تاثیر پیش تیمار دمایی و نور بر القاء جنین و کالوس در کشت بساک خیار

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانش آموخته کارشناسی ارشد، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد اصفهان (خوراسگان)، اصفهان، ایران

2 دانشیار گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد اصفهان (خوراسگان)، اصفهان، ایران.

3 مرکز تحقیقات اصلاح و تولید بذر دانشگاه آزاد اسلامی واحد اصفهان (خوراسگان)، اصفهان، ایران

چکیده

با هدف ب‍ررس‍ی‌ تاثیر ترکیب‌ها و غلظت‌های مختلف هورمونی و همچنین تاثیر پیش‌تیمار دمایی و نور بر تغییر مسیر بیولوژیکی و حرکت به سمت کالوس‌زایی، جنین‌زایی و باز‌زایی در ری‍زنمونه‌های ب‍س‍اک‌ خ‍ی‍ار، پژوهشی به ص‍ورت‌ دو آزمایش ف‍اک‍ت‍وری‍ل‌ جداگانه در ق‍ال‍ب‌ طرح‌ ک‍ام‍لا ت‍ص‍ادف‍ی‌ ب‍ا س‍ه‌ ت‍ک‍رار بر روی رقم بومی فضای باز خیار اصفهانی و لاین اصلاحی خیار گلخانه‌ای اج‍را گ‍ردی‍د. فاکتورها شامل پیش تیمار دمایی (سرمای 4 درجه سانتی گراد و بدون پیش‌تیمار سرمایی (گل تازه))، تیمار نوری پس از کشت (نور و تاریکی) و غلظت‌های مختلف هورمونی شامل KIN (1 تا 5/2 میلی‌گرم/لیتر)، 2,4-D (1 تا 5/3 میلی-گرم/لیتر) و BAP (1/0 تا 5/3 میلی‌گرم/لیتر) بودند. ن‍ت‍ای‍ج‌ ح‍اک‍ی‌ از ب‍رت‍ری‌ پ‍ی‍ش‌ت‍ی‍م‍ار بدون سرما (گ‍ل‌ ت‍ازه)‌ نسبت به پیش‌تیمار سرما در ج‍ن‍ی‍ن‌‌زای‍ی‌ و ک‍ال‍وس‌‌زای‍ی‌ در لاین اصلاحی و ک‍ال‍وس‌‌زای‍ی‌ در رق‍م‌ ب‍وم‍ی‌ ب‍ود. تیمار تاریکی باعث افزایش معنی‌دار درصد کالوس‌زایی و قطر کالوس لاین اصلاحی شد، اما تاثیر معنی‌داری بر روی صفات مورد بررسی در رقم بومی نداشت. ت‍رک‍ی‍ب‌ ه‍ورم‍ون‍ی BAP و 2,4-D (5/3+1 میلی‌گرم/لیتر)در ه‍ر دو ژنوتیپ‌ ب‍اع‍ث‌ ب‍ی‍ش‍ت‍ری‍ن‌ ال‍ق‍ای‌ جنین‌زایی و کالوس‌زایی ش‍د. جنین-زایی در لاین اصلاحی تحت تاثیر فاکتورهای مورد مطالعه قرار گرفت اما این فاکتورها تاثیر معنی‌داری بر جنین‌زایی رقم بومی نداشتند. اثرمتقابل سه‌گانه پیش‌تیمار دمایی، تیمار نوری و هورمونی محیط کشت نشان داد که به‌منظور بیشترین جنین‌زایی، کالوس‌زایی و قطر کالوس در کشت بساک خیار، استفاده از گل تازه و محیط کشت 2,4-D+BAP ( 5/3+1 میلی‌گرم/لیتر )باعث حاصل شدن بهترین نتیجه خواهد شد و شرایط نور و تاریکی نقش چندانی در جنین‌زایی ندارد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Effect of Temperature Pre-Treatment and Light on Embryogenesis and Callus Induction in Anther Culture of Cucumber

نویسندگان [English]

  • Samaneh Ghanbari 1
  • Maryam Golabadi 2 3

1 MS Graduate, Dept. of Production Engineering and Plant Genetics, Collage of Agriculture, Isfahan (Khorasgan) Branch, Islamic Azad University, Isfahan, I.R. of Iran.

2 Associate Prof., Dept. of Production Engineering and Plant Genetics, Collage of Agriculture, Isfahan (Khorasgan) Branch, Islamic Azad University, Isfahan, I.R. of Iran.

3 Associate Prof., Dept. of Production Engineering and Plant Genetics, Collage of Agriculture, Isfahan (Khorasgan) Branch, Islamic Azad University, Isfahan, I.R. of Iran.

چکیده [English]

The aim of this study was to investigate the effects of hormonal compositions and concentrations, temperature and light pre-treatments in changing the biological pathways and moving toward callugenesis, embryogenesis and regeneration in cucumber anther explants. Two seperate factorial experiments were conducted in completely randomized design with three replications on open pollination Isfahan native cucumber and greenhouse inbred line. Factors consisted of tempreture (4°C cold and without cold pretreatment (fresh flower)), Light treatment (brightness and darkness) and different hormone compositions and concentrations including KIN (1 to 2.5 mg/L), BAP (0.1 to 3.5 mg/L) and 2.4-D (1 to 3.5 mg/L) at five levels. The results showed the superiority of the fresh flower in cold pre-treatment for embrygenesis and callugenesis in inbred line, and for callugenesis in native cultivar. Darkness treatment caused a significant increasing in callugenesis and callus diameter of inbred line, however did not significant effects on native cultivar. The combination of BAP and 2,4-D hormones at a rate of 3.5+1mg/L (in both genotypes) caused the highest induction of embryogenesis and callugenesis. Embryogenesis was affected by studied factors in inbred line, however these factors did not have significant effects on embryogenesis in native cucumber. Triple interaction of temperature, light and hormonal compositions in culture media showed that in order to obtain the highest embryogenesis, callus induction and callus diameter, use of fresh flowers and 2,4-D+BAP hormones (3.5+1 mg/L) are suitable in anther culture of cucumber. The conditions of lightness and darkness did not play important role in embryogenesis.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Anther
  • temperature pre-treatment
  • lightness
  • Hormones

تأثیر پیش تیمار دمایی و نور بر القاء جنین و کالوس در کشت بساک خیار

سمانه قنبری1و مریم گل‌آبادی1،2*

1 ایران، اصفهان، دانشگاهآزاداسلامی واحداصفهان (خوراسگان)،دانشکدهکشاورزی، گروهاصلاح نباتات

2 ایران، اصفهان، دانشگاهآزاداسلامی واحداصفهان (خوراسگان)، مرکز تحقیقات اصلاح و تولید بذر

تاریخ دریافت: 12/03/97              تاریخ پذیرش: 25/10/97

چکیده

باهدف ب‍ررس‍ی‌ تأثیر ترکیب­ها و غلظت­های مختلف هورمونی و همچنین تأثیر پیش­تیمار دمایی و نور بر تغییر مسیر بیولوژیکی و حرکت به سمت کالوس­زایی، جنین­زایی و باز­زایی در ری‍زنمونه­های ب‍س‍اک‌ خ‍ی‍ار، پژوهشی به ص‍ورت‌ دو آزمایش ف‍اک‍ت‍وری‍ل‌ جداگانه در ق‍ال‍ب‌ طرح‌ ک‍ام‍لاً ت‍ص‍ادف‍ی‌ ب‍ا س‍ه‌ ت‍ک‍رار بر روی رقم بومی فضای باز خیار اصفهانی و لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای اج‍را گ‍ردی‍د. فاکتورها شامل پیش تیمار دمایی (سرمای 4 درجه سانتی‌گراد و بدون پیش­تیمار سرمایی (گل تازه))، تیمار نوری پس از کشت (نور و تاریکی) و غلظت­های مختلف هورمونی شامل KIN (1 تا 5/2 میلی­گرم/لیتر)، 2,4-D (1 تا 5/3 میلی­گرم/لیتر) و BAP (1/0 تا 5/3 میلی­گرم/لیتر) بودند. ن‍ت‍ای‍ج‌ ح‍اک‍ی‌ از ب‍رت‍ری‌ پ‍ی‍ش‌ت‍ی‍م‍ار بدون سرما (گ‍ل‌ ت‍ازه)‌ نسبت به پیش­تیمار سرما در ج‍ن‍ی‍ن‌­زای‍ی‌ و ک‍ال‍وس‌­زای‍ی‌ در لاین اصلاحی و ک‍ال‍وس‌­زای‍ی‌ در رق‍م‌ ب‍وم‍ی‌ ب‍ود. تیمار تاریکی باعث افزایش معنی­دار درصد کالوس­زایی و قطر کالوس لاین اصلاحی شد، اما تأثیر معنی­داری بر روی صفات مورد بررسی در رقم بومی نداشت. ت‍رک‍ی‍ب‌ ه‍ورم‍ون‍ی BAP و 2,4-D (5/3+1 میلی­گرم/لیتر)در ه‍ر دو ژنوتیپ‌ ب‍اع‍ث‌ ب‍ی‍ش‍ت‍ری‍ن‌ ال‍ق‍ای‌ جنین­زایی و کالوس­زایی ش‍د. جنین­زایی در لاین اصلاحی تحت تأثیر فاکتورهای مورد مطالعه قرارگرفت اما این فاکتورها تأثیر معنی­داری بر جنین­زایی رقم بومی نداشتند.اثرمتقابل سه­گانه پیش­تیمار دمایی، تیمار نوری و هورمونی محیط کشت نشان داد که به­منظور بیشترین جنین­زایی، کالوس­زایی و قطر کالوس در کشت بساک خیار، استفاده از گل تازه و محیط کشت 2,4-D+BAP ( 5/3+1 میلی­گرم/لیتر) باعث حاصل شدن بهترین نتیجه خواهد شد و شرایط نور و تاریکی نقش چندانی در جنین­زایی ندارد.

