعالیت مهارکنندگی نسبی می‌توان جهت مقایسه قدرت بازدارندگی مهارکننده‌های مختلف آنزیم مورد نظر استفاده نمود و جهت محاسبه RIA از معادله زیر استفاده شد (5).

ارزیابی خاصیت آنتی‌اکسیدانی عصاره‌ها: برای ارزیابی خاصیت آنتی‏اکسیدانی عصاره‏ها از دو روش معمول شامل به دام انداختن رادیکال آزاد DPPH و قدرت احیاء آهن استفاده شد. مبنای روش اول، به دام انداختن رادیکال‏های DPPH طبق توانایی اهداء هیدروژن است (19). دی‏فنیل پیکریل هیدرازیل به عنوان یک رادیکال آزاد پایدار به رنگ بنفش می‏باشد که در صورت احیاء شدن توسط عوامل دهنده الکترون (ترکیبات آنتی‏اکسیدانی مثل اسید آسکوربیک) به دی‏فنیل پیکریل هیدرازین (غیر رادیکالی) زرد رنگ تبدیل می‏شود. در جریان این آزمایش قدرت احیاء-کنندگی عصاره‏ها با کم‏رنگ شدن یا بی‏رنگ شدن DPPH توسط ترکیبات عصاره مورد سنجش قرارگرفت و هرچه محلول واکنش کم‏رنگ‏تر شود، جذب آن کاهش می‏یابد و این نشان می‏دهد که عصاره دارای خاصیت آنتی‏اکسیدانی بالقوه می‏باشد (17). در روش دوم، قدرت احیاءکنندگی مواد موجود در عصاره با احیا شدن آهن III به آهن II ارزیابی می‏شود. احیا شدن آهن اکثراً تحت عنوان سنجش الکترون‏دهی استفاده می‏شود که روش مناسبی در بررسی کارکرد فعالیت آنتی‏اکسیدانی مواد فنولی می‏باشد (12).

ارزیابی توان احیاء رادیکال آزاد DPPH توسط عصاره‏ها: جهت بررسی فعالیت آنتی‏اکسیدانی و مهار رادیکال آزاد DPPH در این تحقیق از روش فو (Rao-Fu) و همکارانش استفاده شد (12). تمامی سنجش‌ها در میکروپلیت‌های 96 چاهکی و در حجم نهایی 200میکرولیتر و با استفاده از دستگاه میکروپلیت-خوان (Tecan sunrise) و به ترتیب زیر انجام شد. ابتدا ۱۰۰ میکرولیتر از محلول ۱/۰ میلی‌مولار DPPH (حل شده در متانول) به چاهکها افزوده شد و سپس مقدار ۱۰۰ میکرولیتر از غلظت‌های مختلف عصاره به آن افزوده می‌شد. آنگاه به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد انکوبه ‌شد. از محلول DPPH به عنوان کنترل منفی نیز استفاده گردید. بعد از گذشت ۳۰ دقیقه، جذب در طول موج ۵۱۷ نانومتر اندازه‌گیری می‌شد. از محلول متانولی آسکوربیک اسید به عنوان کنترل مثبت استفاده گردید.

پس از پایان سنجش، جذب پلیت خالی از جذب چاهک‏های متناظرش کسر شده و سپس با تفریق جذب چاهک بلانک از جذب چاهک تست، جذب نهایی محاسبه شد. فعالیت آنتی‏اکسیدانی برای سه تکرار هر عصاره محاسبه و در پایان میانگین گرفته شد. درنهایت مقدار پاکسازی رادیکال DPPH با فرمول (1) محاسبه شد.

فرمول(1)   100×  = فعالیت پاکسازی رادیکال آزاد

 

ارزیابی خاصیت آنتی‏اکسیدانی احیا آهن: میزان قدرت احیاکنندگی عصاره‏ها توسط روش ین و چن  با کمی تغییرات انجام شد (31). بدین ترتیب که عصاره با غلظت‏های مختلف 50، 100، 200، 400، 600 و 800 میکروگرم در میلی‏لیتر آماده شد. سپس 5/2 میلی‏لیتر بافر فسفات 2/0 مولار و 5/2 میلی‏لیتر فری‏سیانیدپتاسیم 1 درصد به آن‏ها اضافه شد. مخلوط واکنش به مدت 30 دقیقه در دمای 45 درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شد. سپس 5/2 میلی‏لیتر تری کلرواستیک اسید 10 درصد به خاطر توقف واکنش به آن‏ها اضافه شد. نمونه‏های حاوی مواد به مدت 15 دقیقه در سانتریفیوژ 3000 دور در دقیقه، سانتریفیوژ شدند پس از اتمام سانتریفیوژ 5/2 میلی‏لیتر از مایع رویی محلول برداشته شد و با 5/0 میلی‏لیتر آهن (III) کلراید 1 درصد مخلوط شد و توسط دستگاه اسپکتروفتومتر جذب در 700 نانومتر خوانده شد. از اسید آسکوربیک با غلظت‏های 50، 100، 200، 400، 600 و 800 میکروگرم بر میلی‏لیتر به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.

اندازهگیری محتوی فنل تام عصاره‏ها: میزان کل ترکیبات فنولی با روش فولین سیوکالچیو و مطابق پروتوکول توسط شهیدی و ناچک با کمی تغییرات اندازه‏گیری شد (24). یک میلی‏گرم از هریک از اندام‏های هوایی گیاه در 10 میلی‏لیتر متانول حل شد تا نمونه کشت ppm100 ایجاد شود. فراکسیون‏های 5/0 میلی‏لیتر (سه گانه) در لوله آزمایش ریخته شد و بعد 5/0 میلی‏لیتر معرف فولین سیوکاچیو به لوله‏ها اضافه و به مدت 2 دقیقه هم‏زده شد. سپس 10 میلی‏لیتر محلول کربنات سدیم 7 درصد اضافه شد. جذب نمونه‏ها پس از یک ساعت قرار دادن آن‏ها در دمای 45 درجه سانتی‏گراد با دستگاه اسپکتروفتومتر در 765 نانومتر اندازه‏گیری شد و آزمایشات برای عصاره و استاندارد سه بار تکرار شد. برای رسم منحنی استاندارد اسید گالیک، محلول پایه‏ای از این ماده با غلظت 100 میکروگرم بر میلی‏لیتر تهیه شد سپس از این غلظت، رقت‏های مختلف (100، 80، 60، 40، 20، 10) بر حسب میکروگرم بر میلی‏لیتر تهیه شد. پس از طی کردن مراحل مختلف طبق روش مذکور جذب نمونه‏ها قرائت شد. براساس یک نمودار کالیبراسیون اسید گالیک، با به دست آوردن معادله خطی منحنی استاندارد و قرار دادن جذب عصاره در آن، مقدار فنول عصاره تام اندازه‏گیری شد. روش فولین سیوکالچیو یک روش مهم برای اندازه‏گیری مقدار فنول موجود در عصاره می‏باشد که اساس این روش احیاء معرف فولین سیوکالچیو توسط ترکیبات فنولی موجود در عصاره و تشکیل کمپلکس آبی رنگ می‌باشد که ماکزیمم جذب را در 765 نانومتر دارد.

