نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه
چکیده
ریحان (Ocimum basillicum L.) از مهمترین گیاهان دارویی حاوی ﺗﺮﮐﯿﺒﺎت ترپنوئیدی از جمله مونوترپن و سزکوئیترپنها میباشد. ژنهای لینالول سینتاز و ژرماکرین D سینتاز از ژنهای کلیدی دخیل در سنتز ترپنها میباشند .در مطالعه حاضر به منظور شناسایی SNPها در این دو ژن در 5 توده مختلف ریحان از نشانگرهای CAPS و توالییابی استفاده شد. قطعاتی به اندازه 600 و 583 جفت باز از نواحی کدکننده این دو ژن تکثیر و با آنزیمهای برشی Pst1 و MseI هضم شد. بعد از توالییابی و بازیابی قطعه تکثیری هر ژن، شناساییSNPها با استفاده از همردیفی توالیهای هر ژن در افراد مختلف انجام گرفت. از نه SNP شناسایی شده در ژن لینالول سینتاز، به ترتیب چهار و پنج SNP در ناحیه اینترون و اگزون مشاهده شد. از کلSNP های شناسایی شده در این ژن، 8/77 درصد آنها از نوع همجنس با فراونی 4/44 درصد A/Gو 3/33 درصد T/C و 2/22 درصد آنها از نوع ناهمجنس با فراونی یکسان ناشی از تبدیلات C/G و C/A بود. از 28 SNP شناسایی شده در ژن ژرماکرین D سینتاز، هفت SNP در ناحیه اگزون و 21SNP در ناحیه اینترون شناسایی شد که 8/67 درصد آنها از نوع همجنس با فراوانی 7/35 درصد G/A و 1/32 درصد C/T و 1/32 درصد آنها از نوع ناهمجنس با فراوانی 1/7 درصد T/A، 3/14 درصد G/C و 7/10 درصد C/A بود. نتایج همردیفی توالی ژنها بین افراد نشان داد که بیشترین جهش در ژنهای لینالول سینتاز و ژرماکرین D سینتاز از نوع تبدیل بازهای همجنس A/G و T/C میباشد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
SNP discovery in exon and intron regions of Linalool synthase and Germacrene D synthase genes in basil
نویسندگان [English]
Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, Urmia University
چکیده [English]
Basil (Ocimum basillicum L.), one of the most important medicinal plants, contains monoterpene and sesquiterpene compounds. Linalool synthase (LIS) and Germacrene D synthase (GDS) are two key genes involved in terpenes biosynthesis. In the current investigation, cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) markers and sequencing were used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) in both genes in five different basil populations. For this means, fragments of 600 and 583 bp from the coding sequences of these genes were amplified and digested by using Pst1 and Mse1 restriction enzymes. After retrieval of the sequences of the amplified gene fragments, SNPs were identified based on multiple sequence alignment in both genes in studied basil genotypes. Out of the nine SNPs identified in LIS gene, five occurred in exon region while the number of SNPs identified in intron was four. Of the total SNPs detected in this gene, the proportion of transition was 77.8%, with frequencies of A/G: 44.4% and T/C: 33.3% and C/G and C/A (transversion) with the same frequencies of 22.2%. In GDS gene, in total, 28 SNPs was detected (seven in exon and 21 in intron) of which 67.8% was transient with a frequency of G/A: 35.7% and C/T: 32.1%, and 32.1% transversion (T/A: 7.15%, G/C: 14.3% and C/A: 10.7%). The results of the sequence alignments revealed that the highest number of the identified SNPs in the studied genes are A/G and TC.
