تاثیر گاما آمینوبوتیریک اسید بر ویژگی‌های هورمونی و بیوشیمیایی گیاه کدو خورشتی Cucurbita pepo)) تحت سمیت علف‌کش تریفلورالین

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه ارومیه

2 گروه زیست شناسی - دانشکده علوم - دانشگاه ارومیه

چکیده

مکانیسم اثر تریفلورالین ازطریق مهار تقسیم میتوز سلولی می‌باشد. گاما آمینو بوتیریک اسید (گابا) به عنوان اسید آمینه غیرپروتئینی، برخی فعالیت‌های فیزیولوژیکی از جمله تنظیم رشد گیاه و مقاومت در برابر تنش‌ها را بر عهده دارد. به منظور بررسی تأثیر علف‌کش تریفلورالین و نقش گابا بر فعالیت‌های آنزیمی ‌‌و میزان پرولین و تنظیم کننده‌های رشد جیبرلین (GA3) و سیتوکینین (6-بنزیل آمینوپورین) در گیاه کدو خورشتی (Cucurbita pepo) آزمایشی به صورت فاکتوریل در قالب طرح کرت‌های کاملاً تصادفی با 4 سطح غلظت علف‌کش تریفلورالین (0، 5، 15 و 25 ppm) و دو سطح گابا (0 و 500 میکرومول برلیتر) در 3 تکرار انجام گرفت. تریفلورالین 2 روز قبل از کاشت به گلدان‌ها اضافه شد. سه روز بعد از رشد گیاهچه‌ها، آب مقطر و محلول 500 میکرومول بر لیتر گابا به ترتیب بر سطح برگ‌های گیاهان شاهد و تیمار اسپری شد. علف‌کش تریفلورالین بر آنزیم اورنیتین‌آمینوترانسفراز (OAT)، پرولین‌دهیدروژناز (PDH)، محتوای پرولین و فیتوهورمون‌های جیبرلین و سیتوکینین معنی‌دار بود. از سوی دیگر، گابا تاثیر معنی‌داری بر فعالیت PDH و محتوای پرولین و سطح جیبرلین و سیتوکنین بر جای گذاشت. با مصرف گابا، محتوای پرولین و سیتوکینین و جیبرلین به طور معنی‌داری افزایش یافت در حالی که فعالیت PDH ریشه و بخش هوایی با استفاده از گابا به طور معنی‌دار کاهش یافت. با افزایش غلظت تریفلورالین، محتوای پرولین و فعالیت OAT افزایش و میزان جیبرلین و سیتوکینین و فعالیت PDH کاهش یافت. شرایط هورمونی و بیوشیمیایی گیاهان کدو تحت سمیت علف‌کش تریفلورالین با استفاده از گابا بهبود یافت.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Effect of exogenous gamma amino butyric acid on hormonal and biochemical characteristics of squash (Cucurbita pepo) plants under toxicity of trifluralin herbicide

نویسندگان [English]

  • Nasrin Esmaeilnejad 1
  • Jalil Khara 2

1 department of Biology, Faculty of Science, Urmia University, Urmia Iran

2 Department of Biology - Urmia University

چکیده [English]

The main mechanism of action of herbicide Trifluralin is the inhibition of cell mitosis. As an important non-protein amino acid, γ-aminobutyric acid (GABA) contributes in certain physiological functions and stress tolerance. So, to detect the effect of Trifluralin and role of GABA on enzymatic activities and content of proline and growth substances including gibberellin (GA3) and cytokinin (6- benzyl amino purine) an experiment was conducted using squash (Cucurbita pepo) seedlings. Four levels (0, 5, 15 and 25 ppm) of trifluralin and presence or absence of GABA were applied in completely randomized design and in 3 replicates. Pots were sprayed by trifluralin 2 days after planting. Distilled water and GABA (500 µmol l-1) were sprayed on control and treated plants respectively 3 days after planting. Effect of trifluralin on ornithine amino-transferase (OAT), proline dehydrogenase (PDH) and content of proline and also GA3 and 6- benzyl amino purine was significant (p≤0.01) according to ANOVA. On the other hand, GABA had a significant effect on activity of PDH, content of proline and GA3 and cytokinin level. Content of proline and activity of OAT and the amounts of GA3 and cytokinin increased significantly, although PDH was decreased under influence of GABA. Content of proline and OAT activity were raised and GA3, benzyl amino purine and activity of PDH were declined by increased levels of trifluralin. Overall, it can be concluded that growth and biochemical indices of squash plants were improved by GABA under toxicity of herbicide trifluralin.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Squash
  • Proline
  • Phytohormones
  • Trifluralin
  • GABA

تأثیر گاما آمینوبوتیریک اسید بر ویژگی‌های هورمونی و بیوشیمیایی گیاه کدو خورشتی (Cucurbita pepo) تحت سمیت علف‌کش تریفلورالین

نسرین اسمعیل نژاد و جلیل خارا*

ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 14/4/97                تاریخ پذیرش: 15/8/97

چکیده

مکانیسم اثر تریفلورالین ازطریق مهار تقسیم میتوز سلولی می‌باشد. گاما آمینو بوتیریک اسید (گابا) به‌عنوان اسیدآمینه غیرپروتئینی، برخی فعالیت‌های فیزیولوژیکی ازجمله تنظیم رشد گیاه و مقاومت در برابر تنش‌ها را بر عهده دارد. به‌منظور بررسی تأثیر علف‌کش تریفلورالین و نقش گابا بر فعالیت‌های آنزیمی ‌‌و میزان پرولین و تنظیم‌کننده‌های رشد جیبرلین (GA3) و سیتوکینین (6- بنزیل آمینوپورین) در گیاه کدو خورشتی (Cucurbita pepo) آزمایشی به‌صورت فاکتوریل در قالب طرح کرت‌های کاملاً تصادفی با 4 سطح غلظت علف‌کش تریفلورالین (0، 5، 15 و 25 ppm) و دو سطح گابا (0 و 500 میکرومول بر لیتر) در 3 تکرار انجام گرفت. تریفلورالین 2 روز قبل از کاشت به گلدان‌ها اضافه شد. سه روز بعد از رشد گیاهچه‌ها، آب مقطر و محلول 500 میکرومول بر لیتر گابا به ترتیب بر سطح برگ‌های گیاهان شاهد و تیمار اسپری شد. علف‌کش تریفلورالین بر آنزیم اورنیتین‌آمینوترانسفراز (OAT)، پرولین‌دهیدروژناز (PDH)، محتوای پرولین و فیتوهورمون‌های جیبرلین و سیتوکینین معنی‌دار بود. از سوی دیگر، گابا تأثیر معنی‌داری بر فعالیت PDH و محتوای پرولین و سطح جیبرلین و سیتوکینین بر جای گذاشت. با مصرف گابا، محتوای پرولین و سیتوکینین و جیبرلین به‌طور معنی‌داری افزایش یافت در حالی که فعالیت PDH ریشه و بخش هوایی با استفاده از گابا به‌طور معنی‌دار کاهش یافت. با افزایش غلظت تریفلورالین، محتوای پرولین و فعالیت OAT افزایش و میزان جیبرلین و سیتوکینین و فعالیت PDH کاهش یافت. شرایط هورمونی و بیوشیمیایی گیاهان کدو تحت سمیت علف‌کش تریفلورالین با استفاده از گابا بهبود یافت.