واژه‌های کلیدی: ب‍س‍اک‌، پ‍ی‍ش‌ت‍ی‍م‍ار دمایی، نور، هورمون.

* نویسنده مسئول، تلفن: 09133026837، پست الکترونیکی: golabadim@gmail.com

مقدمه

 

اگرچه مدت طولانی است که سودمندی هاپلوئیدی در زمینه­های ژنتیک و اصلاح نباتات شناخته شده است، ولی بهره­برداری از آن با محدودیت­هایی مواجه بوده است، زیرا پدیده ایجاد گیاه هاپلوئید در طبیعت با فراوانی بسیار اندک رخ‌داده و ضمناً جداسازی و شناسایی این­گونه گیاهان طبیعی نیز مشکل می­باشد. ولی در صورتی که سلول­های جنسی یا گامت­ها در گیاهان بتوانند بدون انجام لقاح و به‌طور مصنوعی به یک گیاه کامل تبدیل شوند، گیاه حاصل هاپلوئید خواهد بود که سلول­های آن­ها حاوی n کروموزوم می­باشد و دراین صورت قابلیت کاربرد در اهداف مختلف را خواهند داشت (4). محققین در دهه 1950 موفق به تولید اولین گیاه هاپلوئید در خانواده کدوئیان شدند (12 و 13).

روش­های متعددی جهت تولید گیاهان هاپلوئید و به دنبال آن گیاهان هاپلوئید مضاعف وجود دارد که یکی از این روش­ها آندروژنز، می­باشد. تکنیک آندروژنز به دو روش کشت بساک و کشت میکروسپور انجام می­شود. کشت بساک در برنامه­های به نژادی بسیاری از گونه­ها استفاده شده است که محققین زیادی با به کارگیری این روش، موفق به تولید گیاهان هاپلوئید در تعداد زیادی از گونه­های گیاهی شده­اند (37). کشت بساک به عنوان ساده­ترین و مؤثرترین روش القای گیاهان هاپلوئید شناخته شده است. کشت بساک عبارت است از کاشت بساک­های دارای دانه گرده در مراحل به­خصوصی از رشد که به‌منظور تولید آندروژنز در شیشه می­باشد (5). مطالعات اولیه در ارتباط با تولید گیاهان دابل هاپلوئید از طریق روش کشت بساک در خانواده کدوئیان در گیاهانی مانند کدوی پوست کاغذی (24)، خربزه (11) و خیار (18و 32) انجام شده است که نتایج آن محدود به تولید کالوس و تعداد اندکی گیاه هاپلوئید بوده است (19). در گیاهان دیگری مانند یولاف نیز کشت بساک اجرا گردیده است (17) که در آن جنین‍زایی بطور موفق اما باززایی تنها در برخی ژنوتیپها رخ داده است.

اثرات تنظیم کننده­های رشد گیاهی به‌طور وسیعی در کشت بساک مورد بررسی قرارگرفته است. اگرچه تعداد محدودی از گونه­های گیاهی مدل (اعضای خانواده سیب زمینی­ان) به‌اضافه کردن اکسین در محیط کشت بساک نیاز ندارند، با این وجود حضور تنظیم کننده­های رشد از قبیل اکسین­ها، سیتوکنین­ها یا ترکیبی از این دو برای تولید جنین حاصل از میکروسپور در کشت بساک بسیاری از گونه­های گیاهی ضروری می­باشد (22). اکسین­ها باعث تقسیم سلولی و تمایز سلولی می­گردند و مقدار کمی سیتوکینین به‌علاوه اکسین جهت ادامه رشد بساک لازم است. از طرف دیگر توفوردی (2,4-D) باعث تسریع در تکثیر سلولی و القاء کالوس می­شود. سیتوکینین­ها باعث تسریع تقسیم سلولی و تشکیل اندام هوایی و ریخت­زایی می­شوند. تی­دیازورون(TDZ)  دارای فعالیت سیتوکینینی بوده و در غلظت­های کم برای تحریک تشکیل اندام هوایی مؤثر است (27). از طرف دیگر به‌منظور القاء تنش­زایی در آندروژنز و تغییر مسیر آندروژنز از گامتوفیتی به سمت اسپروفیتی از تیمارهای تنشی (مواد غذایی، دمای بالا و پایین) به‌طور گسترده استفاده می­گردد. گزارش­های محدودی در خصوص کشت بساک خیار در ایران وجود دارد. حمیدوند و همکاران (1392) با بررسی تأثیر پیش تیمار سرمایی بر روی کشت بساک خیار مشاهده کردند که استفاده از پیش تیمار دمایی °4 به مدت 4 روز بیشترین میزان کالوس­زایی و بیشترین تعداد رویان را در کشت بساک خیار اصفهانی و خیار آلفا ایجاد کرده­است (6). نجفی و همکاران (1394) در 4 رقم خیار فضای باز اقدام به کشت بساک نموده و فاکتورهای ژنوتیپ، نوع محیط کشت جامد و مایع و تعداد تخمدان در کشت بساک را مورد مطالعه قراردادند (7). در مطالعه آنها پاسخگویی ژنوتیپ برای فاکتورهای مختلف، متفاوت گزارش شد. ارمیون و همکاران (1394) نیز به مطالعه تأثیر ژنوتیپ و ترکیبات هورمونی برکشت بساک خیار پرداختند و مشخص نمودند که رقم خیار فضای باز باسمنج در حضور 2,4-D بیشترین کالوس­زایی را داشته است (1). همچنین تیمار هورمونیNAA  و BA بیشترین رویانزایی را داشتند. رویان­ها دراین آزمایش نمو پیدا نکردند. عبدالهی و همکاران (2016) به مطالعه تأثیر غلظت درشت مغذی­ها و غلظت آگار در محیط کشت بر روی کشت بساک خیار پرداختند و پاسخ متفاوتی را از ارقام خیار بومی و اصلاحی فضای باز به این فاکتورها مشاهده کردند (8).

کومار و همکاران (2003) در تحقیقی باززایی کشت بساک خیار را مورد بررسی قراردادند. آنها از محیط پایه B5 استفاده کردند و با غلظت 2 میکرومول  2,4-Dو 1 میکرومول BAP بهترین جنین­زایی را داشتند. پیش تیمار سرما (4درجه سانتی­گراد) به مدت 2 روز نیز بهترین پاسخ را در جنین­زایی نشان داد (18). در برخی بررسی­ها پیش تیمار دمایی در موفقیت کشت اندام­های زایشی مؤثر بوده است. ﻣﻄﺎﻟﻌﺎت در ﮔﯿﺎه گوجه‌فرنگی ﻧﺸﺎن داده­اﻧﺪ ﮐﻪ ﭘﺲ از ﺗﯿﻤﺎر ﺳﺮﻣﺎﯾﯽ، ﺑﯿﺎن ژن­ﻫﺎی ﮐﺪ ﮐﻨﻨﺪه ﺷﻮک ﮔﺮﻣﺎﯾﯽ (Heat shock proteins) اﻓﺰاﯾﺶ ﻣﯽ­ﯾﺎﺑﺪ (28). ﭼﻨﯿﻦ ﺑﻪ ﻧﻈﺮ ﻣﯽ­رﺳﺪ ﮐﻪ اﻓﺰاﯾﺶ ﺑﯿﺎن ژن­ﻫﺎی ﮐﺪ ﮐﻨﻨﺪه ﺷﻮک ﮔﺮﻣﺎﯾﯽ موجب ﺗﻮﻗﻒ ﻣﺴﯿﺮ ﺗﮑﺎﻣﻠﯽ ﻣﯿﮑﺮوﺳﭙﻮر­ﻫﺎ ﺑﻪ ﺳﻤﺖ ﺗﺸﮑﯿﻞ داﻧﻪ ﮔﺮده ﺑﺎﻟﻎ ﻣﯽ­ﺷﻮد (41). همچنین ﻣﻄﺎﻟﻌﺎت ﻧﺸﺎن داده­اﻧﺪ ﮐﻪ ژن­ﻫﺎی ﮐﺪ ﮐﻨﻨﺪه ﺷﻮک ﮔﺮﻣﺎﯾﯽ ﻣﻮﺟﺐ ﺗﺨﺮﯾﺐ دوک تقسیم و ﻣﯿﮑﺮوﺗﻮﺑﻮل­ﻫﺎ ﺷﺪه و ﺑﻪ اﯾﻦ ﺗﺮﺗﯿﺐ ﻣﻮﺟﺐ ﺑﺎزآراﯾﯽ اﺳﮑﻠﺖ ﺳﻠﻮﻟﯽ و درنتیجه ﺗﻐﯿﯿﺮ در ﭼﺮﺧﻪ ﺳﻠﻮﻟﯽ ﻣﯿﮑﺮﺳﭙﻮرﻫﺎ ﺑﻪ ﺳﻤﺖ ﻓﺮاﯾﻨﺪ روﯾﺎنزاﯾﯽ می­شوند (31).

