شناسایی SNPها در نواحی اگزونی واینترونی ژن‌های لینالول سینتاز و ژرماکرینD سینتاز در گیاه ریحان

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه

چکیده

ریحان (Ocimum basillicum L.) از مهم‌ترین گیاهان دارویی حاوی ﺗﺮﮐﯿﺒﺎت ترپنوئیدی از جمله مونوترپن و سزکوئی‌ترپن‌ها می‌باشد. ژن‌های لینالول سینتاز و ژرماکرین D سینتاز از ژن‌های کلیدی دخیل در سنتز ترپن‌ها می‌باشند .در مطالعه حاضر به ‌منظور شناسایی SNPها در این دو ژن در 5 توده‌ مختلف ریحان از نشانگرهای CAPS و توالی‌یابی استفاده شد. قطعاتی به اندازه 600 و 583 جفت باز از نواحی کدکننده این دو ژن‌ تکثیر و با آنزیم‌‌های برشی Pst1 و MseI هضم شد. بعد از توالی‌یابی و بازیابی قطعه تکثیری هر ژن، شناساییSNPها با استفاده از هم‌ردیفی توالی‌های هر ژن در افراد مختلف انجام گرفت. از نه SNP شناسایی ‌شده در ژن لینالول سینتاز، به ترتیب چهار و پنج SNP در ناحیه اینترون و اگزون مشاهده شد. از کلSNP های شناسایی‌ شده در این ژن، 8/77 درصد آنها از نوع همجنس با فراونی 4/44 درصد A/Gو 3/33 درصد T/C و 2/22 درصد آنها از نوع ناهمجنس با فراونی یکسان ناشی از تبدیلات C/G و C/A بود. از 28 SNP شناسایی ‌شده در ژن ژرماکرین D سینتاز، هفت SNP در ناحیه اگزون و 21SNP در ناحیه اینترون شناسایی شد که 8/67 درصد آنها از نوع همجنس با فراوانی 7/35 درصد G/A و 1/32 درصد C/T و 1/32 درصد آنها از نوع ناهمجنس با فراوانی 1/7 درصد T/A، 3/14 درصد G/C و 7/10 درصد C/A بود. نتایج همردیفی توالی ژن‌ها بین افراد نشان داد که بیشترین جهش در ژن‌های لینالول سینتاز و ژرماکرین D سینتاز از نوع تبدیل بازهای همجنس A/G و T/C می‌باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

SNP discovery in exon and intron regions of Linalool synthase and Germacrene D synthase genes in basil

نویسندگان [English]

  • Samaneh Aliyari
  • Babak Abdollahi Mandoulakani
  • Iraj Bernousi

Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Urmia University

چکیده [English]

Basil (Ocimum basillicum L.), one of the most important medicinal plants, contains monoterpene and sesquiterpene compounds. Linalool synthase (LIS) and Germacrene D synthase (GDS) are two key genes involved in terpenes biosynthesis. In the current investigation, cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) markers and sequencing were used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) in both genes in five different basil populations. For this means, fragments of 600 and 583 bp from the coding sequences of these genes were amplified and digested by using Pst1 and Mse1 restriction enzymes. After retrieval of the sequences of the amplified gene fragments, SNPs were identified based on multiple sequence alignment in both genes in studied basil genotypes. Out of the nine SNPs identified in LIS gene, five occurred in exon region while the number of SNPs identified in intron was four. Of the total SNPs detected in this gene, the proportion of transition was 77.8%, with frequencies of A/G: 44.4% and T/C: 33.3% and C/G and C/A (transversion) with the same frequencies of 22.2%. In GDS gene, in total, 28 SNPs was detected (seven in exon and 21 in intron) of which 67.8% was transient with a frequency of G/A: 35.7% and C/T: 32.1%, and 32.1% transversion (T/A: 7.15%, G/C: 14.3% and C/A: 10.7%). The results of the sequence alignments revealed that the highest number of the identified SNPs in the studied genes are A/G and TC.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Basil
  • Linalool Synthase
  • Germacrene D Synthase
  • SNP marker

شناسایی SNPها در نواحی اگزونیواینترونی ژن‌های لینالول سینتاز و ژرماکرینD سینتاز در گیاه ریحان

سمانه علیاری1، بابک عبدالهی مندولکانی1،2* و ایرج برنوسی1،2

1 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی

2 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، پژوهشکده زیست فناوری، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی

