مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)
تأثیر ژن NARK و تیمار نیتروژن بر رشد، و پروفایل پروتئینی برگ در تیپ موتانت سوپر گره‌زا و تیپ وحشی سویا
نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه بیوتکنولوژی، پژوهشکده علوم محیطی، پژوهشگاه علوم، تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته،
2 گروه بیوتکنولوژی، پژوهشکده علوم محیطی، پژوهشگاه علوم، تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته.
3 گروه بیوتکنولوژی، پژوهشکده علوم محیطی، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته،
4 دانشگاه تحصیلات تکمیلی و صنعتی کرمان (هایتک)
چکیده
نیتروژن یکی از مهم ترین عناصر مورد نیاز گیاهان می‌باشد. گیاهان لگوم بدلیل دریافت این عنصر از طریق تثبیت بیولوژیک نیتروژن اتمسفر حائز اهمیت فراوان می‌باشند. در این مطالعه، تأثیر ژن NARK و تیمارهای نیتروژن‌دار بر رشد و پارامترهای فیزیولوژیک و همچنین تغییرات پروتئینی برگ گیاه سویا تیپ وحشی با تیپ موتانت بررسی گردید. بدین منظور، آزمایش گلخانه ای بصورت فاکتوریل و در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار به اجرا در آمد. تیمارهای آزمایش شامل دو سطح آمونیوم (NH4+) و دو سطح نیترات (NO3-) برای سه تیپ گیاه سویا، استریل (عدم تلقیح با باکتری ریزوبیوم)، وحشی و موتانت سوپر گره‌زا بودند. نتایج تجزیه واریانس نشان داد که تیمار آمونیوم به همراه نیترات نسبت به سایر تیمارها بیشترین تأثیر را بر گیاهان سویا از نظر شاخص های رشد و صفات بیوشیمیایی گذاشته است. الکتروفورز دو بُعدی نیز نشان داد که در گیاهان تیپ استریل تحت تیمار 5 میلی‌مولار سولفات آمونیوم تنوع پروتئینی بیشتری در برگ نسبت به گیاهان تیپ وحشی تلقیح شده با باکتری ریزوبیوم (عدم دریافت نیتروژن معدنی) وجود دارد. این تنوع در پروفایل پروتئینی برگ گیاهان میتواند بدلیل نوع نیتروژن دریافتی گیاهان (نیتروژن معدنی/تثبیت بیولوژیک ازت) باشد. علاوه بر این، تنوع پروتئینی می تواند بدلیل تغییر در بیان ژنها بدلیل همزیستی گیاهان تلقیح شده با باکتری ریزوبیوم باشد. سایر صفات مورد بررسی تحت تیمارها از قبیل کلروفیل b، کلروفیل کل، کارتنوئید، قندهای احیاکننده، بیشترین مقدار را در تیمار توأم و تیمار 5 میلی‌مولار سولفات آمونیوم و کمترین مقدار خود را در تیمار شاهد نشان دادند.
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
The effects of NARK gene and nitrogen on growth and leaf protein profile of wild-type and supernodulation mutant of soybean
نویسندگان [English]
- Mehrnaz Mashayekhi 1
- Saeid Mirzaei 2
- Mahmood Maleki 3
- Hossein Mozafari 4
1 Department of Biotechnology, Institute of Science, High technology and Environmental Sciences, Graduate University of Advanced Technology,
2 Department of Biotechnology, Institute of Science, High technology and Environmental Sciences, Graduate University of Advanced Technology
3 Department of Biotechnology, Institute of Science and High Technology and Environmental Science, Graduate University of Advanced Technology, Kerman, Iran.
4 Institute of Science and High Technology and Environmental Sciences, Graduate University of Advanced Technology, Kerman, Iran
چکیده [English]
Nitrogen is one of the most important elements required by plants. Legume crops are of great significance because they can use nitrogen from the atmosphere through biological nitrogen fixation. In the current study, effects of NARK gene and different nitrogen treatments on growth, physiological parameters and protein profile of soybean leaf of supernodulation mutant and wild-type were investigated. For this, a factorial experiment in a completely randomized design with three replications was conducted under greenhouse conditions. Experiment factors included two levels of ammonium (NH4+) and two levels of nitrate (NO3-) for three types of soybean (sterile, wild-type and supernodulating mutant). Results of variance analysis revealed that the treatment of ammonium plus nitrate in comparison with other treatments had the greatest effect on soybean plants in terms of morphological and biochemical parameters. Two-dimensional electrophoresis also showed that sterile plants under 5mM ammonium sulfate treatment had higher protein variation in leaf compared with the soybean wild-type plants inoculated with rhizobia (non-recipient of mineral nitrogen). This variation in the leaf protein profile of plants could be due to type of nitrogen they receive (mineral nitrogen/biological nitrogen fixation). In addition, the protein variation could be due to alteration in genes expression because of symbiosis in inoculated plants with rhizobia. Traits such as chlorophyll b, total chlorophyll, carotenoids, and reduced sugar content, had the highest amount under the ammonium plus nitrate and 5mM ammonium treatments and the lowest amount in control plants.
کلیدواژه‌ها [English]
- Biological nitrogen fixation
- NARK
- Soybean
- protein profile
- nodulation
تأثیر ژن NARK و تیمار نیتروژن بر رشد، و پروفایل پروتئینی برگ در تیپ موتانت سوپر گره‌زا و تیپ وحشی سویا
مهرناز مشایخی1، سعید میرزایی1*، محمود ملکی1 و حسین مظفری2
1 ایران، کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم، تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، پژوهشکده علوم محیطی، گروه بیوتکنولوژی
2 ایران، کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم، تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، پژوهشکده علوم محیطی، گروه اکولوژی
تاریخ دریافت: 26/4/97 تاریخ پذیرش: 25/10/97
چکیده
نیتروژن یکی از مهمترین عناصر مورد نیاز گیاهان می‌باشد. گیاهان لگوم بدلیل دریافت این عنصر از طریق تثبیت بیولوژیک نیتروژن اتمسفر حائز اهمیت فراوان می‌باشند. دراین مطالعه، تأثیر ژن NARK و تیمارهای نیتروژن‌دار بر رشد و پارامترهای فیزیولوژیک و همچنین تغییرات پروتئینی برگ گیاه سویا تیپ وحشی با تیپ موتانت بررسی گردید. بدین منظور، آزمایش گلخانه‌ای به‌صورت فاکتوریل و در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار به اجرا در آمد. تیمارهای آزمایش شامل دو سطح آمونیوم (NH4+) و دو سطح نیترات (NO3-) برای سه تیپ گیاه سویا، استریل (عدم تلقیح با باکتری ریزوبیوم)، وحشی و موتانت سوپر گره‌زا بودند. نتایج تجزیه واریانس نشان داد که تیمار آمونیوم به همراه نیترات نسبت به سایر تیمارها بیشترین تأثیر را بر گیاهان سویا ازنظر شاخص‌های رشد و صفات بیوشیمیایی گذاشته است. الکتروفورز دوبعدی نیز نشان داد که در گیاهان تیپ استریل تحت تیمار 5 میلی‌مولار سولفات آمونیوم تنوع پروتئینی بیشتری در برگ نسبت به گیاهان تیپ وحشی تلقیح شده با باکتری ریزوبیوم (عدم دریافت نیتروژن معدنی) وجود دارد. این تنوع در پروفایل پروتئینی برگ گیاهان میتواند بدلیل نوع نیتروژن دریافتی گیاهان (نیتروژن معدنی/تثبیت بیولوژیک ازت) باشد. علاوه بر این، تنوع پروتئینی میتواند بدلیل تغییر در بیان ژنها بدلیل همزیستی گیاهان تلقیح شده با باکتری ریزوبیوم باشد. سایر صفات موردبررسی تحت تیمارها از قبیل کلروفیل b، کلروفیل کل، کارتنوئید، قندهای احیاکننده، بیشترین مقدار را در تیمار توأم و تیمار 5 میلی‌مولار سولفات آمونیوم و کمترین مقدار خود را در تیمار شاهد نشان دادند.
واژه‌های کلیدی: تثبیت بیولوژیک ازت، NARK، سویا، پروفایل پروتئینی، گرهزایی
* نویسنده مسئول، تلفن: 09133956266، پست الکترونیکی: s.mirzaei@kgut.ac.ir
مقدمه
گیاهان لگوم سومین خانواده بزرگ از گیاهان گلدار هستند که بسیار متنوع است و دارای 800 جنس و 20000 گونه می‌باشد (35). گیاهان این خانواده در سراسر جهان پراکنده شدهاند و از گیاهانی با اندازه بسیار کوچک تا درختان بزرگ را شامل میشود (35). لگوم‌ها بدلیل برقراری همزیستی با باکتری‌هایی که عموماً ریزوبیوم نامیده میشوند دارای اهمیت فراوان می‌باشند (14). لوبیا و سویا از خانواده لگوم به ترتیب جزء اصلی محصولات گیاهی در آمریکا و آسیا می‌باشند که هر دو از 3000 سال پیش اهلی شدهاند (17و 18).