کلیدواژهها [English]
شناسایی SNPها در نواحی اگزونیواینترونی ژنهای لینالول سینتاز و ژرماکرینD سینتاز در گیاه ریحان
سمانه علیاری1، بابک عبدالهی مندولکانی1،2* و ایرج برنوسی1،2
1 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی
2 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، پژوهشکده زیست فناوری، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی
تاریخ دریافت: 14/4/97 تاریخ پذیرش: 25/10/97
چکیده
ریحان (Ocimum basillicum L.)از مهمترین گیاهان دارویی حاوی ﺗﺮﮐﯿﺒﺎت ترپنوئیدی ازجمله مونوترپن و سزکوئیترپنها میباشد. ژنهای لینالول سینتاز و ژرماکرین D سینتاز از ژنهای کلیدی دخیل در سنتز ترپنها میباشند. در مطالعه حاضر بهمنظور شناسایی SNPها دراین دو ژن در 5 توده مختلف ریحان از نشانگرهای CAPS و توالییابی استفاده شد. قطعاتی بهاندازه 600 و 583 جفت باز از نواحی کد کننده این دو ژن تکثیر و با آنزیمهای برشی Pst1 و MseI هضم شد. بعد از توالییابی و بازیابی قطعه تکثیری هر ژن، شناساییSNPها با استفاده از همردیفی توالیهای هر ژن در افراد مختلف انجام گرفت. از نه SNP شناسایی شده در ژن لینالول سینتاز، به ترتیب چهار و پنج SNP در ناحیه اینترون و اگزون مشاهده شد. از کلSNP های شناسایی شده دراین ژن، 8/77 درصد آنها از نوع همجنس با فراوانی 4/44 درصد A/Gو 3/33 درصد T/C و 2/22 درصد آنها از نوع ناهمجنس با فراوانی یکسان ناشی از تبدیلات C/G و C/A بود. از 28 SNP شناسایی شده در ژن ژرماکرین D سینتاز، هفت SNP در ناحیه اگزون و 21SNP در ناحیه اینترون شناسایی شد که 8/67 درصد آنها از نوع همجنس با فراوانی 7/35 درصد G/A و 1/32 درصد C/T و 1/32 درصد آنها از نوع ناهمجنس با فراوانی 1/7 درصد T/A، 3/14 درصد G/C و 7/10 درصد C/A بود. نتایج همردیفی توالی ژنها بین افراد نشان داد که بیشترین جهش در ژنهای لینالول سینتاز و ژرماکرین D سینتاز از نوع تبدیل بازهای همجنس A/G و T/C میباشد.
واژههای کلیدی: ریحان، لینالول سینتاز، ژرماکرین D سینتاز، SNP
* نویسنده مسئول، تلفن: 04431942482 ، پست الکترونیکی: b.abdollahi@urmia.ac.ir
مقدمه
ریحان (Ocimum basilicum L.) یکی از گیاهان مهم متعلق به خانواده نعناعیان (Lamiaceae) است. این گیاه بومی ایران، هند و مناطق گرم آفریقا هست (16). اسانس ریحان غنی از ترکیبات فنولی است که در صنایع داروسازی و عطرسازی مورد استفاده قرار میگیرد (16). ریحان همانند سایر گیاهان خانواده نعناع منبع ترکیبات حلقوی و اسانس است که دافع حشرات بوده و عملکرد ضدانگلی، ضدباکتریایی، ضدقارچی و آنتیاکسیدانتی آن به خاطر وجود ترپنوئیدها میباشد که بهطور عمده در بذر، ساقه و گلآذین تجمع مییابند (1). گیاهان گروه بزرگ و متنوعی از ترکیبات آلی به نام متابولیتهای ثانویه را تولید میکنند (15). ترپنوئیدها بزرگترین و وسـیعترین گـروه از متابولیتهای ثانویه هستند که دارای بیش از ۲۰ هزار ترکیب شناخته شده میباشند. مونوترپنها و سزکوئیترپنها از ترکیبات اصلی ترپنوئیدها میباشند که از یک ساختار10 و 15 کربنی تشکیل شدهاند که گروههای عاملی گوناگونی بر اساس نوع ترکیب به این ساختارها افزوده میشود (14). مونوترپنها گروه بزرگی از ترپنوئیدها هستند که نقشهای اکولوژیکی فراوانی را در گیاهان ایفا میکنند. این ترکیبات نقش مهمی در حفاظت گیاهان در برابر آفات گیاهخوار و بیماریها، جلب گردهافشانها، حشرات پراکنده بذر، ساختار غشاء، واکنشهای اکسایشی، بازدارنده نوری، حفاظت نوری و تنظیم رشد و نمو بر عهده دارند (2و 18). لینالول بهعنوان مهمترین مونوترپن، عمدتاً از مسیر غیرموالونات مشتق میشود. همچنین سزکوئیترپنهای با ارزش دارویی در ریحان شامل ژرماکرین D و گاما کادنین توسط مسیر موالونات در سیتوزول ساخته میشوند (7). مطالعه ژنهای دخیل در بیوسنتز این ترکیبات و بررسی تنوع ژنتیکی جمعیتهای گیاهی بهمنظور تلاش برای بهبود تولید این ترکیبات ارزشمند در ریحان بسیار مهم است و ازنظر تجاری سودآور خواهد بود (21).