واژه‌هایکلیدی: کدوی خورشتی، پرولین، فیتوهورمون‌ها، تریفلورالین، گاما آمینوبوتیریک اسید

* نویسنده مسئول، تلفن: 09144414713 ، پست الکترونیکی: j.khara@urmia.ac.ir

مقدمه

 

گیاهان همواره تحت تأثیر عوامل زنده و غیرزنده محیط اطراف خود ازجمله خاک، آب، اقلیم، مواد شیمیایی، علف‌های هرز و غیره هستند. علف‌های هرز از طریق رقابت با گیاهان زراعی باعث کاهش عملکرد گیاه می‌شوند (33). کنترل شیمیایی علف‌های هرز با استفاده از علف‌کش، مؤثرترین روش کنترل علف‌های هرز است. تریفلورالین (C13H16F3N3O4) ازجمله علف‌کش‌های از خانواده دی‌نیتروآنیلین‌ها است که از مدتها پیش برای کاهش تراکم و گستردگی علف‌های هرز مورداستفاده قرارگرفته است (3 و 4). تریفلورالین جزو علف‌کش‌های مهارکننده تقسیم میتوز محسوب شده که بااتصال به پروتئین توبولین در ساختمان میکروتوبول‌ها، باعث مهار تقسیم سلولی شده و از تشکیل دیواره سلولی جلوگیری می‌کند. کمپلکس توبولین- علف‌کش از پلیمریزه شدن میکروتوبول­ها جلـوگیری می­کند. درنتیجه باعث اخـتلال در مرحله متافاز تقسیم میتوز می­شود (23). استفاده از علف‌کش تریفلورالین اثرات سوئی نیز بر روی گیاه زراعی دارد، برای مثال استفاده از تریفلورالین با غلظت 15 تا 25 ppm سبب کاهش معنی‌دار رشد ریشه و ساقه و عملکرد آفتابگردان شده است (2).

مصرف علف‌کش‌ها حتی در واریته‌های مقاوم محصولات می‌تواند با تأثیر بر مسیرهای متابولیکی و فرایندهای انتقال انرژی و همچنین ایجاد صدمات اکسیداتیو، موجب تنش شده و حتی سبب گیاه‌سوزی و مرگ شود (5). در اثر انواع تنش‌های محیطی، الکترون‌های برانگیخته در داخل کلروپلاست و میتوکندری به مولکول اکسیژن منتقل می‌شوند و گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) ازجمله یون‌های سوپراکسید و پراکسیدها بخصوص هیدروژن پراکسید تشکیل می‌گردد (21) که برای مولکول‌هایی مانند DNA در هسته،RNA  در هسته و سیتوپلاسم، پروتئین‌های سیتوپلاسمی و حتی اندامکی و همچنین لیپیدهای غشایی بسیار سمی هستند (18). تنش اکسیداتیو که یکپارچگی غشای سلولی گیاه را از بین می‌برد، زمانی ایجاد می‌شود که تولید گونه‌های فعال اکسیژن بیش از مقدار تولید آنتی‌اکسیدان‌ها باشد (20).

آنتی‌اکسیدان‌های غیرآنزیمی‌ مانند پرولین، آسکوربیک اسید و گلوتاتیون سلول را در مقابل تنش اکسیداتیو حفظ می‌کنند (44). علف‌کش‌های خانواده دی‎نیتروآنیلین سبب افزایش محتوای هیدرکسی پرولین در دیواره سلولی گیاه بادام‌زمینی می‌شوند و برخی اسیدهای آمینه ازجمله گلوتامیک اسید در ریشه و برگ‌ افزایش می‌یابد که پیش ماده تولید اسیدهای آمینه دیگر ازجمله پرولین است (19). پرولین دارای توانایی حفظ و موازنه پروتئین‌ها و پایداری DNA و غشاست (9).

گاما آمینو بوتیریک اسید (گابا) همراه با بتا آمینو بوتیریک اسید به‌عنوان اسیدهای آمینه غیرپروتئینی، برخی فعالیت‌های فیزیولوژیکی ازجمله تنظیم رشد گیاه و مقاومت در برابر تنش‌ها، حفظ pH سیتوزول، تنظیم اسمزی و متابولیسم کربن و نیتروژن بر عهده دارند (12). هرگاه گیاهان در معرض تنش‌های مختلف محیطی قرارگیرند، میزان این ماده در گیاهان به‌سرعت افزایش می‌یابد (38). مصرف گابا مقاومت به سرما را در هلو (Prunus persica) (36)، مقاومت به شوری را در تنباکوی زینتی (Nicotiana sylvestris) (6) و مقاومت به خشکی را در چچم چندساله (Lolium perenne) (25) افزایش داده است. همچنین، رشد لوله گرده و جهت آن به مقدار گابا در گیاهان توتون (Nicotiana tabaccum) بستگی دارد (45).

مقدار گابا در گیاهان بسیار اندک است ولی در شرایط تنش‌، گیاهان جهت افزایش مقاومت خود، به‌سرعت مقدار آن را در بافت‌های رویشی افزایش می‌دهند (24). مصرف آن رشد رویشی، فتوسنتز و ظرفیت تبادل گازها را افزایش می‌دهد، بیوسنتز کلروفیل، پاسخ‌های آنزیمی غیرآنتی‌اکسیدانی و پایداری غشاء را تحریک می‌کند (30).

با توجه به اثرات نامطلوب علف‌کش تریفلورالین روی محصول، استفاده از ترکیبات و برقراری شرایطی که به نحوی میزان سمیت علف‌کش­ها را در جهت رسیدن به محصول بهینه، کاهش دهند بسیار حائز اهمیت است. با در نظر گرفتن مقاومت محدود کدو خورشتی به بسیاری از علف‌کش‌ها و نبود اطلاعات کافی در مورد اثرات فیزیولوژیکی تریفلورالین بر کدو و نقش مصرف گابا بر تعدیل اثرات مضر این علف‌کش، مطالعه حاضر برای بررسی اثرات تریفلورالین بر برخی پارامترهای رشد و احتمال نقش حفاظتی گابا در برابر تنش ناشی از علف‌کش انجام گرفت. برای اولین بار در سال 1963 برای کنترل طیف وسیعی از علف‌های هرز پهن‌برگ و علف‌های هرز خانواده گرامینه در مزارع سویا، پنبه و آفتابگردان از علف‌کش تریفلورالین استفاده شده است (2). از طرفی، مصرف گابا در گیاهان عدس تحت تنش علف‌کش با افزایش میزان گابای درونی و فعال نمودن مسیرهای آنتی‌اکسیدانی و تخفیف صدمات رادیکال‌های آزاد باعث کاهش آسیب‌های ناشی از علف‌کش شد (46). هدف از این تحقیق، سنجش هورمون‌های جیبرلین (GA3) و سیتوکینین (6- بنزیل آمینوپورین) جهت ردیابی توازن هورمونی و ارزیابی فعالیت آنزیم‌های اورنیتین ‌آمینوترانسفراز (OAT) و پرولین ‌دهیدروژناز (PDH) به‌منظور تعیین اثرات تریفلورالین و گابا روی توازن هورمونی و مسیر بیوسنتز پرولین (به‌عنوان یکی از تنظیم‌کننده‌های اسمزی در گیاهان تحت تنش) می‌باشد. در صورت نتیجه‌بخش بودن این ایده شاید بتوان با کاربرد گابا، وضعیت بیوشیمیایی و هورمونی گیاه کدوی خورشتی را در تنش تریفلورالین بهبود بخشید و غلظت مؤثری از علف‌کش را یافت که باوجود کنترل مناسب علف‌های هرز، تأثیر سمی بر گیاه نداشته باشد.

مواد و روشها

آزمایش به‌صورت طرح کاملاً تصادفی با 4 سطح غلظت علف‌کش تریفلورالین (0، 5، 15 و 25 ppm) و دو سطح گابا (0 و 500 میکرومول بر لیتر) در 3 تکرار به‌صورت گلدانی انجام شد. 24 گلدان با قطر 12 سانتی‌متر و ارتفاع 10 سانتی‌متر در محلول تجاری وایتکس ضدعفونی شده و با پنبه آغشته به الکل استریل شدند. خاک گلدان‌ها عبارت از ماسه شسته و استریل شده دراتوکلاو بود. تا حدود 3 سانتی‌متری لبه گلدان‌ها پر شد. سپس غلظت‌های مختلف علف‌کش تریفلورالین 2 روز قبل از کاشت به گلدان‌ها اضافه شد. بذر­های کدو خورشتی (Cucurbita pepo cv. Shiraz Hybrid F1) با استفاده از محلول هیپوکلریت سدیم 10 درصد به مدت 15 دقیقه ضدعفونی سطحی شد. سپس، بذرها با آب مقطر به‌طور کامل شسته شدند. بذرهای کدو داخل یک پارچه تمیز به مدت سه روز در شرایط رطوبت کافی قرار داده شدند تا این‌که ریشه‌چه بذرها به طول 2 میلی‌متر ظاهر شدند. در گلخانه، بر سطح گیاهچه‌های چهار برگچه‌ای (هفت روزه) بدون تیمار و تیمار با گابا به ترتیب آب مقطر و محلول 500 میکرومول بر لیتر گابا پاشیده شد. گلدان‌ها طی دوره رشد 5 هفته‌ای در اتاقک رشد با دمای شبانه میانگین 18 و دمای روزانه 30 درجه، رطوبت نسبی 70 تا 80 درصد و دوره نوری 16:8 (شب : روز) قرارگرفتند. گیاهان در طی دو هفته اول با آب مقطر و از هفته سوم به بعد، به‌صورت یک روز در میان با محلول غذایی هوگلند تغذیه شدند. در ابتدای هفته ششم، آنالیزهای رشدی و بیوشیمیایی گیاهان بعد از تفکیک اندام هوایی و ریشه انجام گرفت.