تاریخ دریافت: 14/4/97                        تاریخ پذیرش: 25/10/97

چکیده

ریحان (Ocimum basillicum L.)از مهم‌ترین گیاهان دارویی حاوی ﺗﺮﮐﯿﺒﺎت ترپنوئیدی ازجمله مونوترپن و سزکوئی­ترپن­ها می­باشد. ژن­های لینالول سینتاز و ژرماکرین D سینتاز از ژن‌های کلیدی دخیل در سنتز ترپن­ها می­باشند. در مطالعه حاضر به‌منظور شناسایی SNPها دراین دو ژن در 5 توده‌ مختلف ریحان از نشانگرهای CAPS و توالی­یابی استفاده شد. قطعاتی به‌اندازه 600 و 583 جفت باز از نواحی کد کننده این دو ژن‌ تکثیر و با آنزیم‌‌های برشی Pst1 و MseI هضم شد. بعد از توالی­یابی و بازیابی قطعه تکثیری هر ژن، شناساییSNPها با استفاده از هم‌ردیفی توالی‌های هر ژن در افراد مختلف انجام گرفت. از نه SNP شناسایی ‌شده در ژن لینالول سینتاز، به ترتیب چهار و پنج SNP در ناحیه اینترون و اگزون مشاهده شد. از کلSNP های شناسایی‌ شده دراین ژن، 8/77 درصد آنها از نوع هم‌جنس با فراوانی 4/44 درصد  A/Gو 3/33 درصد T/C و 2/22 درصد آنها از نوع ناهم‌جنس با فراوانی یکسان ناشی از تبدیلات C/G و C/A بود. از 28 SNP شناسایی ‌شده در ژن ژرماکرین D سینتاز، هفت SNP در ناحیه اگزون و 21SNP  در ناحیه اینترون شناسایی شد که 8/67 درصد آنها از نوع هم‌جنس با فراوانی 7/35 درصد G/A و 1/32 درصد C/T و 1/32 درصد آنها از نوع ناهم‌جنس با فراوانی 1/7 درصد T/A، 3/14 درصد G/C و 7/10 درصد C/A بود. نتایج هم‌ردیفی توالی ژن­ها بین افراد نشان داد که بیشترین جهش در ژن­های لینالول سینتاز و ژرماکرین D سینتاز از نوع تبدیل بازهای هم‌جنس A/G و T/C می­باشد.

واژه­های کلیدی: ریحان، لینالول سینتاز، ژرماکرین D سینتاز، SNP

* نویسنده مسئول، تلفن: 04431942482 ، پست الکترونیکی: b.abdollahi@urmia.ac.ir

مقدمه

 

ریحان (Ocimum basilicum L.) یکی از گیاهان مهم متعلق به خانواده نعناعیان (Lamiaceae) است. این گیاه بومی ایران، هند و مناطق گرم آفریقا هست (16). اسانس ریحان غنی از ترکیبات فنولی است که در صنایع داروسازی و عطرسازی مورد استفاده قرار می­گیرد (16). ریحان همانند سایر گیاهان خانواده نعناع منبع ترکیبات حلقوی و اسانس است که دافع حشرات بوده و عملکرد ضدانگلی، ضدباکتریایی، ضدقارچی و آنتی­اکسیدانتی آن به خاطر وجود ترپنوئیدها می‌باشد که به‌طور عمده در بذر، ساقه و گل‌آذین تجمع می‌یابند (1). گیاهان گروه بزرگ و متنوعی از ترکیبات آلی به نام متابولیت­های ثانویه را تولید می­کنند (15). ترپنوئیدها بزرگترین و وسـیع‌ترین گـروه از متابولیت‌های ثانویه هستند که دارای بیش از ۲۰ هزار ترکیب شناخته ‌شده می­باشند. مونوترپن­ها و سزکوئی­ترپن­ها از ترکیبات اصلی ترپنوئیدها می­باشند که از یک ساختار10 و 15 کربنی تشکیل شده­اند که گروه­های عاملی گوناگونی بر اساس نوع ترکیب به این ساختارها افزوده می­شود (14). مونوترپن­ها گروه بزرگی از ترپنوئیدها هستند که نقش‌های اکولوژیکی فراوانی را در گیاهان ایفا می‌کنند. این ترکیبات نقش مهمی در حفاظت گیاهان در برابر آفات گیاه‌خوار و بیماری‌ها، جلب گرده‌افشان‌ها، حشرات پراکنده بذر، ساختار غشاء، واکنش‌های اکسایشی، بازدارنده نوری، حفاظت نوری و تنظیم رشد و نمو بر عهده دارند (2و 18). لینالول به‌عنوان مهمترین مونوترپن، عمدتاً از مسیر غیرموالونات مشتق می‌شود. همچنین سزکوئی­ترپن­های با ارزش دارویی در ریحان شامل ژرماکرین D و گاما کادنین توسط مسیر موالونات در سیتوزول ساخته می­شوند (7). مطالعه ژن­های دخیل در بیوسنتز این ترکیبات و بررسی تنوع ژنتیکی جمعیت­های گیاهی به‌منظور تلاش برای بهبود تولید این ترکیبات ارزشمند در ریحان بسیار مهم است و ازنظر تجاری سودآور خواهد بود (21).