در اصلاح نبات سنتی، تنوع ژنتیکی اغلب براساس صفات ظاهری مشخص میشود. امروزه با پیشرفت نشانگرهای مولکولی در بسیاری از محصولات زراعی، شناسایی تنوع ژنتیکی در سطح مولکولی و بر اساس تفاوت موجود در DNA و همچنین اثر آن بر صفات فنوتیپی نیز امکانپذیر است. نشانگرهای مولکولی مبتنی بر DNA ازجمله ابزارهای قدرتمند تشخیصی هستند که نهتنها برای شناسایی چندشکلی در سطح ژنوم بلکه در ارتباط با ژنها و مکانهای ژنتیکی خاص نیز مورد استفاده قرار میگیرند. همچنین در حوزه ژنتیک و بهنژادی، اطلاع از ساختار ژنتیکی جمعیتها، پیشنیاز حفظ ذخایر ژنتیکی و برنامهریزی طرحهای اصلاح نژاد میباشد. استفاده از نشانگرهای مولکولی دراین زمینه یکی از بهترین راهکارها محسوب میشود، زیرا باتوجه به اطلاعات زیادی که به دست میدهد میتواند نتایجی که از تجزیهوتحلیل رکوردها با روشهای آماری حاصلشده را تأیید و تکمیل نماید (3). همچنین با نشانگرهای مولکولی میتوان ژنوتیپ افراد را در مکانها و جایگاههای ژنتیکی خاص تعیین نمود (13) و در انتخاب و اصلاح نژاد ممکن است بهطور مهیجی پیشرفت ژنتیکی را تسریع کند (9). مطالعه تنوع ژنتیکی نژادهای بومی برای حفاظت از منابع ژنتیکی ذخایر بومی لازم و ضروری است (12) و باید بر اساس دانش عمیقی از منابع ژنتیکی نژادهای خاص باشد، لذا تلاش برای شناسایی و تعیین خصوصیات ژنتیکی نژادهای بومی و محلی بسیار اهمیت دارد (20 و21). نشانگرهای SNP (Single nucleotide polymorphism) چندشکلی مبتنی بر تفاوت در یک نوکلئوتید است که منبع ژنتیکی عمدهای از تغییرات فنوتیپی درون یکگونه میباشد. این نشانگرها هم بارز و دو آللی میباشند و کارآیی بالای آنها به دلیل فراوانی زیاد و حضور در تمامی نواحی ژنوم (اینترونها و اگزونها) میباشد. هر فرد متعلق به یکگونه، دارای هزاران SNP میباشد که به علت پایداری بیشتر، موتاسیون کمتر و وجود آنها در بیشتر نقاط ژنوم بهعنوان نشانگرهای ژنتیکی مهم و قابلاعتماد محسوب میشوند (8و 11). بنابراین به دلیل اهمیت گیاه دارویی ریحان و نقش کلیدی دو ژن لینالول سینتاز (LIS) و ژرماکرین D سینتاز (GDS) به ترتیب در مسیر بیوسنتز مونوترپنها وسزکوئیترپنها و همچنین کارایی نشانگرهای SNP، تحقیقی بهمنظور شناسایی SNPها در ژنهای مذکور در تودههای مختلفO. basilicum و استفاده از نشانگرهای مبتنی بر این SNPها برای تمایز و تفکیک ژنوتیپها و تودههای مختلف ریحان انجام شد.
مواد و روشها
دراین تحقیق60 فرد از 5 توده ریحان ( 12 فرد از هر توده) که از مناطق مختلف ایران جمعآوریشده بود استفاده گردید (جدول1). بذور تودههای ریحان جهت استخراج DNAدر پژوهشکده زیست فناوری دانشگاه ارومیه کشت شد. برای کشت بذور از پیت ماس و گلدانهایی با اندازه مناسب استفاده شد. از زمان جوانهزنی بذر تا رسیدن به مرحله نمونهبرداری، به فاصله هر 2 روز یکبار آبیاری بهصورت مرتب انجام گرفت و بعد از رسیدن گیاه به مرحله 4-8 برگی، نمونهبرداری از برگهای تک بوتههای هر جمعیت بهصورت مجزا برای استخراج DNAانجام شد. نمونههای برگی درون نیتروژن مایع به فریزر 80- درجه سانتیگراد منتقل شد.
جدول 1- محل جمعآوری و موقعیت جغرافیایی تودههای ریحان
رنگ برگ |
عرض جغرافیایی |
طول جغرافیایی |
ارتفاع از سطح دریا |
محل جمعآوری |
کد توده |
سبز |
13-59 |
52-32 |
1491 |
بیرجند |
1 |
سبز |
46-36 |
34-48 |
1824 |
همدان |
2 |
بنفش |
23-34 |
03-47 |
1389 |
کرمانشاه 1 |
3 |
بنفش |
4-51 |
7-35 |
1100 |
ری |
4 |
بنفش |
49-34 |
56-50 |
928 |
قم |
5 |
استخراج DNA ژنومی:DNA ژنومی از برگهای جوان و سبز گیاه ریحان به روش CTAB استخـراج شد (6). بهمنظور بررسی کیفیت و کمیت DNA از الکتروفورز ژل آگارز یک درصد و اسپکتوفتومتری استفاده شد.