باززایی گیاه ­هاپلوئید مضاعف از کشت بساک خیار توسط سانگ و همکاران (2007) مورد بررسی قرارگرفت. آنها بیان کردند که خیار مناطق سرد به شوک سرما و خیار مناطق گرم به شوک گرمایی پاسخ خوبی نشان می­دهند (31). این محققین برای القای کالوس از محیط پایه MS به‌اضافه 44/4 میکرومول BAP، 26/2 میکرومول 2,4-D، 64/4 میکرومول KIN، 3 درصد ساکاروز و 8/0 درصد آگار، و برای القای جنین از محیط پایه MS به‌اضافه 54/0 میکرومول NAA، 32/13 میکرومول BAP، 3 درصد ساکاروز و 8/0 درصد آگار استفاده کردند و به کمک این پروتکل 93 درصد باززایی گیاه دابل­هاپلوئید مشاهده شد. بنابراین روش کشت بساک برای هر ژنوتیپ باید بهینه‌سازی گردد (9).  

باتوجه به اینکه تیمارهای مختلف کشت بافت در شرایط مختلف آزمایشگاهی و محیطی و همچنین شرایط فیزیولوژیکی و ژنوتیپ گیاه، پاسخ­های بسیار متفاوتی را نشان می­دهند، جهت تولید گیاه هاپلویید در هر برنامه اصلاحی بایستی این فرایند در شرایط موجود به‌روز رسانی شود. از طرف دیگر مطالعه اثر فاکتورهای مختلف بر کشت بساک خیار در مقایسه با کشت تخمدان در رسیدن به موفقیت و حصول گیاه هاپلویید محدودتر بوده و اغلب بر روی خیار فضای باز انجام شده است. همچنین تعداد گزارش­های کشت بساک خیار در ایران بسیار محدود بوده و تمرکز اصلی آنها بر نوع و ترکیبات محیط کشت و اثر ژنوتیپ بوده است. لذا هدف از این مطالعه بررسی تأثیر ترکیب­ها و غلظت­های مختلف هورمون و همچنین تأثیر پیش تیمار دمایی و نور بر تغییر مسیر بیولوژیکی بساک و حرکت به سمت کالوس­زایی، جنین­زایی و باززایی در یک رقم بومی فضای باز و یک لاین اصلاح شده خیار گلخانه­ای در شرایط آزمایشگاهی مرکز تحقیقات بذر دانشگاه آزاد اسلامی واحد اصفهان بوده است.

مواد و روشها

برای اجرای این تحقیق، کشت بذور خیارهای فضای باز و گلخانه­ای درون گلخانه با دمای روز بین 25 تا 30 درجه سانتی­گراد و در شب 15-20 درجه سانتی­گراد و درصد رطوبت گلخانه حدود 60 درصد انجام شد. آبیاری به‌صورت قطره­ای و هر 2-3 روز یکبار اجرا گردید. عملیات داشت بوته­ها نیز مطابق با نیاز آن­ها صورت گرفت. بوته­ها 30 تا 45 روز پس از کشت، شروع به گلدهی کردند. ریز نمونه­های مورد نظر، اندام جنسی نر بوته خیار بودند. بیشترین گل­های چیده شده از روی گره­های اولیه ساقه بودند (29). گل­های نر با اندازه 2 تا 5 میلی­متر که حاوی میکروسپور جنین­زا (اواسط تا اواخر مرحله تک هسته­ای) بودند، بین ساعت 9:00 تا 10:00 صبح از بوته جدا شده و در ظرفی روی یخ به آزمایشگاه منتقل شدند (18) (شکل 1، a, b,c).

برای زدودن غبار سطحی ریز نمونه‌ها از آب مقطر همراه با مایع ظرفشویی به مدت سه دقیقه استفاده شد. ضدعفونی کامل گل­ها در هیپوکلریت سدیم 10 درصد به مدت ده دقیقه انجام شد. پس از آن با آب مقطر استریل و سرد، سه تا چهار بار شستشو شده و در آخر از محلول اتانول 70 درصد به مدت پنج دقیقه استفاده شد. بعد از جدا کردن بساک­ها از گل­های نر در محیط استریل، ده عدد بساک در هر پتری­دیش قرارگرفتند و به اتاقک رشد با شرایط بدون هوای آزاد و میزان نور 3000 لوکس، رطوبت 50 درصد و شرایط دمایی 2±24 درجه سانتی­گراد و 16 ساعت نور منتقل شدند. برای محیط کشت از محیط موراشیگ و اسکوگ (MS) حاوی 8 گرم بر لیتر آگار و 30 گرم بر لیتر ساکاروز استفاده شد و هورمون­های رشد براساس تیمارهای مورد استفاده به شیشه‌ها اضافه شدند و PH محیط کشت بر روی 8/5 تنظیم شد. ﻫﻮﺭﻣـﻮﻥ­ﻫـﺎﻱ ﻣـﻮﺭﺩ ﺍﺳـﺘﻔﺎﺩﻩ شامل ﺑﻨﺰﻳﻞﺁﻣﻴﻨﻮﭘﻮﺭﻳﻦ (BAP)، ﻛﻴﻨﺘﻴﻦ (Kin) و 2,4-D بودند.

به دلیل بررسی 4 فاکتور مختلف شامل ژنوتیپ، غلظت و ترکیب هورمونی، پیش تیمار دمایی و تیمار نوری در این آزمایش و پیچیدگی اثرات متقابل، این آزمایش بر روی رقم بومی خیار اصفهانی و لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای (2435/15*20) به‌طور جداگانه انجام شد. رقم بومی خیار اصفهانی از شرکت­های فروشنده بذر در اصفهان تهیه شد و لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای در دانشگاه آزاد اسلامی واحد اصفهان تهیه گردید. در هر آزمایش فاکتور اول شامل پیش تیمار دمایی در دو سطح (سرمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 48 ساعت و بدون پیش تیمار سرما به‌صورت گل تازه چیده شده از بوته)، فاکتور دوم تیمار نوری پس از کشت در دو سطح (نور و تاریکی) و فاکتور سوم غلظت­های مختلف هورمونی KIN, BAP, 2,4-D در پنج سطح (M1-M5) بودند. برای اعمال تیمار نور، نیمی از شیشه­های کشت شده حاوی غلظت­ها و ترکیبات هورمونی مختلف و همچنین بساک­های پیش تیمار شده و نشده (گل تازه) با فویل آلومینیومی (برای اعمال تاریکی) و نیمی دیگر بدون فویل، در اتاق رشد قرار داده شدند.

 

جدول 1- خلاصه‌ای از فاکتورهای مورد بررسی بر روی دو ژنوتیپ مختلف خیار

لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای

خیار بومی فضای باز اصفهانی

ترکیب و غلظت هورمونی

بدون پیش تیمار سرما (گل تازه)

4 درجه سانتی­گراد پیش تیمار سرما

بدون پیش تیمار سرما (گل تازه)

4 درجه سانتی­گراد پیش تیمار سرما

تاریکی

نور

تاریکی

نور

تاریکی

نور

تاریکی

نور

ü      

ü      

ü      

ü      

ü      

ü      

ü      

ü      

M1

ü      

ü      

ü      

ü      

ü      

ü      

ü      

ü      

M2

ü      

ü      

ü      

ü      

ü      

ü      

ü      

ü      

M3

ü      

ü      

ü      

ü      

ü      

ü      

ü      

ü      

M4

ü      

ü      

ü      

ü      

ü      

ü      

ü      

ü      

M5

M1: 2,4-D+KIN به میزان 5/1+5/3 میلی­گرم بر لیتر، M2: 2,4-D+BAP به میزان 1+5/2 میلی­گرم بر لیتر، M3: 2,4-D+BAP+KIN به میزان 1+5/2+5/3 میلی­گرم بر لیتر، M4: 2,4-D+BAP به میزان 5/3+1 میلی­گرم بر لیتر، M5: 2,4-D+BAP+KIN به میزان 1/0+1+5/1 میلی­گرم بر لیتر

 

 

چهار هفته پس از کشت درصد جنین­زایی، درصد کالوس­زایی و قطر کالوس (با استفاده از کولیس دیجیتال) اندازه­گیری شد (شکل­های 1، d, e, f, g, h). به این منظور تعداد بساک­هایی که جنین یا کالوس تولید کرده بودند یادداشت شدند. از تقسیم کردن تعداد بساک­های دارای جنین یا کالوس به تعداد اولیه بساک، درصدهای مختلف جنین­زایی و کالوس­زایی به دست آمدند.