اندازهگیری محتوی فلاونوئید تام عصاره‏ها: فلاونوئید تام با روش ایجاد رنگ کلریدآلومینیوم و مطابق پروتوکول چانگ- یانگ، با کمی تغییرات اندازه‏گیری شد (8). طبق این روش، محلول 1/0 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر از عصاره هریک از اندام‏های هوایی دو گیاه تهیه شد. 5/0 میلی‏لیتر از نمونه در 5/1 میلی‏لیتر متانول حل شد. سپس 1/0 میلی‏لیتر آلومینیوم کلراید 10 درصد، 1/0 میلی‏لیتر استات پتاسیم 1 مولار و 8/2 میلی‏لیتر آب مقطر به آن اضافه شد و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق قرارگرفت و جذب خوانده شد. جذب مخلوط در 415 نانومتر قرائت شد. از کوئرستین به عنوان رسم منحنی استاندارد استفاده شد و نتایج براساس میلی‏گرم معادل کوئرستین در گرم عصاره بیان شد. بدین صورت که ابتدا یک محلول از کوئرستین با غلظت 100 میکروگرم بر میلی‏لیتر تهیه شد. سپس غلظت‏های دیگر (100، 80، 60، 40، 20، 10) بر حسب میکروگرم بر میلی‏لیتر به دست آمد. براساس یک نمودار کالیبراسیون کوئرستین، با به دست آوردن معادله خط و قرار دادن جذب عصاره در آن، مقدار فلاونوئید عصاره تام ارزیابی شد. آزمایشات 3 بار تکرار شد و میانگین این تکرارها گزارش شد. اساس این روش رنگ ایجاد شده توسط کمپلکس اسیدی ایجاد شده آلومینیوم کلراید با گروه هیدروکسیل فلاونوئیدها است و در صورت وجود فلاونوئید در عصاره این کمپلکس ایجاد می‏شود که بیش‏ترین جذب را در طول موج 415 نانومتر دارد.

کروماتوگرافی‏گازی متصل به طیفسنج‏جرمی (GC/MS): نظر به اینکه درصورت وجود خاصیت مهارکنندگی در عصاره متانولی اندام‏های گیاهان، لازم است تعیین گردد که این خاصیت مربوط به کدام‏ یک از اجزاء تشکیل دهنده عصاره است، شناسایی ترکیبات نیز صورت گرفت. جهت شناسایی ترکیبات عصاره‏های مختلف گیاهان از (GC/MS) استفاده شد. در این تکنیک پس از تزریق نمونه‏ها به دستگاه (GC/MS) با محاسبه و بررسی مولفه‏های مختلف طیف‏های جرمی ترکیبات موجود در عصاره‏ها و مقایسه تمامی این مولفه‏ها با مشخصات ترکیب‏های استاندارد اقدام به شناسایی اجزای موجود در نمونه می‏گردد. در این پژوهش جهت انجام این آنالیز، عصاره استخراج شده از گل گیاه گل‏استکانی‏برگه‏دار و سیلن‏حبابی، در 100 میکرولیتر به آزمایشگاه تخصصی (آزمایشگاه مرکزی دانشگاه کردستان) تحویل گردید، سپس نتایج آنالیز (GC/MS) نمونه از آزمایشگاه فوق‏الذکر تحویل گرفته شد. مشخصات دستگاه GC-MS و جزئیات روش کار مورد استفاده جهت آنالیز نمونه‏های عصاره درجدول 1 آمده است.

تحلیلها و آنالیزهای آماری: داده‏ها و نتایج حاصل از آزمایش‏ها در این تحقیق، با استفاده از نرم‏­افزار SPSS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. برای بررسی و مقایسه میانگین عصاره‏های هگزانی از آزمون تجزیه واریانس یکطرفه (ANOVA) استفاده شد و تمام داده‏های حاصل از آزمایش با سه بار تکرار و مقدار آن‏ها به صورت میانگین ± انحراف معیار گزار شد.

 

 

جدول 1- مشخصات دستگاه GC-MS و جزئیات روش‏کار مورد استفاده جهت آنالیز نمونه‏های عصاره‏ اندام‏های گیاهان مورد تحقیق

 مدل A-7890، شرکت  Agilent، ساخت کشور آمریکا

دستگاه GC

N-5

نوع ستون

طول 30 متر، قطر 250 میکرومتر

ابعاد ستون

دمای اولیه c ْ 45، گرادیان دمایی c/minْ 2 ، دمای نهاییc ْ250

برنامه ریزی دمایی ستون

Split/split less

محل تزریق

هلیوم

گاز حامل

مدل A-5973، شرکت  Agilent، ساخت کشور آمریکا

دستگاه Mass

˚C230

دمای محفظه یونش

Quadrupole

تجزیه­گر جرمی

˚C150

دمای تجزیه­گر جرمی

                                                                                         

 

نتایج

درصد مهار و IC50 : نتایج حاصل از مهارکنندگی عصاره متانولی اندام‏های هوایی این گیاهان نشان داد که در گیاه سیلن‏حبابی بیش‏ترین درصد مهار (۱۰۰ درصد) مربوط به اندام‏های گل و برگ (شکل ۱) در غلظت ۲ میلی‏گرم بر میلی‏لیتر و در گیاه گل‏استکانی‏برگه‏دار بیشترین درصد مهار (۱۰۰ درصد) مربوط به اندام‏های گل و برگ (شکل 2) در غلظت 40 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر بود.

میزان IC50 در غلظت نهایی مهارکننده‏ها در محیط واکنش برای آکاربوز و هم‏چنین برای سایر عصاره‏های متانولی در جدول 2 آورده شده است مطابق آن میزان IC50 به دست آمده برای عصاره متانولی اندام برگ گیاه گل‏استکانی‏برگه‏دار و اندام‏های برگ و گل در گیاه سیلن‏حبابی نسبتاً پایین و لذا قابل توجه است. هم‏چنین شاخص RIA برای عصاره متانولی اندام-های دارای بالاترین درصد مهار بر آنزیم آلفاگلوکوزیداز در جدول 3 آورده شده است.