در اصلاح نبات سنتی، تنوع ژنتیکی اغلب براساس صفات ظاهری مشخص می‌شود. امروزه با پیشرفت نشانگرهای مولکولی در بسیاری از محصولات زراعی، شناسایی تنوع ژنتیکی در سطح مولکولی و بر اساس تفاوت موجود در DNA و همچنین اثر آن بر صفات فنوتیپی نیز امکان‌پذیر است. نشانگرهای مولکولی مبتنی بر DNA ازجمله ابزارهای قدرتمند تشخیصی هستند که نه‌تنها برای شناسایی چندشکلی در سطح ژنوم بلکه در ارتباط با ژن­ها و مکان­های ژنتیکی خاص نیز مورد استفاده قرار می­گیرند. همچنین در حوزه ژنتیک و به­نژادی، اطلاع از ساختار ژنتیکی جمعیت­ها، پیش‌نیاز حفظ ذخایر ژنتیکی و برنامه­ریزی طرح­های اصلاح نژاد می­باشد. استفاده از نشانگرهای مولکولی دراین زمینه یکی از بهترین راهکارها محسوب می­شود، زیرا باتوجه به اطلاعات زیادی که به دست می­دهد می­تواند نتایجی که از تجزیه‌وتحلیل رکوردها با روش­های آماری حاصل‌شده را تأیید و تکمیل نماید (3). همچنین با نشانگرهای مولکولی می­توان ژنوتیپ افراد را در مکان­ها و جایگاه­های ژنتیکی خاص تعیین نمود (13) و در انتخاب و اصلاح نژاد ممکن است به‌طور مهیجی پیشرفت ژنتیکی را تسریع کند (9). مطالعه تنوع ژنتیکی نژادهای بومی برای حفاظت از منابع ژنتیکی ذخایر بومی لازم و ضروری است (12) و باید بر اساس دانش عمیقی از منابع ژنتیکی نژادهای خاص باشد، لذا تلاش برای شناسایی و تعیین خصوصیات ژنتیکی نژادهای بومی و محلی بسیار اهمیت دارد (20 و21). نشانگرهای SNP (Single nucleotide polymorphism) چندشکلی مبتنی بر تفاوت در یک نوکلئوتید است که منبع ژنتیکی عمده­ای از تغییرات فنوتیپی درون یک‌گونه می­باشد. این نشانگرها هم بارز و دو آللی می­باشند و کارآیی بالای آنها به دلیل فراوانی زیاد و حضور در تمامی نواحی ژنوم (اینترون­ها و اگزون­ها) می­باشد. هر فرد متعلق به یک‌گونه، دارای هزاران SNP می­باشد که به علت پایداری بیشتر، موتاسیون کمتر و وجود آنها در بیشتر نقاط ژنوم به‌عنوان نشانگرهای ژنتیکی مهم و قابل‌اعتماد محسوب می­شوند (8و 11). بنابراین به دلیل اهمیت گیاه دارویی ریحان و نقش کلیدی دو ژن لینالول سینتاز (LIS) و ژرماکرین D سینتاز (GDS) به ترتیب در مسیر بیوسنتز مونوترپن­ها و­سزکوئی­ترپن­ها و همچنین کارایی نشانگرهای SNP، تحقیقی به‌منظور شناسایی SNPها در ژن‌های مذکور در توده‌های مختلفO. basilicum  و استفاده از نشانگرهای مبتنی بر این SNPها برای تمایز و تفکیک ژنوتیپ‌ها و توده‌های مختلف ریحان انجام شد.

مواد و روشها

دراین تحقیق60 فرد از 5 توده ریحان ( 12 فرد از هر توده) که از مناطق مختلف ایران جمع‌آوری‌شده بود استفاده گردید (جدول1). بذور توده­های ریحان جهت استخراج  DNAدر پژوهشکده زیست­ فناوری دانشگاه ارومیه کشت شد. برای کشت بذور از پیت ماس و گلدان­هایی با اندازه مناسب استفاده شد. از زمان جوانه­زنی بذر تا رسیدن به مرحله نمونه­برداری، به فاصله هر 2 روز یک‌بار آبیاری به‌صورت مرتب انجام گرفت و بعد از رسیدن گیاه به مرحله 4-8 برگی، نمونه­برداری از برگ­های تک بوته­های هر جمعیت به‌صورت مجزا برای استخراج  DNAانجام شد. نمونه­های برگی درون نیتروژن مایع به فریزر 80- درجه سانتی‌گراد منتقل شد.

 

جدول 1- محل جمع‌آوری و موقعیت جغرافیایی توده‌های ریحان

رنگ برگ

عرض جغرافیایی

طول جغرافیایی

ارتفاع از سطح دریا

محل جمع‌آوری

کد توده

سبز

13-59

52-32

1491

بیرجند

1

سبز

46-36

34-48

1824

همدان

2

بنفش

23-34

03-47

1389

کرمانشاه 1

3

بنفش

4-51

7-35

1100

ری

4

بنفش

49-34

56-50

928

قم

5

 

 

استخراج DNA ژنومی:DNA ژنومی از برگ­های جوان و سبز گیاه ریحان به روش CTAB استخـراج شد (6). به‌منظور بررسی کیفیت و کمیت DNA از الکتروفورز ژل آگارز یک درصد و اسپکتوفتومتری استفاده شد.

طراحی آغازگر: ابتدا توالی ناحیه کد کننده ژن­های لینالول سینتاز و ژرماکرن D سینتاز در ریحان با استفاده از بانک­ اطلاعاتی NCBI تعیین شدند و نواحی اینترونی و اگزونی آنها با استفاده از نرم‌افزار Softberry مشخص شد. ژن لینالول سینتاز دارای دو ناحیه اگزونی (۴۷۳-۱ و ۱۷۲۵-۵۷۱) و یک ناحیه اینترونی و ژن ژرماکرین D سینتاز دارای یک ناحیه اگزونی (۱۶۴۱-۱) بود. آغازگرها (جدول2) با نرم‌افزارهای FastPCR  و Gene Runner طراحی و ازنظر وجود ساختارهای ثانویه مثل آغازگر-دایمر و ساختارهای سنجاق سری بررسی شدند.