آزمایش به‌صورت فاکتوریل و براساس طرح کاملاً تصادفی و با سه تکرار اجرا شد. برای داده­هایی که نرمال نبودند از تبدیل داده­ها استفاده گردید. تجزیه واریانس با استفاده از دستور ANOVA در نرم‌افزار آماری  SASانجام شد. مقایسات میانگین با استفاده از آزمون حداقل تفاوت معنی­دارLSD  در سطح معنی‌دار 05/0 درصد انجام گرفت.

نتایج

دراین بررسی اثر پیش­تیمار 4 درجه سانتی­گراد به مدت 48 ساعت در مقابل گل­هایی که پیش­تیمار نداشتند، تیمار نور و تاریکی و ترکیبات هورمونی مختلف برکشت بساک خیار در یک لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای و خیار بومی اصفهان بررسی شد که نتایج تجزیه واریانس در جدول 2 آورده شده است. هردو ژنوتیپ خیار شامل لاین اصلاحی و رقم بومی روند مشابهی را در مقابل پیش تیمار سرما از خود نشان دادند و بیشترین کالوس­زایی در هر دو ژنوتیپ مورد بررسی در شرایط بدون پیش­تیمار سرما به دست آمد و رقم بومی خیار درصد کالوس­زایی بیشتری نسبت به لاین اصلاحی نشان داد (36 درصد در مقابل 26 درصد).

 

شکل 1- القاء کالوس و جنین در کشت بساک خیار. (a,b) اندازه و شکل مناسب گل­های نر خیار در کشت بساک،c) ) مرحله تک هسته­ای میکروسپور در گل نر با اندازه مناسب، d)) کالوس­های القا شده روی بساک، e , f)) کالوس­های رویان­زا، g, h)) رویان­های القاء شده در مراحل رشد و نموی مختلف روی کالوس­ها

اگرچه خیار گلخانه­ای جنین­زایی بیشتری را در شرایط بدون سرما نشان داد (75/7 درصد در مقابل 72/0 درصد)، اما رقم بومی فضای باز تفاوتی ازنظر جنین­زایی در دو شرایط دمایی نداشت (جدول 3).

تیمار تاریکی اثر معنی­داری بر درصد کالوس­زایی و قطر کالوس لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای داشت و باعث افزایش معنی­دار کالوس­زایی و قطر کالوس در این ژنوتیپ شد، اما تأثیر معنی­داری بر روی صفات مورد بررسی در رقم بومی نداشت (جداول 2 و4).

در این بررسی محیط کشت­های مختلف بر هر سه صفت مورد بررسی به‌جز درصد جنین­زایی در رقم بومی دارای اثر معنی­داری بودند (جدول 2).

 

جدول2- نتایج تجزیه واریانس لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای و رقم بومی در کشت بساک

منبع تغییر

درجه آزادی

میانگین مربعات در لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای

میانگین مربعات در رقم بومی

جنین­زایی(%)

کالوس­زایی(%)

قطر کالوس (mm)

جنین­زایی(%)

کالوس­زایی(%)

قطر کالوس (mm)

پیش­تیمار دما (P)

1

**0312/0

**1047/0

n.s   0507/0

n.s 0071/0

*0779/0

n.s  185/0

نور(T)

1

n.s00002/0

**1368/0

*234/0

n.s0001/0

n.s0561/0

n.s001/0

غلظت هورمون (M)

4

**0051/0

**0571/0

*158/0

n.s003/0

*614/0

**559/0

P*T

1

n.s001/0

**105/0

*258/0

n.s0045/0

**158/0

n.s031/0

P*M

4

**0058/0

**0462/0

*156/0

n.s  0147/0

**  114/0

**443/0

T*M

4

n.s0014/0

**084/0

n.s154/0

n.s  0104/0

n.s0148/0

n.s015/0

P*T*M

4

*003/0

**101/0

**362/0

n.s0073/0

n.s0396/0

*213/0

خطا

40

0012/0

0091/0

055/0

0021/0

0185/0

08/0

ضریب تغییرات

0

72/5

72/11

76/15

64/7

5/14

64/16

** و * و nsبه ترتیب معنی­دار در سطح احتمال 1 درصد، 5 درصد، و فاقد تفاوت معنی­دار

جدول3- مقایسه میانگین درصد جنین زایی و کالوس زایی در پیش­تیمارهای دمایی مختلف در دو ژنوتیپ لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای و بومی

رقم بومی

 

لاین اصلاحی خیار گلخانه‌ای

پیش تیمار

کالوس­زایی(%)

 

کالوس­زایی(%)

جنین­زایی(%)

b15/32

 

b17/18

b72/0

سرما

a87/36

 

a08/26

a75/7

بدون سرما

میانگین­های دارای حداقل یک حرف مشترک فاقد تفاوت معنی­دار با آزمون LSD در سطح احتمال 5 درصد می‌باشند.

 

جدول4- مقایسه میانگین صفات درصد جنین زایی و کالوس زایی در تیمار نوری پس از کشت در کشت بساک خیار

تیمار

صفات در لاین اصلاحی خیار گلخانه‌ای

کالوس­زایی(%)

قطر کالوس(mm)

نور

b66/16

b41/1

تاریکی

a2/28

a05/2

میانگین­های دارای حداقل یک حرف مشترک فاقد تفاوت معنی­دار با آزمون LSD در سطح احتمال 5 درصد می‌باشند.

 

محیط کشت شماره 4 با ترکیب BAP و 2,4-D (به میزان 5/3+1 میلی­گرم بر لیتر) دارای بیشترین درصد جنین­زایی و کالوس­زایی و بیشترین قطر کالوس در هر دو ژنوتیپ بود (جدول 5). اگرچه اختلاف این تیمار با سایر تیمارهای هورمونی در همه صفات به‌جز میزان کالوس­زایی در رقم بومی ازنظر آماری معنی­دار بود و تأثیر غلظت­های مختلف هورمونی بر جنین­زایی و کالوس­زایی خیار گلخانه­ای بیشتر از خیار بومی مشاهده گردید.

اثر متقابل پیش­تیمار دمایی و تیمار پس از کشت (نور و تاریکی) برای صفات درصد کالوس­زایی و قطر کالوس در لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای و برای صفت درصد کالوس­زایی در رقم بومی معنی­دار بو (جدول 2). بیشترین کالوس­زایی در پیش­تیمار بدون سرما (گل تازه) و شرایط تاریکی پس از کشت مشاهده شد. اما در رقم بومی بیشترین کالوس­زایی در پیش تیمار بدون سرما و شرایط نور حاصل شد (جدول 6). در هر دو مورد اختلاف تیمارهای ذکرشده با سایر تیمارها ازنظر آماری معنی­دار بود. ازنظر قدرت کالوس­زایی در تیمارهای نوری و دمایی تفاوت قابل‌توجهی بین رقم بومی و لاین اصلاحی وجود داشت بطوریکه لاین اصلاحی در تیمار بدون سرما و تاریکی بیشترین کالوس­زایی و جنین­زایی را نشان داد، اما رقم بومی در تیمار بدون سرما و نور بیشترین کالوس­زایی را بروز داد.

 

جدول5- مقایسه میانگین صفات در غلظت­ها و ترکیبات هورمونی مختلف در کشت بساک دو ژنوتیپ لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای و رقم بومی

تیمار محیط کشت

صفات مورد بررسی در لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای

صفات مورد بررسی در رقم بومی

جنین­زایی(%)

کالوس­زایی(%)

قطر کالوس(mm)

کالوس­زایی(%)

قطر کالوس(mm)

M1

b38/1

bc62/16

b48/1

b98/24

bc  87/1

M2

b2/3

c9/16

b62/1

a45/37

c5/1

M3

b1/3

ab67/21

b89/1

a02/37

bc86/1

M4

a57/10

a26/30

a57/1

a64/41

ab5/2

M5

b15/4

a35/26

ab55/1

ab91/31

a77/2

میانگین­های دارای حداقل یک حرف مشترک فاقد تفاوت معنی­دار با آزمون LSD در سطح احتمال 5 درصد می‌باشند.

