مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)

شناسایی یک پروتئین مهارکننده فعالیت آمیلازی در بذر گندم

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 عضو هیات علمی گروه زیست شناسی-دانشگاه کردستان

2 دانش آموخته گروه علوم زیستی دانشگاه کردستان

چکیده

پروتئینهای ذخیرهای در دانه گیاهان در زمینه های متنوعی مانند تغذیه ، شیمی پروتئین، داروسازی، بیوشیمی گیاهی و پزشکی مورد مطالعه قرار می‌گیرند. توانایی این ترکیبات برای ایجاد مشکلات تغذیه ای، اثرات سمی و دارویی هنگامی‌که مصرف می شوند باعث گردیده که در زمینه پراکندگی آنها در گیاهان مطالعات متعددی انجام شود. در این پژوهش پروتئینهای بذر گندم واریته زرین استخراج و خالص سازی پروتئین روش رسوب جزءبه‌جزء با آمونیوم سولفات، دیالیز و کروماتوگرافی تعویض یونی انجام گردید. بعد از خالصسازی با روش کروماتوگرافی سریع پروتئین با فاز مایع، ویژگیهای الکتروفوزی این پروتئین با روش الکتروفورز ژل سدیم دو دسیل سولفات پلی آکریل آمید بررسی شد. مهارکنندگی پروتئین مورد نظر در برابر فعالیت آلفاآمیلاز استاندارد (با منشأ باکتریایی) و بزاق انسانی با استفاده از روش برنفلد مورد سنجش قرار گرفت. دیاگرام خالص سازی و جمع آوری پروتئین مورد نظر را نشان داد. الگوی الکتروفورزی این پروتئین با حرکت نسبی 59/0 و 60/0 تأییدی بر فرایند خالص‌سازی پروتئین میباشد. فعالیت آلفاآمیلاز استاندارد (با منشأ باکتریایی) به میزان %97/89 و همچنین فعالیت هیدرولیتیک بزاق انسانی توسط این پروتئین به میزان%07/97 کاهش نشان داد. جداسازی، خالص سازی و مهارکنندگی آلفا آمیلازی پروتئین استخراج‌شده از بذر گندم زرین در این پژوهش تایید گردید. مهار آلفاآمیلاز باکتریایی توسط این پروتئین با استفاده از روشهای نوین و ابزارهای بیوتکنولوژی و مهندسی ژنتیک درکنترل طبیعی بیماریها و آفات گیاهی میتواند مورد توجه محققین کشاورزی قرارگیرد. این مهارکننده آلفاآمیلاز همچنین میتواند در درمان دیابت و نارساییهای گوارشی و اصلاح رژیمهای غذایی به منظورکاهش وزن کاربرد داشته باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Identification of a protein that inhibit amylase activity in seed of wheat

نویسندگان [English]

  • Masoud Haidarizadeh 1
  • Fariba Hasanvand 2

1 Faculty member of departement of Biology,University of Kurdistan

2 Department of Biological Science, University of Kurdistan, Sanandaj, Iran

چکیده [English]

Storage proteins which found in seeds of many plants are studied in various fields such as human and animal nutrition, chemistry of protein, pharmacology, plant biochemistry and medicinal plants. The ability of these compounds to cause nutritional problems and toxic effects when used as foods has led to several studies on their dispersion in plants. In this research, seed proteins of wheat (Zarrin variety) have been extracted. The protein of interest was purified by ammonium sulfate precipitation method; dialysis and ion exchange chromatography. After purification by Fast protein liquid chromatography (FPLC), electrophoretic properties of this protein were investigated by Sodium dodecyl-polyacrylamide gel electrophoresis )SDS-PAGE( method. Inhibitory activity of this Protein against Bacterial alpha-amylase and human saliva were measured using the Bernfeld method. FPLC diagram illustrates the purification and collection of the desired protein. The electrophoretic pattern of this protein with relative mobility of 0.60 and 0.59 confirmed the purification process. Hydrolytic activity of bacterial and human saliva Alpha- amylase decreased by this protein 89.97% and 97.07% respectively. In general the isolation, purification and alpha-amylase inhibition property of this protein which extracted from wheat seed were confirmed in this study. Inhibition of bacterial alpha-amylase by this protein can be considered by agricultural researchers in biological control of parasites and pests. This alpha-amylase inhibitor can also be used to treat diabetes, digestive deficiencies and modify dietary regimens to reduce weight.

کلیدواژه‌ها [English]

  • " wheat"
  • " enzyme inhibitors"
  • " alpha-amylase"