 

جدول2- مشخصات آغازگرهای طراحی شده برای تکثیر ژن‌های لینالول سینتاز و ژرماکرین D سینتاز در ریحان

دمای اتصال

اندازه محصول (جفت باز)

توالی آغازگر

شماره دسترسی

ژن

61

434

GCTTCGTAGTGAGGTGGCGCAA (رفت)

 (برگشت)GCAATGGAGGGTCAGT

AY693647

LIS

61

236

CTTTGGTTAGGTTGGGTGCCAGAA (رفت)

TTGGGAGTCTACTTTGAA (برگشت)

AY693644

GDS

* LIS :Linalool synthase ، GDS:  Germacrene D synthase

 

واکنش­های PCR : برنامه دمایی PCR به‌منظور تکثیر ژن­های مورد مطالعه در 60 فرد، شامل واسرشته سازی اولیه در دمای ۹۵ درجه سانتی‌گراد به مدت ۵ دقیقه، تکرار ۳۵ چرخه شامل ۳۰ ثانیه واسرشته سازی در دمای ۹۴ درجه سانتی­گراد، ۴۰ ثانیه در دمای اتصال بهینه هر آغازگر و ۲ دقیقه برای گسترش در دمای ۷۲ درجه سانتی­گراد و گسترش نهایی به مدت ۵ دقیقه در دمای ۷۲ سانتی­گراد بود. محصول واکنش PCR بر روی ژل آگارز 8/1درصد الکتروفورز  و رنگ‌آمیزی با اتیدیوم بروماید انجام گرفت.

هضم قطعات تکثیر شده ژن‌های مورد مطالعه: الگو برشی و طول قطعات حاصل از برش در ژن­های مورد مطالعه با استفاده از نرم‌افزار FastPCR پیش‌بینی شد. برش توالی­های تکثیری هر دو ژن با آنزیم­های Pst1 و Tru1(Mse1)در افراد مورد مطالعه (60 فرد) چندشکلی تولید نکرد. جهت آشکارسازی قطعات حاصل از برش از الکتروفورز ژل آگارز 5/1 درصد با ولتاژ 80 استفاده شد.

توالی­یابی: با توجه به این‌که هضم آنزیمی توالی­های تکثیری دو ژن در افراد مطالعه شده چندشکلی تولید نکرد، بنابراین برای شناسایی نشانگرهای SNP در نواحی کد کننده ژن‌های لینالول سینتاز و ژرماکرین D سینتاز از روش توالی­یابی استفاده شد. از هرکدام از توده­های مورد مطالعه یک فرد انتخاب و توالی تکثیری ژن­های مورد مطالعه در این افراد توالی­یابی شد. بدین منظور بعد از انجام واکنش PCR، حدود 80 میکرولیتر از محصول PCR هر نمونه روی ژل آگارز 5/1 درصد و تحت ولتاژ 85 تفکیک گردید. با مشخص نمودن اندازه محصول روی ژل، باندهای مورد نظر برش داده شد و جهت خالص­سازی و توالی­یابی به شرکت تکاپو زیست (تهران، ایران) ارسال گردید. توالی­یابی از هر دو انتهای قطعات PCR و با استفاده از هر دو آغازگر پیشرو و معکوس که در واکنش PCRاستفاده شده بود انجام گرفت. جهت جلوگیری از اشتباهات توالی­یابی، هر قطعه سه بار از هر دو جهت توالی­یابی شده و بعد توالی مورد توافق (Consensus) استخراج گردید. بعد از استخراج توالی دقیق، نواحی مشترک توالی­های رفت‌وبرگشت هر قطعه شناسایی و توالی نهایی بازیابی ­شد. در هرکدام از ژن­ها یک توالی به خاطر کیفیت پایین توالی­یابی در شناسایی SNPها مورد استفاده قرار نگرفت. برای شناسایی SNPها در هر ژن هم‌ردیفی توالی­ها با استفاده از نرم‌افزار Clastal Omega انجام گرفت.

نتایج

تکثیر قطعات ژنی و هضم آنزیمی: به‌منظور برسی الگوی برشی آنزیمی و شناسایی تنوع تک نوکلئوتیدی، قطعاتی از نواحی کد کننده این ژن‌ها به طول 600 جفت باز از ژن لینالول سینتاز و583 جفت باز از ژن ژرماکرین D سینتاز تکثیر شد (شکل1).

 

 

شکل1- تکثیر ژن­های لینالول سینتاز (سمت چپ) و ژرما کرین D سینتاز (سمت راست) و تولید قطعاتی به ترتیب به اندازه­های 600 و 583 جفت باز در توده­های مختلف ریحان (چاهک­ها به ترتیب M: نشانگر 1Kb فرمنتاس، 1: ری، 2: همدان،3: بیرجند، 4: کرمانشاه، 5: قم)

 

سپس قطعات تکثیری ژن لینالول سینتاز با آنزیم Pst1هضم شد. پیش‌بینی نواحی برشی این آنزیم در توالی ژن مورد مطالعه با استفاده از نرم‌افزار FastRCR نشان داد که هضم ناحیه اگزونی تکثیر شده ژن لینالول سینتاز با این آنزیم منجر به ایجاد دو قطعه به طول 161 و 302 جفت باز می­شود که بعد از برش با این آنزیم چندشکلی در افراد مورد مطالعه مشاهده نگردید. بنابراین، قطعات تکثیری ژن لینالول سینتاز با آنزیم Mse1 نیز هضم شد. پیش‌بینی نواحی برشی این آنزیم در این ژن با استفاده از نرم‌افزار FastRCR نشان داد که هضم ناحیه تکثیری این ژن با این آنزیم منجر به ایجاد سه قطعه به طول 170، 95 و 215 جفت باز می­شود. البته هضم توالی تکثیری این ژن با این آنزیم نیز در بین افراد مورد مطالعه چندشکلی ایجاد نکرد (شکل 2).

بررسی نواحی برشی آنزیم Pst1 در توالی ژن ژرماکرین D سینتاز با استفاده از نرم‌افزار FastPCR نشان داد که هضم ناحیه کد کننده این ژن منجر به تولید دو قطعه به طول 223 و 245 جفت باز می­شود. برش قطعه تکثیری این ژن در افراد مورد مطالعه با آنزیم Pst1 نیز چندشکلی تولید نکرد.