طراحی آغازگر: ابتدا توالی ناحیه کد کننده ژنهای لینالول سینتاز و ژرماکرن D سینتاز در ریحان با استفاده از بانک اطلاعاتی NCBI تعیین شدند و نواحی اینترونی و اگزونی آنها با استفاده از نرمافزار Softberry مشخص شد. ژن لینالول سینتاز دارای دو ناحیه اگزونی (۴۷۳-۱ و ۱۷۲۵-۵۷۱) و یک ناحیه اینترونی و ژن ژرماکرین D سینتاز دارای یک ناحیه اگزونی (۱۶۴۱-۱) بود. آغازگرها (جدول2) با نرمافزارهای FastPCR و Gene Runner طراحی و ازنظر وجود ساختارهای ثانویه مثل آغازگر-دایمر و ساختارهای سنجاق سری بررسی شدند.
جدول2- مشخصات آغازگرهای طراحی شده برای تکثیر ژنهای لینالول سینتاز و ژرماکرین D سینتاز در ریحان
دمای اتصال |
اندازه محصول (جفت باز) |
توالی آغازگر |
شماره دسترسی |
ژن |
61 |
434 |
GCTTCGTAGTGAGGTGGCGCAA (رفت) (برگشت)GCAATGGAGGGTCAGT |
AY693647 |
LIS |
61 |
236 |
CTTTGGTTAGGTTGGGTGCCAGAA (رفت) TTGGGAGTCTACTTTGAA (برگشت) |
AY693644 |
GDS |
* LIS :Linalool synthase ، GDS: Germacrene D synthase
واکنشهای PCR : برنامه دمایی PCR بهمنظور تکثیر ژنهای مورد مطالعه در 60 فرد، شامل واسرشته سازی اولیه در دمای ۹۵ درجه سانتیگراد به مدت ۵ دقیقه، تکرار ۳۵ چرخه شامل ۳۰ ثانیه واسرشته سازی در دمای ۹۴ درجه سانتیگراد، ۴۰ ثانیه در دمای اتصال بهینه هر آغازگر و ۲ دقیقه برای گسترش در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد و گسترش نهایی به مدت ۵ دقیقه در دمای ۷۲ سانتیگراد بود. محصول واکنش PCR بر روی ژل آگارز 8/1درصد الکتروفورز و رنگآمیزی با اتیدیوم بروماید انجام گرفت.
هضم قطعات تکثیر شده ژنهای مورد مطالعه: الگو برشی و طول قطعات حاصل از برش در ژنهای مورد مطالعه با استفاده از نرمافزار FastPCR پیشبینی شد. برش توالیهای تکثیری هر دو ژن با آنزیمهای Pst1 و Tru1(Mse1)در افراد مورد مطالعه (60 فرد) چندشکلی تولید نکرد. جهت آشکارسازی قطعات حاصل از برش از الکتروفورز ژل آگارز 5/1 درصد با ولتاژ 80 استفاده شد.
توالییابی: با توجه به اینکه هضم آنزیمی توالیهای تکثیری دو ژن در افراد مطالعه شده چندشکلی تولید نکرد، بنابراین برای شناسایی نشانگرهای SNP در نواحی کد کننده ژنهای لینالول سینتاز و ژرماکرین D سینتاز از روش توالییابی استفاده شد. از هرکدام از تودههای مورد مطالعه یک فرد انتخاب و توالی تکثیری ژنهای مورد مطالعه در این افراد توالییابی شد. بدین منظور بعد از انجام واکنش PCR، حدود 80 میکرولیتر از محصول PCR هر نمونه روی ژل آگارز 5/1 درصد و تحت ولتاژ 85 تفکیک گردید. با مشخص نمودن اندازه محصول روی ژل، باندهای مورد نظر برش داده شد و جهت خالصسازی و توالییابی به شرکت تکاپو زیست (تهران، ایران) ارسال گردید. توالییابی از هر دو انتهای قطعات PCR و با استفاده از هر دو آغازگر پیشرو و معکوس که در واکنش PCRاستفاده شده بود انجام گرفت. جهت جلوگیری از اشتباهات توالییابی، هر قطعه سه بار از هر دو جهت توالییابی شده و بعد توالی مورد توافق (Consensus) استخراج گردید. بعد از استخراج توالی دقیق، نواحی مشترک توالیهای رفتوبرگشت هر قطعه شناسایی و توالی نهایی بازیابی شد. در هرکدام از ژنها یک توالی به خاطر کیفیت پایین توالییابی در شناسایی SNPها مورد استفاده قرار نگرفت. برای شناسایی SNPها در هر ژن همردیفی توالیها با استفاده از نرمافزار Clastal Omega انجام گرفت.