نتایج بررسی سنتیکی واکنش آنزیم آلفاگلوکوزیداز در حضور عصاره گیاهان با استفاده از رویکرد لینویور- برک: نتایج حاصل از بررسی سنتیکی اثر عصاره متانولی برای اندام‌های گل و برگ هر دو گیاه بر روی فعالیت آنزیم آلفاگلوکوزیداز نشان داد که، گل و برگ گیاه گل‏استکانی ‌‏برگه‏دار به ترتیب الگوی مهارکنندگی غیررقابتی و مرکب نارقابتی- غیررقابتی (نمودارهای 1 و 2) و عصاره اندام گل و برگ سیلن‌حبابی به ترتیب الگوی مهار مرکب نارقابتی- غیررقابتی و نارقابتی از خود نشان می‌دهند (نمودارهای 3 و 4). جهت مقایسه، آکاربوز که در غلظت 1 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر به عنوان کنترل مثبت در نظر گرفته شد، با الگوی مهار رقابتی باعث مهار آنزیم آلفاگلوکوزیداز شد.

 

شکل 1- نمایش درصد مهار آلفاگلوکوزیداز توسط عصاره متانولی اندام‌های هوایی سیلن‌حبابی و آکاربوز (غلظت‌های عصاره گل، برگ، ساقه و آکاربوز به ترتیب 2، 2، 1/0 و 1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر بودند).

 

 

شکل 2- نمایش درصد مهار آلفاگلوکوزیداز توسط عصاره متانولی اندام‌های هوایی گل‌استکانی‌برگه‌دار با آکاربوز (غلظت‌های عصاره گل، برگ، ساقه و آکاربوز به ترتیب 40، 40، 8 و 1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر بودند).

مقادیر پارامترهای سنتیکی:

 مقادیر Km، Vmax، Kmapp و Vmaxapp از طریق رسم نمودار 1/Vo علیه 1/[S]o و به دست آوردن معادله­ی خط، محاسبه شد. برای تعیین مقدار ثابت مهارکنندگی (Ki)، نمودار ثانویه رسم گردید (نمودارهای 5-8).

 

 

 

جدول 2- مقادیر IC50 برای عصاره متانولی اندام‌های دارای بالاترین درصد مهار در مقایسه با آکاربوز(mg/ml 0001/0).

نام علمی گیاه

نام فارسی گیاه

اندام

IC50 (mg/ml)

 

 

Silene Ampullata Bioss

 

سیلن‌حبابی

برگ

13/0

گل

13/0

 

Campanula involucrate Auch.ex DC

 

گل‌استکانی‌برگه‌دار

برگ

15/0

گل

47/0

 

جدول 3- مقادیر فعالیت مهارکنندگی نسبی( Relative inhibitory Activity=RA ) برای عصاره متانولی اندام‌های دارای بالاترین درصد مهار.

نام علمی گیاه

نام فارسی گیاه

اندام

فعالیت مهارکنندگی نسبی

 

Silene Ampullata Bioss

 

سیلن‌حبابی

برگ

001/0

گل

001/0

 

Campanula involucrate Auch.ex DC

 

گل‌استکانی‌برگه‌دار

برگ

0009/0

گل

0003/0

 

 

نمودار 1- نمودار لینویور-برک تغییرات Vo -1 در مقابل [S]o -1 (نمودار معکوس مضاعف) با استفاده از غلظت 10 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر عصاره متانولی اندام گل گیاه گل‌استکانی‌برگه‌دار، الگوی مهار غیررقابتی می‌باشد.

 

 

 

نمودار 2- نمودار لینویور-برک تغییرات Vo -1 در مقابل [S]o -1 (نمودار معکوس مضاعف) با استفاده از غلظت 10 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر عصاره متانولی اندام برگ گیاه گل‌استکانی‌برگه‌دار، الگوی مرکب نارقابتی- غیررقابتی می‌باشد.

 

 

 

نمودار 3- نمودار لینویور-برک تغییرات Vo -1 در مقابل [S]o -1 (نمودار معکوس مضاعف) با استفاده از غلظت 1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر عصاره متانولی اندام گل گیاه سیلن‌حبابی، الگوی مهار مرکب نارقابتی- غیررقابتی می‌باشد.

 

 

 

 

 

نمودار 4- نمودار لینویور-برک تغییرات Vo -1 در مقابل [S]o -1 (نمودار معکوس مضاعف) با استفاده از غلظت 1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر عصاره متانولی اندام برگ گیاه سیلن‌حبابی، الگوی مهار نارقابتی می‌باشد.

نمودار 5- نمودار ثانویه تغییرات شیب نمودار اولیه در مقابل غلظت‌های مختلف مهارکننده جهت تعیین ثابت مهارکنندگی عصاره متانولی گل گیاه گل‌استکانی‌برگه‌دار.

نمودار 6- نمودار ثانویه تغییرات شیب نمودار اولیه در مقابل غلظت‌های مختلف مهارکننده جهت تعیین ثابت مهارکنندگی عصاره متانولی برگ گل‌استکانی‌برگه‌دار.

این نمودار از رسم تغییرات شیب نمودارهای اولیه لاین ویور برک در برابر غلظت‌های مختلف مهارکننده به دست ‌آمدند. پارامتر‌های سنتیکی محاسبه شده برای عصاره متانولی اندام‌های دارای بالاترین درصد مهار در جدول (4) آمده اند.

توانایی به دام اندازی رادیکال DPPH توسط اندام‏های هوایی گیاهان مورد مطالعه: فعالیت پاکسازی رادیکال آزاد عصاره متانولی اندام‏های هوایی دو گیاه توسط معرف DPPH صورت گرفت.

 

نمودار 7- نمودار ثانویه تغییرات شیب نمودار اولیه در مقابل غلظت‌های مختلف مهارکننده جهت تعیین ثابت مهارکنندگی عصاره متانولی گل سیلن‌حبابی.

نمودار 8- نمودار ثانویه تغییرات شیب نمودار اولیه در مقابل غلظت‌های مختلف مهار‌کننده جهت تعیین ثابت مهارکنندگی عصاره متانولی برگ سیلن‌حبابی.