مسلماً نیتروژن مهمترین عنصر مورد نیاز گیاهان و جزء اساسی برای تمامی اسیدهای آمینه و اسیدهای نوکلئیک است. اگرچه جو زمین شامل 78 درصد گاز نیتروژن است اما گیاهان قادر به استفاده از این فرم نیتروژن نیستند (16و 29). گیاهان نیتروژن مورد نیاز خود را به‌صورت نیترات و آمونیوم از خاک دریافت می‌کنند (10). بدون شک تثبیت بیولوژیک نیتروژن (BNF= Biolgical nitrogen fixation) بهترین و مهمترین راهی است که خاک به‌طور طبیعی از نیتروژن سرشار میشود. در طی این فرایند بیولوژیک که توسط باکتری‌ها و به کمک سیستم آنزیمی نیتروژناز صورت می‌گیرد سالانه به‌طور طبیعی مقادیر زیادی نیتروژن اتمسفری به اکوسیستم‌های طبیعی وارد میشود که هیچ‌یک از مشکلات اقتصادی و زیست‌محیطی ناشی از مصرف نامتعادل کودهای شیمیایی نیتروژنه را به همراه ندارد (2). از این منظر گیاهان خانواده لگوم بدلیل توانایی تثبیت بیولوژیک ازت بواسطه همزیستی با باکتری ریزوبیوم و تشکیل گره بر روی ریشه دارای اهمیت فراوان می‌باشند (28و 29). مکانیسم تشکیل گره و کنترل آن در این خانواده (ازجمله سویا) به‌خوبی مطالعه شده است و عوامل مؤثر در این پروسه شناسایی شدهاند. سویا ازجمله لگومهایی است که میتواند بخش عمده نیتروژن مورد نیاز خود را از طریق تثبیت بیولوژیک نیتروژن تأمین نماید. در برخی مطالعات توانایی این همزیستی در تأمین نیتروژن مورد نیاز سویا تا 95 درصد گزارش شده است (2).
ژن‌های شناسایی شده درگیر در گره‌سازی لگوم‌ها از نوع گیرنده شبه‌کینازی (Receptor-like kinase) می‌باشند (28). گیرنده‌های شبه‌کینازی، پروتئینهای غشایی هستند که در سراسر گونه‌ها و سلسله‌ی گیاهان یافت شده است و در بسیاری از فرایندهای گیاهان مانند فعل‌وانفعالات پاتوژن، پذیرش هورمون، توسعه مریستم رأسی و تقسیم سلول، و گره‌سازی درگیر هستند. سویا (گیاهان لگوم) برای رسیدن به یک پایداری بین رشد و نمو و فواید تثبیت بیولوژیک ازت تعداد گره‌هایش را تنظیم می‌کند. این کنترل از طریق سیستم بازخورد خودتنظیمی گرهزایی (AON= Autoregulation of nodulation) صورت می‌گیرد. خودتنظیمی گرهزایی شامل پیام‌رسانی دوردست بین ریشه و ساقه است، به طوریکه رخدادهای آغازین گرهزایی حالت بازدارنده برای مراحل بعدی تشکیل گره دارد. بیشتر جهش‌یافته‌های AON که دارای فنوتیپ فراگره‌زایی یا بیش گرهزایی هستند، ازنظر گرهزایی متحمل به نیترات نیز هستند.
همسانه کردن ژن مسئول فنوتیپ فوق‌گره‌زایی در سویا به نام GmNARK یا گیرنده کینازی خودکنترلی؛ در Lotus معروف به فراگره‌زایی و ریشه‌های غیر نرمال یا HAR1؛ در یونجه به نام SUNN یا تعداد گره فوق‌العاده، نشان داد که یک پروتئین شبه گیرنده کینازی غنی از لوسین، نقش کلیدی را در مسیر پیام‌رسانی AON برعهده دارد. یک جهش نقطه‌ای در این ژنها عامل فنوتیپ جهش‌یافته است (شکل ۱). از دست رفتن کارکرد این سیستم از طریق موتاسیون ها باعث شده که تشکیل گره بیش‌ازحد توسعه پیدا بکند و همچنین مورفولوژی ریشه‌های جانبی نیز تغییر نماید (32).
شکل ۱- ساختار و آلل‌های ژن NARK در سویا. جهش‌ها منجر به از دست رفتن فعالیت ژن NARKو درنتیجه گرهزایی فراوان میشوند (19)
اگرچه رونوشت‌های GmNARK، HAR1 و SUNNدر دو بافت ریشه و ساقه به‌صورت فعال دیده میشوند، آزمایشهای پیوند زدن نشان داده است که فنوتیپ گرهزایی توسط ساقه (بخش هوایی) گیاه کنترل میشود. تاکنون ماهیت پیام‌های ریشه و ساقه ناشناخته مانده است و معلوم نیست که چگونه گیرنده شبه کینازی LRR پیام‌رسانی دوردست را موجب میشود (16). جهش‌یافته‌های GmNARK، HAR1 و SUNN در شرایط عدم تلقیح ریزوبیومی، نسبت به تیپ وحشی دارای ریشه‌های کوتاه‌تر و یا تعداد ریشه‌های جانبی بیشتر هستند. عامل‌های گرهزایی توسط گیرنده‌های کینازی نوع LysM در غشای پلاسمایی دریافت میشوند. در سویا ژن‌های NRF1 و NRF5 این نقش را بر عهده دارند که جهش در این‌ها یا همسانه‌های آنها در نخود‌فرنگی و M .trancatula موجب عدم گرهزایی میشود (22و 23). در ادامه یک گیرنده NBS-LRR، به نام های GmNORK، LjNORK، MsSYMRK، MtDM12 و PsSYM19 به ترتیب از سویا، لوتوس، یونجه، شبدر و نخود اثر نموده و موجب تحریک کانال‌های یونی غشایی، نوکلئوپروتئین‌ها و پروتئین کینازهای کالمادولین وابسته به کلسیم می‌گردند. نشانه ناشناخته ریشه‌ای Q، موجب پیام‌رسانی به برگ میشود که در اثر بیان GmNARK در برگ سرانجام سیگنال بازدارندگی برگی (SDI=Shoot dreived inhibitor) به ریشه می‌آید که اثر بازدارندگی بر گرهزایی دارد (16). تجزیه‌وتحلیل‌های بانک اطلاعاتی مشخص کرد که پروتئینهای پیش‌بینی‌شده برای GmNARK، HAR1، SyM29 و SUNN بسیار مشابه گیرنده شبه کینازی LRR آرابیدوپسیس (CLAVATA1 (AtCLV1)) است،که تکثیر سلول‌های مریستمی ریشه و ساقه را کنترل می‌کند (28و 29).
باتوجه به اهمیت تثبیت بیولوژیک ازت و نقش سویا در تأمین روغن خوراکی مطالعات گوناگونی برای درک عوامل مؤثر بر گرهزایی و رشد گیاه سویا انجام شده است. سایتو و همکاران (2014) نشان دادند که رشد گره بعد از گذشت 7 ساعت از اعمال تیمار نیترات متوقف میشود و همین الگو برای رشد ریشه اصلی نیز مشاهده گردید. در حالیکه رشد ریشه‌های جانبی با اعمال تیمار نیترات افزایش یافت (34). در مطالعه‌ای دیگر مشخص گردید که نیترات کلسیم در بین نمکهای نیتراتی بیشترین تأثیر را بر روی شاخص جوانه‌زنی و شاخص‌های رشدی گیاه سویا دارد (5). محققین دیگر از تکنیک پروتئومیکس برای درک مکانیسم‌های درگیر در استرس شوری، خشکی و غرقابی در گیاه سویا بکار گرفتند (20و 36). بررسی عوامل مؤثر و تعیین ویژگی‌های ژن‌های مؤثر در سازوکار خودتنظیمی گرهزایی، میتواند بینش درستی از فرایند گرهزایی را فراهم نماید.
دراین مطالعه به‌منظور بررسی تأثیر ژن NARK برکارایی توان تثبیت ازت مولکولی توسط باکتری ریزوبیوم همزیست با سویا و همچنین مقایسه تغییرات پروتئینی و فیزیولوژی برگ گیاه سویا تیپ وحشی با تیپ موتانت در سال 1394 آزمایش گلخانه‌ای در دانشگاه تحصیلات تکمیلی، صنعتی و فناوری پیشرفته کرمان به‌صورت فاکتوریل و در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار به اجرا درآمد.