شناسایییکپروتئین مهارکنندهفعالیتآمیلازیدربذر گندم

مسعود حیدری زاده* وفریبا حسنوند

سنندج، دانشگاه کردستان، دانشکده علوم پایه، گروه علوم زیستی

تاریخ دریافت: 4/2/97                  تاریخ پذیرش: 18/7/97

چکیده

پروتئین­های ذخیره­ای موجود در دانه بسیاری از گیاهان در زمینه­های متنوعی مانند تغذیه انسان، تغذیه دام، شیمی پروتئین، داروسازی، بیوشیمی گیاهی و پزشکی مورد مطالعه قرار می‌گیرند. توانایی این ترکیبات برای ایجاد مشکلات تغذیه­ای، اثرات سمی و دارویی هنگامی‌که به‌عنوان غذاهای گیاهی مصرف می‌شوند باعث گردیده که در زمینهٔ پراکندگی آنها در گیاهان مطالعات متعددی انجام شود. دراین پژوهش پروتئین­های بذر گندم واریته زرین استخراج و خالص‌سازی پروتئین موردنظر با روش رسوب جزءبه‌جزء با آمونیوم سولفات، دیالیز و کروماتوگرافی تعویض یونی انجام گردید. بعد از خالص­سازی با روش کروماتوگرافی سریع پروتئین با فاز مایع، ویژگی­های الکتروفوزی این پروتئین با روش الکتروفورز ژل سدیم دو دسیل سولفات پلی آکریل آمید بررسی شد. مهارکنندگی پروتئین مورد نظر در برابر فعالیت آلفاآمیلاز استاندارد (با منشأ باکتریایی) و بزاق انسانی با استفاده از روش برنفلد مورد سنجش قرار گرفت. دیاگرام خالص‌سازی و جمع‌آوری پروتئین مورد نظر را نشان داد. الگوی الکتروفورزی این پروتئین با حرکت نسبی 59/0 و 60/0 تأییدی بر فرایند خالص‌سازی پروتئین می­باشد. فعالیت آلفاآمیلاز استاندارد (با منشأ باکتریایی) به میزان 97/89 درصد و همچنین فعالیت هیدرولیتیک بزاق انسانی توسط این پروتئین به میزان07/97 درصد کاهش نشان داد. به‌طورکلی جداسازی، خالص‌سازی و مهار­کنندگی آلفا آمیلازی پروتئین استخراج‌شده از بذر گندم زرین دراین پژوهش تأیید گردید. مهار آلفاآمیلاز باکتریایی توسط این پروتئین با استفاده از روشهای نوین و ابزارهای بیوتکنولوژی و مهندسی ژنتیک در کنترل طبیعی بیماریها و آفات گیاهی می­تواند موردتوجه محققین کشاورزی قرار­گیرد. این مهارکننده آلفاآمیلاز همچنین می­تواند در درمان دیابت و نارسایی‌های گوارشی و اصلاح رژیم‌های غذایی به‌منظور کاهش وزن کاربرد داشته باشد.

واژه­های کلیدی: گندم، مهارکننده­های آنزیمی، آلفا­آمیلاز

* نویسنده مسئول، تلفن: 09183780543، پست الکترونیکی:  m.haidarizadeh@uok.ac.ir

مقدمه

 

باز­دارندگان آنزیمی یکی از گروه­های مهم پروتئین­های ذخیره­ای در بذر­ها می­باشند. این ترکیبات در گستره وسیعی از برنامه‌های تحقیقاتی در زمینه تغذیه انسان، تغذیه دام، شیمی پروتئین، داروسازی، بیوشیمی­گیاهی و پزشکی قرار می‌گیرند (20). بخش عمده­ای از این یافته­ها مرتبط با نقش فیزیولوژیک مهارکننده­های آنزیمی بذرها می­باشد. این پروتئین­ها با آنزیم­های هیدرولیتیک ترکیبات پایدار ایجاد­ کرده و باعث مهار عملکرد آنها می­شوند (16). توانایی مهارکننده­های آنزیمی در ایجاد مشکلات تغذیه­ای و اثرات سمی هنگامی‌که به‌عنوان غذا­های گیاهی مصرف می­شوند یکی از دلایل عمده توجه ویژه به آنها در دانه­ها می­باشد. مهارکننده­های پروتئیناز در غلظت­های زیاد باعث کندی رشد، هیپرتروفی پانکراتیک (افزایش حجم بافت یا اندام در اثر بزرگ شدن یاخته‌های موجود در آن) و هیپرپلازیا (افزایش تعداد یاخته‌های بهنجار در بافت یا عضو) می­شوند.

مهارکننده­های آلفا­آمیلاز موجود در غذاهای گیاهی به‌ویژه مهار­کننده­های موجود در غلات و حبوبات می­توانند آنزیم­های بزاقی و پانکراتیک انسانی را غیر­فعال سازند. شناخته­شده­ترین بازدارندگان آنزیمی موجود در بذرها، مهار­کننده­های سرین پروتئیناز­هایی مانند تریپسین، کیموتریپسین و سوبتیلیسین می­باشند. در دهه­های اخیر توجه ویژه بر روی باز­دارندگان آلفا­آمیلاز (EC 3.2.1.1) متمرکز شده است. آنزیم­های دیگر که به‌وسیله پروتئین­هایی با منشأ گیاهی مهار می­شوند، نیز پیوسته گزارش شده اند (20). اخیراً به اثبات رسیده است که وقتی مهار­کننده دو عملکردی جو (Barley) به آلفاآمیلاز خود گیاه متصل می­شود، بنیان اختصاصی تریپتوفانی آنزیم را که برای واکنش پیوندی آنزیم- سوبسترا ضروری است، تغییر داده و این فرایند را مختل می­نماید. این احتمال که این پروتئین­ها ممکن است سلامت و تندرستی انسان را به مخاطره بیندازند باعث گردیده که در زمینه پراکندگی آن­ها در گیاهان و به­ویژه در مورد وجود آن­ها در بافت­های گیاهی که به‌عنوان غذا مصرف می­گردند، مطالعات متعددی آغاز گردد (6و 7).

عصاره‌ی خام لوبیای معمولی حاوی مهارکننده‌های آلفاآمیلازی شبه لکتین می‌باشد و به‌عنوان بازدارنده‌های هضم نشاسته، در اوایل دهه‌ی 1980 برای کنترل دیابت ملیتوس غیروابسته به انسولین و چاقی به کار ‌رفته است (5). اخیراً این گروه از مهارکننده‌ها به خاطر داشتن ویژگی‌های حشره­کشی به‌منظور محافظت از بذرها در برابر حشرات آفت مورداستفاده قرارگرفته‌اند (13). یک گروه تحقیقاتی در کلینیک مایو (Mayo Clinic) ترکیبی از لوبیای سفید را به‌طور نسبی خالص‌سازی کرده و نشان دادند که این ترکیب فعالیت آمیلاز بزاقی، درون‌دئودنال (intraduodenal) و درون‌ایلئال (intraileal) (دو بخش ابتدایی روده کوچک واقع در ناحیه‌ی دوازدهه) را در شرایط آزمایشگاهی (In vitro) غیرفعال می‌کند (1و 12).

در پژوهشی دیگر یونی­کریشنان و همکاران (2015) مهار

کننده‌های آلفا­آمیلاز و آلفا­گلوکوزیداز را به‌منظور معرفی داروی طبیعی دیابت در چهار جلبک سبز شناسایی کردند (25)

هیروشی اونه­دا و همکاران (2004) مهارکننده‌ی آلفا آمیلازی با حرکت نسبی 19/0 را که طبق روش چوودهوری و همکاران (1996) و شامل مهارکننده‌های 19/0، 28/0، 36/0، 38/0، 53/0 و دیگر مهارکننده‌های آلفاآمیلازی گندم بود خالص‌سازی و معرفی کردند (16).