درصد مهار DPPH و EC50 (بیان کننده مقدار غلظتی از عصاره که باعث مهار 50 درصد از رادیکال آزاد می‏شود) توسط عصاره متانولی هریک از اندام‏های هوایی در گیاه سیلن‏حبابی و گل‏استکانی‏برگه‏دار (جدول 5) نشان داده شده است. هم‏چنین مقدار RSA نیز در عصاره متانولی هر یک از اندام‏های هوایی دو گیاه (جدول 6) آورده شده است.

توانایی احیاءکنندگی آهن توسط عصاره متانولی اندامهای هوایی دو گیاه: توان احیاءکنندگی، قدرت الکترون‏دهی آنتی‏اکسیدان را نشان می‏دهد. در این روش قدرت احیایی عصاره متانولی اندام‏های هوایی براساس احیاء آهن III به آهن II ارزیابی می‏شود و محلول عصاره هر اندامی که قدرت احیای بالایی داشته باشد، جذب بیش‏تری دارد، شکل 3 منحنی غلظت- جذب عصاره متانولیی اندام‏های هوایی دو گیاه را نشان می‏دهد و مشاهده می‏شود که قدرت احیاءکنندگی تمام اندام‏ها با افزایش غلظت زیاد می‏شود.

 

شکل 3- مقایسه درصد احیاء آهن برای عصاره متانولی اندام‌های هوایی گیاهان گل‌استکانی‌برگه‌دار و سیلن­حبابی، معنی علایم (گل سیلن­حبابی=Po.F، برگِ‏ سیلن­حبابی=Po.L، گلِ گل­استکانی­برگه­دار =Cp.F، برگِ ­گل­استکانی­برگه­دار=Cp.L، ویتامین ث =Vit C)

مقدار فنل تام موجود در اندام‏های هوایی: مقدار ترکیبات فنلی تام عصاره متانولی گل‌استکانی‌برگه‌دار و سیلنحبابی براساس مقدار جذب حاصل از واکنش عصاره با معرف فولین‌سیو‌کالتو و بر مبنای مقایسه آن با نمودار استاندارد اسید گالیک و با استفاده از معادله خط حاصل از منحنی اسیدگالیک (6829/0 + x0114/0= y) محاسبه گردید (جدول7).

مقدار فلاونوئید تام موجود در اندام‏های هوایی: مقدار فلاونوئید تام عصاره متانولی دو گیاه گل‌استکانی‌برگه‌دار و سیلن‌حبابی بر مبنای روش رنگ‌سنجی کمپلکس آلومینیوم کلراید صورت گرفت. با قرار دادن میزان جذب عصاره اندام‌های هوایی در معادله خط منحنی استاندارد محلول کوئرستین (6829/0 + x0114/0= y) محاسبه میزان ترکیبات فلاونوئیدی صورت گرفت مقدار فلاونوئید محاسبه شده برای اندامهای هوایی هر دو گیاه در ( جدول8) آمده است.

 

 

جدول 4- پارامترهای سنتیکی کنترل و مهار در حضور عصاره متانولی اندام‌های گیاهی دارای بیشترین درصد مهار آلفاگلوکوزیداز

 

نوع مهار

 

Ki

(mg/ml)

 

 

Vmaxapp

(mM/min)

 

Kmapp

(mM)

 

Vmax

(mM/min)

 

Km

(mM)

پارامتر سنتیکی

 

غلظت

(mg/ml)

اندام

نام فارسی گیاه

نام علمی گیاه

غیررقابتی

43/23

83/0

25/0

48/0

25/0

10

گل

 

گل‌استکانی‌برگه‌دار

Campanula involucrate Auch. ex DC

مرکب نارقابتی-غیررقابتی

08/11

58/0

20/0

49/0

25/0

10

برگ

مرکب نارقابتی-غیررقابتی

650

44/0

32/0

32/0

22/0

1

گل

                     سیلن‌حبابی

Silene Ampullata Bioss

نارقابتی

55/10

49/0

25/0

48/0

28/0

1/0

برگ

جدول 5- درصد مهار DPPH و EC50 نشان داده شده برای عصاره متانولی هریک از اندام‌های هوایی گیاه گل‌استکانی‌برگه‌دار و سیلن‌حبابی، اسید آسکوربیک به عنوان کنترل مثبت در نظر گرفته شد (mg/ml 35/0=EC50).

اسم علمی گیاه

اندام

EC50 (mg/ml)

درصد احیا DPPH در غلظت mg/ml100

 

Campanula involucrate Auch.ex DC

گل

5/4

100

برگ

5/5

100

 

Silene Ampullata Bioss

گل

1

100

برگ

5

65/36

جدول 6- مقدار فعالیت به دام اندازی رادیکال نسبی (RSA=Relative Scavenging Activity) برای عصاره متانولی اندام­های هوایی گیاهان

نام علمی گیاه

اندام

RSA

 

Campanula involucrate Auch.ex DC

گل

07/0

برگ

06/0

 

Silene Ampullata Bioss

گل

35/0

برگ

07/0

جدول 7-محتوای فنلی محاسبه شده برای اندام‏های هوایی گیاهان مورد مطالعه

نام علمی گیاه

اندام‌های هوایی

محتوای فنلی (µg/ml)

 

Campanula involucrate Auch.ex DC

گل

22/108

برگ

92/19

 

Silene Ampullata Bioss

گل

54/120

برگ

14/92

 

نتایج طیف‏سنجی‏جرمی (GC/MS) : جهت کسب اطلاعاتی در خصوص ترکیبات موجود در عصاره‏های فعال، با استفاده از دستگاه (GC/MS)ترکیبات موجود در عصاره‏های متانولی دارای بیشترین درصد مهار آنزیم آلفاگلوکوزیداز مشخص شد. این عصاره‏ها شامل عصاره گل گیاه سیلن‏حبابی و عصاره گل گیاه گل‏استکانی‏برگه‏دار بود.

نتایج آنالیز GC/MSعصاره متانولی گلِ گیاه گل‏استکانی ‏برگه‏دار: نمودار 9 کروماتوگرام حاصل ازGC/MS مربوط به عصاره متانولی اندام گلِ گیاه گل‏استکانی‏برگه‏دار می‏باشد. جدول9 ترکیبات موجود در عصاره و مقدار آن‏ها را نشان می‏دهد. در میان پیک‏ها، 5 پیک قابل توجه بودند که در مقایسه با ترکیبات استاندارد اقدام به شناسایی ترکیبات آن‏ها شد.