مواد و روشها
کشت گیاهان و اعمال تیمارها: گیاهان کاشته شده در گلدان‌ها، ابتدا به مدت یک هفته با آب مقطر آبیاری شدند، پس از یک هفته رشد گیاهان، از محلول‌های حاوی مقادیر مختلف نیترات پتاسیم (صفر و پنج میلی‌مولار) و سولفات آمونیوم (صفر و پنج میلی‌مولار) جهت تیمار استفاده گردید. محلول‌های مذکور به‌طور روز در میان با حجم 50 میلیلیتر به گلدان‌ها اضافه گردید. قابل‌ذکر است در تمام مدت تیماردهی برای گیاهان استریل از آب مقطر و محلول‌های اتوکلاو شده استفاده گردید. پس از گذشت 4 هفته، از نمونه‌های گیاهی جهت بررسی پارامترهای مورد نظر استفاده گردید (شکل 2).
آزمایش به‌صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار، در محیط کنترل شده گلخانه روی سه تیپ گیاه سویا شامل، رقم وحشی Bragg (حالت استریل و دارای ریزوبیوم) و رقم موتانت NTS انجام گردید. فاکتورهای آزمایش شامل دو سطح 0و 5 میلی‌مولار آمونیوم (NH4+) و دو سطح 0 و 5 میلی‌مولار نیترات (NO3-) بود و از گیاهچه های 30 روزه برای اندازه‌گیری صفات مختلف استفاده شد.
شکل 2- نمایی از گیاهان سویای کشت‌شده در گلخانه تحت تیمارهای آزمایش
تلقیح گیاهان آزمایش با باکتری ریزوبیوم: پس از کشت بذور، باکتری ریزوبیوم سویه CB1809 (تهیه شده از استرالیا) در دو مرحله زمانی به گلدان‌های حاوی گیاهان غیر استریل، به‌منظور القای گرهزایی ریشه‌های سویا داده شد. جهت رشد باکتری ریزوبیوم، 5/0 لیتر از محیط کشت (YMB=Yeast Mannitol Broth) مطابق با جدول ۱ استفاده گردید. به‌منظور رشد باکتری‌ها، محیط حاوی باکتری به شیکر انکوباتور (با دمای 28 درجه سانتی‌گراد و 180 دور در ثانیه) انتقال یافت. پس از گذشت 4 روز،50 میلیلیتر از باکتریهای رشد کرده تا حجم 500 میلیلیتر با آب مقطر رقیق و به هر گلدان به میزان 80 میلیلیتر محلول باکتری داده شد.
جدول 1- مواد تشکیل‌دهنده محیط کشت Yeast Mannitol Broth (YMB)
|
ترکیب مورد استفاده |
غلطت (g/l) |
|
مانیتول (Mannitol) |
2 |
|
عصاره مخمر (Yeast extract) |
5/0 |
|
دی پتاسیم فسفات (K2HPO4) |
5/0 |
|
سولفات منیزیوم هپتا هیدرات (MgSO4.7H2O) |
2/0 |
|
کلرید سدیم (NaCl) |
1/0 |
سنجش پارامترهای مورفولوژیکی گیاهان سویا: پس از 4 هفته از رشد، سنجش پارامترهای مورفولوژیکی انجام شد و شاخص‌هایی از قبیل طول اندام هوایی و ریشه، وزن‌تر اندام هوایی و ریشه، طول میان گره، سطح برگ، تعداد گره، محتوای آب نسبی برگ، موردسنجش قرارگرفت. طول ساقه، از یقه گیاه تا جوانه انتهایی و طول ریشه از یقه گیاه تا نوک ریشه اصلی برحسب سانتی‌متر (cm) با خط کش اندازه‌گیری شد. وزن‌تر اندام هوایی و ریشه در هر گیاه سویا تیمار شده، پس از جدا کردن اندام هوایی و ریشه از یکدیگر، با ترازوی با دقت g 0001/0 سنجش و برحسب گرم بر هر گیاه ارائه گردید.
سنجش محتوای نسبی آب برگ: برای محاسبه درصد نسبی آب بافت برگ، وزن‌تر برگ گیاهان اندازه‌گیری گردید. سپس نمونهها به مدت 5 ساعت در آب دیونایز قرارگرفته و وزن حالت تورگور آنها نیز اندازه‌گیری گردید. بعد نمونهها در فویل آلومینیومی قرار داده شده و به مدت 72 ساعت در آون با دمای 70 درجه سانتی‌گراد خشک گردید. سپس وزن خشک نمونهها با ترازو اندازه‌گیری شد و درصد نسبی آب بافت برگ با استفاده از معادله زیر برحسب درصد محاسبه گردید (38). باتوجه به رشد ریشه گیاهان تحت تیمار در یک محیط هیدروپونیک با محلولB & D (12)، محتوای آب نسبی فقط برای برگ محاسبه گردید.
معادله: محتوای نسبی آب برگ:
100* ( وزن خشک –وزن تورگور / وزن خشک –وزن‌تر) RWC (%) =(Relative Water Content)
سنجش رنگیزه های فتوسنتزی برگ: پس از اعمال 21 روزه تیمارها بر گیاهان رشد یافته در گلدان سنجش میزان رنگیزه های فتوسنتزی در برگ به روش لیختنتالر (1987) انجام پذیرفت (26). در یک سری کاشت و تیمار مستقل، 2/0گرم از برگ سوم تازه در هر گیاه سویا با 15 میلیلیتر استون 80 درصد به خوبی سائیده شده تا بافت برگ به خوبی با استون مخلوط گردد. پس از صاف کردن و سانتریفیوژ مخلوط حاصل، جذب محلول بدست آمده بلافاصله با دستگاه اسپکترو فتومتر 50 carry در طول‌موج‌های 8/646، 20/663 و 470 نانومتر بدست آمد و غلظت رنگیزه‌ها برحسب میکروگرم بر گرم وزن‌تر با استفاده از معادلههای زیر بدست آمد.
8/646A 79/2 - 2/663 A25/12 =chla (کلروفیل a)
2/663A 1/5 - 8/646 A21/21 = chlb (کلروفیل b)
chla + chlb = Tchl (کلروفیل کل)
198/ ( chlb02/85 - chla 8/1 - 470A 1000)= carotenoid (کارتنوئید)
سنجش میزان قندهای احیاکننده در اندام هوایی: برای سنجش میزان قندهای احیاکننده از روش سوموگی (1952) استفاده شد (37). 2/0 گرم از اندام هوایی گیاه با 10 میلیلیتر آب مقطر در هاون چینی سائیده شد. سپس محتوای هاون به بشر کوچکی منتقل گردید و روی اجاق‌برقی حرارت داده شد. به‌محض اینکه محلول به نقطه‌جوش رسید، حرارت قطع گردیده و محتوای بشر توسط دستگاه سانتریفیوژ صاف شد و عصاره گیاهی حاوی قند‌ها به دست آمد. مقدار 2 میلیلیتر از هریک از عصاره‌های تهیه شده به لوله آزمایش منتقل شد و پس از افزودن 2 میلیلیتر محلول سولفات مس به آنها، سر لوله‌ها با پنبه بسته شد و به مدت 20 دقیقه در حمام آب گرم (بن ماری) با دمای 100 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. سپس 2 میلیلیتر محلول فسفو مولیبدیک اسید به آنها اضافه و شدت جذب محلول‌ها در طول‌موج 600 نانومتر توسط دستگاه اسپکترو فتومتر تعیین شد. درنهایت با استفاده از منحنی استاندارد غلظت قندهای احیاکننده محاسبه و مقدار قندهای احیاکننده برحسب میلی‌گرم بر گرم وزن‌تر ارائه گردیدند.
سنجش اسیدآمینه پرولین در اندام هوایی: برای اندازه‌گیری پرولین از روش بیتس و همکاران (1973) استفاده شد (9). 02/0 گرم از بافت فریز شده گیاه (ساقه و برگ) در 10 میلیلیتر محلول 3 درصد سولفوسالیسیلیک اسید سائیده و عصاره حاصل به مدت 5 دقیقه در g 10000 سانتریفوژ شد. سپس 2 میلیلیتر از مایع رویی را با 2 میلیلیتر معرف نین هیدرین و 2 میلیلیتر استیک اسید خالص مخلوط کرده و یک ساعت در دمای 100 درجه سانتی‌گراد در حمام آب گرم قرارگرفت سپس بلافاصله لوله‌های محتوی مخلوط در حمام یخ سرد گردید. بعد 4 میلیلیتر تولوئن به مخلوط اضافه گردید و لوله‌ها به خوبی تکان داده شد. با ثابت نگه‌داشتن لوله‌ها به مدت 15 تا 20 ثانیه دو لایه مجزا تشکیل شد. میزان جذب لایه‌ی رنگی فوقانی که حاوی تولوئن و پرولین بود در 518 نانومتر تعیین شد و با استفاده از منحنی استاندارد پرولین، نتایج برحسب میلی‌گرم بر گرم وزن‌تر محاسبه گردید.