اوکتاویو لوییز فرانکو و همکاران (2000)، پنج مهارکننده‌ی‌ آلفاآمیلازی با ویژگیهای ساختاری و حرکت نسبی (19/0، 53/0) و وزن مولکولی 25 ، 26 و 27 کیلو دالتونی را از بذرهای گندم خالص‌سازی کرده و فعالیت مهارکنندگی آن‌ها را در برابر آنزیم‌های آلفاآمیلاز پانکراسی خوک و آلفاآمیلاز سه حشره Callosobruchus maculatus، Zabrotes subfasciatus و Acanthoscelides obtectusبا استفاده از روش برنفلد (Bernfeld) مورد سنجش قراردادند (4).

ایوان کلوه (Ivan Kluh) و همکاران (2004) اثر مهارکننده‌ی آلفاآمیلازی- α-AI-1 بذر لوبیا را پس از تخلیص، بر آلفاآمیلازهای سی گونه از رده‌های اصلی حشرات، بی‌مهرگان و قارچ‌های آسیب­زای گیاهی مورد مطالعه قراردادند (8).

صابری و قدم‌یاری (2012) آنزیم آلفاآمیلاز را از روده و همولنف دو حشره Rhynchophorus ferrugineus Olivieri جداسازی و مهارکننده‌ای آلفاآمیلازی را از ماش (Vigna radiate L) و لوبیا (Phaseolus vulgaris L.) جداسازی کردند (22).

دیفنسین‌ها که به‌عنوان گاماتیونین‌ها نیز شناخته می‌شوند، به‌عنوان ابزارهای بیوتکنولوژیکی در کشاورزی برای کنترل آفت‌ها و پاتوژن‌ها به کار می‌روند. پاتریشیا پیلیگرینی و همکاران (2008)، VuD1 را که یک دیفنسین غیرمعمول با قابلیت مهارکنندگی آلفاآمیلازهای حشرات می‌باشد، را از بذر نخود Vigna unguiculata جداسازی و به‌وسیله‌ی کروماتوگرافی میل ترکیبی خالص‌سازی کرده و فعالیت بازدارندگی مهارکننده‌ی به‌دست‌آمده را با استفاده از روش برنفلد در برابر آلفاآمیلاز بزاقی انسان، آلفاآمیلاز پانکراسی خوک، آلفاآمیلاز Acanthoscelides obtectus، آلفاآمیلاز Aspergillus fumigates و آلفاآمیلاز Callosobruchus maculates مورد سنجش قراردادند (18).

چارلز دیلر و همکاران (2005) مهارکننده‌ی آلفاآمیلازی جدیدی با فعالیت کیتینازی از بذرهای لوبیای وحشی جداسازی کردند. مشخص شد که این مهارکننده خالص‌سازی شده فعالیت بازدارندگی قابل‌توجهی در مقابل آلفاآمیلازهای لارو Z. subfasciatus دارد اما تقریباً هیچ فعالیتی در مقابل آنزیم‌های پستانداران ندارد (2).

دراین تحقیق مهارکننده آلفا­آمیلاز موجود در بذر گندم واریته زرین جداسازی و تخلیص گردید، ویژگی­های الکتروفورزی و میزان کاهش فعالیت هیدرولیتیک آمیلازی بزاق انسانی و آلفا­آمیلاز باکتریایی در اثر افزودن این مهارکننده به محیط واکنش آنزیم مورد مطالعه قرارگرفت. مطالعه مهارکننده­های آنزیمی با منشأ گیاهی در محصولات زراعی به­ویژه گندم که سرانه مصرفی آن در ایران بالاست هدف این تحقیق می­باشد. باتوجه به اینکه هیچ­گونه اطلاعاتی در مورد پراکندگی و میزان بازدارندگی مهارکننده­ها موجود در بذر محصولات زراعی عمده ایران وجود ندارد، بررسی این مهارکننده­ها در گونه‌ها و واریته­های زراعی ایران ضروری به نظر می‌رسد.

مواد و روشها

استخراج: پنج بذر گواهی‌شده گندم رقم زرین را وزن کرده و در هاون با افزودن دو سانتی‌متر مکعب آب دو بار تقطیر آسیاب گردید (با نسبت w: v 1:10)(16). استخراج پروتئین در دمای °C 20 به مدت یک ساعت انجام شد. محلول رویی با سانتریفوژ 10000 دور در دقیقه( RPM) معادل g 11963 به مدت 20 دقیقه جدا گردید. این محلول با بافر A (Tris – Hcl 20 m M pH=8) به حجم ml 5/2 رسانده شد (3).

رسوب جزءبه‌جزء پروتئین به‌وسیله آمونیوم سولفات: برای رسیدن به غلظت 50 ـ 35 درصد اشباع (F 35 – 50) 485/0گرم آمونیوم سولفات جامد به محلول پروتئینی مرحله قبل به‌تدریج و به‌آرامی اضافه گردید. محلول رویی در هر مرحله با سانتریفیوژ 5000 دور در دقیقه( RPM)  معادل g2991 به مدت 30 دقیقه جدا و پروتئین رسوب یافته در دو میلی‌لیتر از بافر A حل گردید (3).

دیالیز: مراحل آماده‌سازی کیسه دیالیز انجام و محلول پروتئینی به کیسه دیالیز فعال‌شده منتقل گردید (3). دیالیز به مدت هشت ساعت در حجمی از بافر A به میزان ml 200 برای رسیدن به مرحله تعادل ادامه یافت. بعد از تنظیم pH (8= pH مانند PH بافر A) دیالیز در ml۲۰۰ از آب دو بار تقطیر به مدت دو ساعت تکرار گردید. نمونه دیالیز شده بعد از انتقال از   کیسه­ی دیالیز به مدت 15 دقیقه در 5000 دور در دقیقه(RPM)  معادل g2991 سانتریفیوژ گردید (3).