نتایج
تکثیر قطعات ژنی و هضم آنزیمی: بهمنظور برسی الگوی برشی آنزیمی و شناسایی تنوع تک نوکلئوتیدی، قطعاتی از نواحی کد کننده این ژنها به طول 600 جفت باز از ژن لینالول سینتاز و583 جفت باز از ژن ژرماکرین D سینتاز تکثیر شد (شکل1).
شکل1- تکثیر ژنهای لینالول سینتاز (سمت چپ) و ژرما کرین D سینتاز (سمت راست) و تولید قطعاتی به ترتیب به اندازههای 600 و 583 جفت باز در تودههای مختلف ریحان (چاهکها به ترتیب M: نشانگر 1Kb فرمنتاس، 1: ری، 2: همدان،3: بیرجند، 4: کرمانشاه، 5: قم)
سپس قطعات تکثیری ژن لینالول سینتاز با آنزیم Pst1هضم شد. پیشبینی نواحی برشی این آنزیم در توالی ژن مورد مطالعه با استفاده از نرمافزار FastRCR نشان داد که هضم ناحیه اگزونی تکثیر شده ژن لینالول سینتاز با این آنزیم منجر به ایجاد دو قطعه به طول 161 و 302 جفت باز میشود که بعد از برش با این آنزیم چندشکلی در افراد مورد مطالعه مشاهده نگردید. بنابراین، قطعات تکثیری ژن لینالول سینتاز با آنزیم Mse1 نیز هضم شد. پیشبینی نواحی برشی این آنزیم در این ژن با استفاده از نرمافزار FastRCR نشان داد که هضم ناحیه تکثیری این ژن با این آنزیم منجر به ایجاد سه قطعه به طول 170، 95 و 215 جفت باز میشود. البته هضم توالی تکثیری این ژن با این آنزیم نیز در بین افراد مورد مطالعه چندشکلی ایجاد نکرد (شکل 2).
بررسی نواحی برشی آنزیم Pst1 در توالی ژن ژرماکرین D سینتاز با استفاده از نرمافزار FastPCR نشان داد که هضم ناحیه کد کننده این ژن منجر به تولید دو قطعه به طول 223 و 245 جفت باز میشود. برش قطعه تکثیری این ژن در افراد مورد مطالعه با آنزیم Pst1 نیز چندشکلی تولید نکرد.
شکل2- هضم قطعه تکثیری ژن لینالول سینتاز با آنزیم برشی Mse1، چاهکهای 1 و 2 برش با آنزیم، و 3 و 4 بدون برش، شماره چاهکها به ترتیب، 1 و 3: توده کرمانشاه، 2 و 4: توده بیرجند (اندازه باندهای نشانگر 1Kb فرمنتاس برحسب جفت باز میباشد)
بنابراین قطعه تکثیری ژن ژرماکرین Dسینتاز با آنزیم Mse1 هضم شد. بررسی نواحی برشی این ژن با نرمافزار FastPCR بیانگر تولید سه قطعه به طول 117، 104 و 352 جفت باز بود ولی هضم آنزیمی قطعه تکثیری این ژن در افراد مورد مطالعه چهار قطعه تولید کرد که نشانگر وجود یک سایت برشی اضافی برای این آنزیم در توالی این ژن در افراد مطالعه شده میباشد. هضم آنزیمی این ژن نیز در افراد مطالعه شده چندشکلی تولید نکرد (شکل3).
شناسایی نواحی اینترونی در دو ژن لینالول سینتاز و ژرماکرین D سینتاز: بهمنظور بررسی الگوی برشی آنزیمی و شناسایی تنوع تک نوکلئوتیدی، آغازگرها طوری طراحی شده بودند که اندازه محصول PCR در ژن لینالول سینتاز 434 جفت باز و در ژرماکرین D سینتاز 236 جفت باز باشد اما بعد از تکثیر و الکتروفورز نتایج متفاوتی حاصل گردید طوریکه اندازه محصول تکثیر شده در لینالول سینتاز 600 جفت باز و در ژرماکرین D سینتاز 583 جفت باز بود (شکلهای 2و 3).