سنجش مقدار آمینواسید های آزاد (FAA) در اندام هوایی: عصارهگیری نمونهها: میزان آمینواسیدهای آزاد به روش رنگسنجی و با استفاده از معرف نین هیدرین اندازه‌گیری شد (21). 2/0 گرم بافت تازه گیاهی در 5 میلیلیتر بافر پتاسیم فسفات سرد 50 میلی‌مولار (8/6 =pH ) سائیده شد. مخلوط حاصل به مدت 30 دقیقه در 10000 دور در دقیقه سانتریفوژ گردید. میزان جذب محلول رویی جذب نمونهها در طول‌موج 570 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری و مقدار آمینواسیدهای آزاد با استفاده از منحنی استاندارد گلیسین محاسبه شد (21).
سنجش پروتئین کل در اندام هوایی: جهت سنجش مقدار پروتئین کل از روش بردفورد (1976) استفاده شد (11). به این منظور به لوله‌های آزمایش مقدار 1/0 میلیلیتر عصاره پروتئینی، 5 میلیلیتر معرف بیوره افزوده و سریعاً ورتکس گردید. پس از دو دقیقه و قبل از یک ساعت جذب محلول‌ها با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول‌موج 595 نانومتر خوانده شد و غلظت پروتئین با استفاده از منحنی استاندارد آلبومین محاسبه و برحسب میلی‌گرم بر گرم وزن‌تر محاسبه گردید.
انجام آزمایش پروتئومیکس: استخراج پروتئین از بافت برگی براساس روش دامروال و همکاران (1986) با اندکی تغییرات انجام گرفت (13). ابتدا مقدار 1 گرم از بافت گیاهی که در فریزر 80- درجه سانتی‌گراد نگهداری میشد، در هاون با استفاده از ازت مایع به خوبی ساییده شد. سپس مقدار 10 میلیلیتر محلول استون حاوی 10 درصد تری کلرواستیک اسید (TCA)و 5/0 درصد β-مرکاپتواتانول که از قبل طبق جدول 2 تهیه و در دمای 50- درجه سانتی‌گراد قرارگرفته بود، به پودر ساییده شده اضافه شد. مخلوط در هاون مجدداً ساییده و سپس به لوله‌های سانتریفیوژ منتقل شد. مخلوط بدست آمده سپس در 20- درجه سانتی‌گراد به مدت حداقل 2 ساعت تحت تیمار قرار گرفتند تا پروتئینها به‌طور کامل رسوب کنند. حضور TCA در استون سبب رسوب کامل پروتئینها میشود. پس‌ازاینکه پروتئینها به‌طور کامل رسوب نمودند، نمونهها به سانتریفیوژ منتقل شدند و در دمای 4 درجه به مدت 15 دقیقه در دور 17000 سانتریفیوژ انجام گرفت. در این مرحله مایع رویی به‌آرامی دور ریخته شد و به رسوب حاوی پروتئین، 10 میلیلیتر محلول شستشوی اضافه شد (جدول ۲)، تا رسوب به‌صورت سوسپانسیون درآید. نمونهها سپس به مدت 1 ساعت دردمای 20- درجه سانتی‌گراد قرارگرفته تا پروتئینها به‌طور کامل رسوب نمایند. مجدداً نمونههادردمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه در دور 12000 سانتریفیوژ شدند. این مرحله (مرحله شستشو) دو بار دیگر به‌منظور برطرف نمودن آلودگیهای غیرپروتئینی موجود در رسوب پروتئینی تکرار شد و درنهایت رسوب بدست آمده با استفاده از دستگاه لیوفیلایزر خشک گردید، تا بقایای استون موجود در رسوب بطور کامل حذف شود. پس از خشک نمودن رسوب میتوان رسوب را در فریزر 80- به مدت نامحدودی نگهداری نمود. برای استخراج پروتئینهای موجود در رسوب لیوفیلایز شده میزان 50 میکرو لیتر به ازاء هر 1 میلی‌گرم پودر لیوفیلاز شده (µl/mg50)، محلول Lysis (9M Urea, 4%w/v CHAPS, 35mM, Tris, 1%w/v DTT, 1%v/v Ampholyte pH 3-10) اضافه شد. پس از یک ساعت ورتکس مداوم در دمای اتاق مجدداً در دمای 15 درجه سانتی‌گراد و دور 12000 سانتریفیوژ انجام گرفت. این بار مایع روئی (سوپرناتانت) برداشته و رسوب دور ریخته شد. مایع روئی در حقیقت عصاره پروتئینی است که پس از تعیین غلظت آن میتوان از آن به‌طور مستقیم استفاده نمود.
جدول ۲- محلول شست‌وشو پروتئین استخراج شده (حجم 10 میلیلیتر)
|
مقدار |
ماده |
|
70 میلی‌گرم |
ددت (DTT) |
|
100 میلیلیتر |
استون (Aceton) |
روش‌های آنالیز آماری: داده‌های کمی بدست آمده از این آزمایش با استفاده از نرم‌افزار SPSS (نسخه ۱۵) و Excel مورد تجزیه‌وتحلیل آماری قرار گرفتند. جهت این امر با استفاده از آنالیز واریانس و توزیع F مقایسه میانگین‌ها در سطح معنی‌دار 5 درصد صورت گرفت و همچنین برای مقایسه بهتر از آزمون چند دامنه‌ای دانکن استفاده شد.
نتایج
پارامترهای رشد و فیزیولوژیک: نتایج کلی تجزیه واریانس نشان داد که در هر سه تیپ گیاه سویا، رقم Bragg (استریل و دارای ریزوبیوم) و موتانت NTS، رشد اندام‌های هوایی نسبت به ریشه تحت تیمارها افزایش بیشتری داشت. وزن‌تر ریشه نسبت به وزن‌تر ساقه در مرحله یک ماه پس از کشت در هر سه تیپ گیاه سویا مقدار بیشتری نشان داد (جدول ۳).
بررسی دقیق‌تر مقایسه میانگینهای مربوط به رشد طولی اندام هوایی بیان می‌کند که کاربرد توأم نمکهای نیترات و آمونیوم در گیاهان موتانت NTS موجب یک افزایش معنی‌دار تقریباً 82 درصدی نسبت به شرایط کنترل در رقم Bragg شده است (شکل 3). البته این تیمار توأم در رقم Bragg نیز موجب افزایش 52 درصدی نسبت به شرایط کنترل شد. این افزایش‌ها در میزان رشد طولی نشان می‌دهد تأثیر متقابل نیترات و آمونیوم بر رشد طولی اندام هوایی به‌ویژه در موتانت NTS کاملاً معنی‌دار و چشمگیر بوده است (شکل ۳).
شکل ۳- مقایسه تغییرات رشد طولی اندام هوایی در گیاهان سه تیپ سویا مطالعه شده تحت تیمارهای مختلف نیتروژن‌دار در محیط کشت پرلیت در سطح معنی‌دار 5 درصد که با استفاده از آنالیز واریانس و آزمون چند دامنه‌ای دانکن بدست آمده است. Error Bar هر نمودار تغییرات خطای استاندارد (SE) را نشان می‌دهد. حروف لاتین متفاوت نیز در بالای نمودار‌ها بیانگر اختلاف معنی‌دار بین تیمارها می‌باشد
تأثیر تیمارها بر رشد طولی ریشه چندان قابل‌توجه نبود (جدول 3) و فقط تیمار نیترات پتاسیم در موتانت NTS موجب افزایش 20 درصدی رشد طولی ریشه نسبت به گیاهان کنترل گردید. در سایر تیمارها و ارقام مورد مطالعه تأثیر تیمارها بر این پارامتر رشد معنی‌دار نبود.
بررسی داده‌های مربوط به وزن‌تر اندام هوایی نمونه‌های تحت تیمار در شکل ۴ بیان می‌کند که بیشترین مقادیر مربوط به تیمار توأم نیترات و آمونیوم مربوط به رقم Bragg و موتانت NTS می‌باشد. میزان افزایش وزن‌تر این ارقام نسبت به شاهد Bragg در حدود 5/1 برابر است که بسیار قابل‌توجه و معنی‌دار بود. لازم به ذکر است که کاربرد تیمار جداگانه حاوی نیترات یا آمونیوم در موتانت NTS تأثیر معنیداری بر وزن‌تر اندام هوایی نداشته است. در مورد تغییرات وزن‌تر ریشه هم باید گفت که اثر متقابل معنی‌دار در رقم Bragg و موتانت NTS تحت تیمار توأم حاوی مواد نیتروژن‌دار مشاهده شد (جدول 3). بیشترین مقدار وزن‌تر هم مربوط به تیمار حاوی 5 میلی‌مولار از هر دو ماده نیترات پتاسیم و سولفات آمونیوم بود که افزایشی در حدود 46 درصد نسبت به رقم Bragg شاهد از خود نشان داد.
شاخص کلروفیل b، کلروفیل کل و کارتنوئید در دو تیمار 5 میلی‌مولار سولفات آمونیوم و تیمار توأم 5 میلی‌مولار (نیترات پتاسیم، سولفات آمونیوم) بیشترین مقدار و در تیمار شاهد کمترین مقدار را دارا بودند، و همچنین میزان کلروفیل کل ارقام در مقایسه با کلروفیل b بیشتر بود (جدول ۳).