کروماتوگرافی سریع پروتئین به‌وسیله فاز مایع FPLC(Fast protein liquid chromatography): خالص­سازی پروتئین با روش کروماتوگرافی تعویض یونی انجام گردید. محلول پروتئینی بعد از مراحل استخراج، رسوب‌دهی و دیالیز به ستون آماده Hiprep 16/10DEAE تزریق گردید. ستون ابتدا با 100ml بافرA Tris – Hcl 20mM pH=8  با شدت‌جریان  ml / min5/0) با شدت یونی پایین به تعادل رسید. تعادل زمانی کامل می­گردد که pH بافر خروجی از دستگاه برابر pH بافر A (pH=8) باشد. سپس μL 75 میکرولیتر از نمونه حاصل از مراحل قبل بر روی دستگاه بارگذاری گردیده و سپس تزریق انجام شد. در این مرحله پروتئین­های موجود با رزین ستون پیوند برقرار کرده و به آن می­چسبند. این مرحله 60 دقیقه ادامه یافته و طی آن ml 30 بافر A از ستون عبور نمود. ثابت ماندن پیک دستگاه بیانگر اتمام مرحله پیوند یونی و عدم خروج پروتئین در این مرحله می­باشد. به‌منظور جدا نمودن پروتئین­ها بافر ( B Tris – HCl 20 mM + NaCl 1 M, pH=8 ) با شدت یونی بالا از ستون عبور داده شد. پروتئین موردنظر در دقیقه 85 از ستون جدا گردید. تمام بافرها و نمونه­ها قبل از تزریق به دستگاه با کاغذ صافی μm22/0 صاف گردیدند. روش جایگزین به‌جای کاغذ صافی سانتریفیوژ نمونه­ها به مدت 15 دقیقه با سرعت 10000 دور در دقیقه( RPM) معادل g 11963 می­باشد. نمودار ترسیم‌شده توسط PC-Controller با استفاده از نرم‌افزار Unicorn نصب‌شده بر روی رایانه متصل به دستگاه  AKTA  FPLCدر بخش نتایج شکل1 ارائه‌شده است.

مطالعه ویژگی­های الکتروفورزی مهار­کننده آلفا­آمیلاز خالص­سازی شده با روش SDS-PAGE (Sodium dodecyl-polyacrylamide gel electrophoresis): بعد از اتمام خالص­سازی پروتئین مهار­کننده آلفا­آمیلاز بذر گندم با روش FPLC، فرا­کشن­های جمع­آوری شده برحسب پیک نمودار در لوله‌آزمایش‌های جداگانه جمع‌آوری‌شده و برای مطالعات بعدی درC º4- نگه­داری شدند. برای مطالعه ویژگی الکتروفوزی فرا­کشن­های جمع‌آوری شده از روش SDS-PAGE استفاده نمودیم (6).

نمونه‌های موردمطالعه در این بخش شامل:

نمونه شماره 1. پروتئین­های شبه آلبومینی محلول در آب استخراج‌شده با آب مقطر

نمونه شماره 2. پروتئین رسوب یافته بعد از فرایند رسوب با آمونیوم سولفات و دیالیز، فراکشن اول خارج‌شده از ستون FPLC براساس نمودار ترسیم‌شده که همان پروتئین موردنظر و مهار­کننده آلفا­آمیلاز می‌باشد.

نمونه شماره 3 و 4 دو سری از پروتئین‌های استاندارد با وزن مولکولی معلوم برای رسم نمودار استاندارد تعیین وزن مولکولی (شکل5 )

نمونه (5 و 6) دو تکرار از پروتئین‌های محلول در آب بذر گندم زرین نتایج الکتروفوز در ژل به‌صورت شکل 2 و جدول 1 نشان داده‌شده است.

 

 

جدول 1- نتایج الکتروفورز SDS-PAGE پروتئین بازدارنده آلفاآمیلاز از بذر گندم زرین، بعد از استخراج، جداسازی و خالص‌سازی با FPLC

وزن مولکولی پروتئین kD

حرکت نسبیRm (Relative mobility)

پروتئین خارج‌شده ازستون 2

پروتئینهای استخراج‌ شده با آب 5، 6، 1

فاصله طی شده cm

شماره باند

85/116

11/0

 

ـــ

9/0

1

24/111

12/0

 

ـــ

1

2

73/100

15/0

 

ـــ

2/1

3

73/67

25/0

 

ـــ

2

4

33/61

27/0

 

ـــ

2/2

5

13/53

31/0

 

ـــ

5/2

6

27/32

43/0

 

ـــ

5/3

7

75/22

52/0

 

ـــ

2/4

8

58/17

59/0

ـــ

ـــ

3/5

9

96/16

60/0

ـــ

ـــ

5/5

10

32/9

75/0

 

ـــ

6

11

27/7

81/0

 

ـــ

5/6

12

علامت- نشان‌دهنده وجود باند پروتئینی در همان موقعیت است

 