مطابق جدول 9 و نمودار 9، عصاره متانولی گل گیاه گل‏استکانی‏برگه‏دار دارای 5 پیک قابل تشخیص است و در کل دارای 13 ترکیب می‏باشد.

نتایج آنالیز GC/MSعصاره متانولی گلِ گیاه سیلن‏حبابی:

نمودار 10  کروماتوگرام  حاصل  از GC/MS   مربوط  به

عصاره متانولی اندام گل گیاه سیلن‏حبابی می‏باشد. همچنین جدول10 ترکیبات موجود در عصاره و مقدار آن‏ها را نیز نشان می‏دهد. در میان پیک‏ها 7 پیک قابل توجه بودند که در مقایسه با ترکیبات استاندارد اقدام به شناسایی ترکیبات آن‏ها شد.

مطابق جدول10 و نمودار 10، عصاره متانولی گل گیاه گل‏استکانی‏برگه‏دار دارای 5 پیک قابل تشخیص است و در کل دارای 14 ترکیب می‏باشد.

بحث و نتیجه گیری

گیاه سیلن حبابی (Silene Ampullata Bioss) از خانواده Caryophyllaceae و گیاهی یکساله است که اغلب در مکان‌های علفی و خشک می‌روید و مقاوم به خشکسالی و تنش گرمایی است (30). گیاه گل‏استکانی‏برگه‏دار (Campanula involucrate) از خانواده Campanulaceae گیاهی علفی، یکساله، دوساله یا پایا هستند. مهمترین جنس تیره گل‌استکانی، کامپانولا می‌باشد که حدود 250 گونه دارد و مرکز انتشار آن تقریباً نواحی مدیترانه‌ای است (27). هردو گیاه در معرفی فلور، شکل زیستی و کورولوژی گیاهان منطقه سارال کردستان (زیر حوزه فرهاد آباد) مورد اشاره قرار گرفته‏اند (2).

شای و همکاران در سال (2010)، تاثیر مهارکنندگی شش گیاه دارویی را بر روی فعالیت آلفاگلوکوزیداز مورد بررسی قرار دادند.

 

 

 

جدول 8- محتوای فلاونوئید محاسبه شده برای اندام­های هوایی گیاهان مورد مطالعه

نام علمی گیاه

اندام‌های هوایی

محتوای فلاونوئیدی (µg/ml)

 

Campanula involucrate Auch.ex DC

گل

46/30

برگ

58/24

 

Silene Ampullata Bioss

گل

44/56

برگ

25/16

 

 

 

نمودار 9 - کروماتوگرام حاصل از GC/MS مربوط به عصاره متانولی اندام گل گیاه گل­استکانی­برگه­دار (زمان بر حسب دقیقه است)

 

نمودار 10- کروماتوگرام حاصل از GC/MS مربوط به عصاره اندام گل گیاه سیلن­حبابی (واحد محور افقی زمان دقیقه است).

 

جدول 9- ترکیبات شناسایی شده در عصاره متانولی اندام گل گیاه گل­استکانی­برگه­دار توسط دستگاه  GC/MS

درصد نسبی

RTa (min)

نام ترکیب

شماره پیک

%96/1

677/3

Trimethyl [4-(1,1,3,3,-tetramethylbutyl) phenoxy] silane

1

 

 

2,4,6-Cycloheptatrien-1-one, 3,5-bis-trimethylsilyl

 

%55/2

54/4

 

Benzene, 1-methyl-2,3-dinitroAllyl (dimethyl) benzyloxysilane

2

 

 

 

Silane, trimethyl (phenylmethoxy)

 

 

 

Benzene, 1-methyl-2,3-dinitro

%14/1

052/8

Benzaldehyde, 2,5-bis [(trimethylsilyl) oxy]

3

 

 

 

Benzaldehyde, 2,4-bis (trimethylsiloxy)

 

 

Benzeneacetic acid, .alpha.,4-bis [(trimethylsilyl)oxy]-, trimethylsilyl ester

 

 

4-Hydroxymandelic acid, ethyl ester, di-TMS

%100

656/14

Diethyl Phthalate

4

 

 

Phthalic acid, ethyl isoporpyl ester

 

%72/10

375/15

Diethyl Phthalate

5

 

 

Phthalic acid, ethyl 2-pentyl ester

 

 

جدول 9- ترکیبات شناسایی شده در عصاره متانولی اندام گل گیاه سیلن­حبابی توسط دستگاه  GC/MS

درصد نسبی

RTa (min)

نام ترکیب

شماره پیک

%17/37

167/3

Acetic acid, 2-methylpropyl ester

1

 

 

Acetic acid, butyl ester

 

12%

635/3

Acetic acid, butyl ester

2

%7/21

204/5

trans-(2- Chlorovinyl) methyldiethoxysilane

3

 

 

Oxime-, methoxy-phenyl

 

 

[2-(4-Methoxy-phenyl)-[1,3]dioxolan-2- yl]-acetic acid

 

 

1-Buten-3-one, 1-(2-carboxy-4,4- dimethylcyclobutenyl)

 

 

5-Nitrobenzofuran-2-one

%98/10

251/6

Silane, diethoxydimethyl

4

 

 

dl-Glyceraldehyde diethylacetal

 

 

2,2-Diethoxyacetophenone

%15/18

614/8

1,2,3-Propanetriol, monoacetate

5

 

 

D-Mannitol

 

 

Xylitol

 

 

نتایج نشان داد که عصاره گیاه Cassia Abbreviata بیشترین اثر مهارکنندگی بر روی آلفا گلوکوزیداز دارد (25). لاواگ و همکارانش در سال (2012)، 6 گیاه بومی فیلیپین را برای وجود مهارکننده آلفاگلوکوریداز بررسی کردند (15). گوردوبان و همکاران در سال (2012)، اثر مهارکنندگی 10 گیاه دارویی ساحلی را بر روی آنزیم آلفاگلوکوزیداز مخمر مورد بررسی قرار دادند. نتایج نشان داد که Citrullus colocynthis بیشترین تاثیر مهارکنندگی را بر روی آنزیم آلفاگلوکوزیداز داشته‌اند (12). 