تغییرات میزان کارتنوئیدهای برگی تحت تیمارهای آزمایش قابل‌توجه بود (جدول 3) به‌ویژه در موتانت NTS تحت تیمار توأم دو ماده گفته شده که یک افزایش تقریبی چهار برابری نسبت به شاهد مشاهده شد و در دو رقم دیگر نیز افزایش در میزان کارتنوئیدها نیز نسبت به شرایط کنترل معنی‌دار بود.
شکل ۴- مقایسه تغییرات وزن‌تر ساقه در گیاهان سه تیپ سویا مطالعه شده تحت تیمارهای مختلف نیتروژن‌دار در محیط کشت پرلیت در سطح معنی‌دار 1 درصد که با استفاده از آنالیز واریانس و آزمون چند دامنه‌ای دانکن بدست آمده است. Error Bar هر نمودار تغییرات خطای استاندارد (SE) را نشان می‌دهد. حروف لاتین متفاوت نیز در بالای نمودار‌ها بیانگر اختلاف معنی‌دار بین تیمارها می‌باشد
جدول ۳- نتایج تجزیه واریانس پس از نرمال‌سازی دادهها در سطح معنی‌دار 05/0 α = و 01/0 α =(صفات مورفولوژیک)
|
میانگین مربعات |
|||||||||
|
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
طول اندام هوایی |
طول ریشه |
میان گره |
وزن‌تر ساقه |
وزن‌تر ریشه |
تعداد گره |
سطح برگ |
محتوای نسبی آب |
|
رقم |
2 |
**339/93 |
**75/126 |
**105/5 |
**137/1 |
**362/7 |
**9/9993 |
**8/579 |
**558/233 |
|
نیترات |
1 |
**738/94 |
**44/205 |
*859/1 |
**522/3 |
**235/2 |
**804/1270 |
**5/2047 |
*582/183 |
|
آمونیوم |
1 |
**28/260 |
ns 36 |
**183/5 |
**452/4 |
**545/0 |
**5/4402 |
**8/1475 |
**763/545 |
|
رقم*نیترات |
2 |
**094/32 |
ns 74/24 |
ns 184/0 |
**458/0 |
**181/1 |
**27/552 |
**81/759 |
ns 493/71 |
|
رقم*آمونیوم |
2 |
ns28/0 |
ns 963/20 |
ns 099/0 |
ns 022/0 |
**847/0 |
**2/2486 |
ns 29/26 |
**266/541 |
|
نیترات*آمونیوم |
1 |
ns 538/0 |
*04/104 |
ns 021/0 |
*118/0 |
*378/0 |
ns 209/7 |
ns 507/2 |
*961/170 |
|
رقم*نیترات*آمونیوم |
2 |
*919/19 |
ns 243/8 |
ns 023/0 |
**31/0 |
**406/0 |
*36/193 |
*25/424 |
**106/122 |
|
خطا |
24 |
366/4 |
37/15 |
296/0 |
026/0 |
071/0 |
081/45 |
25/108 |
214/40 |
ادامه جدول 3- نتایج تجزیه واریانس پس از نرمال‌سازی دادهها در سطح معنی‌دار 05/0 α = و 01/0 α =(صفات فیزیولوژیک و بیوشیمیایی)
|
میانگین مربعات |
|||||||||
|
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
کلروفیل a |
کلروفیل b |
کلروفیل کل |
کارتنوئید |
قندهای احیاکننده |
پروتئین کل |
آمینواسید های آزاد |
پرولین |
|
رقم |
2 |
ns063/26 |
ns 474/1 |
ns 28/28 |
ns 93/2 |
ns 08/0 |
**049/0 |
*144/0 |
*097/0 |
|
نیترات |
1 |
ns 05/61 |
ns 105/10 |
ns 48/21 |
ns 361/5 |
**528/1 |
ns 018/0 |
ns 078/0 |
ns 013/0 |
|
آمونیوم |
1 |
**6/5964 |
**55/445 |
**0/9696 |
**361/311 |
ns 359/0 |
**087/0 |
**039/1 |
ns 082/0 |
|
رقم*نیترات |
2 |
ns 69/99 |
ns 361/4 |
ns 6/116 |
**626/21 |
ns 261/0 |
**081/0 |
ns 003/0 |
**281/0 |
|
رقم*آمونیوم |
2 |
ns 74/40 |
ns 618/1 |
ns 29/53 |
ns 258/9 |
ns 144/0 |
ns 016/0 |
**297/0 |
ns 008/0 |
|
نیترات*آمونیوم |
1 |
ns 521/0 |
*793/23 |
ns 35/31 |
ns 005/0 |
ns 013/0 |
ns 018/0 |
ns 056/0 |
ns 008/0 |
|
رقم*نیترات*آمونیوم |
2 |
ns 12/40 |
ns 184/4 |
ns 42/34 |
*758/15 |
**686/0 |
**076/0 |
**349/0 |
ns 048/0 |
|
خطا |
23 |
086/30 |
788/4 |
29/49 |
01/3 |
095/0 |
007/0 |
034/0 |
02/0 |
همچنین یک افزایش مشابه نیز در رقم Bragg استریل هم در تیمار آمونیوم رخ داد. این مقایسه‌ها ثابت می‌کند تأثیر تیمارهای آزمایش مانند تیمار توأم حاوی هر دو ماده نیترات و آمونیوم قابل‌توجه بوده است (جدول 3). لازم است در مقایسه میانگین کارتنوئیدها، تأثیر تیمار حاوی آمونیوم تنها با تیمار توأم هر دو ماده تأکید شود که قبلاً انجام شده است. تیمار نیترات تنها بر محتوای کارتنوئیدها تأثیر معنی‌دار نداشته است (شکل ۵).
شکل ۵- مقایسه تغییرات کارتنوئید در گیاهان سه تیپ سویا مطالعه شده تحت تیمارهای مختلف نیتروژن‌دار در محیط کشت پرلیت در سطح معنی‌دار 5 درصد که با استفاده از آنالیز واریانس و آزمون چند دامنه‌ای دانکن بدست آمده است. Error Bar هر نمودار تغییرات خطای استاندارد (SE) را نشان می‌دهد. حروف لاتین متفاوت نیز در بالای نمودار‌ها بیانگر اختلاف معنی‌دار بین تیمارها می‌باشد
علاوه براین،نتایج نشان داد قندهای احیاکننده تحت تیمار سولفات آمونیوم افزایش بیشتری در مقایسه با تیمار نیترات پتاسیم داشتند. بیشترین مقدار پروتئین کل در دو تیمار توأم و 5 میلی‌مولار سولفات آمونیوم مربوط به تیپ گیاه سویا دارای ریزوبیوم و کمترین مقدار در تیمار شاهد مربوط به Bragg استریل بود (جدول ۳).
داده‌های حاصل از شمارش گره‌ها نیز نشان داد که تیمار توأم نیترات و آمونیوم در دو رقم Bragg و NTS منجر به کاهش چشمگیر در تعداد گره‌ها گردید (جدول 3) و این میزان کاهش معنی‌دار به ترتیب برای دورق8/13 و 38 درصد بود (شکل ۶).
مقدار اسیدآمینه پرولین در Bragg استریل و در تیمار 5 میلی‌مولار نیترات پتاسیم حداکثر و همچنین دارای تفاوت معنی‌دار نسبت به بقیه تیمارها بود. کمترین مقدار این اسیدآمینه درNTS در تیمار توأم مشاهده شد. شاخص اسیدآمینه های آزاد در هر سه تیپ در دو تیمار توأم و 5 میلی‌مولارسولفات آمونیوم بیشترین مقدار و در تیمار شاهد کمترین مقدار را دارا بود. به‌طور کلی اکثر صفات بررسی‌شده تحت تیمارها، بیشترین مقدار را در تیمار توأم و تیمار 5 میلی‌مولار سولفات آمونیوم و کمترین مقدار خود را در تیمار شاهد نشان دادند (جدول ۳).
پروفایل پروتئینی: نتایج حاصل از الکتروفورز دوبعدی دو نمونه تیپ وحشی سویا تلقیح شده با باکتری ریزوبیوم تحت تیمار شاهد (B0) و تیپ وحشی سویا تحت شرایط استریل بدون تلقیح شدن با باکتری ریزوبیوم تحت تیمار 5 میلی‌مولار آمونیوم (BS5) در شکل 7 نشان داده شده است. در نمونه‌های الکتروفورز شده بطور میانگین 202 لکه پروتئینی مشاهده گردید. در ژل الکتروفورز شده نمونه B0 تعداد 41 لکه پروتئینی در pH:4-5، 118 لکه در pH:5-6 و 35 لکه در pH:6-7 دیده شد.