روش سنجش فعالیت آلفا­آمیلاز: به‌منظور اندازه­گیری میزان کاهش فعالیت آلفاآمیلاز در بزاق انسانی و آلفا­آمیلاز با منشأ باسیلوس سوبتیلس (استاندارد) زمانی که مهارکننده آلفا­آمیلاز به مخلوط واکنش آن‌ها اضافه می­شود، از روش سنجش فعالیت هیدرولیتیک از روش برنفلد  استفاده نمودیم. مهارکننده آلفا آمیلاز موجود در بذر گندم (زرین) بعد از مراحل خالص‌سازی با روش FPLC تا زمان سنجش فعالیت هیدرولتیک در دمای ‍‍C° 4- در اپندورف نگه­داری گردید. یک میلی­لیتر از هرکدام از نمونه­های موردمطالعه (4 نمونه) با شش میلی­لیتر از محلول استخراج در بستر یخ به­خوبی هموژن گردید. برای صاف نمودن عصاره هموژن از پارچه نخی چندلایه استفاده گردید. عصاره صاف‌شده به مدت 15 دقیقه در g 40000 سانتریفیوژ گردید. محیط واکنش آنزیمی شامل 3 میلی‌لیتر نشاسته 2 درصد و سه میلی­لیتر از عصاره استخراج محتوی نمونه­ها تهیه گشته به مدت 30 دقیقه در دمای C°30 نگه­داری گردید. سپس یک میلی­لیتر از محیط واکنش با یک میلی­لیتر از معرف رنگی دی نیتروسا­لیسیلیک اسید به‌آرامی مخلوط گردیده و به مدت 5 دقیقه در حمام آب جوش حرارت داده شد. سپس نمونه­ها به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق سرد گردیده و شدت جذب نوری آن‌ها در طول‌موج 546 نانومتر خوانده شد. غلظت نمونه‌ها با استفاده از معادله استاندارد مالتوز و با در نظر گرفتن میزان رقیق نمودن آن‌ها محاسبه گردید (21). گروههای احیاکننده در کنار ماده‌ی 3 و 5 دی نتیروسالیسیلیک اسید، ترکیبات رنگی ایجاد می‌نمایند. میزان ترکیبات رنگی ایجادشده با میزان گروههای احیاکننده حاصل از فعالیت هیدرولازی نسبت مستقیم دارند. ماکزیمم جذب نوری ترکیبات رنگی حاصله در طول‌موج 546 نانومتر قراردارد. برای سنجش مهارکنندگی پروتئین خالص‌سازی شده از بذر گندم، به‌عنوان مهارکننده آلفاآمیلاز روش سنجش فعالیت هیدرولیتیک بر مبنای استفاده از 3 و 5 دی نیترو سالیسیلیک اسید (روش برنفلد) مبنای عمل گرفت (21).

در این سنجش فعالیت هیدرو­لیتیک چهار نمونه زیر باهم مقایسه گردید:

1- محلول آلفا آمیلاز با­سیلسوس سوبتیلیس (Merck Art 1329) با غلظت ml / mg 1 به‌عنوان شاهد

2- محلول آلفا ­آمیلاز با­سیلسوس سوبتیلیس (Merck Art 1329) با غلظت ml / mg 1 به همراه یک میلی‌لیتر مهارکننده آلفا آمیلاز خالص‌شده با مراحل FPLC

3– بزاق انسانی رقیق‌شده (1: 3) با آب دو بار تقطیر بدون مهارکننده به‌عنوان شاهد

4– بزاق انسانی رقیق‌شده (1:3) با آب دو بار تقطیر به همراه یک میلی‌لیتر مهارکننده آلفا آمیلاز خالص‌شده با مراحل FPLC

برای قابل‌مقایسه و معنی­دار بودن نتایج از هریک از نمونه­ها 3 تکرار در آزمایش لحاظ گردید (جدول2).

نتایج

نتایج کروماتوگرافی تعویض یونی با استفاده از ستون تعویض­کننده­ی آنیونی DEAE و سیستم AKTA FPLC TM به‌صورت شکل 1 نشان داده‌شده است. این منحنی شدت جذب نوری پروتئین خارج‌شده از ستون را در طول‌موج nm280 با استفاده از لامپ UV مرتبط با دستگاه نشان می­دهد. پروتئین­ها در pH بالاتر و یا پایین­تر از pH ایزو الکتریک خود به‌صورت مثبت و یا منفی بار­دار شده و همراه بافر آغاز­کننده (بافر A) بر روی ستون اعمال‌شده و به ذرات بار­دار ستون متصل می­شوند. با تغییر شرایط به‌صورت افزایش غلظت نمک یا تغییر pH که با جایگزینی بافر A توسط بافر B (بافر جداکننده)، صورت می‌پذیرد پروتئین­های متصل شده در مرحله قبلی براساس شدت پیوند یونی با لیگاند­های ستون به‌صورت مجزا همراه بافر B از ستون خارج می­شوند و بدین ترتیب جدا­سازی یک نوع پروتئین صورت می­گیرد. در این دستگاه برای شناسایی پروتئین خارج‌شده از لامپ UV و مانیتور UV با فیلتر 280 نانومتری در مسیر عبور پروتئین در بخش flow cell تعبیه گردیده است. دراین بخش همانند یک اسپکتروفتومتر، شدت جذب نوری نمونه عبوری در طول‌موج 280 نانومتر اندازه­گیری شده و در بخش مانیتور UV نمایش داده و نرم‌افزار unicorn نصب‌شده آن را به­صورت منحنی شدت جذب در طول‌موج 280 نانومتر برحسب زمان تزریق نمونه نمایش می­دهد. شکل 1 نمودار ترسیم‌شده توسط نرم‌افزار unicorn مرتبط با دستگاه AKTA TM FPlC را نشان می­دهد.

 

 

شکل 1- پیک ترسیم‌شده توسط نرم‌افزار unicorn مرتبط با دستگاه AKTA FPlC

مهارکننده آلفا­آمیلاز استخراج‌شده از بذر گندم (زرین) که بامحلول 50- 35 درصد اشباع آمونیوم سولفات رسوب یافته و با ستون­کروماتوگرافی تعویض­یونی آنیونی آماده DEAE FF جداسازی شده است. پروتئین هنگام اعمال 100 درصد بافر جداکننده در دقیقه 80 شروع به خروج از ستون نموده است.

 

فراکشن جمع‌آوری‌شده حاصل از کروماتوگرافی تعویض یونی به‌منظور شناسایی، تعیین ویژگی، اطمینان از خلوص و دیگر ویژگی­ها، با روش SDS-PAGE الکترو­فورز گردید. روش اجرایی کامل الکتروفورز نمونه در منابع توضیح داده ‌شده است (6). نتیجه الکتروفورز به­صورت شکل 2 و داده‌های مرتبط با آن در جدول شماره 1 نشان داده‌شده است. ستون اول،  پنجم و ششم پروتئین­های شبه آلبومینی محلول در آب بذر گندم استخراج‌شده با آب مقطر را نشان می­دهد.