براساس نتایج حاصل از این تحقیق بیشترین میزان فعالیت مهارکنندگی گیاه گل‏استکانی‏برگه‏دار مربوط به غلظت 40 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر عصاره متانولی برگ (100%) و عصاره متانولی گل (100%) بود، همچنین بیشترین میزان فعالیت مهارکنندگی گیاه سیلن‌حبابی مربوط به غلظت 2 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر عصاره متانولی برگ (100%) و عصاره متانولی گل (100%) بود. طبق نتایج به‌دست آمده می‌توان گفت که از میان اندام‌های هوایی دو گیاه فوق‌الذکر گل و برگ هر دو گیاه دارای اثر مهارکنندگی بالایی می‌باشند و جهت پژوهش‌های بعدی می‌توان بر روی این اندام‌ها تمرکز کرد. براساس مطالعات مربوط به محاسبه IC50 برای اندام‌های گیاهی مورد نظر عصاره اندام برگ گیاه گل‌استکانی‌برگه‌دار (4/1 میلی‌گرم‏برمیلی‌لیتر) و اندام‌های گل و برگ سیلن‌حبابی دارای کمترین مقدارِ IC50 (00/1میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) بودند. همچنین شاخص RA هم برای این اندام‌ها، در مقایسه با سایر اندام‌ها، بیشترین مقدار (001/0) محاسبه گردید. اگر شاخص RA برابر 1 باشد به این معنا است که مهارکننده مورد نظر ما دارای قدرت مهارکنندگی معادل قدرت مهارکنندگی آکاربوز است. اگر شاخص RA بیشتر از 1 باشد یعنی مهارکننده دارای قدرت مهارکنندگی بیشتری نسبت به آکاربوز است و اگر کمتر از 1 باشد بیانگر این است که مهارکننده دارای قدرت مهارکنندگی کمتری نسبت به آکاربوز (که یک مهارکننده قوی و استاندارد برای فعالیت آلفاگلوکوزیداز می‌باشد) است. این خصوصیات می‌تواند نشان‌دهنده وجود یک مهارکننده قوی‌تر در عصاره‌ی اندام‌های گل و برگ گیاه سیلن‌حبابی باشد، بنابراین در مطالعات بعدی با در نظر داشتن این موضوع می‌توان جهت یافتن ترکیباتی با فعالیت مهارکنندگی آلفاگلوکوزیداز، بیشتر بر روی این اندام از گیاه تحقیق کرد. مطابق نتایج حاصل از بررسی سنتیکی با استفاده از رویکرد لینویو – برک، عصاره متانولی اندام‌های گل و برگ گیاه گل‌استکانی‌برگه‌دار به ترتیب الگوی مهار غیررقابتی و مرکب نارقابتی-غیررقابتی و عصاره متانولی اندام‌های گل و برگ گیاه سیلن‌حبابی به ترتیب الگوی مهارکنندگی مرکب نارقابتی-غیررقابتی و نارقابتی را از خود نشان دادند. در مورد گل گیاه گل‌‌استکانی‌برگه‌دار به دلیل وجود مهار غیررقابتی می‌توان این گونه برداشت نمود که مهارکننده موجود در عصاره به آنزیم و به مجموعه‌ی آنزیم- سوبسترا وصل می‌شود. همچنین در مورد برگ گیاه سیلن‏حبابی به دلیل وجود مهار نارقابتی می‌توان گفت که مهارکننده به مجموعه آنزیم- سوبسترا متصل می‌شود، که احتمالاً اتصال قبلی سوبسترا به آنزیم برای شکل‌گیری جایگاه اتصال مهارکننده برروی آنزیم لازم است.

نتایج حاصل از آزمایش مهار رادیکال‌های آزاد DPPH توسط اندام‌های هوایی گل‌استکانی‌برگه‌دار و سیلن‌حبابی نسبت به کنترل مثبت) آسکوربیک اسید (نشان داد که خاصیت ضد رادیکالی در اندام‌های هوایی همانند آسکوربیک اسید وابسته به غلظت بود. به طوری که با زیاد شدن غلظت در هریک از اندام‌ها، عصاره متانولی اندام مربوطه، فعالیت مهارکنندگی رادیکال آزاد بیش‌تری نشان می‌دادند و همان‌طور که مشاهده شد، فعالیت مهارکنندگی در گل و برگ گیاه گل‌استکانی‌برگه‌دار (غلظت 40 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) و گل گیاه سیلن‌حبابی (غلظت 10میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) (100 درصد مهار) در مقایسه با آسکوربیک اسید با غلظت 9 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر (100 درصد مهار) برابر بودند و از این نظر قابل مقایسه با آسکوربیک اسید بودند. افزایش خاصیت آنتی‌اکسیدانی در اندام‌های هوایی با افزایش ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی مرتبط می‌شود و در غلظت‌های بالاتر ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی، به دلیل زیاد شدن عوامل هیدروکسیل در واکنش، احتمال اهداء هیدروژن به رادیکال آزاد و در نتیجه توانایی مهارکنندگی عصاره مربوط به اندام هوایی زیاد می‌شود. باتوجه به نتایج به دست آمده، عصاره متانولی گل گیاه سیلن‌حبابی و گل گیاه گل‌استکانی‌برگه‌دار دارای میزان بالاتری از فنول و فلاونوئید تام در مقایسه با دیگر اندام‌های این دو گیاه بودند، البته باید توجه داشت که برگ گل‌استکانی‌برگه‌دار دارای مقدار قابل توجهی فنول و فلاونوئید است، که با نتایج صبورا و همکاران در خصوص پوست پسته قابل مقایسه است (1). از آنجایی که ترکیبات فنولی و فلاونوئید دارای اثرات آنتی اکسیدانی هستند، بنابراین می‌توان گفت وجود چنین ترکیباتی عامل اصلی فعالیت آنتی اکسیدانی گیاهان فوق‌الذکر می‌باشد، همچنین وجود این ترکیبات در انسان باعث جلوگیری بسیاری از بیماری‌ها به‌خصوص بیماری‌های قلبی- عروقی می‌شوند (10). با توجه به نتایج به دست آمده از انجام آزمایش‌ها و طبق آنالیز واریانس مشاهده می‌شود که در دو تست آنتی‌اکسیدانی (DPPH و قدرت احیا) انجام شده، اختلاف کنترل و تست معنی‌دار بودند (05/0>P). در تمام تست‌ها مشاهده شد که گل و برگ گل‌استکانی‌برگه‌دار و گل سیلن‌حبابی فعالیت مهارکنندگی DPPH بالا و هم‌چنین خاصیت احیاکنندگی بالایی داشتند.