شکل ۶- مقایسه تغییرات تعداد گره در ریشه گیاهان سه تیپ سویا مطالعه شده تحت تیمارهای مختلف نیتروژن‌دار در محیط کشت پرلیت در سطح معنی‌دار 5 درصد که با استفاده از آنالیز واریانس و آزمون چند دامنه‌ای دانکن بدست آمده است. Error Bar هر نمودار تغییرات خطای استاندارد (SE) را نشان می‌دهد. حروف لاتین متفاوت نیز در بالای نمودار‌ها بیانگر اختلاف معنی‌دار بین تیمارها می‌باشد.
شکل7- الگو بیان پروتئینی در برگ سویا. A: الگو بیان پروتئین برگ تحت تیمار B0 (عدم دریافت نیتروژن معدنی)، B: الگو بیان پروتئین برگ تحت تیمار BS5 (دریافت 5 میلی‌مولار (NH4(SO4)2 هستند. لکه‌های پاسخ‌دهنده با شماره مشخص شدهاند.
همچنین از مجموع لکه‌های پروتئینی دیده شده در ژل BS5، تعداد 72 لکه در pH:4-5، 98 لکه در pH:5-6 و 41 لکه پروتئینی نیز در pH:6-7 مشاهده شد. به‌طور کلی در هر دو ژل الکتروفورز شده B0 و BS5 تعداد لکه‌های پروتئینی تفکیک شده به ترتیب در pH:5-6>pH:4-5>pH:6-7 قرار داشتند. نتایج دو نمونه الکتروفورز شده B0 و BS5نشان می‌دهد که تعداد لکه‌های پروتئینی تفکیک شده در pH های متفاوت در ژل مربوط به نمونه BS5 نسبت به نمونه B0 بیشتر است. موسوی و همکاران در سال 1390 نشان دادند که، با افزایش غلظت NH4NO3 افزایش معنیداری در میزان پروتئین کل اندام هوایی و اسیدآمینه‌های آزاد گیاه نخود دیده میشود. به‌طوری که کمترین مقدار پروتئین (45/0) در گروه تیماری با غلظت صفر NH4NO3 و بیشترین مقدار پروتئین (53/0) در گروه تیماری با غلظت 40 میلی‌مول بر لیتر NH4NO3مشاهده شد (1). نتایج این پژوهش نیز نشان داد که، گیاهان BS5 تحت تیمار 5 میلی‌مولار NH4(SO4)2 پروتئین بیشتر و متنوع‌تری در برگ خود نسبت به گیاهان B0 تحت تیمار شاهد ( عدم دریافت نیتروژن معدنی) نشان دادند.
با مقایسه کیفی دو ژل بدست آمده در شرایط تلقیح شده با باکتری ریزوبیوم (B0) و تیمار با پنج میلی‌مولار آمونیوم (BS5) حداقل 11 لکه شناسایی شدند که 9 لکه بیان آنها در شرایط B5 آنقدر کم بود که بر روی ژل قابل مشاهده نبودند و میتوان گفت فقط در شرایط B0 بیان شدند و 2 لکه هم فقط در شرایط B5 بیان شدند (جدول 4). هرچند که آنالیز پروتئومیکس به‌صورت تکرار دار صورت نگرفته است، با این حال میتوان میتوان نتیجه گرفت که در صورتی که الکتروفورز دوبعدی به صورت کمی صورت پذیرد و دادهها به صورت کمی درآیند، قطعاً نتایج بسیار خوبی حاصل خواهد شد.
جدول 4- مشخصات لکه‌هایی که به صورت کیفی به‌عنوان لکه‌های پاسخ‌دهنده به شرایط تیمار 5 میلی‌مولار آمونیوم شناسایی شدهاند
|
شماره لکه |
وزن مولکولی بدست آمده |
نقطه ایزو الکتریک بدست آمده |
شرایط B0 |
شرایط B5 |
|
1 |
45 |
39/5 |
+ |
|
|
2 |
48 |
78/5 |
+ |
|
|
3 |
44 |
70/5 |
+ |
|
|
4 |
52 |
79/5 |
+ |
|
|
5 |
46 |
96/5 |
|
+ |
|
6 |
46 |
09/6 |
+ |
|
|
7 |
26 |
62/5 |
+ |
|
|
8 |
28 |
75/5 |
+ |
|
|
9 |
29 |
63/5 |
|
+ |
|
10 |
36 |
58/5 |
+ |
|
|
11 |
20 |
02/6 |
+ |
|
بحث و نتیجه‌گیری
پارامترهای رشد: نیتروژن یکی از مهمترین عوامل محـدودکننـده تولیـد محصولات زراعی است. میانگین مقدار نیتـروژن در مـاده خشک گیاهان 2-1 درصد و گـاهی بـه 6-4 درصـد نیـز می‌رسد. نیتروژن در بین 16 عنصر مورد نیاز گیاهان ازنظر اهمیت در جای چهارم قـرار دارد. مـیتـوان گفـت هـیچ جایی نیست که در آن کمبود نیتروژن وجود نداشته باشـد به‌جز در مورد گیاهان لگومینوز عکس‌العمل گیاهان نسبت به کودهای نیتروژنه بیش از هر ماده غذایی دیگری است (30و 31). سویا میتواند از هر دو روش: تثبیت بیولوژیکی نیتروژن در گره‌های ریشه و جذب نیتروژن معدنی از خاک برای نیاز نیتروژنی نسبتاً بالای خود استفاده کند. سویا ازجمله لگوم هایی است که برای تولید محصول احتیاج به مقادیر فراوانی نیتروژن دارد. اگر سیستم همزیستی در این گیاه به کارایی بالایی رسانده شود، سویا به کود نیتروژنه پاسخ مثبت نشان نمی‌دهد. کاربرد بیش‌ازحد ترکیبات نیتروژنه بخصوص آمونیوم در گیاهان خانواده لگومینه، ازجمله سویا به‌عنوان مهارکننده قوی گرهزایی، رشد و تثبیت نیتروژن شناخته شده است (30و 33).
بیشتر گیاهان اغلب نیتروژن را از محلول خاک به صورت یون نیترات معدنی (NO3) و در موارد کمتری به صورت یون آمونیوم (NH4) جذب می‌کنند، این موضوع به سبب اکسایش میکروبی آمونیوم در خاک و همچنین اثرات ترکیبی اسیدی شدن ناحیه ریشه است، که بدلیل تجمع بیش‌ازحد کاتیونها نسبت به آنیونهادر طول جذب آمونیوم و نیز اثرات سمی آمونیوم آزاد در بافت گیاه می‌باشد. پس در گیاه NO3 قبل از ورود به داخل آمینواسیدها، پروتئینها و سایر مولکول‌های نیتروژنی بهNH4 احیا میشود (8). فرم نیتروژن که توسط گیاه استفاده میشود، همبستگی به بارندگی و pH خاک دارد. در خاکهای اسیدی جذب (NH4) مطلوب بوده و جذبNO3 کاهش می‌یابد (2). در مطالعه‌ای مشخص گردید که غلظت بالای نیترات برای رشد و توسعه گرهزایی، رشد ریشه‌های اولیه، ریشه‌های جانبی و همچنین تثبیت نیتروژن یک عامل محدودکننده است (27). در این پژوهش بررسی نتایج حاصل از سنجش پارامترهای رشد، شامل رشد طولی، وزن‌تر ساقه، سطح برگ و طول میان گره نشان داد که به‌طور کلی تیمار توأم سولفات آمونیوم همراه با نیترات پتاسیم موجب افزایش معنی‌دار پارامترهای رشدی همچون رشد طولی ساقه، سطح برگ و طول میان گره نسبت به شاهد گردید. نتایج حاصل از تجزیه واریانس رشد طولی اندام هوایی نشان داد که گیاهان رقم موتانت NTS، تحت تیمار توأم حداکثر رشد اندام هوایی را دارا بودند، این افزایش رشد نسبت به گیاهان تیپ شاهد خودشان و دو تیمار دیگر در سطح 5 درصد معنی‌دار بود. همچنین رقم موتانت NTS در تیمار آمونیوم همراه با نیترات بیشترین طول میان گره‌ها را نسبت به شاهد و گیاهان تحت سایر تیمارها به خود اختصاص داد، که این افزایش طول باعث معنی‌دار شدن این پارامتر در سطح 5 درصد شد. کاربرد توأم نیترات و آمونیوم موجب بهبود و افزایش چشمگیر شاخص سطح برگ گردید و سطح برگ در رقم Bragg دارای ریزوبیوم را به 33/81 سانتی‌متر مربع رساند که این میزان از حد شاهد 66/36 بطور قابل‌ملاحظه‌ای بیشتر می‌باشد.