محتوای جیبرلین (GA3) و سیتوکینین (6- بنزیل آمینو پورین) با استفاده از کروماتوگرافی با کارایی بالا (HPLC) تعیین شد. استاندارد GA3 و 6- بنزیل آمینوپورین از شرکت سیگما (St. Louis, MO, USA) تهیه شد. برای استخراج هورمون‌ها بر روی 10 گرم از نمونه‌ها، 10 میلی‌لیتر استونیتریل اسیدی شده (محلول 1% اسیداستیک در استونیتریل) اضافه شد. مخلوط حاصل به مدت 2 دقیقه همگن شد. 4 گرم سولفات منیزیم و 5/1 گرم استات سدیم افزوده شد و به مدت 1 دقیقه لوله‌ها در ورتکس قرار داده شدند. بعد به مدت 3 دقیقه با دور4000 سانتریفوژ شدند. 2 میلی‌لیتر از مایع رویی در لوله‌های 2 میلی‌لیتری حاوی 25 میلی‌گرم سوربنت C18 و 150 میلی‌گرم انهیدرید سولفات منیزیم ریخته شد. لوله‌ها ابتدا به مدت 1 دقیقه ورتکس و بعد به مدت 5 دقیقه با دور16000 سانتریفوژ شدند. محلول رویی از فیلترهایی با منافذ 22/0 میکرومتر فیلتر شده و در دمای4 درجه سانتی‌گراد برای انجام آنالیز نگه‌داری شد (47).

برای تعیین میزان پرولین از روش بیتس و همکاران (1972) (13) استفاده شد. 04/0 گرم از بافت خشک ریشه‌ها و اندام هوایی همراه با 15 میلی‌لیتر میلی‌لیتر سولفوسالیسیلیک اسید 3 درصد ساییده شد و به مدت 72 ساعت در دمای 4 درجه یخچال نگهداری شد تا اسید آمینه پرولین آزاد شود. بعد هموژنات در g3000 به مدت 20 دقیقه سانتریفوژ شد. محلول رویی با 2 میلی­لیتر اسیداستیک گلاسیال و 2 میلی­لیتر معرف نین­هیدرین مخلوط شد و به مدت یک ساعت در بن­ماری در حال جوش قرارگرفت. لوله­های آزمایش بعد از خروج از بن­ماری در آب یخ قرارگرفتند و بعد 4 میلی­لیتر تولوئن به هر لوله اضافه و به هم زده شد تا دو فاز جداگانه ایجاد گردد. میزان جذب در520 نانومتر با اسپکتروفتومتر اندازه­گیری شد و محتوای پرولین برحسب میلی‌گرم بر گرم وزن خشک تعیین شد. برای محاسبه میزان پرولین نمونه­ها، منحنی استاندارد تعیین غلظت پرولین (در محدوده غلظت‌های 1/0، 2/0، 3/0 و 4/0 میلی‌گرم بر لیتر) ترسیم شده معادله خطی (y = 0.2173x + 0.007) به‌دست‌آمده برای تعیین غلظت­های مجهول پرولین مورد استفاده قرارگرفت.

جهت اندازه‌گیری آنزیم پرولین دهیدروژناز، برای تهیه عصاره گیاهی از روش لوپز-کاریون (2008) (28) با اندکی تغییرات استفاده شد. 5 گرم از بافت تر هر دو اندام ریشه و هوایی به‌طور مجزا از کلیه تیمارها و تکرارها وزن شد و به داخل هاون سرد (داخل آب یخ) بود منتقل شد. بافت‌های موجود در هاون توسط 1 میلی­لیتر بافر شامل (بافرتریس HCl - 05/0 مولار با pH 4/7، MgCl2 7 میلی مولار، HCl 6/0 مولار، EDTA 3 میلی­مولار، دی تیوتریتول 1 میلی­مولار، پلی وینیل پیرولیدن 5% (وزنی-حجمی) ساییده شد. هموژن بدست آمده توسط کاغذ صافی فیلتر شد. محلول حاصل از فیلتر، با نیروی g39000 به مدت 20 دقیقه سانتریفوژ شد. سپس، محلول رویی با استفاده از ستون سفادکس 25-G نمک­گیری شده و با 1 میلی­لیتر بافر (شامل بافر تریس HCl 05/0 مولار با pH 4/7 و گلیسرول 10% حجمی) رقیق شد. محلول حاصل به‌عنوان عصاره خام برای اندازه­گیری فعالیت آنزیم پرولین دهیدروژناز مورد استفاده قرارگرفت. به این ترتیب که بر روی 5/2 میلی­لیتر بافر (شامل Na2CO3-HCl 15/0 مولار با pH 3/10 و پرولین 67/2 میلی­مولار و NAD+ 10 میلی­مولار) 3/0 میلی­لیتر عصاره آنزیمی استخراج شده افزوده شد و بعد فعالیت آنزیم از طریق احیاء شدنNAD+  توسط دستگاه اسپکتروفتومتر مدل UV/visible (s210-WPA) (شرکت Shimadzu، ژاپن) در طول‌موج 340 نانومتر اندازه­گیری شد.

برای تهیۀ عصاره گیاهی و سنجش میزان فعالیت آنزیم OAT از روش سانچز و همکاران (35) با اندکی تغییرات استفاده شد. 5 گرم از بافت تر ریشه و اندام هوایی به‌طور مجزا از کلیه تیمارها و تکرارها به داخل هاون سرد منتقل شد. بافت‌های موجود در هاون توسط 1 میلی­لیتر بافر (شامل بافر فسفات پتاسیم 05/0 مولار با pH 9/7، EDTA 1 میلی­مولار و گلیسرول 15% حجمی) و 2-مرکاپتول 10 میلی­مولار، ساییده شد و عصاره بدست آمده در لوله­های آزمایشی با نیروی g15000 به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شد. بر روی محلول رویی، 2 میلی­لیتر سولفات آمونیوم 60 درصد اضافه شد و این محلول به‌عنوان عصاره خام برای اندازه­گیری فعالیت OAT مورد استفاده قرارگرفت. بر روی 2 میلی­لیتر بافر (شامل بافر تریس HCl- 2/0 مولار با pH 8/7، اورنیتین 8/46 میلی­مولار و a - کتوگلوتارات 5/12 میلی­مولار و NAD+ 125/0 میلی­مولار) 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی استخراجی افزوده شد. فعالیت آنزیم از طریق احیا شدن NAD+ با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (S2100-WPA) UV/visible (شرکت Shimadzu، ژاپن) در طول‌موج 340 نانومتر اندازه­گیری شد.