M1: 2,4-D+KIN به میزان 5/1+5/3 میلی­گرم بر لیتر، M2: 2,4-D+BAP به میزان 1+5/2 میلی­گرم بر لیتر، M3: 2,4-D+BAP+KIN به میزان 1+5/2+5/3 میلی­گرم بر لیتر، M4: 2,4-D+BAP به میزان 5/3+1 میلی­گرم بر لیتر، M5: 2,4-D+BAP+KIN به میزان 1/0+1+5/1 میلی­گرم بر لیتر

جدول6- مقایسه میانگین صفات در بررسی اثر متقابل پیش تیمار دمایی و تیمار نوری در کشت بساک خیار

رقم بومی

لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای

اثر متقابل

کالوس­زایی(%)

قطر کالوس­(mm)

کالوس­زایی(%)

2/32 b

ab48/1

b7/16

P1*T1

1/32 b

ab02/2

b05/19

P1*T2

02/44 a

b36/1

b65/16

P2*T1

73/29 c

a08/2

a77/20

P2*T2

میانگین­های دارای حداقل یک حرف مشترک فاقد تفاوت معنی­دار با آزمون LSD در سطح احتمال 5 درصد می‌باشند.

P1: پیش­تیمار سرما و P2: پیش­تیمار بدون سرما. T1: تیمار نور و T2: تیمار تاریکی.

 

در شرایط پیش تیمار بدون سرما و محیط کشت  M4(BAP و 2,4-D به میزان 5/3+1 میلی­گرم بر لیتر) بیشترین درصد جنین­زایی، کالوس­زایی و قطر کالوس در لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای مشاهده شد (جدول 7). به‌ویژه درصد جنین­زایی در این تیمار اختلاف زیادی را با سایر تیمارها نشان داد (38/19 درصد). در ارقام بومی بیشترین کالوس­زایی و قطر کالوس در شرایط پیش تیمار بدون سرما و محیط کشت  M4(BAP و 2,4-D به میزان 5/3+1 میلی­گرم بر لیتر) و همچنین محیط کشت M3 (2,4-D+BAP+KIN به میزان 1+5/2+5/3 میلی­گرم بر لیتر) همراه با پیش تیمار سرما مشاهده شد. این در حالی است که در رقم بومی نوع و غلظت هورمون در حضور یا عدم حضور پیش تیمار دمایی تأثیر متفاوتی بر کالوس­زایی داشته است.

باتوجه به شکل دو مشخص می­شود که بیشترین کالوس­زایی در لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای در شرایط تاریکی پس از کشت و محیط کشت شماره 4 (BAP و 2,4-D به میزان 5/3+1 میلی­گرم بر لیتر) به دست آمد. کمترین کالوس­زایی نیز در شرایط نور پس از کشت و محیط کشت شماره 1 (2,4-D+KIN به میزان 5/1+5/3 میلی­گرم بر لیتر)به دست آمد (شکل 2). در محیط کشت­های شماره 1، 3 و 4 درصد کالوس­زایی در تاریکی بیش از نور بود، اما در دو محیط کشت دیگر (2 و5) برعکس این حالت دیده شد، هرچند همچنان بالاترین کالوس­زایی در تیمار تاریکی به دست آمد. نتایج حاضر نشان می­دهد در لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای شرایط نور و حضور غلظت بالای 2,4-D می­تواند باعث کاهش معنی­دار کالوس­زایی شود. در مقابل حضور غلظت بالای BAP در تاریکی کالوس­زایی را افزایش داده است. اثر متقابل تیمار نوری و ترکیب هورمونی در رقم بومی خیار تفاوت معنی­داری برای صفات مورد بررسی نشان نداد (جدول 2).

 

 

جدول7- مقایسه میانگین صفات در اثر متقابل پیش تیمار دمایی و ترکیب و غلظت هورمونی در کشت بساک خیار

ارقام بومی

لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای

اثر متقابل

قطر کالوس(mm)

کالوس­زایی(%)

قطر کالوس(mm)

کالوس­زایی(%)

جنین­زایی(%)

cde 26/1

c41/19

ab43/1

bc18/22

b0

P1*M1

de19/1

ab85/38

b05/1

d58/10

b4/0

P1*M2

abc69/1

a50

ab43/1

bcd36/14

b2/0

P1*M3

bcde38/1

bc31/33

ab39/1

bc96/19

b0

P1*M4

abcd68/1

bc18/22

b28/1

bcd18/22

b76/2

P1*M5

abcd63/1

bc55/30

b23/1

cd06/11

b76/2

P2*M1

e06/1

abc06/36

ab32/1

bc18/22

b53/5

P2*M2

cde25/1

bc8/20

b14/1

ab76/27

b53/5

P2*M3

a07/2

a96/49

a05/2

a85/38

a38/19

P2*M4

ab79/1

ab65/41

ab45/1

ab53/30

b53/5

P2*M5

میانگین­های دارای حداقل یک حرف مشترک فاقد تفاوت معنی­دار با آزمون LSD در سطح احتمال 5 درصد می‌باشند.

P1: پیش­تیمار سرما و P2: پیش­تیمار بدون سرما. M1-5: (ترکیبات و غلظت­های مختلف هورمون

M1: 2,4-D+KIN به میزان 5/1+5/3 میلی­گرم بر لیتر، M2: 2,4-D+BAP به میزان 1+5/2 میلی­گرم بر لیتر

M3: 2,4-D+BAP+KIN به میزان 1+5/2+5/3 میلی­گرم بر لیتر،M4: 2,4-D+BAP به میزان 5/3+1 میلی­گرم بر لیتر، M5

: 2,4-D+BAP+KIN به میزان 1/0+1+5/1 میلی­گرم بر لیتر

 

 

شکل 2- اثر متقابل تیمار نور و ترکیب و غلظت هورمونی محیط کشت بر روی صفت کالوس زایی در لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای

M1: 2,4-D+KIN به میزان 5/1+5/3 میلی­گرم بر لیتر، M2: 2,4-D+BAP به میزان 1+5/2 میلی­گرم بر لیتر، M3: 2,4-D+BAP+KIN به میزان 1+5/2+5/3 میلی­گرم بر لیتر، M4: 2,4-D+BAP به میزان 5/3+1 میلی­گرم بر لیتر، M5: 2,4-D+BAP+KIN به میزان 1/0+1+5/1 میلی­گرم برلیتر

اثر متقابل سه‌گانه پیش تیمار دمایی، تیمار نوری و ترکیب هورمونی محیط کشت برای سه صفت اندازه­گیری شده در لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای و قطر کالوس در رقم بومی معنی­دار بود (جدول 2). بیشترین جنین­زایی در لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای (شکل 3) را پیش تیمار بدون سرما و شرایط نور و محیط کشت شماره 4 (BAP و 2,4-D به میزان 5/3+1 میلی­گرم بر لیتر) و پیش­تیمار بدون سرما و شرایط تاریکی و محیط کشت شماره 4 (BAP و 2,4-D به میزان 5/3+1 میلی­گرم بر لیتر) به خود اختصاص داد. بیشترین کالوس­زایی نیز در لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای مربوط به اثر متقابل پیش تیمار بدون سرما و تیمار تاریکی و تیمار محیط کشت شماره 3و 4 بود (شکل 4) و با سایر تیمارها تفاوت معنی­داری نشان داد. قطر کالوس در لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای در اثر متقابل پیش­تیمار بدون سرما و تیمار نور و تیمار محیط کشت شماره 4 بالاترین مقدار را نشان داد (شکل 5).

نتایج حاضر نشان داد به‌منظور حاصل شدن بیشترین جنین­زایی، کالوس­زایی و قطر کالوس در کشت بساک خیار استفاده از گل تازه بدون پیش تیمار سرمایی و محیط کشت شماره 4 حاوی هورمون­های توفوردی و بنزیل آمینو پورین باعث حاصل شدن بهترین نتیجه خواهد شد و شرایط نور و تاریکی نقش چندانی در جنین­زایی ندارد. بیشترین قطر کالوس در ارقام بومی نیز در شرایط پیش تیمار بدون سرما، تیمار تاریکی و ترکیب هورمونی محیط کشت شماره 4 (BAP و 2,4-D به میزان 5/3+1 میلی­گرم بر لیتر) مشاهده شد (شکل 6). نتایج بررسی اثر متقابل سه‌گانه در دو ژنوتیپ مورد بررسی نشان داد که هر دو ژنوتیپ تقریباً واکنش مشابهی به شرایط موجود در این آزمایش نشان داده­اند.