 

شکل2- هضم قطعه تکثیری ژن لینالول سینتاز با آنزیم برشی Mse1، چاهک­های 1 و 2 برش با آنزیم، و 3 و 4 بدون برش، شماره چاهک­ها به ترتیب، 1 و 3: توده کرمانشاه، 2 و 4: توده بیرجند (اندازه باندهای نشانگر 1Kb فرمنتاس برحسب جفت باز می­باشد)

بنابراین قطعه تکثیری ژن ژرماکرین  Dسینتاز با آنزیم Mse1 هضم شد. بررسی نواحی برشی این ژن با نرم‌افزار FastPCR بیانگر تولید سه قطعه به طول 117، 104 و 352 جفت باز بود ولی هضم آنزیمی قطعه تکثیری این ژن در افراد مورد مطالعه چهار قطعه تولید کرد که نشانگر وجود یک سایت برشی اضافی برای این آنزیم در توالی این ژن در افراد مطالعه شده می­باشد. هضم آنزیمی این ژن نیز در افراد مطالعه شده چندشکلی تولید نکرد (شکل3).

شناسایی نواحی اینترونی در دو ژن لینالول سینتاز و ژرماکرین D سینتاز: به‌منظور بررسی الگوی برشی آنزیمی و شناسایی تنوع تک نوکلئوتیدی، آغازگرها طوری طراحی شده بودند که اندازه محصول PCR در ژن لینالول سینتاز 434 جفت باز و در ژرماکرین D سینتاز 236 جفت باز باشد اما بعد از تکثیر و الکتروفورز نتایج متفاوتی حاصل گردید طوریکه اندازه محصول تکثیر شده در لینالول سینتاز 600 جفت باز و در ژرماکرین D سینتاز 583 جفت باز بود (شکل­های 2و 3).

 

شکل3- هضم آنزیمی ژن ژرماکرین D سینتاز با آنزیم برشی  Mse1در توده­های مختلف ریحان (M: نشانگر اندازه 1Kb فرمنتاس، اندازه باندهای نشانگر برحسب جفت باز می­باشد، چاهک­های 1 و 9 نمونه­های بدون هضم، چاهک­های 2 تا 8 نمونه­های هضم شده، 2 و 3: کرمانشاه، 4 و 5: بیرجند، 6 و 7: ری، 8: همدان)

باتوجه به تفاوت قطعات تکثیری پیش‌بینی شده با قطعات مشاهده شده روی ژل و بررسی توالی قطعات به‌وسیله نرم‌افزار Softberry مشخص شد نواحی اضافی تکثیری مربوطه به یک ناحیه اینترونی به طول80 جفت باز در ژن لینالول سینتاز و یک ناحیه اینترونی به طول 400 جفت باز در ژن ژرماکرین D سینتاز می­باشد (شکل­های 4و 5).

 

 

CCCCGGATAATTCAGAGCATCTGAGATGGCGAGGTTGGAAGCCACGACGATTCATCAGAGCAATATGGTGCACAGAGCGACCATCGGGCCAACCTTTTGGAGCTCGCAATTTCGGATTATAACCAAGTTCAGTCTCAACACCATTCGGAACTCACTGAAATTACCCGGTTTGGATATGCGATTACTTTATAGTCAATTACATGCAATTATAAATGTTTATGATTTAGTATTTGGCGAGATCGGCTCGCTGTGGTGGAAGCAGCTCGGTTTGGTTGAAAACTTGAGTTTTGGGCGAGACAGACCGTTTCGGTGCTTTTTATGGCCCATGGGGTTCCTCCCGAACCCCAAGTATTCGAGCGTTAGAATAAAATTGGCAAAAACCATTTTTATTCTGTTAGTGATGGATGACATTTTGGATACCTATGGAAAGATGGATGAATTCTTCTTTTTCACAGATGCAATTGGAAGGTTTCCTTCTGGATCAACCCCCCAACCTTTCTTCTTACCAAAATAAATGATTATGGTGACGAACAATATCAGCGATAC

شکل4- ناحیه اینترونی 80 جفت بازی شناسایی شده در ژن لینالول سینتاز در ریحان

 

GTGCTTCCTCTATGAGAGACGAGTCACGTGATAGAAGATTTATTAGAAGTTTGCCAAATTGGACTTCAATATATTACAAAAGATTCATCAGGAAGAGCTAACCCATATTGCAAGGTTAGCATTGTTAATAATGTTGAGGGAGTAGTACTCTATAGTCTACACATACTGTCTCAAGAATCATCCATATTCGACTTTCAATATTTCAAGTAATACTACCAAAATTGATGTCCTGTGAAAAACTTTTCCTTTGACTGTGAATTGGATATAAATCTCTTATTTTTCTAAGACGTGATCACAAGGTCTGTCCCCCCTATACGACCCCGAACAGATTTACCCGCGTGTCGACCAGCAGAGAAATGTTCCACCGGACGTCATTTTTCCCAGAAAAAACTAAATAACATGACTCTTTTTGTCATTTTGTACTGACTGGAAAATCTTATAAAAATTTGTGTATAATATATATTTTGTATTTCATAAGTATTTAATGTAGCAAAAATAATATGATCATCAATCACTGAATGTAGGTGGTGGAAGGAACTAGACTTTGGAAACAAACTACCATTGCAAGGGATAGAGTCGTGAATGCCACAGAG

شکل5- ناحیه اینترونی 400 جفت بازی شناسایی شده در ژن ژرماکرین D سینتاز در ریحان

 

هم‌ردیفی توالی­ها و شناسایی SNPها در ژن لینالول سینتاز: به‌منظور شناسایی SNPها در ژن لینالول سینتاز در نواحی اگزونی و اینترونی، هم‌ردیفی بین قطعات توالی­یابی شده در توده­های همدان، بیرجند، کرمانشاه و قم انجام گرفت (شکل­های 6و 7). در این هم‌ردیفی جهش مربوط به تغییر بازهای G/A، T/C، C/A و C/G مشاهده گردید که بیشترین جهش در نواحی اگزونی و اینترونی به ترتیب مربوط به تبدیل بازهای G/A و T/C بود (جدول3).