جهت کسب شناخت بیشتر از کم و کیف ترکیبات شیمیایی موجود در عصاره‏های گیاهی دارای فعالیت مهاری آلفاگلوکوزیدازی با استفاده از دستگاه (GC/MS) ترکیبات موجود در عصاره‏های متانولی با بیشترین درصد مهار آلفاگلوکوزیدازی مشخص شدند. این عصاره‏ها شامل عصاره‏ی گلِ گیاهان گل‏استکانی‏برگه‏دار و سیلن‏حبابی بود. نتایج حاصل از تعیین ترکیبات عصاره‏های گل گیاهان گل‏استکانی‏برگه‏‏دار و سیلن‏حبابی حاکی از آن است که این عصاره‏ها حاوی گروه هیدروکسیل، فنیل و عنصر سیلیسیم می‏باشند. از این ترکیبات شناسایی شده می‏توان به 2 (4 – متوکسی‏فنیل) 1و 3 دیوکلان استیک‏اسید، 5 - نیتروبنزوفوران، گلیسرآلدهید دی‏اتیل‏استال، 3،2،1 – پروپانتریول مونوفسفات، مانیتول و زایلیتول اشاره کرد که دارای گروه هیدروکسیل می‏باشند، این ترکیبات دارای شباهت ساختاری با سوبسترای آنزیم آلفاگلوکوزیداز هستند. ترکیبات دیگری مانند بنزن - 1-متیل-3،2-دینی ترو آللییل (دی متیل) بنزیلوسی سیلان، سیلان، تری متیل (فنیل متیل)، 2(4 – متوکسی‏فنیل) - 3،1 دیوکلان استیک-اسید و اکسیم - متوکسی - فنیل دارای فنیل می‏باشند که این نشان دهنده تأثیر متیل در مهار آنزیم توسط این ترکیبات است. ترکیباتی از جمله ترانس - (2- کلرووینیل) متیل‏دی‏اتیل‏اکسیلانی، سیکلوتری‏سیلکسان– تری‏متیل (4-(3،3،1،1 تترامتیل‏بوتیل) فنوکسی) سیلان، بنزن - 1- متیل-3،2-دینی ترو آللییل (دی متیل) بنزیلوسی سیلان، بنزالدئید-5،2-بیس‏تری‏ متیل‏سایلیل‏اکسی، بنزالدئید- 4،2 – تری‏متیل- سیلوکسی، بنزنیک‏استیک‏اسید - آلفا.4 بیس‏تری‏متیل‏سایلیل ‏اکسی – تری‏متیل‏سیل‏استر، 4 – هیدروکسی‏ماندلیک‏اسید-اتیل‏استر دارای عنصر سیلیسیم هستند، به علت وجود این عنصر در بسیاری از ترکیبات عصاره‏ی این دو گیاه این گونه برداشت می‏شود که این عنصر در مهار آنزیم ممکن است نقش بسزایی داشته باشد. باتوجه به ترکیبات موجود درعصاره متانولی دو اندام و همچنین مشخص شدن نوع مهار در دو اندام، انتظار میرود که این ترکیبات موجب مهار غیررقابتی در گلِ گیاه گل‏استکانی‏برگه‏دار و برگ سیلن‏حبابی شوند. همچنین به نظر می‏رسد که با توجه به مهار غیررقابتی در گل گیاهان گل‏استکانی‏برگه‏دار و سیلن‏حبابی، این ترکیبات با تمایل متفاوت به آنزیم (E) و مجموعه آنزیم- سوبسترا (ES) متصل شوند.

نتیجه گیری

نتایج حاصل از این تحقیق نشان می‌دهد که عصاره متانولی

اندام‏های گل و برگ هر دو گیاه گل‏استکانی‌برگه‏دار و سیلن‌حبابی به صورت قابل توجهی دارای اثر مهارکنندگی بر روی فعالیت آنزیم آلفاگلوکوزیداز هستند. بنابراین شاید بتوان در مطالعات بعدی از این عصاره‌ها با هدف شناسایی منابع بالقوه جهت تهیه دارو‌های جدید در جلوگیری از پیشرفت بیماری دیابت و درمان این بیماری استفاده کرد. همان گونه که مشاهده شد گل گیاه سیلن‌حبابی و گل گیاه گل‌استکانی‌برگه‌دار دارای میزان بالاتری از فنول و فلاونوئید تام بودند که همین باعث می‌شود این اندام‌ها خاصیت آنتی‌اکسیدانی بالایی داشته باشند. عصاره متانولی گل و برگ گل‌استکانی‌برگه‌دار و گل سیلن‌حبابی فعالیت آنتی‌اکسیدانی بالایی را از خود نشان دادند، باتوجه به اینکه در سال‌های اخیر به دلایل مربوط به سلامتی توجه زیادی به آنتی‌اکسیدان‌های طبیعی معطوف گردیده است و تحقیقات گسترده‌ای به منظور به کارگیری این ترکیبات در مواد غذایی به جای آنتی اکسیدان‌های سنتزی در دست اجرا است، شاید بتوان از این منابع جهت دسترسی به ترکیباتی با خاصیت آنتی‌اکسیدانی بهره جست.

سپاسگزاری

نویسندگان این مقاله مراتب سپاس و قدردانی خود را از تمامی همکاران و مسئولین دانشکده علوم دانشگاه کردستان به جهت فراهم نمودن شرایط و امکانات انجام این پژوهش ابراز می نمایند.

  1. آزاده‏دل، ش.، حناچی، پ.، و صبورا، ع.، 1396. بررسی خاصیت آنتی اکسیدانی در عصاره پوست پسته (Pista)، مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)، جلد30، شماره 4، صفحات 827-835 .
  2. گرگین کرجی، م.، کرمی، پ.، و معروفی، ح.، 1392. معرفی فلور، شکل زیستی و کورولوژی گیاهان منطقه سارال کردستان (زیر حوزه فرهاد آباد)، مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)، جلد26، شماره 4، صفحات 510-525.