 

شکل 3-اثر متقابل پیش تیمار دما، تیمار نور و ترکیب محیط کشت بر روی صفت جنین زایی در لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای

M1: 2,4-D+KIN به میزان 5/1+5/3 میلی­گرم بر لیتر، M2: 2,4-D+BAP به میزان 1+5/2 میلی­گرم بر لیتر، M3: 2,4-D+BAP+KIN به میزان 1+5/2+5/3 میلی­گرم بر لیتر، M4: 2,4-D+BAP به میزان 5/3+1 میلی­گرم بر لیتر، M5: 2,4-D+BAP+KIN به میزان 1/0+1+5/1 میلی­گرم بر لیتر

 

 

شکل 4- اثر متقابل پیش تیمار دما، تیمار نور و ترکیب محیط کشت بر روی صفت کالوس زایی در لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای

M1: 2,4-D+KIN به میزان 5/1+5/3 میلی­گرم بر لیتر، M2: 2,4-D+BAP به میزان 1+5/2 میلی­گرم بر لیتر، M3: 2,4-D+BAP+KIN به میزان 1+5/2+5/3 میلی­گرم بر لیتر، M4: 2,4-D+BAP به میزان 5/3+1 میلی­گرم بر لیتر، M5: 2,4-D+BAP+KIN به میزان 1/0+1+5/1 میلی­گرم بر لیتر

 

شکل 5- اثر متقابل پیش تیمار دما، تیمار نور و ترکیب محیط کشت بر روی صفت قطر کالوس در لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای

M1: 2,4-D+KIN به میزان 5/1+5/3 میلی­گرم بر لیتر، M2: 2,4-D+BAP به میزان 1+5/2 میلی­گرم بر لیتر، M3: 2,4-D+BAP+KIN به میزان 1+5/2+5/3 میلی­گرم بر لیتر، M4: 2,4-D+BAP به میزان 5/3+1 میلی­گرم بر لیتر، M5: 2,4-D+BAP+KIN به میزان 1/0+1+5/1 میلی­گرم بر لیتر

 

 

شکل 6-اثر متقابل پیش تیمار دمایی، تیمار تاریکی و محیط کشت بر روی صفت قطر کالوس در ارقام بومی

M1: 2,4-D+KIN به میزان 5/1+5/3 میلی­گرم بر لیتر، M2: 2,4-D+BAP به میزان 1+5/2 میلی­گرم بر لیتر، M3: 2,4-D+BAP+KIN به میزان 1+5/2+5/3 میلی­گرم بر لیتر، M4: 2,4-D+BAP به میزان 5/3+1 میلی­گرم بر لیتر، M5: 2,4-D+BAP+KIN به میزان 1/0+1+5/1 میلی­گرم بر لیتر

بحث و نتیجه‌گیری

یکی از فاکتورهای مورد بررسی در این مطالعه پیش تیمار سرما در کشت بساک بود. انتظار می‌رود پیش تیمار سرما باعث کندی فرآیندهای تجزیه بافت­های سوماتیک بساک و متعاقباً حفاظت میکروسپور در برابر ترکیبات سمی رهاشده از زوال بساک شود. پیش تیمار سرما همچنین می­تواند باعث افزایش فراوانی مضاعف شدگی مجدد داخلی ((endo-reduplication می­شود (30). در تیمارهای سرمایی محتوای آمینواسید آزاد بساک افزایش پیدا می­کند که باعث سازگارشدن میکروسپور به تغییرات متابولیکی القای جنین زایی می­شود (39).

دو مکانیسم پیشنهادی برای اثر سرما در القای آندروژنز در کشت میکروسپور وجود دارد. یکی ساخته شدن دو پروتئین از نوع پروتئین­های حرارتی (Heat shock proteins) که برای محافظت از سلول­ها در برابر سرما ساخته می­شوند که با مکانیسمی سبب تغییر مسیر گامتوفیتی به اسپروفیتی می­شود. مکانسیم دیگر آهسته­تر شدن مراحل رشد فیزیولوژیکی است که موجب کمبود مواد غذایی و گرسنگی می­شود و گرسنگی موجب تغییر مسیر گامتوفیتی به اسپروفیتی می­گردد (30). پیش تیمار سرما باعث تغییر روند رشد میکروسپور از تولید دانه گرده به سمت فرآیند آندورژنز خواهد شد (10). نتایج مقایسه میانگین این مطالعه نشان داد در هر دو ژنوتیپ خیار شامل لاین اصلاحی و رقم بومی بیشترین جنین­زایی و کالوس­زایی در شرایط بدون پیش­تیمار سرما حاصل شده است. احتمالاً باتوجه به اینکه ژنوتیپ­های بکار رفته در این مطالعه ماهیت گرمادوست داشته‌اند (سازگار به شرایط گرم و خشک اصفهان برای رقم بومی و سازگار به شرایط گرم و مرطوب گلخانه‌ای برای لاین اصلاحی)، پاسخگویی آنها به‌پیش تیمار سرما قابل‌مشاهده نبوده است. از طرف دیگر با توجه به اینکه پیش­تیمار سرما منجر به تغییر فاز گامتوفیتی به اسپروفیتی می­شود، امکان وقوع این حالت در کالوس­ها و جنین­های ایجاد شده در این مطالعه وجود دارد که نیازمند بررسی­های سلولی و شمارش تعداد کروموزوم­ها در ادامه روند مطالعه است. لازاریدو و همکاران (2005) دﻟﯿﻞ ﮐﻢﭘﺎﺳﺦده ﺑﻮدن ﮔﯿﺎﻫﺎن ﺑﻪ ﮐﺸﺖ ﺑﺴﺎک و ﺑﺎززاﯾﯽ ﮔﯿﺎﻫﭽﻪ ﺳﺒﺰ را ﺗﻔﺎوت در ژﻧﻮﺗﯿﭗﻫﺎ ﺑﯿﺎن ﮐﺮدﻧﺪ (20). سوپرونووا و شمیکووا (2008) در بررسی امکان تولید هاپلوییدی از کشت بساک، تخمدان و میکروسپور خیار بر روی 10 ژنوتیپ مختلف، مشخص نمودند که تنها یک ژنوتیپ توانست گیاهچه هاپلویید تولید نماید و در کشت بساک، جنین­ها از بافت سوماتیکی بساک حاصل شدند (33). در مطالعه سانگ و همکاران (2007) در آزمایشی اعمال پیش­تیمار 4 درجه سانتی­گراد را به مدت 0 تا 4 روز، بر روی سه ژنوتیپ خیار مورد بررسی قراردادند. نتایج آن­ها نشان داد که در دو ژنوتیپ پیش­تیمار 4 درجه سانتی­گراد به مدت 2 روز باعث افزایش تولید کالوس جنین­زا شد، ولی یک ژنوتیپ بدون اعمال پیش­تیمار سرما بیشترین القای کالوس و جنین را داشت (32)، که در یکی از ژنوتیپ­های مطالعه این محققان، نتایجی مشابه بامطالعه حاضر به دست آمد که نشان‌دهنده تأثیر بسیار شدید ژنوتیپ بر مؤثر بودن پیش تیمار سرما در جنین­زایی و کالوس­زایی است. مکانیسم­های سلولی رخ‌داده در اثر پیش تیمار سرما توسط کومار و همکاران (2002) بررسی شد (18). این محققین از دو ژنوتیپ خیار، غلظت­های مختلف اکسین و سیتوکینین و اعمال پیش­تیمار 4 درجه سانتی­گراد به مدت یک تا ده روز استفاده کردند. نتایج آن­ها حاکی از آن بود که در هر دو ژنوتیپ، اعمال سرما به مدت 2 روز بیشترین القای جنین را داشت. بنابراین درمجموع بهترین تنش دمایی بستگی به نوع ژنوتیپ و منشأ آن دارد، بطوریکه در یک سری ژنوتیپ­ها پیش تیمار سرمایی4 روز، در ژنوتیپ­های دیگر پیش­تیمار سرمایی 2 روز و در برخی ژنوتیپ­ها حتی تیمار عدم سرما در پاسخ گیاه به کشت بافت تأثیر داشته است.به‌طور مثال ژنوتیپ­هایی که منشأ آنها مناطق سردسیر باشد به تنش­های سرمایی پاسخ مناسبتری می­دهند، در مقابل ژنوتیپ­های با منشأ مناطق گرمسیر پاسخ بهتری به تنش­های گرما می­دهند (32). در مطالعه حاضر نیز رقم بومی اصفهان و لاین اصلاحی باتوجه به سازگاری به شرایط آب و هوایی گرم، به تنش سرما پاسخ کمتری نشان دادند.