شکل 3 نشان می­دهد که فعالیت هیدرولیتیک آلفا­آمیلاز استاندارد (با منشأ باکتریایی) به میزان 97/89 درصد توسط مهار­کننده کاهش‌یافته است. همچنین فعالیت هیدرولیتیک بزاق انسانی (با لحاظ­کردن مقدار رقیق نمودن نمونه­ها) توسط مهار­کننده آلفا­آمیلاز استخراج‌شده و خالص­سازی شده از بذر گندم (زرین) به میزان07/97 درصد کاهش ‌یافته است. در جدول 2 نتایج اندازه­گیری میزان کاهش فعالیت آلفاآمیلاز در بزاق انسانی و آلفا­آمیلاز با منشأ باسیلوس سوبتیلس (استاندارد) با استفاده از روش برنفلد زمانی که مهارکننده آلفا­آمیلاز به مخلوط واکنش آن‌ها اضافه می­شود نشان داده شده است، آزمایش‌ها با سه تکرار انجام و محاسبه انحراف معیار و رسم نمودار با نرم‌افزار اکسل انجام گردید.

شکل 4 نمودار استاندارد مالتوز ترسیم‌شده با روش برنفلد و شکل 5 نمودار استاندارد اندازه‌گیری وزن مولکولی پروتئین براساس حرکت نسبی روی ژل را نشان می‌دهد.

 

جدول 2- میزان کاهش فعالیت آلفا آمیلاز توسط مهارکننده استخراج شده از بذر گندم بعد از خالص‌سازی ؛ بر اساس مالتوز تولید شده

درصد بازدارندگی

غلظت محاسبه شده مالتوز با منحنی استاندارد

میانگین

 ±Sd

OD

تکرار

نمونه

 

43/27μm

808/0+ 006/0

817/0

اول

آلفاآمیلاز استاندارد با منشأ

aus Bacillus subtilis (MerckArt.1329)

1mg/1ml

808/0

دوم

799/0

سوم

97/89%

75/2μm

580/0+ 016/0

590/0

اول

آلفاآمیلاز استاندارد با منشأ

aus Bacillus subtilis (MerckArt.1329)

1mg/1ml

+

مهارکننده آلفاآمیلازموجوددر بذر گندم زرین بعدازخالص سازی با FPLC

557/0

دوم

595/0

سوم

 

86/129μm

991/0+ 004/0

991/0

اول

بزاق انسانی

985/0

دوم

998/0

سوم

07/97%

80/3μm

823/0+ 016/0

820/0

851/0

800/0

 

 

1

2

3

 

 

بزاق انسانی

+

مهارکننده آلفاآمیلازموجوددر بذر گندم زرین              بعدازخالص سازی با FPLC

 

 

 

شکل 4- نمودار استاندارد مالتوز ترسیم شده با روش برنفلد

 

شکل 5- نمودار استاندارد اندازه‌گیری وزن مولکولی پروتئین بر اساس حرکت نسبی بر روی ژل

بحث و نتیجه­گیری

شکل 1 نشان می­دهد که از دقیقه 1 تا 62 بافر A به دستگاه اعمال گردیده است. در دقیقه 62 بافر A با بافر B جایگزین گردیده است. بافر B بافر جداکننده بوده و محتوی بافر A و NaCl یک مولار می­باشد. پروتئین­های موجود در نمونه با توجه به سیستم و pH بافر به­صورت منفی باردار شده و به ذرات ستون DEAEکه دارای گروه تبادل کننده N+(C2H5)2 H دی اتیل آمینو اتیل با بار مثبت می­باشد متصل می­شوند. در مرحله اول پروتئین­ها به علت قرارگرفتن در pH بالاتر از  pH  ایزوالکتریک دارای بار منفی شده و به ستون دارای گروه باردار شونده مثبت، متصل می­شوند. با اعمال بافر جدا­کننده با شدت یونی قوی ) Nacl 1M یون­های Cl جایگزین پروتئین­ها شده و پروتئین­ها از ستون جداشده و همراه بافر خارج می­شوند. به علت پیوند یونی با شدت یکسان، تمام مولکول­های یک پروتئین ویژه در یک‌زمان معین باهم از ستون جداشده و این به فرایند تخلیص کمک می‌نماید. اولین پروتئین در دقیقه 90 از زمان تزریق نمونه و تقریباً 30 دقیقه بعد از جایگزینی بافر B از ستون خارج‌شده و ماکزیمم جذب نوری را نشان می­دهد در طی ده دقیقه این پروتئین به حداکثر تجمع رسیده و به‌طور کامل از ستون خارج می­شود. با توجه به‌شدت جریان 5/0 میلی­لیتر در دقیقه به همراه پروتئین تقریباً 5 سی‌سی بافر B نیز در فراکشن اول جمع‌آوری گردید. در برخی روش­ها برای تغلیظ نمونه در این مرحله روش­های ویژه­ای به­کار برده شده است در این آزمایش فراکشن جمع‌آوری‌شده را همراه با بافر به مدت 24 ساعت در دیسکاتور محتوی هیدرو­کسید سدیم به‌منظور آبگیری قرارداده شد. نمونه تغلیظ شده برای مطالعات تکمیلی مورداستفاده قرارگرفت.

همچنان که جدول 1 نشان می­دهد در این ستون 12 باند پروتئین تفکیک‌شده‌اند که حرکت نسبی آن‌ها از 11/0 تا 81 /0 متغیر می­باشد. ستون دوم شامل پروتئین­های رسوب یافته با آمونیوم­سولفات می­باشد یعنی از گروه پروتئین­های شبه آلبو­مینی (ستون 1) با استفاده از رسوب جزءبه‌جزء توسط محلول 50- 35 درصد اشباع آمونیم سولفات پروتئین­های ستون دوم رسوب یافتند، که شامل دو باند پروتئین یعنی باندهای شماره 9،10 می‌باشند پروتئین مهارکننده آلفا­آمیلاز (هدف) در باند­های 9 و 10 دیده می­شود. برای اطمینان و پیگیری دقیق مراحل خالص­سازی نمونه پروتئینی بعد از دیالیز الکتروفورز گردید.