 

  1. Almroth, B. C., Albertsson, E., Sturve, J., and Förlin, L., 2008. Oxidative stress, evident in antioxidant defences and damage products, in rainbow trout caged outside a sewage treatment plant, Ecotoxicology and Environmental Safety, 70(3), PP: 370-378.
  2. Asano, N., 2003. Glycosidase inhibitors: update and perspectives on practical use. Glycobiology, 13(10), PP: 93R-104R.
  3. Bachhawat, J. A., Shihabudeen, M. S., and Thirumurugan, K., 2011. Screening of fifteen Indian ayurvedic plants for alpha-glucosidase inhibitory activity and enzyme kinetics, Int Journal Pharm Pharm Sci, 3(4), PP: 267-74.
  4. Brownlee, M., 2001. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications, Nature, 414(6865), 813 p.
  5. Chang, T. S., 2009. An updated review of tyrosinase inhibitors, International Journal of molecular sciences, 10(6), PP: 2440-2475.
  6. Chang, C. C., Yang, M. H., Wen, H. M., and Chern, J. C., 2002. Estimation of total flavonoid content in propolis by two complementary colorimetric methods. Journal of food and drug analysis, 10(3), 178-182..
  7. Chung, Y. C., Chien, C. T., Teng, K. Y., and Chou, S. T., 2006. Antioxidative and mutagenic properties of Zanthoxylum ailanthoides Sieb & zucc. Food Chemistry, 97(3), PP: 418-425.
  8. Dillard, C. J., and German, J. B., 2000. Phytochemicals, nutraceuticals and human health, Journal of the Science of Food and Agriculture, 80(12), PP: 1744-1756.
  9. Frankel, E. N., 1991. Recent advances in lipid oxidation, Journal of the Science of Food and Agriculture, 54(4), PP: 495-511.
  10. Fu, R., Zhang, Y., Guo, Y., and Chen, F., 2014. Antioxidant and tyrosinase inhibition activities of the ethanol-insoluble fraction of water extract of Sapium sebiferum (L.) Roxb, leaves, South African Journal of Botany, 93, PP: 98-104.
  11. Gurudeeban, S., Satyavani, K., and Ramanathan, T., 2012. Alpha glucosidase inhibitory effect and enzyme kinetics of coastal medicinal plants, Bangladesh Journal of Pharmacology, 7(3), PP: 186-191.
  12. Hinneburg, I., Dorman, H. D., and Hiltunen, R., 2006. Antioxidant activities of extracts from selected culinary herbs and spices. Food chemistry, 97(1), PP: 122-129.
  13. Huang, D., Ou, B., and Prior, R. L., 2005. The chemistry behind antioxidant capacity assays, Journal of agricultural and food chemistry, 53(6), PP: 1841-1856.
  14. Ieyama, T., Gunawan-Puteri, M. D., and Kawabata, J., 2011. α-Glucosidase inhibitors from the bulb of Eleutherine americana. Food chemistry, 128(2), PP: 308-311.
  15. Jayaprakasha, G. K., and Patil, B. S., 2007. In vitro evaluation of the antioxidant activities in fruit extracts from citron and blood orange, Food Chemistry, 101(1), PP: 410-418.
  16. Kazeem, M. I., Adamson, J. O., and Ogunwande, I. A., 2013. Modes of inhibition of α-amylase and α-glucosidase by aqueous extract of Morinda lucida Benth leaf. BioMed research international Hindawi Publishing Corporation BioMed Research International, Article ID 527570, 6 pages http://dx.doi.org/10.1155/2013/527570.
  17. Molyneux, P., 2004. The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity, Songklanakarin Journal Sci, Technol, 26(2), PP: 211-219.
  18. Nyenwe, E. A., Jerkins, T. W., Umpierrez, G. E., and Kitabchi, A. E., 2011. Management of type 2 diabetes: evolving strategies for the treatment of patients with type 2 diabetes, Metabolism, 60(1), PP: 1-23.
  19. Pistia-Brueggeman, G., and Hollingsworth, R. I., 2003. The use of the o-nitrophenyl group as a protecting/activating group for 2-acetamido-2-deoxyglucose. Carbohydrate research, 338(5), PP: 455-458.
  20. Sayyah, M., Mandgary, A., and Kamalinejad, M., 2002. Evaluation of the anticonvulsant activity of the seed acetone extract of Ferula gummosa Boiss. against seizures induced by pentylenetetrazole and electroconvulsive shock in mice, Journal of ethnopharmacology, 82(2-3), PP: 105-109.
  21. Segel, I. H., 1976. Biochemical Calculations: How to Solve Mathematical Problems in General Biochemisrems in General Biochemistry.
  22. Shahidi, F., and Naczk, M., 1995. Food Phenolics, Technomic pub. Co. Inc. Lancester-Basel.
  23. Shai, L. J., and Masoko, P., et al. 2010. Yeast alpha glucosidase inhibitory and antioxidant activities of six medicinal plants collected in Phalaborwa, South Africa, South African Journal of Botany, 76(3), PP: 465-470.
  24. Shim, Y. J., Doo, H. K., Ahn, S. Y., Kim, Y. S., Seong, J. K., Park, I. S., and Min, B. H., 2003. Inhibitory effect of aqueous extract from the gall of Rhus chinensis on alpha-glucosidase activity and postprandial blood glucose Journal of ethnopharmacology, 85(2-3), PP: 283-287.
  25. Shulkina, T. V., Gaskin, J. F., and Eddie, W. M. M., 2003. Morphological studies toward an improved classification of Campanulaceae s. str, Annals of the Missouri Botanical Garden, PP: 576-591.
  26. Singh, P., Jayaramaiah, R. H., Agawane, S. B., Vannuruswamy, G., Korwar, A. M., Anand, A., and Kulkarni, M. J., 2016. Potential dual role of eugenol in inhibiting advanced glycation end products in diabetes: proteomic and mechanistic insights. Scientific reports, 6, 18798 p.
  27. Vetrichelvan, Thangarasu, Maniappan Jegadeesan, and Bangaru Adigalar Uma Devi, 2002. "Anti-diabetic activity of alcoholic extract of Celosia argentea Linn, seeds in rats." Biological and pharmaceutical bulletin, 25, 4, PP: 526-528.
  28. Viorela, Ţ., Elena, G. C., and Radu, S., 2012. Researches on the preparation and characterization of some tinctures from Silene Alba herba and Silene pendulae herba, Current health sciences journal, 38(20), PP. 80-83.
  29. Yen, G. C., and Chen, H. Y., 1995. Antioxidant activity of various tea extracts in relation to their antimutagenicity. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 43(1), PP: 27-32.
  30. Zarei, M. A., and Tahazadeh, H., 2019, "Searching for Alpha-Glucosidase Inhibitory Activity in Metanol Extracts by some Plants Kurdistan Province", Journal of Medicinal Plants, 18(72 And S12): 227-235.
  31. Zhang, J., Zhao, S., Yin, P., Yan, L., Han, J., Shi, L., and Ma, C., 2014. α-Glucosidase inhibitory activity of polyphenols from the burs of Castanea mollissima Blume. Molecules, 19(6), PP: 8373-8386.