جهت آنالیز کمی فیتوهورمون‌های جییرلین و سیتوکینین برگی، از سیستم کروماتوگرافی Agilent1100 مجهز به گاززدا (Degasser) به همراه پمپ چهارتایی و دتکتور (DAD) آرایۀ دیودیی و همراه شیر تزریق Rheodyne مدل (i)7725 و ستون XDB-C18 به طول 100 میلی­متر و قطر 6/4 میلی­متر و نرم­افزار Chemstation استفاده شد. برای جداسازی جییرلین و سیتوکینین از ستون XDB-C18 به طول 100 میلی­متر و قطر 6/4 میلی­متر استفاده شد. جهت سنجش جییرلین و سیتوکینین، به ترتیب از استاندارد GA3 و 6- بنزیل آمینوپورین شرکت سیگما استفاده شد. در تمامی آزمایش­ها از آب دیونیزه استفاده گردید. برای جداسازی GA3 و 6- بنزیل آمینوپورین از روش بهاللا و همکاران (15) با اندکی تغییر استفاده گردید. جداسازی طبق برنامه شویش گرادیان در HPLC ، توسط دو حلال A شامل ترکیب استات آمونیوم 5 میلی­مولار در اسید فرمیک 05/0 درصد و حلال B شامل استونیتریل بود. فاز متحرک برای سنجش GA3، استونیتریل و آب‌اسیدی (اسید فسفریک 01/0 درصد) با نسبت 60:40 (60 قسمت استو نیتریل و 40 قسمت آب اسیدی) و فاز متحرک برای سنجش 6- بنزیل آمینوپورین، استات آمونیوم 5 میلی­مولار در اسید فرمیک 05/0 درصد در آب با نسبت 60:40 (60 قسمت استات آمونیم و 40 قسمت آب اسیدی) مورد استفاده قرارگرفت. حجم تزریق 20 میکرولیتر و سرعت جریان 6/0 میلی‌لیتر در دقیقه و دمای ستون به میزان °C35 تنظیم گردید.

برای آماده­سازی استانداردها برای به دست آوردن پیک استاندارد، به میزان 1 میلی­گرم از هرکدام از ترکیبات در بالن 10 میلی­لیتر توسط استونیتریل حل شد و حجم حاصل به‌عنوان محلول استوک شامل 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر از هرکدام از ترکیبات تهیه شد. 1 میلی­لیتر از این محلول استوک در بالون 10 میلی­لیتری با استونیتریل به حجم رسانده شد. این محلول 10 میکروگرم بر میلی­لیتر از ترکیبات مذکور را شامل می­شود که با چندین بار رقیق­سازی محلول 1 میکروگرم بر میلی­لیتر از جییرلین و 6- بنزیل آمینوپورین به دست آمد. حدود 20 میکرولیتر به دستگاه تزریق شد تا منحنی استاندارد حاصل شود. سپس، برای آماده­سازی نمونه­ها جهت انجام HPLC، بر روی 10 گرم از نمونه­ها، 10 میلی­لیتر استونیتریل اسیدی شده (1% اسیداستیک در استونیتریل) اضافه شد. مخلوط حاصل به مدت 2 دقیقه هموژن شد. 4 گرم سولفات منیزیم و 5/1 گرم استات سدیم افزوده شد و به مدت 1 دقیقه لوله­ها در ورتکس قرار داده شدند. بعد به مدت 3 دقیقه با دور4000 سانتریفوژ شدند. 2 میلی­لیتر از مایع رویی در لوله­های 2 میلی­لیتری حاوی 25 میلی­گرم سوربنت C18 و 150 میلی­گرم انهیدرید سولفات منیزیم ریخته شد. لوله­ها ابتدا به مدت 1 دقیقه ورتکس و بعد به مدت 5 دقیقه با دور 16000 سانتریفوژ شدند. محلول رویی از فیلترهایی با منافذ 22/0 میکرومتر فیلتر شد و در دمای °C 4 برای انجام آنالیز نگهداری شد. طول‌موج برای جییرلین 206 نانومتر و برای 6- بنزیل آمینوپورین 270 نانومتر در نظر گرفته شد.

کلیه محاسبات آماری با استفاده از آزمون توکی و دانکن و نرم‌افزار SPSS Version 22 و رسم نمودارها با استفاده از نرم‌افزار Excel  انجام گرفت.

نتایج

تغییرات فعالیت آنزیم اورنیتین‌آمینوترانسفراز(OAT): نتایج حاصل از تجزیه واریانس حاکی بود که گابا تأثیر معنی‌داری بر فعالیت OAT در ریشه و بخش هوایی ندارد، در حالی که تأثیر غلظت‌های مختلف علف‌کش تریفلورالین بر آنزیم OAT در سطح احتمال 01/0 معنی‌دار بود (جدول1).

 

جدول 1- تجزیه واریانس فعالیت آنزیم‌های اورنیتین آمینوترانسفراز و پرولین دهیدروژناز در تیمارهای علف‌کش و گابا

میانگین مربعات

df

منبع تغییرات

آنزیم پرولین‌دهیدروژناز (PDH)

 

آنزیم اورنیتین‌آمینوترانسفراز (OAT)

بخش هوایی

ریشه

 

بخش هوایی

ریشه

**207/148

**839/140

 

**525/489

**800/835

3

عامل غلظت علف‌کش

**673/7

**526/9

 

ns454/10

ns300/9

1

عامل (گابا)

ns006/0

ns036/0

 

ns416/0

ns049/0

3

اثرات متقابل دو عامل

081/0

187/0

 

841/3

974/6

16

خطا

ns به معنی عدم تأثیر تیمارها است و علامت **به معنی تأثیر معنی‌دار تیمارها در سطح احتمال 01/0 است.

بقیه جدول 1

میانگین مربعات

df

منبع تغییرات

GA3

6- آمینوبنزیل پورین

 

پرولین

 

بخش هوایی

ریشه

**553/12

**989/70

 

**165/0

**182/0

3

عامل غلظت علف‌کش

**855/25

**039/184

 

*074/0

**022/0

1

عامل گابا

**544/6

**428/32

 

ns003/0

*010/0

3

اثرات متقابل دو عامل

069/0

132/0

 

001/0

002/0

16

خطا

داده‌ها نشانگر میانگین سه تکرار±SE  بوده و علامت‌های * و ** به ترتیب به معنی تأثیر معنی‌دار تیمارها در سطوح احتمال 05/0 و 01/0 است. همچنین عدم اختلاف معنی‌دار با ns نشان داده‌شده است.

جدول2- مقایسه میانگین محتوای پرولین و فعالیت آنزیم‌های اورنیتین آمینوترانسفراز و پرولین دهیدروژناز در گیاه کدو خورشتی تحت تیمار با گابا

آنزیم پرولین‌دهیدروژناز (PDH)

 (U/mg protein)

آنزیم اورنیتین‌آمینوترانسفراز (OAT)

 (U/mg protein)

پرولین بخش هوایی

(mgg-1DW)

تیمار

بخش‌هوایی

ریشه

بخش‌هوایی

ریشه

487/4±35/26a

73/26± 466/4 a

a505/8±12/37

55/38±95/10a

455/0± 171/0b

بدون گابا

21/25± 517/4b

47/25±329/4b

44/38±177/8a

80/39±87/10a

565/0± 134/0a

با گابا

داده‌ها نشانگر میانگین سه تکرار±SE  بوده و حروف غیرمشترک در هر ستون، اختلاف معنی‌دار را نشان می‌دهند.

جدول3- مقایسه میانگین محتوای پرولین و فعالیت آنزیم‌های اورنیتین آمینوترانسفراز و پرولین دهیدروژناز در گیاه کدو خورشتی تحت تیمار با غلظت‌های مختلف علف‌کش تریفلورالین

آنزیم پرولین‌دهیدروژناز (PDH)

(U/mg protein)

آنزیم اورنیتین‌آمینوترانسفراز (OAT)

(U/mg protein)

پرولین بخش هوایی (mgg-1DW)

غلظت علف‌کش (ppm)

بخش‌هوایی

ریشه

بخش‌هوایی

ریشه

89/32 ± 657/0a

88/32± 909/0a

33/27 ± 768/1c

75/22± 003/2c

268/0± 098/0d

0

16/25  ± 750/0b

97/25 ± 724/0b

21/33± 225/3b

45/38± 354/4b

545/0 ± 062/0c

5

56/23 ± 611/0c

89/23 ± 734/0c

37/44± 774/0a

22/47± 827/0a

588/0 ± 057/0b

15

51/21 ± 655/0d

68/21 ± 795/0d

22/46±708/0a

28/48± 738/0a

640/0 ± 051/0a

25

داده‌ها نشانگر میانگین سه تکرار±SE  بوده و حروف غیرمشترک در هر ستون، اختلاف معنی‌دار را نشان می‌دهند.