فراکشن جمع‌آوری‌ و خارج‌شده از دستگاه مطابق پیک شکل1 بعد از مراحل تغلیظ به‌صورت ستون شماره دو الکتروفورز گردید. الگوی الکتروفورزی نمونه­ها که در شکل 2 نشان داده‌شده است، تأییدی بر فرایند خالص‌سازی پروتئین مورد نظر یعنی پروتئین مهارکننده آلفا­آمیلاز استخراج‌شده از بذر گندم هست. این پروتئین دارای حرکت نسبی 59/0 و 60/0 بوده و فاصله طی شده توسط آن بر، روی ژل 5/5 و 3/5 سانتی‌متر از ابتدای ژل می­باشد. مقایسه این شکل با پیک شکل 1 نشان‌دهنده این مطلب می­باشد.

  

       الف                     ب                   ج

شکل 2- مطالعه ویژگی­های الکتروفورزی مهارکننده آلفاآمیلازبذرگندم خالص­سازی و جمع‌آوری‌شده از AKTA FPLCTM

الف 1) پروتئین­های محلول در آب بذر گندم 2) پروتئین رسوب یافته با محلول 50-35% اشباع آمونیوم سولفات پروتئین موجود در فراکشن اول جمع‌آوری‌شده از ستون­کروماتوگرافی تعویض­یونی.

ب 3) دو سری از پروتئینهای استاندارد با وزن مولکولی معلوم برای رسم نمودار استاندارد تعیین وزن مولکولی (شکل 5)

ج 5و6) دو تکرار از پروتئینهای محلول در آب بذر گندم زرین تکرار باکیفیت تر ستون 1

شکل 1 وجود تنها یک پروتئین را اثبات می­نماید، درحالی‌که ژل الکتروفورز وجود 2 باند پروتئین را به­طور واضح نشان می­دهد. تفسیر این است که دو باند مشاهده‌شده در حقیقت نشان‌دهنده دیمر­بودن این پروتئین ویژه می­باشد یعنی پروتئین اصلی که در شکل 1 به‌صورت یک نمودار دیده می­شود در مراحل مختلف الکتروفورز به‌ویژه هنگام استفاده از مواد و معرف­هایی نظیر مرکاپتواتانول، آمونیم پرسولفات (APS) و سدیم دو دسیل سولفات (SDS) با احیاء باندهای دی­سولفیدی دو زنجیر دیمر آن از هم جداشده و به‌صورت دو باند پروتئینی که وزن مولکولی بسیار نزدیک به هم دارند دیده می­شوند. این تفسیر با نتایج دیگر محققین که بیانگر شناسایی یک مهارکننده دیمر توسط آن­ها می­باشد هم­خوانی دارد (۱۱، ۱۵، ۱۹، 2۱ و ۲۳). مائده و همکاران (1985) مهارکننده آلفاآمیلاز با فرم 62/0 و وزن مولکولی 26 کیلو دالتون را که به‌صورت دایمری بود معرفی و شناسایی کردند (11). دیگر فرمهای دایمری 53/0،23/0، 28/0، 19/0 نیز توسط دیگر محققین شناسایی و معرفی‌شده‌اند.

مهار­کننده آلفا­آمیلاز خالص‌سازی شده توسط این مطالعه بسیار شبیه پروتئینی می‌باشد که توسط مائده و همکاران (1985) گزارش گردیده است 66/0(Rm= (11).

مهار­کننده­های آلفا­آمیلاز فعالیت هیدرولیتیک آنزیم را مهار کرده و عمل کاتالیتیکی آن را متوقف می­نمایند. برای سنجش میزان مهار­کنندگی عموماً از نشاسته محلول استفاده می‌شود. آلفا­آمیلاز در گروه اندوگلیکوزیدازها قرار داشته و پیوندهای آلفا 1 و 4 گلیکوزیدی را در پلی­ساکاریدها به‌صورت تصادفی در قسمت داخلی هیدرولیز می­نماید، نتیجه واکنش عمدتاً دکسترین و به مقدار کم گلوکز می­باشد (16). گروه­های احیاکننده که توسط شکافته شدن هیدرولیتیک پیوندهای گلیکوزیدی بین قندها تشکیل می­شوند، مبنای سنجش فعالیت آنزیم قرار می­گیرند.

چهار نمونه­ای که دراین تحقیق فعالیت هیدرولیتیک آن‌ها باهم مقایسه گردید، شامل آلفا آمیلاز استاندارد بدون مهارکننده، آلفا­آمیلاز استاندارد همراه با مهارکننده، بزاق انسانی رقیق‌شده بدون مهارکننده و بزاق انسانی رقیق‌شده همراه با مهارکننده بودند. از هر نمونه سه تکرار برای قابل‌اطمینان بودن نتایج بکار برده شد. مبنای مقایسه فعالیت آمیلازی در 4 نمونه فوق، بر اساس میزان مالتوز حاصل از فعالیت هیدرولیتیک آنزیم می­باشد. هرچه میزان فعالیت آنزیم بیشتر باشد، غلظت مالتوز ایجادشده در محلول واکنش بیشتر خواهد بود. در نمونه‌های شماره دو و چهار به مقدار یک میلی‌لیتر از مهار­کننده جمع‌آوری‌شده از فراکشن شماره یک دستگاه بعد از خالص­سازی، استخراج، رسوب و دیالیز به محلول واکنش اضافه شد. مشاهده می­شود که غلظت مالتوز اندازه­گیری شده در این نمونه­ها در مقایسه با نمونه‌های 1 شماره یک و دو که مهار­کننده اضافه نگردیده است، به‌طور کاملاً معنی­داری کاهش نشان می­دهد. با محاسبه مقادیر مالتوز در نمونه دارای مهارکننده و نمونه بدون مهار­کننده، درصد بازدارندگی فعالیت آمیلازی توسط مهارکننده محاسبه گردید (جدول 2).

شکل 3 نشان می­دهد که فعالیت هیدرولیتیک آلفا­آمیلاز استاندارد (با منشأ باکتریایی) به میزان 97/89 درصد توسط مهار­کننده کاهش‌یافته است. همچنین فعالیت هیدرولیتیک بزاق انسانی (با لحاظ­کردن مقدار رقیق نمودن نمونه­ها) توسط مهار­کننده آلفا­آمیلاز استخراج‌شده و خالص­سازی شده از بذر گندم (زرین) به میزان07/97 درصد کاهش‌یافته است. مهار­کننده­های آلفا­آمیلاز با منشأ گیاهی به‌طور ویژه در بذر غلات و حبوبات به فراوانی یافت شده و به­طور گسترده مطالعه شده­اند. زیرا در حفاظت از گیاه در برابر حشرات و آفات میکروبی دارای نقش می­باشند (۹، ۱۰، ۱۶ و ۲۳). علاوه بر این آن­ها به‌عنوان عامل ایجاد حساسیت و آلرژن در بیماری آسم نانوایان Baker‘s asthma)) شناخته می­شوند (۲۱).