در ژن لینالول سینتاز از نه  SNPشناسایی شده، به ترتیب چهار و پنج SNP در نواحی اینترونی و اگزونی مشاهده شد که 78/77 درصد آنها از نوع هم‌جنس با فراوانی 44/44 درصد A/G و 33/33 درصد T/C و 22/22 درصد جهش ناهم‌جنس با فراوانی یکسان ناشی از تبدیلات C/G و C/A بود. بیشترین جهش­ها در هر دو ناحیه اگزونی و اینترونی از نوع هم‌جنس (C/Tو A/G) بود. تعداد کم SNPهای شناسایی شده در ناحیه اینترونی در این ژن به خاطر طول کوتاه آن (80 جفت بازی) در مقایسه با طول ناحیه اگزونی (374 جفت بازی) بود.

 

 

 

شکل6- هم‌ردیفی توالی ناحیه اگزونی ژن لینالول سینتاز در چهار توده ریحان (Ham: همدان، Bir: بیرجند، kar:کرمانشاه، Gom: قم)

 

شکل7- هم‌ردیفی توالی ناحیه اینترونی ژن لینالول سینتاز در چهار توده ریحان (Ham: همدان، Bir: بیرجند، kar:کرمانشاه، Gom: قم)

 

جدول3- فراوانی SNP های شناسایی شده در ژن لینالول سینتاز در توده­های مختلف ریحان

درصد SNP

کل SNP

تعداد در اینترون

تعداد در اگزون

نوع SNP

44/44

4

۱

۳

G/A

۳۳/۳۳

۳

۲

۱

T/C

۱۱/۱۱

۱

-

۱

C/G

۱۱/۱۱

۱

۱

-

C/A

 

 

 

درکل در توالی ژن لینالول سینتاز به ازای هر 100 جفت باز 5/1 SNP مشاهده شد ( به‌طور متوسط 3/1 SNP در ناحیه اگزونی و 5 SNP در ناحیه اینترونی به ازای هر 100 جفت باز).

هم‌ردیفی توالی­ها و شناسایی SNP ها در ژن ژرماکرین D سینتاز: به‌منظور شناسایی SNPها در ژن ژرماکرین D سینتاز، هم‌ردیفی بین توالی ناحیه اینترون و اگزون در توده­های بیرجند، کرمانشاه، همدان و ری انجام گرفت (شکل­های 8و 9). در این هم‌ردیفی جهش­های مربوط به تبدیل بازهای G/A، T/A،C/A، G/C و T/C شناسایی شد. بیشترین جهش در ناحیه اگزونی مربوط به تبدیل باز G/A و ناحیه اینترونی مربوط به تبدیل باز  G/Aو T/C بود. همچنین در این ژن یک حذف باز در توده همدان و یک درج باز در توده بیرجند شناسایی شد (جدول4).

در ژن ژرماکرینD  سینتاز از 28 SNP شناسایی شده، هفت  SNPدر ناحیه اگزونی و 21 SNP در ناحیه اینترونی مشاهده شد که 85/67 درصد آن از نوع هم‌جنس با فراوانی 71/35 درصد G/A و 14/32 درصد C/T و 15/32 درصد جهش از نوع ناهم‌جنس با فراوانی 14/7 درصد T/A، 28/14 درصد  G/Cو 73/10 درصد C/A بود. در این ژن تفاوت­های تک نوکلئوتیدی در نواحی اینترونی بیشتر از نواحی اگزونی بود. درکل در توالی ژن ژرماکرین D سینتاز به ازای هر 100جفت باز، 8/4 SNP مشاهده شد (به‌طور متوسط 4 SNP در نواحی اگزونی و 25/5 SNP در نواحی اینترونی به ازای هر 100 جفت باز).

 

 

شکل8- هم‌ردیفی توالی ناحیه اگزونی ژن ژرماکرینD سینتاز در ریحان (Bir: بیرجند، Ham: همدان، Kar:کرمانشاه، Ray: ری)

جدول4- فراوانی SNPهای شناسایی شده در ژن ژرماکرین D سینتاز در توده­های مختلف ریحان

درصد SNP

کل SNP

تعداد در اینترون

تعداد در اگزون

نوع SNP

71/35

10

7

3

G/A

14/7

2

2

-

T/A

14/32

9

6

3

C/T

28/14

4

3

1

G/C

73/10

3

3

-

C/A

 

 