 

نتایج حاصل از مقایسه میانگین‌ها نشان داد استفاده از تریفلورالین سبب افزایش معنی‌دار فعالیت آنزیم OAT ریشه و بخش هوایی گیاه کدوی خورشتی می‌شود. فعالیت آنزیم OAT ریشه و بخش هوایی متناسب با افزایش غلظت تریفلورالین، به‌طور معنی‌دار افزایش یافت (جدول های 2 و 3). فعالیت آنزیم OAT ریشه در گیاهان شاهد 75/22 و در غلظت 25 ppm تریفلورالین، حدود U/mg protein 3/48 بود. همچنین، فعالیت OAT بخش هوایی در حضور غلظت 25 ppm تریفلورالین به ترتیب 3/27 و 2 U/mg protein 2/46 اندازه‌گیری شد. از سوی دیگر، تاثیرگابا بر فعالیت آنزیم OAT ریشه و بخش هوایی قابل‌ملاحظه نبود و با مصرف گابا، فعالیت این آنزیم افزایش جزئی نشان داد، در حالی که با مصرف تریفلورالین، فعالیت آن در ریشه بیش از 2 برابر افزایش یافت.

 

شکل 1- مقایسه میانگین تأثیر علف‌کش تریفلورالین بر فعالیت اورنیتین آمینوترانسفراز ریشه و بخش هوایی کدو خورشتی. داده‌ها نشانگر میانگین سه تکرار±SE  است. حروف لاتین غیر مشابه نشانگر معنی‌دار بودن (0.01P≤) می باشد

 

شکل2- مقایسه میانگین تاثیر گاما آمینوبوتیریک اسید  برفعالیت اورنیتین آمینوترانسفراز ریشه و اندام هوایی کدو خورشتی. داده ها نشانگر میانگین سه تکرار±SE  بوده و حروف لاتین غیرمشابه نشانگر معنی‌دار بودن (0.01P≤) می‌باشد

تغییرات فعالیت آنزیم پرولین‌دهیدروژناز (PDH): نتایج حاصل از تجزیه واریانس حاکی است که تأثیر گابا و غلظت‌های مختلف علف‌کش تریفلورالین بر آنزیم PDH ریشه و بخش هوایی در سطح احتمال 01/0 معنی‌دار است (جدول 1). میزان این آنزیم در ریشه و بخش هوایی به‌تناسب افزایش غلظت تریفلورالین، به‌طور معنی‌دار کاهش یافت (جدول­های 2 و 3). مقدار آن در ریشه شاهد 88/32 و در تیمار 25 ppm تریفلورالین حدود U/mg protein 68/21 بود. به‌علاوه، مقدار این آنزیم به ترتیب در اندام هوایی شاهد و در تیمار 25 ppm تریفلورالین، 9/32 و 51/21 U/mg protein بود و بیش از 5/1 برابر در مقایسه با شاهد کاهش یافت. طبق نتایج حاضر، PDH ریشه و بخش هوایی با استفاده از گابا به‌طور معنی‌دار در مقایسه با شاهد کاهش یافت. در مقایسه با اثرات تریفلورالین، تیمار گابا منجر به تغییرات کمتری در فعالیت PDH ریشه و اندام هوایی شد.

 

شکل3- مقایسه میانگین تأثیر علف‌کش تریفلورالین بر میزان پرولین دهیدروژناز ریشه و اندام هوایی کدو خورشتی. داده‌ها نشانگر میانگین سه تکرار±SE  بوده و حروف لاتین غیرمشابه نشانگر معنی‌دار بودن (0.01P≤) می‌باشد

 

شکل4- مقایسه میانگین تأثیر گاما آمینوبوتیریک اسید بر میزان پرولین دهیدروژناز ریشه و بخش هوایی کدو خورشتی. داده‌ها نشانگر میانگین سه تکرار±SE  بوده و حروف لاتین غیرمشابه نشانگر معنی‌دار بودن (0.01P≤) می‌باشد

تغییرات میزان پرولین: آنالیز آماری داده­ها، افزایش محتوای پرولین را در گیاهان تیمار شده با گابا و گیاهان فاقد گابا، همراه با افزایش غلظت تریفلورالین نشان داد. این تفاوت بین سطوح غلظت، در سطح احتمال 1 درصد معنی­دار بود. گیاهان تیمار شده با گابا از محتوای پرولین بیشتری نسبت به فاقد تیمار برخوردار بودند و آنالیز آماری داده­ها مربوط به محتوای پرولین ریشه، اختلاف معنی­داری (در سطح 01/0P£) را بین گیاهان شاهد و گیاهان تیمار شده با گابا نشان داد.

 

 

شکل5 - مقایسه میانگین تأثیر گابا بر میزان پرولین  ریشه و بخش هوایی در غلظت‌های مختلف تریفلورالین در گیاه کدو خورشتی. داده‌ها نشانگر میانگین سه تکرار±SE  بوده و حروف لاتین غیرمشابه نشانگر معنی‌دار بودن (0.01P≤) می‌باشد.

 

جدول4- مقایسه میانگین محتوای پرولین، 6- بنزیل آمینوپورین و GA3 در حضوروغیاب گابا و غلظت‌های مختلف تریفلورالین در کدو خورشتی

 یبرلین

(ng g-1FW)

سیتوکینین

(pmol g-1FW)

پرولین(mg g-1DW)

تیمار

غلظت علف‌کش (ppm)

بخش‌هوایی

ریشه

80/12±002/0 bc

55/19±001/0d

183/0±045/0d

140/0±028/0e

بدون گابا

0

00/18±100/0a

03/32±064/0a

353/0±021/0c

323/0±21/0d

با گابا

41/12±047/0cd

68/18±170/0d

490/0±017/0b

a035/0±453/0

بدون گابا

5

22/13±069/0b

09/22±090/0b

600/0±017/0ab

470/0±045/0c

با گابا

09/12±100/0de

30/17±173/0e

543/0±035/0b

bc020/0±533/0

بدون گابا

15

26/13±379/0b

99/20±853/0c

633/0±032/0a

556/0±066/0abc

با گابا

62/11±541/0e

74/16±274/0e

603/0±011/0ab

ab020/0±630/0

بدون گابا

25

74/12±223/0bc

31/19±427/0c

a049/0±676/0

646/0±083/0a

با گابا

603/0

866/0

106/0

106/0

LSD (α= 0.01)

داده‌ها نشانگر میانگین سه تکرار±SE  بوده و حروف غیرمشترک در هر ستون، اختلاف معنی‌دار (0.01P≤) را نشان می‌دهند.

 

همبستگی آنزیم‌های پرولین دهیدروژناز و اورنیتین آمینوترانسفراز با پرولین ریشه و بخش هوایی: همبستگی بین غلظت OAT بخش هوایی و ریشه گیاه با مقدار پرولین اندام هوایی مثبت و معنی‌دار بود یعنی با افزایش مقدار این آنزیم، مقدار پرولین نیز افزایش یافت (شکل 6).

از سوی دیگر، همبستگی بین غلظت OAT ریشه و اندام هوایی گیاه با مقدار PDH معکوس بوده و باوجود اختلاف اندک، معنی‌دار بود به‌طوری که با افزایش مقدار OAT مقدار PDH کاهش یافت (شکل 7).

فیتوهورمون‌های جیبرلین و سیتوکینین: نتایج حاصل از تجزیه واریانس حاکی است که تأثیر  گابا و غلظت‌های مختلف تریفلورالین بر فیتوهورمون‌های GA3 و 6-بنزیل آمینوپورین در سطح احتمال 01/0 معنی‌دار بود. اثرات متقابل بین گابا و غلظت علف‌کش برای این دو ماده در سطح احتمال 1 درصد معنی‌دار بود (جدول 1). در تمامی غلظت‌های تریفلورالین، محتوای 6- بنزیل آمینوپورین و GA3 در گیاهان تیمار شده با گابا به‌طور معنی‌دار در مقایسه با شاهد افزایش یافت.