شکل3- هضم آنزیمی ژن ژرماکرین D سینتاز با آنزیم برشی Mse1در تودههای مختلف ریحان (M: نشانگر اندازه 1Kb فرمنتاس، اندازه باندهای نشانگر برحسب جفت باز میباشد، چاهکهای 1 و 9 نمونههای بدون هضم، چاهکهای 2 تا 8 نمونههای هضم شده، 2 و 3: کرمانشاه، 4 و 5: بیرجند، 6 و 7: ری، 8: همدان)
باتوجه به تفاوت قطعات تکثیری پیشبینی شده با قطعات مشاهده شده روی ژل و بررسی توالی قطعات بهوسیله نرمافزار Softberry مشخص شد نواحی اضافی تکثیری مربوطه به یک ناحیه اینترونی به طول80 جفت باز در ژن لینالول سینتاز و یک ناحیه اینترونی به طول 400 جفت باز در ژن ژرماکرین D سینتاز میباشد (شکلهای 4و 5).
CCCCGGATAATTCAGAGCATCTGAGATGGCGAGGTTGGAAGCCACGACGATTCATCAGAGCAATATGGTGCACAGAGCGACCATCGGGCCAACCTTTTGGAGCTCGCAATTTCGGATTATAACCAAGTTCAGTCTCAACACCATTCGGAACTCACTGAAATTACCCGGTTTGGATATGCGATTACTTTATAGTCAATTACATGCAATTATAAATGTTTATGATTTAGTATTTGGCGAGATCGGCTCGCTGTGGTGGAAGCAGCTCGGTTTGGTTGAAAACTTGAGTTTTGGGCGAGACAGACCGTTTCGGTGCTTTTTATGGCCCATGGGGTTCCTCCCGAACCCCAAGTATTCGAGCGTTAGAATAAAATTGGCAAAAACCATTTTTATTCTGTTAGTGATGGATGACATTTTGGATACCTATGGAAAGATGGATGAATTCTTCTTTTTCACAGATGCAATTGGAAGGTTTCCTTCTGGATCAACCCCCCAACCTTTCTTCTTACCAAAATAAATGATTATGGTGACGAACAATATCAGCGATAC
شکل4- ناحیه اینترونی 80 جفت بازی شناسایی شده در ژن لینالول سینتاز در ریحان
GTGCTTCCTCTATGAGAGACGAGTCACGTGATAGAAGATTTATTAGAAGTTTGCCAAATTGGACTTCAATATATTACAAAAGATTCATCAGGAAGAGCTAACCCATATTGCAAGGTTAGCATTGTTAATAATGTTGAGGGAGTAGTACTCTATAGTCTACACATACTGTCTCAAGAATCATCCATATTCGACTTTCAATATTTCAAGTAATACTACCAAAATTGATGTCCTGTGAAAAACTTTTCCTTTGACTGTGAATTGGATATAAATCTCTTATTTTTCTAAGACGTGATCACAAGGTCTGTCCCCCCTATACGACCCCGAACAGATTTACCCGCGTGTCGACCAGCAGAGAAATGTTCCACCGGACGTCATTTTTCCCAGAAAAAACTAAATAACATGACTCTTTTTGTCATTTTGTACTGACTGGAAAATCTTATAAAAATTTGTGTATAATATATATTTTGTATTTCATAAGTATTTAATGTAGCAAAAATAATATGATCATCAATCACTGAATGTAGGTGGTGGAAGGAACTAGACTTTGGAAACAAACTACCATTGCAAGGGATAGAGTCGTGAATGCCACAGAG
شکل5- ناحیه اینترونی 400 جفت بازی شناسایی شده در ژن ژرماکرین D سینتاز در ریحان
همردیفی توالیها و شناسایی SNPها در ژن لینالول سینتاز: بهمنظور شناسایی SNPها در ژن لینالول سینتاز در نواحی اگزونی و اینترونی، همردیفی بین قطعات توالییابی شده در تودههای همدان، بیرجند، کرمانشاه و قم انجام گرفت (شکلهای 6و 7). در این همردیفی جهش مربوط به تغییر بازهای G/A، T/C، C/A و C/G مشاهده گردید که بیشترین جهش در نواحی اگزونی و اینترونی به ترتیب مربوط به تبدیل بازهای G/A و T/C بود (جدول3).