مطالعه اثرات دو تیمار 5 و 30 میلی‌مولار سولفات آمونیوم در گیاه سویا پس از تلقیح با باکتری ریزوبیوم نشان داد کاربرد تیمار 5 میلی‌مولار سولفات آمونیوم در مقایسه با شاهد به‌طور قابل‌توجهی باعث افزایش پارامترهای رشد از قبیل رشد اندام هوایی وزن‌تر ساقه و سطح برگ شد و در تیمار 30 میلی‌مولار بیومس گیاهی، نرخ فتوسنتز خالص و هدایت روزنه‌ای بسیار مشابه بود بازمانی که گیاهان با محدودیت نیتروژن مواجه بودند (40).
باتوجه به مقایسه میانگین بین تیمارهای نوع و میزان ترکیبات نیتروژن‌دار و سطوح تلقیح، در بین گیاهان سویا ازنظر تعداد گره اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد مشاهده گردید. در هر چهار تیمار نیتروژن‌دار، تعداد گره بر روی ریشه‌های گیاهان استریل تیپ وحشی سویا که با باکتری ریزوبیوم تلقیح نشده بودند، صفر بود. در مورد دو تیپ دیگر سویا یعنی موتانت NTS وBragg که با باکتری ریزوبیوم تلقیح شدند، نتایج تجزیه واریانس نشان داد که، بین تیمارها و همچنین تیپ‌های سویا در سطح 5 درصد تفاوت معنی‌دار وجود دارد. از میان چهار تیمار بیشترین تعداد گره سطح ریشه را گیاهان تحت تیمار شاهد دارا بودند. زمانیکه گیاهان سویا منبع نیتروژنی خارجی دریافت کردند، از تعداد گره‌های سطح ریشه آنها کاسته شد و به وزن گره و طول ریشهشان افزوده گردید. همچنین نتایج نشان داد که تیمار آمونیوم تعداد گره را بیشتر از کودهای نیترات تحت تأثیر خود قرار داده است، چرا که در تیمارهای آمونیوم و توأم کمترین تعداد گره مشاهده گردید. از بین دو رقم سویا، رقم موتانت NTSنیز در مقایسه با تیپ وحشی تلقیح شده با ریزوبیوم، بیشترین تعداد گره را بر سطح ریشه خود داشتند.
گزارش شده است که در غلظت‌های کم، نیتروژن از طریق تحریک تشکیل گره، تحریک فعالیت نیتروژناز و افزایش رشد گیاه بر تثبیت نیتروژن اثر تشدیدکنندگی دارد. افزودن مقدار زیاد نیتروژن باعث کاهش نفوذ باکتری به تارهای کشنده ریشه، کاهش تعداد و توده گره، و کاهش فعالیت تثبیت نیتروژن ریشه‌های گره‌دار و مقدار نیتروژن کل تثبیت شده در سویا و لپه هندی می‌گردد. اما درجه بازدارندگی به فرم ترکیبات نیتروژنه، جنس، رقم، سوش باکتری ریزوبیوم، فصل، شدت نور، درجه حرارت و شرایط تغذیه گره‌ها بستگی دارد (15).
نتایج قلیزاده و همکاران در سال 1386 نشان دادند که، وجـود بالاترین وزن گره و تعداد گره در روی ریشه یونجههـایی که با محلول غذایی محتوی 1 میلی‌مول نیترات پتاسیم و 1 میلی‌مول فسفات آمونیوم رشد نمودند نیاز گیاه یونجـه را به مقدار کمی از مکمل نیتروژن معدنی در اوایل رشد گیاه تأیید می‌کند (7). دلایل و مکانیسم‌های چگونگی بازدارنـدگی اثر کودهای نیتروژنه از مدتها پیش مورد مطالعه قرارگرفته است نرسیدن محصول فتوسـنتز بـه گـره‌هـا باعـث عـدم تشکیل گره در روی ریشه مـی‌شـود، زیـرا کربوهیـدرات حاصل همراه نیتـروژن معـدنی قبـل از بـه کـار رفـتن در تشکیل گره بـه مصـرف رشـد گیـاه می‌رسد (7). در مطالعه‌ای دیگر مشخص گردید که در گیاه سویا اختلاف معنیداری بین فرم نیتروژن به‌صورت آمونیوم یـا نیتـرات در انتقـال مـواد فتوسنتزی به گـره‌هـا وجـود ندارد. ایـن مسئله نشـان می‌دهد که هر دو منبع نیتروژنی می‌توانند به‌طور تقریباً یکسان جریان انرژی را به گره‌ها کاهش دهنـد امـا نیتـرات اثـر بیشتری بر روی فعالیـت آنـزیم نیتروژنـاز دارد. از طـرف دیگر، آمونیوم به احتمال زیـاد تأثیر بیشـتری را بـر روی تشکیل گره داشته باشد. از نقطه نظر ژنتیکی، مسیر اصلی کنترل گرهزایی تحت عنوان خود تنظیمی گرهزایی یا AONخوانده میشود که شامل پیام‌رسانی بین ریشه و ساقه است (27).
مطالعات نشان داده است، در ارقام وحشی سویا، هنگامی که ریشه سویا به باکتری برادی ریزوبیوم آلوده میشود، سیگنالهایی در ریشه سنتز میشود و پیام‌های ریشه‌ای ناشی از تحریک ریزوبیومی منجر به فعال شدن گیرنده شبه کینازی غنی ازLRRدر شاخه میشود که این گیرنده به‌نوبه خود یک بازدارنده گره را در ساقه تولید می‌کند. به عبارت ساده‌تر، نشانه ناشناخته ریشه‌ایQ، موجب پیام‌رسانی برگ میشود که در اثر بیان GmNARK در برگ سرانجام علامت بازدارندگی برگی (SDI) به ریشه می‌آید که اثر بازدارندگی بر گرهزایی دارد و تعداد گره در ریشه را تنظیم می‌کند (16).
تاکنون ماهیت پیام‌های ریشه و ساقه شناخته نشده است و معلوم نیست که چگونه گیرنده شبه کینازی LRR پیام‌رسانی دوردست را موجب میشود بررسی‌های زیادی با روش ژنتیک مستقیم جهت شناسایی ژن‌های درگیر در گرهزایی انجام شده است. در سویا ژن‌هایNRF1 و NRF5 این نقش را بر عهده دارند، که جهش در این‌ها موجب عدم گرهزایی میشود (16، 22و 23).
پارامترهای فیزیولوژی: مطالعات قبلی نشان داده است که تأمین نیتروژن بهینه میتواند رشد گیاه را تحریک کند (4و 6). حدود 70 درصد از نیتروژن برگ گیاهان در کلروپلاست وجود دارد و بیشتر برای دستگاههای فتوسنتزی استفاده میشود. تأمین نیتروژن برای عملکرد دستگاه فتوسنتز کننده خیلی مهم است. تجربیات نشان داده است که تأمین کردن 5 میلی‌مولار از NH4(SO4) به سویا تلقیح شده با ریزوبیوم حداکثر محتوای رنگدانه های فتوسنتزی (کلروفیل)، نرخ فتوسنتز خالص، هدایت روزنه‌ای، بهره‌وری کربوکسیلاسیون همراه با حداقل کربن، حداکثر بهره‌وری فتوشیمیایی از فتوسیستم II و زیست توده را در مقایسه با گیاهان شاهد در پی داشته است، به طوری که افزایش مختلف محتوای کلروفیل a و b منجر به تفاوت در نسبت کلروفیل a/b در بین تیمارها شد. برای گیاهان رشد یافته تحت تیمار 5 میلی مولار آمونیوم کلروفیل (a+b) در تمامی تکرارها بسیار بالا بود، نسبت به زمانی که گیاهان نیتروژن اضافی دریافت کرده بودند. همچنین 42،6 و 60 درصد افزایش در فتوسنتز خالص و کربوکسیلاسیون به ترتیب در برگ‌های سویا تحت این تیمار در مقایسه با گیاهان شاهد وجود داشت (40). آزمایشات ما نیز بیانگر این موضوع بود که دو تیمار سولفات آمونیوم+نیترات و آمونیوم نسبت به تیمار 5 میلی مولار نیترات و شاهد بیشترین تأثیر را ازنظر رنگیزه های گیاهی و محتوای کلروفیل a و b بر گیاهان سویا گذاشته است. به طوریکه هر سه تیپ از گیاهان سویا حداقل میزان کلروفیل a وb، کلروفیل کل و کارتنوئید را در تیمارهای شاهد و نیترات و حداکثر میزان این پارامتر را در دو تیمار دیگر یعنی تیمار آمونیوم و توأم داشتند.