 

 

شکل 6- همبستگی فعالیت آنزیم اورنیتین آمینوترانسفراز با محتوای پرولین اندام هوایی و ریشه کدو خورشتی

 

 

شکل 7- همبستگی فعالیت آنزیم اورنیتین آمینوترانسفراز با پرولین دهیدروژنازدر کدوی خورشتی

 

 

شکل 8- محتوای سیتوکینین و جیبرلیک اسید ریشه و بخش هوایی در حضوروغیاب گابا و غلظت‌های مختلف تریفلورالین در کدو خورشتی

 

بحث

در رابطه با افزایش مشاهده شده در فعالیت OAT، گفته می‌شود که تنش سبب افزایش فعالیت آنزیم‌های درگیر در سنتز پرولین از قبیل OAT و پرولین ردوکتاز می‌شود و در نتیجه پرولین در گیاه افزایش می‌یابد (31). در راستای نتایج این پژوهش، Shang و همکاران (36) نیز گزارش کرده‌اند که تیمار پس از برداشت میوه هلو با گابا سبب افزایش OAT و کاهش فعالیت PDH در میوه می‌گردد. معلوم شده گابا مقدار گلوتامات و اورنیتین را بالا برده، درنتیجه میزان پرولین افزایش می‌یابد (27).

در زمان مواجهه گیاه با تنش، بیان ژن کد کننده آنزیم پرولین-5- کربوکسیلات سنتتاز (P5CS) افزایش‌یافته و مانع بیان ژن PDH و کاهش آن در بافت گیاه می‌شود (32). از آنچه که مشاهده شد به نظر می‌رسد تریفلورالین به‌عنوان تنش فعالیت PDH را کاهش داده و در این شرایط پرولین در گیاه تجمع می‌یابد. این نتایج با یافته‌های مطالعه حاضر و نتایج بدست آمده توسط شانگ و همکاران (2011) (36) مطابقت داشت. آنها نشان داده‌اند تیمار گابا در میوه هلو، با کاهش میزان تخریب لیپیدها و پروتئین‌ها و با تجمع پرولین و تنظیم متابولیسم، تحمل گیاه را در مقابل تنش‌های محیطی افزایش می‌دهد.

طبق نتایج حاصل از مقایسه میانگین‌ها، مقدار پرولین ریشه و بخش هوایی با استفاده از گابا افزایش یافت. مصرف این ماده با افزایش ظرفیت تبادل گازها و بیوسنتز کلروفیل، میزان فتوسنتز و رشد مورفولوژیکی گیاه را بهبود می‌بخشد و پاسخ‌های آنزیمی‌ و غیرآنتی‌اکسیدانی و پایداری غشا را نیز فعال می‌کند (30). افزایش مقدار پرولین از طریق بیان زیاد ژن بیوسنتز پرولین (P5CS) (35)، آزاد شدن یون کلسیم و فعال‌سازی پروتئین کیناز C (24)، افزایش مقدار گلوتامات و اورنیتین (27) و افزایش فعالیت OAT، گلوتامات دکربوکسیلاز (GAD) و پرولین- 5- کربوکسیلات دهیدروژناز (36) صورت می‌گیرد. تیمار پس از برداشت میوه هلو با گابا سبب افزایش OAT و P5CS و کاهش فعالیت PDH در این میوه و موجب افزایش قابل‌ملاحظه میزان پرولین می‌گردد (36). با این‌حال، برخلاف نتایج این تحقیق، مقدار پرولین در گیاهان Arabidopsis و Agrostis stolonifera تحت تیمار با گابا تحت تنش گرما کاهش‌یافته که دلیل آن فعال شدن فسفولیپاز D عنوان شده است (26). این آنزیم اثر تنظیم‌کنندگی منفی روی بیوسنتز پرولین دارد.

مشاهده شد که پرولین ریشه و بخش هوایی به‌تناسب افزایش غلظت تریفلورالین افزایش‌یافته است. نتایج این تحقیق با نتایج دورگشا (1993) (19) مطابقت داشت. وی دریافت که تیمار فلوکلورالین از علف‌کش‌های خانواده دی نیتروآنیلین سبب افزایش محتوای هیدرکسی پرولین در دیواره سلولی گیاه بادام زمینی می‌شود. گلوتامیک اسید، اولین اسیدآمینه‌ای است که در فرآیند آمیناسیون تشکیل می‌شود و می‌تواند پیش ماده تولید‌ اسیدهای آمینه دیگر ازجمله پرولین باشد. افزایش مقدار اسیدهای آمینه ممکن است به دلیل کاهش سنتز پروتئین‌ها و تحریک بیوسنتز اسیدهای آمینه و پروتئولیز پروتئین‌ها باشد (1). همچنین این نتایج با نتایج مرادبیگی و خارا (1390) (2) مطابقت داشت که در آن با افزایش غلظت تریفلورالین، محتوای پرولین و اسید‌های آمینه آزاد در ریشه و اندام هوایی آفتابگردان افزایش‌یافته است.

به‌طور کلی، تجمع پرولین در شرایط تنش ممکن است به دلیل تحریک سنتز آن و یا جلوگیری از تجزیه آن و یا تجزیه پروتئین‌ها باشد (22). به‌علاوه، افزایش فعالیت آنزیم‌های درگیر در سنتز پرولین از قبیل OAT و پرولین ردوکتاز و جلوگیری از فعالیت آنزیم پرولین کاتابولاز می‌تواند سبب افزایش میزان پرولین شود (31). در گیاهان، پرولین از طریق گلوتامات یا اورنیتین و با فعالیت آنزیم‌های P5CS و یا OAT سنتز می‌گردد. تجمع پرولین در نتیجه تنش‌های محیطی ممکن است از روش‌های زیر انجام گیرد: الف) تنش سبب تحریک سنتز پرولین از گلوتامات شود. ب) در اثر کاهش فعالیت پرولین دهیدروژناز توسط گابا به‌صورت پس‌خور منفی، مسیر تجزیه متوقف شده و با فعال شدن OAT مسیر سنتز پرولین تحریک شود ج) کاهش اکسیداسیون پرولین به کاهش ورود آن به ساختار پروتئین‌ها منجر ‌شود (9). علف‌کش‌ها نیز به با ایجاد تنش در گیاه، سبب افزایش پرولین در گیاه می‌شوند، به‌طوری که طبق نتایج توتوا و همکاران (2004) (41) میزان پرولین در گیاه توتون یک روز پس از تیمار با کلروسولفورون (Chlorosulfron) افزایش یافته است.

در این پژوهش، تریفلورالین با ایجاد تنش در گیاه سبب کاهش معنی‌دار مقدار سیتوکینین (6- بنزیل آمینوپورین) و جیبرلیک اسید (GA3) شد. کاهش مقدار سیتوکینین درون‌زاد در واکنش به تنش‌ها مشاهده شده است (11 و 37). اثرات متقابل بین گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) و اکسین و سیتوکینین به گیاه اجازه می‌دهد تا توسعه و رشد خود را در شرایط غیرمساعد بیرونی تعدیل کند (16).

انواعی از تنش‌های غیرزنده فعالیت هورمون سیتوکینین را تحت تأثیر قرار می‌دهند (10). در شیره آوند چوبی، تنش خشکی سبب کاهش ترانس زاتین، زاتین ریبوزید، ایزوپنتنیل آدنین و ایزوپنتیل آدنوزین می‌شود (8). همچنین علاوه بر آن، انتقال ترانس- زآتین ریبوزید به‌طور قابل ملاحظه‌ای کاهش می‌یابد (11 و 17). غلظت بالای 6- بنزیل آمینوپورین سبب تجمع پرولین در گیاه می‌شود (39). نقش همزمان سنتز سیتوکینین و آنزیم‌های تجزیه‌کننده در پاسخ به تنش احتمالاً به الگوهای بیان فضایی و موقتی آنها بستگی دارد. مطالعات ژنتیکی در مورد آرابیدوپسیس نشان داده‌اند که سیتوکینین نقش منفی در پاسخ به تنش بازی می‌کند (29، 42 و 43). کاهش مقدار سیتوکینین تحمل به تنش شوری و خشکی را بهبود می‌بخشد (34 و 43). بیان ژن گلوتاتیون S- ترانسفراز کلاس تاو (GSTU5) در اثر تنش‌های غیرزنده افزایش می‌یابد. بر این اساس، بیان بیش‌ازحد ژن GSTU5 در اثر فعالیت بالای گلوتاتیون پراکسیداز، سبب می‌شود تحمل گیاهان تراریخته به سرما، اسمز، شوری و علف‌کش افزایش یابد (14 و 40).