دراین بررسی تیمار تاریکی باعث افزایش معنی­دار کالوس­زایی و قطر کالوس لاین اصلاحی خیار گلخانه­ای شد، اما تأثیر معنی­داری بر روی صفات مورد بررسی در رقم بومی نداشت. زی و همکاران (2005) در بررسی کشت بساک خیار بهترین شرایط کالوس­زایی را در شرایط تاریکی و پیش تیمار دمایی 4 درجه سانتی­گراد به مدت 48 تا 72 ساعت مشاهده کردند (39). شدت نور، دوره نوری و کیفیت نور از مهمترین عوامل فیزیکی مؤثر در رشد و نمو، مورفوژنزیز، فتوتروپیسم، فتوسنتز و متابولیسم گیاه هستند (25). باتوجه به پاسخ متفاوت دو ژنوتیپ به تیمار نوری و باتوجه به مکانیسم­های متفاوت فعال‌شده در حضور یا عدم حضور نور از قبیل تغییر در سطح تنظیم کننده­های رشد از قبیل اکسین و سیتوکنین و تغییر در سطح آنزیم­هایی مانند پلی فنل اکسیداز (34و 25)، می­توان نتیجه گرفت که سطح تحریک این‌گونه متابولیسم­ها در دو ژنوتیپ متفاوت بوده و برای یافتن تفاوت آنها بایستی ارزیابی­های بیوشیمیایی در سطح سلولی صورت پذیرد. همچنین باتوجه به نتایج این مطالعه و سایر مطالعات مشخص می­شود که پاسخ به تیمار نوری همانند تیمار دمایی به‌شدت وابسته به ژنوتیپ است و مکانیسم­های بسیار پیچیده در ژنوتیپ­های مختلف می‍توانند تحت تأثیر این‌گونه تیمارها فعال یا غیرفعال شوند. محققان زیادی به تأثیر ژنوتیپ بر پاسخگویی بساک در کشت بافت گیاه اشاره کرده­اند (14، 15و 26). در بررسی کشت بساک خیار توسط کومار و همکاران (2002) نیز به پاسخ متفاوت دو رقم مورد بررسی به جنین­زایی اشاره شده است (18). در مطالعه حاضر نیز باتوجه به ماهیت متفاوت دو ژنوتیپ به کاررفته ازنظر فضای باز و گلخانه­ای بودن و همچنین بومی و اصلاحی بودن آنها، انتظار پاسخ­های متفاوت چندان دور از انتظار نیست. درمجموع پاسخ متفاوت ژنوتیپ­ها به کشت بافت می­تواند به تفـاوت ترکیـب و غلظـت­هـای هورمـون­هـای داخلــی گیــاه و تفــاوت­هــای حساســیت بــه تنظیم کننده­های رشد مصـنوعی مورد استفاده و شـرایط محیطی گیاه مرتبط باشد  (21، 23و 36).

مکانیزم کامل بهبود اندام‌زایی در شرایط تاریکی هنوز به‌صورت کامل روشن نشده است، اما محققان اظهار داشتند که انکوباسیون بافت­های گیاهی در تاریکی ممکن است باعث محافظت تنظیم کننده­های رشد و دیگر ترکیبات حساس به نور شود (40). تانگ و همکاران (2009) نیز برای القای کالوس در کشت بساک گیاه نخود از تیمار تاریکی استفاده کردند (35). در مطالعه بر روی کشت بساک خیار توسط سانگ و همکاران (2007) نشان داده شد که تفاوت معنی­داری بین تیمار نور و تاریکی پس از کشت وجود نداشت (32). نتایج مطالعه رضا نژاد و طراحی (1392) در کشت ریز نمونه­های دمبرگ، برگ، ساقه، بساک، مادگی و گلبرگ رز گالیکا تحت تیمار نوری و تنظیم کننده‌های رشد نشان داد که غلظت‌ 3-2 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D و 1 میلی‌گرم در لیتر BAP برای تحریک تولید کالوس در ‌جداکشتهای مختلف بهینه بودند. همچنین در مطالعه این محققان مشخص شد که تیمارهای نوری و تاریکی، اثر معنی‌داری برکالوس‌زایی نشان ندادند، اما نور با شدت 2000 لوکس تا حدودی سبب بازدارندگی کالوس‌زایی ‌در جداکشتهای رویشی و بساک شد (3).

تنظیم کننده­های رشد بخصوص اکسین­ها به‌طور گسترده­ای به‌منظور القاء آندروژنز استفاده می­شوند و غلظت مناسب آنها از گونه­ای به گونه دیگر متفاوت است (16). غلظت بالای اکسین می­تواند مانع ریخت­زایی گردد. دراین بررسی محیط کشت شماره 4 با ترکیب BAP و 2,4-D (به میزان 5/3+1 میلی­گرم بر لیتر) دارای بیشترین درصد جنین­زایی و کالوس­زایی و بیشترین قطر کالوس بود. در مطالعه جوادیان و همکاران (1394) بیشترین باززایی در کشت نوساقه کتان سفید در تیمار هورمونی 2 میلی‌گرم در لیتر BAP بدست آمد. کومار و همکاران (2002) اثر 2,4-D را با BAP، KIN و TDZ بررسی کردند و با ترکیب 2,4-D+BAP بیشترین جنین­زایی و کالوس­زایی را به دست آوردند (18)، که با نتایج تحقیق حاضر مطابقت دارد. در اکثر محیط­های استفاده شده در تحقیق حاضر غلظت­های مختلف 2,4-D و BAP وجود داشت و این نتایج مطابق با داده­های به دست آمده از پژوهش تانگ و همکاران (2009) مبنی بر وجود 2,4-D و BAP جهت القای جنین و گیاهچه در کشت بساک بود (35). توفوردی نه‌تنها اثر هورمون رشدی دارد، بلکه اگر در غلظت­های بالا استفاده شود می­تواند به‌عنوان یک تیمار تنش­زا در القای آندروژنز کشت میکروسپور به کار رود (14). توفوردی با تغییرات در فیزیولوژی و بیان ژن سلول، می­تواند نقش احتمالی در ایجاد تنش برای تولید رویان­های هاپلوئید داشته باشد (12).

درمجموع نتایج این تحقیق نشان داد که کاربرد و تأثیر تیمارهای مختلف دمایی، نوری و هورمون­های توفوردی، بنزیل آمینوپورین و کینتین در غلظت­های مختلف وابستگی زیادی به ژنوتیپ داشته و بایستی برای ژنوتیپ­های مختلف بخصوص با ماهیت متفاوت، مورد آزمون قرارگیرد. از طرف دیگر مشخص شد که اثرات متقابل قابل‌توجهی بین این سه فاکتور وجود داشته و امکان تصمیم قاطع در انتخاب سطوح فاکتور مطلوب برای همه شرایط اعم از محیط و ژنوتیپ وجود ندارد. اگرچه وجود هورمون­های توفوردی و بنزل آمینوپورین به‌صورت ترکیبی پاسخگویی بهتری را در کالوس­زایی و جنین­زایی نشان دادند. پاسخ متفاوت رقم بومی و لاین اصلاحی در برخی فاکتورها نیز قابل‌توجه بود که نشان‌دهنده وجود تفاوت ژنتیکی بین آنها است. جنین­زایی در لاین اصلاحی تحت تأثیر فاکتورهای مختلف قرارگرفت اما فاکتورهای مورد بررسی تأثیر معنی­داری بر جنین­زایی رقم بومی نداشتند. نیاز به بررسی­های مولکولی و سلولی جهت مطالعه تأثیر پیش تیمار دمایی و نور بر تغییر مسیر گامتوفیتی به اسپروفیتی در کالوس و جنین­های بدست آمده و بررسی تفاوت متابولیسمی دو ژنوتیپ مورد بررسی در تشخیص تفاوت­های آنها برای مطالعات بعدی پیشنهاد می­شود.

1- آرمیون، ا.، لطفی، م.، مرتضویان، س. م. م.، پویش، ع.، و کریمی فر، ح.، 1394. بررسی اثر رقم و تنظیم‌کننده های رشد گیاهی بر کالوس­زایی و رویانزایی کشت بساک خیار
(Cucumis sativus L) ، نهمین کنگره علوم باغبانی، 5 تا 8 بهمن 1394. اهواز، ایران.
2- جوادیان، ن.، کریم­زاده، ق.، شریفی، م.، و معینی، ا.، 1394. باززایی درون شیشه‌ای گیاه دارویی کتان سفید (Linum album Kotschy ex Boiss)، مجله پژوهش­های گیاهی (زیست شناسی ایران)، 28 (4)، صفحات 737-745.
3- رضا نژاد، ف.، و طراحی، ر.، 1392. اثر نور و تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی بر کالوس‌زایی و تجمع آنتوسیانین در کالوسهای حاصل از ‌جداکشتهای مختلف در رز گالیکا (.Rosa gallica L)، مجله پژوهش­های گیاهی (زیست­شناسی ایران)، 26(2)، صفحات 184-195.
4- عرشی، ی.، 1379. اصلاح ژنتیکی سبزیهای زراعی، انتشارات جهاد دانشگاهی مشهد، 735 صفحه.
5- فرشاد فر، م.، و بخشی خانیکی، غ.، 1385. مبانی بیوتکنولوژی و کشت بافت گیاهی، انتشارات دانشگاه پیام نور، تهران، 249 صفحه.
6- حمیدوند، ی.، عبداللهی، م.، چایچی، م.، و موسوی، 1392. بررسی اثر تنظیم‌کننده های رشد (اکسین و سیتوکینین ) و اثرات متقابل آنها بر میزان کالوسزایی و رویانزابیگامتی از کشت بساک دو واریتهی خیار( Cucumis sativus L.)، هشتمین همایش بیوتکنولوژی جمهوری اسلامی ایران و چهارمین همایش ملی امنیت زیستی.
7- نجفی، س.، عبداللهی، م. ر.، ساری خانی، ح.، و موسوی س. س.، 1394. اثر محیط کشت حاوی تخمدان روی کالوس زایی و رویان‌زایی گامتی درکشت بساک ارقام مختلف خیار
 (Cucumis Sativus L.)، تولیدات گیاهی (مجله علمی کشاورزی)، جلد 83، شماره 4، صفحات 105-116
 