پارامترهای بیوشیمیایی: Ahmad Khan در سال2014 نشان داد که، ریزوبیوم در هنگام تنش‌های غیر زیستی با تولید ترکیباتی همچون انواع هورمون‌ها و ویتامین‌ها، ترکیبات اسمولیت مثل گلایسین بتائین، تولیدACC-دآمیناز جهت جلوگیری از سنتز اتیلن و تولید آنتی‌اکسیدانت‌های آنزیمی در هنگام شرایط تنشی بسیار سخت در کاهش شرایط تنش برای گیاهان مؤثر است (24). درواقع این باکتری‌ها در هنگام شرایط تنشی سبب القای دفاع گیاه و ایجاد مقاومت در گیاه میشوند. ازجمله مکانیسم‌های مقاومت سیستمیک القایی میتوان به تولید آنزیمACC-دآمیناز اشاره کرد. این آنزیم با تجزیهACC از تولید هورمون اتیلن جلوگیری می‌کند درنتیجه اثرات اتیلن که موجب رشد ضعیف ریشه و کاهش توانایی آن در اکتساب آب و مواد غذایی میشود را کاهش می‌دهد. تولید هورمون‌هایی مثل آبسیزیک‌اسید که موجب بسته‌شدن روزنه‌ها میشود و آنتی‌اکسیدانت‌هایی مثل سوپراکسیددیسموتاز که تحت شرایط تنشی خیلی شدید باعث مهار رادیکال‌های آزاد میشوند ازجمله مکانیسم‌های دیگر به‌کاررفته توسط این باکتری‌ها هستند. ازجمله مکانیسم‌های دیگر میتوان به تولید ترکیبات اسمولیت مثل پرولین و گلایسین بتائین اشاره کرد که چنین ترکیباتی در هنگام تنش‌ها منجر به ایجاد تعادل اسمزی در گیاه میشود. در گیاهان شاهد این تحقیق که نیتروژن دریافت نکرده بودند (تنش دیده‌اند) این اسیدآمینه بیشترین مقدار را نشان داد (24).
گیاهان سویا در دو تیمار توأم و سولفات آمونیوم کمترین مقدار پرولین را داشتند، چرا که در این دو تیمار به دلیل اسیدی بودن محیط اطراف ریشه، جذب سولفات آمونیوم و یا نیتروژن احیا شده توسط گیاهان راحت بود و با تنش ازت مواجه نبودند. این شاخص در تیمارهای شاهد و نیترات پتاسیم بیشترین میزان خود را در برگ گیاهان سویا نشان داد. کمترین مقدار این اسیدآمینه در NTS در تیمار توأم مشاهده شد.
مطالعه‌ای بر روی سه گونه اسفناج، نخود و آفتابگردان نشان داد که افزایش پروتئین کل در تیمار آمونیاکی، در اسفناج 50 درصد و در نخود و آفتابگردان 20 درصد بیش از تیمار نیتراتی بوده است و با افزایش غلظت نیترات آمونیوم محتوای پروتئین نیز بالا رفت (25). نتایج حاصل از بررسی ما در گیاه سویا با گزارشهای بالا مطابقت می‌کند. گیاهان تیپ Bragg دارای ریزوبیوم در تیمار آمونیوم همراه با نیترات در مقایسه با گیاهان تحت تیمارهای دیگر برگ‌هایی با مقدار پروتئین کل بیشتری داشتند. موتانت NTS ازنظر این شاخص همچون گیاهان Bragg دارای ریزوبیوم، برگ‌هایی با پروتئین کل بالایی داشتند که این میزان از پروتئین طی تیمار آمونیوم حاصل شد. در تیمار توأم گیاهان NTS نسبت به تیمار آمونیوم و نیترات میزان پروتئین کمتری را دارا بودند، اگرچه برگ‌ها دارای پروتئین می‌باشند ولی در برگ ذخیره نمی‌شود و احتمالاً پروتئین از برگ‌ها به سایر بافته‌ای گیاهی منتقل میشود. همچنین گفته میشود که پروتئین کل با اسیدآمینه های آزاد رابطه عکس دارد، به طوری که هر جا میزان پروتئین کل اندام هوایی پایین باشد میزان اسیدآمینه های آزاد بیشتر خواهد بود.
پروفایل پروتئینی: دامنه بررسی‌ها در علم پروتئومیکس وسعت زیادی دارد که از مهمترین آنها شناخت پروتئینها، بررسی کمی آنها در سلول‌ها، بافت ها و مایعات زیست‌شناختی، سنجش تغییرات در بیان پروتئینها در سلول‌های بیمار در مقابل سلول‌های طبیعی، توصیف تغییرات پس از ترجمه، مطالعه بر همکنش‌های پروتئین-پروتئین، تعیین موقعیت، شناسایی عملکرد سلولی در سطح پروتئینها، شناسایی ژن‌های ناشناخته به کمک پروتئینها و بسیاری از کاربردها و جوانب دیگر است. در روش الکتروفورز دوبعدی، در بعد اول الکتروفورز، پروتئینها براساس نقطه ایزوالکتریکشان به صورت خطی جدا میشوند و در بعد دوم، مولکول‌ها با ۹۰ درجه تفاوت نسبت به بعد اول براساس وزن مولکولی‌شان جدا میشوند. شدت تحرک پروتئینها در نزدیکی نقطه ایزو الکتریک برای هر پروتئین ثابت است و به‌شدت بار الکتریکی مولکول در نزدیکی نقطه ایزوالکتریک آن بستگی دارد. ضریب انتشار پروتئینها معمولاً تناسب معکوس با اندازه آنها دارد، هرچه اندازه مولکول بزرگتر باشد، ضریب انتشار آن کمتر خواهد بود. پروتئینها مولکول‌های چند یونی هستند که بار خالص آنها وابسته به pH محیط اطراف است، این مواد آمفوتری هریک در pH خاصی فاقد بار الکتریکی هستند و هرچه میزان تغییرات pH نسبت به تغییرات مسافت کمتر باشد، قابلیت تفکیک پروتئینها نیز بهتر میشود (39).
براساس نتایج این آزمایش گیاهان سویا استریل بدون تلقیح شدن با باکتری ریزوبیوم، تحت تیمار 5 میلی‌مولار NH4(SO4)2 در مقایسه با گیاهان سویا تلقیح شده با باکتری ریزوبیوم (عدم دریافت نیتروژن معدنی)، تنوع پروتئینی بیشتری در برگ خود نشان دادند. این تنوع پروتئینی بیشتر میتواند به دلیل در دسترس بودن میزان کافی نیتروژن در این گیاهان در مقایسه با گیاهانی که منبع نیتروژنی آنها فقط از طریق گرهزایی بوده است، باشد و یا اینکه به دلیل نوع منبع نیتروژنی معدنی (سولفات آمونیوم) باشد. علاوه بر این، این احتمال نیز داده میشود در گیاهان تلقیح شده با باکتری ریزوبیوم تغییری که در بیان ژنها به دلیل همزیستی ایجاد شده است، دلیل این تفاوت در تنوع پروتئینی باشد.
نتیجه‌گیری کلی اثر نیترات، آمونیوم، تثبیت بیولوژیک و موتانت NTS: بقولات با ایجاد همزیستی با باکتریهای تثبیت‌کننده نیتروژن و تولید گره در ریشه سبب تثبیت نیتروژن مولکولی میشوند. گیاهان سویا می‌توانند از هر دو روش تثبیت بیولوژیک نیتروژن و جذب نیتروژن معدنی از خاک، نیتروژن مورد نیاز خود را تأمین کنند. بیشتر گیاهان می‌توانند نیترات، آمونیوم، اوره و اسیدهای آمینه را به‌عنوان منبع نیتروژن جذب و تثبیت نمایند، اما جذب شکل خاصی از نیتروژن از گونه‌ای به گونه دیگر فرق می‌کند. بیشتر گیاهان زراعی مخلوطی از آمونیوم و نیترات را ترجیح می‌دهند و نسبت بالاتری از آمونیوم به نیترات را از محلول خاک جذب می‌نمایند (3). به‌طور کلی در اکثر پارامترهای بررسی شده (طول اندام هوایی، وزن‌تر ساقه و ریشه، سطح برگ،میان گره، رنگیزههای گیاهی،پروتئین کل،اسید آمینههای آزاد)، تیمار آمونیوم همراه با نیترات نسبت به سایر تیمارها بیشترین تأثیر را بر گیاهان سویا گذاشته است. علاوه بر این تأثیر تثبیت بیولوژیک ازت بر روی پارامتر رشد اندام هوایی، پارامترهای فیزیولوژی و بیوشیمیایی قابل‌ملاحظه است. در اکثر صفات مورد مطالعه تحت تیمارها، در تیپ NTS که در ژن NARK عامل کنترل‌کننده گرهزایی نقص دارد و منجر به تشکیل انبوه گره بر روی ریشه میشود، تفاوت معنی‌دار دیده میشود. در گیاهان کنترل که هیچ‌گونه منبع نیتروژنی معدنی را دریافت نکردند، مشاهده میشود که رشد اندام هوایی در تیپ Bragg و NTS بهبود یافته و این افزایش در NTS در مقایسه با Bragg استریل معنی‌دار است.
(علمی)', './data/plant/coversheet/cover_fa.jpg'))
دوره 33، شماره 3
مهر 1399صفحه 738-755
- تاریخ دریافت: 26 تیر 1397
- تاریخ بازنگری: 03 آذر 1397
- تاریخ پذیرش: 25 دی 1397