بحث و نتیجه‌گیری

 SNPها چندشکلی تک نوکلئوتیدی و معمولاً دو آللی می­باشند که در بیش از یک درصد افراد جمعیت مشاهده می­شوند (10). از آنجایی که در مقایسه با دیگر نشانگرها،SNP ها عموماً فراوانی بالایی دارند و قابل اتوماسیون شدن و کارآمد و مقرون به‌صرفه بودن از ویژگی‌های بارز آنها می­باشد بنابراین این نشانگرها در برنامه­های اصلاح گیاهان برای تهیه نقشه­های ژنتیکی با وضوح بالا و انتخاب ژنومی جزو نشانگرهای پرکاربرد هستند (17و 15). چندشکلی‌های تک نوکلئوتیدی ممکن است به‌طور ویژه مسئول تنوع فنوتیپی یک صفت باشد یا با SNPهای دیگر پیوسته باشند (11). انتخاب مناسب‌ترین مجموعه SNPها در یک روش مقرون به‌صرفه یک گام اساسی در جهت کاربرد نشانگرهای مولکولی برای توسعه محصولات می­باشد. امروزه نشانگرهایSNP ها در مطالعات اشباع نقشه­های ژنتیکی، مکان­یابی ژن­های کنترل‌کننده صفات مختلف و انتخاب براساس نشانگر در برنامه­های اصلاحی گیاهان مورد استفاده قرار می­گیرند. در مطالعه حاضر SNPهای موجود در نواحی اگزونی و اینترونی ژن­های لینالول سینتاز و ژرماکرین D سینتاز (از ژن‌های کلیدی دخیل در سنتز ترپن­ها) به‌منظور استفاده از آنها در برنامه­های اصلاحی ریحان شناسایی شد. در بررسی SNPها بین دو گونه O. sanctum و O. basilicum گزارش شد که 6/66 درصد از SNPها مربوط به جهش­های هم‌جنس می­باشد که از این میزان 66/32 درصد مربوط به تبدیل A/G و 5/32 درصد ناشی از تبدیل C/T بود (19).

 

 

شکل9- هم‌ردیفی توالی ناحیه اینترونی ژن ژرماکرین D سینتاز در ریحان (Bir: بیرجند، Ham: همدان، Kar: کرمانشاه، Ray: ری)

 

میزان SNPهای به‌دست‌آمده از جهش ناهم‌جنس در این مطالعه 4/33 درصد بود که 97/10 درصد ناشی از تبدیل A/T، 4/7 درصد به علت تبدیل G/T، 52/7 درصد از تبدیل به C/G و 95/7 درصد به خاطر تبدیل A/C بود. در مطالعه حاضر نیز درصد جهش­های هم‌جنس در هر دو ژن لینالول سینتاز و ژرماکرین D سینتاز بیشتر از جهش­های ناهم‌جنس بود. در بررسی توالی­های EST در گیاه سویا نیز گزارش شد که فراوانی SNPها در نواحی اینترونی بیشتر از نواحی اگزونی می­باشد و نسبت آن 2 به 4/1 در هر هزار جفت باز بود (5). در گیاه کدوی تخمه کاغذی (Cucurbita pepo L.)  نیز حدود 19980 SNP شناسایی شد که 68 درصد آنها از نوع جهش­های هم‌جنس با تبدیلات A/G و C/T و 32 درصد مربوط به جهش­های ناهم‌جنس با تبدیلات A/T،A/C ، G/T وC/G  بود (4). نسبت جهش­ها و تبدیلات این مطالعه با نتایج مطالعه حاضر همخوانی دارد.

به‌طور کلی نتایج مطالعه حاضر نشان داد که در هر دو ژن لینالول سینتاز و ژرماکرینD سینتاز تعداد SNPها در نواحی اگزونی کمتر از نواحی اینترونی می­باشد. همچنین بیشترین تعداد تنوع­های تک نوکلئوتیدی در این ژن­ها از نوع تبدیل­های هم‌جنس A/G وT /C  بود. در کل در توالی­های بررسی‌شده این دو ژن، فراوانی SNPها در ژن لینالول سینتاز نسبت به ژرماکرینD سینتاز کمتر و فراوانی SNPها در نواحی اینترونی ژرماکرین Dسینتاز بیشتر از ژن لینالول سینتاز بود. بیشترین تعداد جهش­های حذف و اضافه در ژن ژرماکرین  Dسینتاز مشاهده گردید. پیشنهاد می­شود از این SNPها در برنامه­های اصلاحی ریحان برای تهیه نقشه‌های ژنتیکی با وضوح بالا و انتخاب ژنومی و نقشه­یابی ارتباطی و بهبود محصولات و شناسایی سریع ارقام مختلف زراعی استفاده شود.

سپاسگزاری

از گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی و پژوهشکده زیست فناوری دانشگاه ارومیه به خاطر فراهم نمودن امکانات تحقیق قدردانی می­نماید. از پروفسور عباس حسنی استاد گروه علوم باغبانی دانشگاه ارومیه به خاطر تهیه بذور ریحان سپاسگزاری می­نماید.

1- هدایتی، ا.، میرجلیلی، م. ح.، وهادیان، ج.، 1395. بررسی تنوع شیمیایی اسانس اندام­های مختلف گیاه مریم‌گلی سهندی(Salvia sahendica Boiss. & Buhse)، مجله پژوهش‌های گیاهی، جلد29، شماره 4، صفحات 918-908.
2- رامک، پ.، کاظم پور اوصالو، ش.، ابراهیم‌زاده، ح.، شریفی، م.، و بهمنش، م.، 1393. بیان ژن 1. دئوکسی گزیلولوز 5. فسفات ردوکتاز ایزومراز و ارتباط آن با بیوسنتز مونوترپن کارواکرول در گیاه مرزه خوزستانی، مجله پژوهش‌های گیاهی، جلد27، شماره 4، صفحات623-622.
 