در تمامی غلظت‌های تریفلورالین، سیتوکینین و جیبرلیک اسید با استفاده از گابا به‌طور معنی‌دار در مقایسه با شاهد افزایش یافت. بنابراین با استفاده از گابا می‌توان اثرات منفی تریفلورالین را بر سیتوکینین متعادل ساخت. این نتایج با یافته‌های القراوی و همکاران (2014) (7) مطابقت داشت که در آن استفاده از گابا در شرایط تنش شوری سبب شد مقدار هورمون‌هایی مانند IAA، IBA، GA1 و GA4 به ترتیب به مقدار 6/38، 3/13، 24 و 1/61 درصد افزایش یابد. همچنین شی و همکاران (2010) (38) نشان داده‌اند که گابا در سنتز هورمون‌ها نیز نقش دارد. از طرف دیگر، حجاز و همکاران (2018) (48) گزارش داده‌اند که کاربرد خارجی گابا میزان بسیاری ترکیبات ازجمله برخی فیتوهورمون‌ها (شامل اسید سالیسیلیک، ترانس جاسمونیک اسید، ایندول استیک اسید، و آبسیزیک اسید) را افزایش داده است. آنها دریافتند که در پرتقال (Citrus sinensis) گابا موجب افزایش بیان (upregulation) ژن­های کد کننده این هورمون‌ها می­شود و از این‌رو، سنتز این هورمون‌ها در گیاهان افزایش می­یابد. آنها حتی افزوده‌اند که گابا روی بیان 16 ژن از ژن­های کد کننده هورمون‌های گیاهی اثر مثبت گذاشته و باعث افزایش بیان آنها شده و با این روش بیوسنتز آنها را افزایش داده است.

نتیجه‌گیری

دراین تحقیق استفاده از تریفلورالین و همچنین گابا سبب افزایش فعالیت آنزیم‌های درگیر در سنتز پرولین از قبیلOAT و کاهش آنزیم‌های تجزیه‌کننده پرولین ازجمله آنزیم PDH و درنتیجه افزایش معنی‌دار پرولین ریشه و بخش هوایی گیاه کدو خورشتی شد.

تریفلورالین سبب کاهش معنی‌دار میزان هورمون‌های گیاهی سیتوکینین (6- بنزیل آمینوپورین) و جیبرلیک اسید (GA3) شد، ولی در همه گیاهان تیمار شده با گابا و در حضور تمامی غلظت‌های تریفلورالین، محتوای این هورمون‌ها به‌طور معنی‌داری افزایش یافت. گابا با تأثیر مثبت بر تولید 6- بنزیل آمینو پورین و GA3 سبب بهبود فعالیت سلولی و رشد گیاه گردید. بنابراین، تأثیر منفی تنش علف‌کش بر این هورمون‌ها را می‌توان با استفاده از گابا بهبود بخشید. علاوه براین، لازم است آزمایش‌های مزرعه‌ای تحت شرایط محیط طبیعی جهت مطالعه امکان مصرف و تأثیر گابا برافزایش مقاومت گیاهان به سمیت علف‌کش‌ها و همچنین صرفه اقتصادی کاربرد زراعی آن انجام گیرد.

1- حسنلو، ط.، ا. سفالیان، ع. اصغری و م. زین‌ادینی. 1395. اثر تنش خشکی بر پارامترهای فیزیولوژیکی و تجمع  اسیدهای آمینه در کلزا. پژوهشنامه اصلاح گیاهان زراعی، سال هشتم، شماره 18. 203-191.
2- مرادبیگی، ه. و خارا، ج. 1390. ارزیابی تغییر برخی شاخصهای فیزیولوژیک و بیوشیمیایی حاصل از تعامل علف‌کش تریفلورالین و همزیستی میکوریزی با قارچ Glomus versiformeدر گیاه آفتابگردان (رقم لاکومکا). زیست شناسی گیاهی، سال سوم، شماره دهم. ص 70-59.
3- مرادی ع.ر.، راشد محصل م.ح.، پارسا م. 1388. ارزیابی کارآیی علفکش‌های ایمازاتاپیر، اکسی‌فلورفن، ترفلان، پندیمتالین و وجین دستی روی عملکرد نخود رقم ILC482 در منطقه مشهد. سومین همایش علوم علفهای هرز ایران. بابلسر. جلد 2. ص 460-458.
4-شیمی، پ. رهبری ا. و مصباح م. 1388. بررسی کارایی چند علفکش در کنترل علفهای هرز مزارع توتون
(Nicotiana tabacum). تولید گیاهان زراعی. دوره 2 شماره 4 .ص 38-23.
 