در ژن لینالول سینتاز از نه SNPشناسایی شده، به ترتیب چهار و پنج SNP در نواحی اینترونی و اگزونی مشاهده شد که 78/77 درصد آنها از نوع همجنس با فراوانی 44/44 درصد A/G و 33/33 درصد T/C و 22/22 درصد جهش ناهمجنس با فراوانی یکسان ناشی از تبدیلات C/G و C/A بود. بیشترین جهشها در هر دو ناحیه اگزونی و اینترونی از نوع همجنس (C/Tو A/G) بود. تعداد کم SNPهای شناسایی شده در ناحیه اینترونی در این ژن به خاطر طول کوتاه آن (80 جفت بازی) در مقایسه با طول ناحیه اگزونی (374 جفت بازی) بود.
شکل6- همردیفی توالی ناحیه اگزونی ژن لینالول سینتاز در چهار توده ریحان (Ham: همدان، Bir: بیرجند، kar:کرمانشاه، Gom: قم)
شکل7- همردیفی توالی ناحیه اینترونی ژن لینالول سینتاز در چهار توده ریحان (Ham: همدان، Bir: بیرجند، kar:کرمانشاه، Gom: قم)
جدول3- فراوانی SNP های شناسایی شده در ژن لینالول سینتاز در تودههای مختلف ریحان
درصد SNP |
کل SNP |
تعداد در اینترون |
تعداد در اگزون |
نوع SNP |
44/44 |
4 |
۱ |
۳ |
G/A |
۳۳/۳۳ |
۳ |
۲ |
۱ |
T/C |
۱۱/۱۱ |
۱ |
- |
۱ |
C/G |
۱۱/۱۱ |
۱ |
۱ |
- |
C/A |
درکل در توالی ژن لینالول سینتاز به ازای هر 100 جفت باز 5/1 SNP مشاهده شد ( بهطور متوسط 3/1 SNP در ناحیه اگزونی و 5 SNP در ناحیه اینترونی به ازای هر 100 جفت باز).
همردیفی توالیها و شناسایی SNP ها در ژن ژرماکرین D سینتاز: بهمنظور شناسایی SNPها در ژن ژرماکرین D سینتاز، همردیفی بین توالی ناحیه اینترون و اگزون در تودههای بیرجند، کرمانشاه، همدان و ری انجام گرفت (شکلهای 8و 9). در این همردیفی جهشهای مربوط به تبدیل بازهای G/A، T/A،C/A، G/C و T/C شناسایی شد. بیشترین جهش در ناحیه اگزونی مربوط به تبدیل باز G/A و ناحیه اینترونی مربوط به تبدیل باز G/Aو T/C بود. همچنین در این ژن یک حذف باز در توده همدان و یک درج باز در توده بیرجند شناسایی شد (جدول4).
در ژن ژرماکرینD سینتاز از 28 SNP شناسایی شده، هفت SNPدر ناحیه اگزونی و 21 SNP در ناحیه اینترونی مشاهده شد که 85/67 درصد آن از نوع همجنس با فراوانی 71/35 درصد G/A و 14/32 درصد C/T و 15/32 درصد جهش از نوع ناهمجنس با فراوانی 14/7 درصد T/A، 28/14 درصد G/Cو 73/10 درصد C/A بود. در این ژن تفاوتهای تک نوکلئوتیدی در نواحی اینترونی بیشتر از نواحی اگزونی بود. درکل در توالی ژن ژرماکرین D سینتاز به ازای هر 100جفت باز، 8/4 SNP مشاهده شد (بهطور متوسط 4 SNP در نواحی اگزونی و 25/5 SNP در نواحی اینترونی به ازای هر 100 جفت باز).