3- Alinaghizadeh, H., Mohammadabadi, M. R., and Zakizadeh, S., 2010. Exon 2 of BMP15 gene polymorphism in Jabal Barez Red Goat, Journal of Agricultural Biotechnology, 2 (1), PP: 69-80 (In Farsi).
4- Barbazuki, W. B., Emrich, S. J., Chen, H. D., Li, L., Schnble, P. S., 2006. SNP discovery via 454 transcriptome sequencing, Plant Journal, 51, PP: 910-918.
5- Choi, I., Hyten, D. L., Kumar, L., and Cergan, P. B., 2003. Single nucleotide polymorphism discovery in 3-EST sequence of soybean, in Proceeding of Plant, Animal Genomes XI Conference (San Diego, California), January 11-15, 2003.
6- De Masi, L., Castaldo, D., Galano, G., Minasi, P., and Laratta, B., 2005. Genotyping of fig (Ficus carica L.) via RAPD markers. Journal of the Science Food and Agriculture, 85, PP: 22-35.
7- Ferreira, F. S., Davanad, L., Luthria, D. L., Sasaki, T., and Heyerick, A., 2010. Flavonids from Artemisia annua L. as antioxidants and their potential synergism with artemisinin against malaria and cancer. Molecules, 15, PP: 3135-3170.
8- Gupta, P. K., 2008. Single nucleotide polymorphisms, a new paradigm for molecular marker technology and DNA polymorphism detection with emphasis on their use in plants. Current Science, 80 (4), PP: 524-535.
9- Javanmard, A., Mohammadabadi, M. R., Zarrigabayi, G. E., Gharahedaghi, A. A., Nassiry, M. R., Javadmansh, A., and Asadzadeh, N., 2008. Polymorphism within the intron region of the bovine leptin gene in Iranian Sarabi cattle (Iranian Bos taurus), Russian Journal of Genetics, 44 (4), PP: 495-497.
10- Kim, S., and Misra, A., 2007. SNP genotyping: technologies and biomedical applications. Annual Review of Biomedical Engineering, 9, PP: 289-320.
11- Mohammadi, A., Nassiry, M. R., Mosafer, J., Mohammadabadi, M. R., Sulimova, G. E., 2009. Distribution of BoLA-DRB3 allelic frequencies and identification of a new allele in the Iranian cattle breed Sistani (Bos indicus). Russian journal of genetics, 45(2), PP: 198-202.
12- Mousavizadeh, A., Mohammadabadi, M. R., Torabi, A., Nassiry, M. R., Ghiasi, H., and Esmailizadeh, A. K., 2009. Genetic polymorphism at the growth hormone locus in Iranian Talli goats by polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP), Iranian Journal of Biotechnology, 7 (1), PP: 51-53.
13- Nagegowda, D. A., 2010. Plant volatile terpenoid metabolism: biosynthetic genes, transcriptional regulation and subcellular compartmentation. FEBS letters, 584, PP: 2965-2973.
14- Oksman-Caldentey, K. M., and Inzé, D., 2004. Plant cell factories in the post-genomic era: new ways to produce designer secondary metabolites. Trends in Plant Science, 9(9), PP: 433-440.
15- Ozcan, M., Derya, A. M., and Unver, A., 2005. Effect of drying methods on the mineral content of basil (Ocimum basilicum L.). Journal of Food Engineering, 69, PP: 375-379.
16- Phillipson, J. D., 2007. Phytochemistry and pharmacognosy. Phytochemistry, 68, PP: 2960-2972.
17- Pyne, R., Honig, J., Vaiciunas, J., Koroch, A., Wyenandt, C., Bonos, S., and Simon, J., 2017. A first linkage map and downy mildew resistance QTL discovery for sweet basil (Ocimum basilicum) facilitated by double digestion restriction site associated DNA sequencing (ddRADseq). Plose One, 12(9), PP: 1-23.
18- Rastogi, S., Meena, S., Bhattacharya, A., Ghosh, S., kumar Shukla, R., Sing Songwan, N., Kishorilal, R., Mohan Gupta, M., Chandra Lavania, U., Gupta, V., Nagegowda, D., and Shasany, A., 2014. De novo sequencing and comparative analysis of holy and sweet basil transcriptomes. BMC Genomic, 15(588), PP: 2-18.
19- Shojaei, M., Mohammadabadi, M. R., Asadi Fozi, M., Dayani, O., Khezri, A., and Akhondi, M., 2010. Association of growth trait and leptin gene polymorphism in Kermani sheep. Journal of Cell and Molecular Research, 2, PP: 67-73.
20- Tester, M., 2010. Breeding technologies to increase crop production in a changing World .Science, 327, PP: 818-822.
21- Wang, D. G, Fan, J. B., Siao, C. J., Berno, A., Young, P., Sapolsky, R., Ghandour, G., Perkins, N., Winchester, E., Spencer, J., Krugiyak, L., Stein, L., Hsie, L., Topaloglou, T., Hubbell, E., Robinson, E., Mittmann, M., Morris, M. S., Shen, N., Kilburn, D., Rioux, J., Nusbaum, C., Rozen, S., Hudson, T. J., Lipshutz, R., Chee, M., and Lander, E. S., 1998. Large-scale identification, mapping and genotyping single nucleotide polymorphisms in the human genome. Science, 280, PP: 1077-1082.
دوره 33، شماره 3
مهر 1399
صفحه 686-697
  • تاریخ دریافت: 14 تیر 1397
  • تاریخ بازنگری: 03 آبان 1397
  • تاریخ پذیرش: 25 دی 1397