 
5. Agostinetto D, Perboni, L, Langaro A, Gomes J, Fraga D, Franco J, 2016. Changes in photosynthesis and oxidative stress in wheat plants submmited to herbicides application. Planta Daninha 34: 1-9.
6. Akçay N, Bor, M, Karabudak, T, Özdemir F, Türkan İ, 2012. Contribution of Gamma amino butyric acid (GABA) to salt stress responses of Nicotiana sylvestris CMSII mutant and wild type plants. Journal of Plant Physiology 169: 452-458.
7. Alqarawi A, Abd Allah E, Hashem A, 2014. Alleviation of salt-induced adverse impact via mycorrhizal fungi in Ephedra aphylla Forssk. Journal of Plant Interactions 9: 802-810.
8. Alvarez S, Marsh EL, Schroeder SG, Schachtman DP. 2008. Metabolomic and proteomic changes in the xylem sap of maize under drought. Plant Cell and Environment. 31: 325-340.
9. Amutha R, Muthulaksmi S, Baby Rani W, Indira K, Mareeswari P. 2007. Studies on biochemical basis of heat tolerance in sunflower (Helianthus annus L.). Research Journal of Agriculture and Biological Sciences 3(4): 234-238.
10. Argueso CT, Ferreira FJ, Kieber JJ. 2009. Environmental perception avenues: The interaction of cytokinin and environmental response pathways. Plant Cell and Environment. 32: 1147-1160.
11. Bano A, Hansen H, Dörffling K, Hahn H. 1994. Changes in the contents of free and conjugated abscisic acid, phaseic acid and cytokinins in xylem sap of drought stressed sunflower plants. Phytochemistry. 37: 345-347.
12. Barbarosa JM, Singh NK, Cherry JH, Locy RD, 2010. Nitrate uptake and utilization is modulated by exogenous γ-aminobutyric acid in Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Physiology and Biochemistry 48: 443-450.
13. Bates LS, Waldren RP, Teare ID. 1973. Rapid determination of free proline for water-stress studies. Plant and Soil, 39: 205-207.
14. Benekos K, Kissoudis C, Nianiou-Obeidat I, Labrou N, Madesis P, Kalamaki M, Makris A, Ansen H, Dörffling K. 2003. Root-derived trans-zeatin riboside and abscisic acid in drought-stressed and rewatered sunflower plants: Interaction in the control of leaf diffusive resistance? Functional Plant Biology. 30: 365-375.
15. Bhalla K, Singh SB, Agarwal R. 2010. Quantitative determination of gibberellins by high performance liquid chromatography from various gibberellins producing Fusarium strains. Environental Monitoring and Assessment. 167(1-4): 515-520.
16. Bielach A, Hrtyan M, Tognetti VB. 2017. Plants under stress: Involvement of auxin and cytokinin, Review. International Journal of Molecular Sciences. 18: 1427; doi:10.3390/ijms18071427.
17. Davies WJ, Kudoyarova G, Hartung W. 2005. Long-distance ABA signaling and its relation to other signaling pathways in the detection of soil drying and the mediation of the plant’s response to drought. Journal of Plant Growth Regulation. 24: 285-295.
18. Driessens N, Versteyhe S, Ghaddhab C, Burniat A, De Deken X, Van Sande J, Dumont JE, Miot F, Corvilain B. 2009. Hydrogen peroxide induces DNA single and double-strand breaks in thyroid cells and is therefore a potential mutagen for this organ. Endocrine-related Cancer 16: 845-856.
19. Durgesha M. 1993. Effect of fluchloralin on protein synthesis, free amino acids and hydroxyproline content in groundnut (Arachis hypogaea L.). Annals of Applied Biology 123: 703-708.
20. Foyer CH, Lopez-Delgado H, Dat JF, Scott IM. 1997. Hydrogen peroxide and glutathione associated mechanisms of acclimatory stress tolerance and signalling. Physiologia Plantarum 100: 241-254.
21. Gill SS, Tuteja N, 2010. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry 48: 909-930.
22. Gomes FP, Oliva MA, Mielke MS, Almeida AAF, Aquino LA. 2010. Osmotic adjustment, proline accumulation and membrane stability in leaves of  Cocos nuciera submitted to drought stress. Scientia Horticulturae. 126: 379-384.
23. Horst V. 2004. Further root colonization by arbuscular mycorrhizal fungi in already mycorrhizal plants in suppressed after a critical level of root colonization. Plant Physiology. 161: 339-341.
24. Kinnersley AM, Turano FJ. 2000. Gamma aminobutyric acid (GABA) and plant responses to stress. Critical Reviews in Plant Sciences. 19: 479-509.
25. Krishnan S, Laskowski K, Shukla V, Merewitz EB. 2013. Mitigation of drought stress damage by exogenous application of a non-protein amino acid γ–aminobutyric acid on perennial ryegrass. Journal of the American Society for Horticultural Science 138: 358-366.
26. Li Z, Yu J, Peng Y, Huang B. 2016. Metabolic pathways regulated by γ-aminobutyric acid (GABA) contributing to heat tolerance in creeping bentgrass (Agrostis stolonifera). Scientific  Reports. 6: 30338. doi: 10.1038/srep30338
 27. Lin WD, Liao YY, Yang TJ, Pan CY, Buckhout TJ, Schmidt W. 2011. Coexpression-based clustering of Arabidopsis root genes predicts functional modules in early phosphate deficiency signaling. Plant Physiology, 155: 1383-1402.
28. Lopez-Carrion AI, Castellano R, Rosales MA, Ruiz JM, Romero L. 2008. Role of nitric oxide under saline stress: implications on proline metabolism. Biologiae Plantarum. 52: 587-591.
29. Lubovská Z, Dobrá J, Štorchová H, Wilhelmová N, Vanková R. 2014. Cytokinin oxidase/dehydrogenase overexpression modifies antioxidant defense against heat, drought and their combination in Nicotiana tabacum plants. Journal of Plant Physiology. 171: 1625-1633.
30. Luo HY, Gao HB, Xia QP, Gong BB, Xiao-Lei WU. 2011. Effects of exogenous  GABA on reactive oxygen species metabolism and chlorophyll fluorescence parameters in tomato under NaCl stress. Scientia Agricultura Sinica34: 37-544.
31. Madan S, Nainawatee HS, Jain RK, Chowdhury JB. 1995. Proline and proline metabolising enzymes in in-vitro selected NaCl-tolerant Brassica juncea L. under salt stress. Annals of Botany. 76: 51-57.
32. Monteoliva MI, Rizzi YS, Cecchini NM, Hajirezaei MR, Alvarez ME. 2014. Context of action of proline dehydrogenase (ProDH) in the hypersensitive response of Arabidopsis. BMC Plant Biology. 13: 14-21.
33. Moradbeigi H, Khara J. 2012. An evaluation of some physiological and biochemical parameters resulting from interaction of herbicide trifluralin and mychorrizal colonization by Glomus versiforme in sunflower plants (cv. lakomka). Iranian Journal of Plant Biology 3: 59-70.
34. Nishiyama R, Watanabe Y, Fujita Y, Le DT, Kojima M, Werner T, Vankova R, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K, Kakimoto T, Sakakibara H, Schmulling T, Tran LS. 2011. Analysis of cytokinin mutants and regulation of cytokinin metabolic genes reveals important regulatory roles of cytokinins in drought, salt and abscisic acid responses and abscisic acid biosynthesis. Plant Cell. 23: 2169-2183.
35. Sanchez E, Lopez-Lefebre LR, García PC, Rivero RM, Ruiz JM, Romero L. 2001. Proline metabolism in response to highest nitrogen dosages in green bean plants (Phaseolus vulgaris L. cv. Strike). Journal Plant Physiology. 158: 593-598.
36. Shang H, Cao S, Yang Z, Cai Y, Zheng Y. 2011. Effect of exogenous γ-aminobutyric acid treatment on proline accumulation and chilling injury in peach fruit after long-term cold storage. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59: 1264-1268.
37. Shashidhar VR, Prasad TG, Sudharshan L. 1996. Hormone signals from roots to shoots of sunflower (Helianthus annuus L.) moderate soil drying increases delivery of abscisic acid and depresses delivery of cytokinins in xylem sap. Annals of Botany. 78: 151-155.
38. Shi SQ, Shi Z, Jiang ZP, Qi LW, Sun XM, Li CX, Liu JF, Xiao WF, Zhang SG. 2010. Effects of exogenous  GABA  on gene expression of Caragana intermedia roots under NaCl stress: regulatory roles for H2O2 and ethylene production. Plant Cell and Environment. 33: 149-162.
39. Thomas JC, McElwain EF, Bohnert HJ. 1992. Convergent induction of osmotic stress-responses. Plant Physiology. 100: 416-423.
40. Tiwar, V, Patel MK, Chaturvedi AK, Mishra A, Jha B. 2016. Functional characterization of the Tau class glutathione-S-transferases gene (SbGSTU) promoter of Salicornia brachiata under salinity and osmotic stress. PLoS ONE. 17;11(2): e0148494. doi: 10.1371/journal.pone.0148494. eCollection.
41. Toteva T, Slavov VS, Batchvarova R, Batchvarova A, Stefanov D. 2004. Stress markers in chlorsulphouron tolerant transgenic tobacco plants. Plant Physiology. 30(1-2): 103-111.
42. Vojta P, Kokáš F, Husicková A, Grúz J, Bergougnoux V, Marchetti CF, Jiskrová E, Ježilová E, Mik V, Ikeda Y, Galuszka P. 2016. Whole transcriptome analysis of transgenic barley with altered cytokinin homeostasis and increased tolerance to drought stress. New Biotechnology. 33: 676-691.
43. Werner T, Nehnevajova E, Kollmer I, Novak O, Strnad M, Kramer U, Schmulling T. 2010. Root-specific reduction of cytokinin causes enhanced root growth, drought tolerance and leaf mineral enrichment in Arabidopsis and tobacco. Plant Cell. 22: 3905-3920.
44. Xu A, Xiong H, Yin G. 2009. Distinct oxygenation difference between manganese (IV) hydroxo and oxo moieties: Electron transfer versus concerted oxygen transfer. Chemistry. 15(43): 11478-11481.
45. Yu GH, Sun MX, 2007. Deciphering the possible mechanism of  GABA  in tobacco pollen tube growth and guidance. Plant Signaling & Behavior. 2: 393-395.
46. AL-Quraan NA, Al-Smadi ML, Swaleh AF. 2015. GABA metabolism and ROS induction in lentil (Lens culinaris Medik) plants by synthetic 1,2,3-Thiadiazole compounds. Journal of Plant Interactions. 10: 184- 194.
47. Bhalla K, Singh SB, Agarwal R. 2010. Quantitative determination of gibberellins by high performance liquid chromatography from various gibberellins producing Fusarium strains. Environmental Monitoring and Assessment. 167: 515- 520.
48. Hijaz F, Nehela Y, Nabil Killiny N. 2018. Application of gamma‑aminobutyric acid increased the level of phytohormones in Citrus sinensis. Planta .249: 1-10.
دوره 33، شماره 1
اردیبهشت 1399
صفحه 11-25
  • تاریخ دریافت: 14 تیر 1397
  • تاریخ بازنگری: 07 مهر 1397
  • تاریخ پذیرش: 15 آبان 1397