شکل8- همردیفی توالی ناحیه اگزونی ژن ژرماکرینD سینتاز در ریحان (Bir: بیرجند، Ham: همدان، Kar:کرمانشاه، Ray: ری)
جدول4- فراوانی SNPهای شناسایی شده در ژن ژرماکرین D سینتاز در تودههای مختلف ریحان
درصد SNP |
کل SNP |
تعداد در اینترون |
تعداد در اگزون |
نوع SNP |
71/35 |
10 |
7 |
3 |
G/A |
14/7 |
2 |
2 |
- |
T/A |
14/32 |
9 |
6 |
3 |
C/T |
28/14 |
4 |
3 |
1 |
G/C |
73/10 |
3 |
3 |
- |
C/A |
بحث و نتیجهگیری
SNPها چندشکلی تک نوکلئوتیدی و معمولاً دو آللی میباشند که در بیش از یک درصد افراد جمعیت مشاهده میشوند (10). از آنجایی که در مقایسه با دیگر نشانگرها،SNP ها عموماً فراوانی بالایی دارند و قابل اتوماسیون شدن و کارآمد و مقرون بهصرفه بودن از ویژگیهای بارز آنها میباشد بنابراین این نشانگرها در برنامههای اصلاح گیاهان برای تهیه نقشههای ژنتیکی با وضوح بالا و انتخاب ژنومی جزو نشانگرهای پرکاربرد هستند (17و 15). چندشکلیهای تک نوکلئوتیدی ممکن است بهطور ویژه مسئول تنوع فنوتیپی یک صفت باشد یا با SNPهای دیگر پیوسته باشند (11). انتخاب مناسبترین مجموعه SNPها در یک روش مقرون بهصرفه یک گام اساسی در جهت کاربرد نشانگرهای مولکولی برای توسعه محصولات میباشد. امروزه نشانگرهایSNP ها در مطالعات اشباع نقشههای ژنتیکی، مکانیابی ژنهای کنترلکننده صفات مختلف و انتخاب براساس نشانگر در برنامههای اصلاحی گیاهان مورد استفاده قرار میگیرند. در مطالعه حاضر SNPهای موجود در نواحی اگزونی و اینترونی ژنهای لینالول سینتاز و ژرماکرین D سینتاز (از ژنهای کلیدی دخیل در سنتز ترپنها) بهمنظور استفاده از آنها در برنامههای اصلاحی ریحان شناسایی شد. در بررسی SNPها بین دو گونه O. sanctum و O. basilicum گزارش شد که 6/66 درصد از SNPها مربوط به جهشهای همجنس میباشد که از این میزان 66/32 درصد مربوط به تبدیل A/G و 5/32 درصد ناشی از تبدیل C/T بود (19).
شکل9- همردیفی توالی ناحیه اینترونی ژن ژرماکرین D سینتاز در ریحان (Bir: بیرجند، Ham: همدان، Kar: کرمانشاه، Ray: ری)
میزان SNPهای بهدستآمده از جهش ناهمجنس در این مطالعه 4/33 درصد بود که 97/10 درصد ناشی از تبدیل A/T، 4/7 درصد به علت تبدیل G/T، 52/7 درصد از تبدیل به C/G و 95/7 درصد به خاطر تبدیل A/C بود. در مطالعه حاضر نیز درصد جهشهای همجنس در هر دو ژن لینالول سینتاز و ژرماکرین D سینتاز بیشتر از جهشهای ناهمجنس بود. در بررسی توالیهای EST در گیاه سویا نیز گزارش شد که فراوانی SNPها در نواحی اینترونی بیشتر از نواحی اگزونی میباشد و نسبت آن 2 به 4/1 در هر هزار جفت باز بود (5). در گیاه کدوی تخمه کاغذی (Cucurbita pepo L.) نیز حدود 19980 SNP شناسایی شد که 68 درصد آنها از نوع جهشهای همجنس با تبدیلات A/G و C/T و 32 درصد مربوط به جهشهای ناهمجنس با تبدیلات A/T،A/C ، G/T وC/G بود (4). نسبت جهشها و تبدیلات این مطالعه با نتایج مطالعه حاضر همخوانی دارد.
بهطور کلی نتایج مطالعه حاضر نشان داد که در هر دو ژن لینالول سینتاز و ژرماکرینD سینتاز تعداد SNPها در نواحی اگزونی کمتر از نواحی اینترونی میباشد. همچنین بیشترین تعداد تنوعهای تک نوکلئوتیدی در این ژنها از نوع تبدیلهای همجنس A/G وT /C بود. در کل در توالیهای بررسیشده این دو ژن، فراوانی SNPها در ژن لینالول سینتاز نسبت به ژرماکرینD سینتاز کمتر و فراوانی SNPها در نواحی اینترونی ژرماکرین Dسینتاز بیشتر از ژن لینالول سینتاز بود. بیشترین تعداد جهشهای حذف و اضافه در ژن ژرماکرین Dسینتاز مشاهده گردید. پیشنهاد میشود از این SNPها در برنامههای اصلاحی ریحان برای تهیه نقشههای ژنتیکی با وضوح بالا و انتخاب ژنومی و نقشهیابی ارتباطی و بهبود محصولات و شناسایی سریع ارقام مختلف زراعی استفاده شود.
سپاسگزاری
از گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی و پژوهشکده زیست فناوری دانشگاه ارومیه به خاطر فراهم نمودن امکانات تحقیق قدردانی مینماید. از پروفسور عباس حسنی استاد گروه علوم باغبانی دانشگاه ارومیه به خاطر تهیه بذور ریحان سپاسگزاری مینماید.