8- Abdollahi, M. R., Najafi, S., Sarikhani, H., and Moosavi, S. S., 2016. Induction and development of anther-derived gametic embryos in cucumber (cucumis sativus l.) by optimizing the macronutrient and agar concentrations in culturemedium, Turkish Journal of Biology 40 (3), PP: 571-579.
9- Atanassov, A., Zagorska, N., Boyadjiev, P., and Djilianov, D., 1995. In vitro production of haploid plants, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 11, PP: 400–408.
10- Chen, Y., and Dribnenki, P., 2002. Effect of genotype and medium composition on flax Linumusitatissimum L., Anther culture. Plant Cell Reports, 21, PP: 204–207.
11- Dryanovska, O. A., 1985. Induced callus in vitro from ovaries and anthers of spicies from the Cucurbitaceae family. Comptes Rendus De L Academie Bulgare Des Sciences, 38, PP: 1243-1244.
12- Feher, A., Pasternak, T. P., and Dudits, D., 2003. Transition of somatic plant cells to an embryogenic state. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 74b, PP: 201–228.
13- Gałązka, J., and Niemirowicz-Szczytt, K., 2013. Review of research on haploid production in cucumber and other cucurbits, Folia Horticulturae 25, PP: 67-78.
14- Habibzadeh, S., Shariatpanahi, M. E., Amiri, R., Emamifar, M., Oroojloo, M., Nematzadeh, G., Sadat Noori, S. A., and Heberle-Bors, E., 2011. Effect of 2,4-D as a Novel Inducer of Embryogenesis in Microspores of Brassica napus L. Czech Journal of Genetics and Plant Breeding, 47(3), PP: 114–122.
15- Jaiti, F. J., Benlhabib, O., Sharma, H. C., EI Jaafari, S., and EI Hadrami, I., 1999. Genotypic variation in anther culture and effect of ovary coculture in durum wheat. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 59, PP: 71–76.
16- Kasha, K. J., Ziauddin, A., and Cho, U. H., 1990. Haploids in cereal improvement: anther and microspore culture. In: Gustafson, J. P., (Ed.), Gene Manipulation in Plant Improvement, Vol, II., Plenum Press, New York, PP: 213–235.
17- Kiviharju, E., Puolimatka, M., and Saastamoinen, M., 1998. The effect of genotype on anther culture response of cultivated and wild oats. Agricultural and Food Science, 7(3), PP: 409-422. 
18- Kumar, H. G. A., Murthy, H. N., and Paek, K. Y., 2003. Embryogenesis and plant regeneration from anther cultures of Cucumis sativus L., Scientia Horticulturae, 98, PP: 213-222.
19- Lazarte, J. E., and Sasser, C. C., 1982. Asexual embryogenesis plantlet development in anther culture of Cucumis sativus L., Hort Science, 17, 88 p.
20- Lazaridou, T. B., Lithourgidis, A. S., Kotzamanidis, S. T., and Roupakias, D. G., 2005. Another culture response of barley genotypes to cold pretreatments and culture media. Russian Journal of Plant Physiology, 52, PP: 696-699.
21- Luica, A., Felix, F. I., Federizzi, L. C., Lange, C. E., and Handel, L., 1997. Genetics of regeneration of wheat (Triticum aestivum L.) plants. Brazilian Journal of Genetics, 15, PP: 473-479.
22- Maheshwari, S. C., Rashid, A., and Tyagy, A. K., 1982. Haploid from pollen grains-retrospect and prospect, American Journal of Botany, 69, PP: 865–879.
23- Mendoza, M. G., And Kaeppler, H. F., 2002. Auxin and sugar effects on callus induction and plant regeneration frequencies from mature embryos of wheat (Triticum aestivum L.), In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant, 38, PP: 39-45.
24- Metwally, E., Moustafa, S. A., El-Sawy, B. I., Harun, S. A., and Shalab, Y. T. A., 1998. A Production of haploid plants from in vitro culture of unpollinated ovules of Cucurbita pepo. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 52, PP: 117-121.
25- Mitsukuri, K., Arita, T., Johkan, M., Yamasaki, S., Mishiba, K. I., and Oda, M., 2009. Effects of type of explant and dark preconditioning on bud formation in Habenaria radiata (Thunb.) in vitro. Hort Science, 44(2), PP: 523-525.
26- Murigneux, A., Bentolila, S., Hardy, T., Baud, S., Guitton, C., Jullien, H., Ben Tahar, S., Freyssinet, G., and Beckert, M., 1994. Genotypic variation of quantitative trait loci controlling in vitro androgenesis in maize, Genome 37, PP: 970–976.
27- Murthy, B. N. S., Murch, S. J., and Saxena, P., 1998. Thidiazuron: A potent regulator of in vitro plant morphogenesis. In Vitro Cellular and Developmental Biology- Plant, 34, PP: 267-275.
28- Sabehat, A., Lurie, S., and Weiss, D., 1998. Expression of small heat shock proteins at low temperatures. Plant Physiology, 117(2), PP: 651-658.
29- Shalaby, T. A., 2007. Factor affecting haploid induction through in vitro gynogenesis in summer squash (Cucurbita pepo L.), Scientia Hort culturae, 115, PP: 1-6.
30- Shariatpanahi, M. E., Bal, U., Heberle-Bors, E., and Touraev, A., 2006. stresses applied for the re-programming of plant microspores towards in vitro embryogenesis, Physiol Plantarum, 127, PP: 519–534
31- Simmonds, D. H., and Keller, W. A., 1999. Significance of preprophase bands of microtubules in the induction of microspore embryogenesis in Brassica napus. Planta, 208, PP: 383-391.
32- Song, H., Lou, Q. F., and Luo, X. D., 2007. Regeneration of doubled haploid plants by androgenesis of cucumber (Cucumis sativue L.), Plant Cell, Tissue and Organ Culture 90, PP: 245-254.
33- Suprunova, T., and Shmykova, N., 2008. In vitro induction of haploid plants in unpollinated ovules, anther and microspore culture of Cucumis sativus. Proceedings of the ixth Eucarpia meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae. Avignon, FRANCE, MAY 21-27, PP:  371-374.
34- Suzuki, R. M., Kerbauy, G. B., Pescador, R., Purgatto, E., Ceccantini, G. C., and Ferreira, W. D. M., 2010. Dark-induced hormone changes coincide with the resumption of light-inhibited shoot growth in Catasetum fimbriatum (Orchidaceae). Journal of Plant Physiology, 167(5), PP: 375-381.
35- Tang, Y., Li, H., Liu, J., Liu, B., and Lou, H., 2009. Callus formation from anther culture in baldam pear (Momordica charantia L.). Agriculture and Environmental Science, 6(3), PP: 308-312.
36- Tarinejad, A., Toorchi, M., Habashi, A., and Pellegrineschi, A., 2007. Optimization of gene transfer in Iranian bread wheat cultivars by biolistic bombardment. Journal of Food Agriculture and Environment, 5(3&4), PP: 237-241.
37- Touraev, A., Pfosser, M., and Heberle-Bors, E., 2001. The microspore: A haploid multipurpose cell. Advances in Botanical Research, 35, PP: 53-109.
38- Xie, J. H., Gao, M. W., Liang, Z. Q., Shu, Q. Y., Cheng, X. Y., and Xue, Q. Z., 1997. The effect of cool-pretreatment on the isolated microspore culture and the free amino acid change of anthers in japonica rice (Oryza sativa L.), Journal of Plant Physiology, 151, PP: 79–82.
39- Xie, M., Qin, L. Y., Pan, J. S., HE, H. L., Wu, A. Z., and Cai, R., 2005. Flower morphogenesis and microspore development versus anther culture of cucumber. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica. Available online. http://en.cnki.com.cn/Article_en/CJFDTOTALDNYX200506005.htm; cited on 10 Dec 2012.
40- Yalcin, M. Y., Comlekcioglu, N., Ipek, M., Kocaman, E., Izgu, T., Tekdal, D., And Curuk, P., 2010. The effect of different hormone concentrations and dark pretreatment on adventitious shoot regeneration in snake melon (Cucumis melo var. Flexousus). Romanian Biotechnological, Letters, 15, PP: 5392-5395.
41- Zhao, J. P., Newcomb, W., and Simmonds, D., 2003. Heat-Shock proteins 70 kDa and 19 kDa are not required for induction of embryogenesis of Brassica napus L. Cv. Topas microspores, Plant and Cell Physiology, 44(12), PP: 1417-1421.
دوره 33، شماره 3
مهر 1399
صفحه 713-726
  • تاریخ دریافت: 12 خرداد 1397
  • تاریخ بازنگری: 13 آذر 1397
  • تاریخ پذیرش: 25 دی 1397