برخی از مهارکننده­های موجود در گندم به‌شدت آلفا­آمیلاز حشرات را مهار نموده ولی بر آلفا­آمیلاز پستانداران اثر ندارند، این مشاهده پیشنهاد می­نماید که مهارکننده­ها می­توانند به‌عنوان ابزاری برای افزایش مقاومت غلات در برابر آفات به کار گرفته شوند. آفات و پاتوژن­های گیاهی به‌عنوان عوامل کاهش محصولات کشاورزی مطرح هستند. تغذیه مستقیم آفات از گیاه باعث ایجاد صدمه و آسیب در گیاه شده و مکانیسم­های دفاعی گیاهی را تحریک می­نماید. ترکیبات دفاعی گیاه شامل ترکیبات غیرپروتئینی مانند آنتی‌بیوتیک‌ها، آلکالوئیدها، ترپن­ها و ترکیبات گلیکوزیدی سیانوژنیک و از گروه ترکیبات پروتئینی می­توان به کیتینازها، گلوکانازها، لکتین­ها، آرسلین­ها، ویسیلین­ها و مهار­کننده­های آنزیمی اشاره نمود. مهار­کننده­های آنزیمی فرایند هضم را از طریق مهار آلفاآمیلاز و پروتئیناز بزاق حشره مختل می­نمایند (۱۶). دفاع طبیعی گیاهان به‌ویژه در محصولات زراعی استراتژیک با استفاده از تکنولوژی ترانسژنیک و سیستم­های دفاعی متنوع گیاهی می­تواند با ابزارهای بیوتکنولوژی و مهندسی ژنتیک بهبود یابد. امروزه بیشترین تحقیقات در این زمینه بروی Weevils (نوعی سوسک مزرعه) متمرکز می­باشد زیرا برای تأمین انرژی شدیداً به نشاسته و فعالیت آمیلازی وابسته است (۱۷).

 

 

شکل 3- نمودار درصد کاهش فعالیت آلفاآمیلاز باسیلوس سوبتیلیس و بزاق انسانی بعد از افزایش مهارکننده خالص­سازی شده از بذر گندم زرین به محیط واکنش برحسب میکرومول مالتوز تولید شده در محیط واکنش

 

مهارکننده‌های آلفاآمیلازی گندم، به سه خانواده‌ی 60، 12 و 24 کیلودالتونی تقسیم می‌شوند. خانواده‌ی 60 کیلودالتونی هتروتترامرها هستند. خانواده‌ی 12 کیلودالتونی مونومری بوده و مهارکننده‌ی آلفاآمیلازی 28/0( این عدد براساس حرکت الکتروفورزی آن بر روی ژل غیردناتوره کننده (native) است) شامل می‌شود. خانواده‌ی 24 کیلو دالتونی، شامل مهارکننده‌های آلفاآمیلازی 19/0، 38/0و 53/0 می‌باشد که دایمری می‌باشند. مهارکننده‌ی آلفاآمیلازی 19/0 از خانواده‌ی 24 کیلودالتونی جزء اصلی مهارکننده‌های آلفاآمیلازی گندم است. این مهارکننده می‌تواند آلفاآمیلازهای با منشأهای مختلف شامل آلفاآمیلازهای Bacillus subtilis، کرم آرد زرد، آفت نخود، آفت لوبیای مکزیکی، آفت لوبیا، پانکراس خوکی، پانکراس مرغی و بزاق و پانکراس انسان را مهار کند. مهارکننده‌ی آلفاآمیلازی 19/0 به‌صورت یک همودایمر با وزن مولکولی 6/26 کیلو دالتون است، که به‌صورت دو زیر واحد 3/13 کیلو دالتونی یکسان متشکل از 124 باقیمانده‌ی آمینواسیدی می‌باشد که با میان کنش‌های غیرکوالانت به هم مرتبط می‌شوند. نوع بازدارندگی این مهارکننده در مقابل آلفاآمیلاز پانکراسی به‌صورت رقابتی می‌باشد، چراکه مشخص‌شده است مولکول آنزیمی به هومودایمر این بازدارنده متصل می‌شود. فعالیت بازدارندگی بالای مهارکننده‌ی آلفاآمیلازی 19/0 در مقابل آمیلاز پانکراسی خوک و پایداری دمایی بالای آن نشان‌دهنده‌ی پتانسیل بالقوه آن برای پیشگیری و درمان چاقی و دیابت می‌باشد (16). مهارکننده آلفاآمیلاز خالص‌سازی شده در این مطالعه را می‌توان در گروه 24 کیلو دالتونی و نزدیک به 53/0 که دایمریک هستند، طبقه‌بندی کرد. گزارش شده است گروه مونومریک مهارکننده‌های آمیلازی گندم، به­‌طور ویژه‌ای آمیلازهای حشرات را مهار می‌کنند، درحالی‌که مهارکننده‌های آمیلازی دایمریک گندم، آمیلازهای حشرات و همچنین آمیلازهای بزاق انسانی و آمیلازهای پانکراسی خوک را مهار می‌کنند (24).

نتایج این تحقیق نشان داد که فعالیت هیدرولیتیک بزاق انسانی توسط مهارکننده خالص­سازی شده از بذر گندم زرین، به‌طور قاطع مهار گردید. نتایج شناسایی یک پروتئین با 60/0 و وزن مولکولی تقریبی Kd 96/16 را تائید نمود. دو باند مشاهده‌شده نشان­دهنده­ی دیمر بودن این پروتئین می­باشد. فعالیت هیدرولیتیک آلفا­آمیلاز استاندارد (با منشأ باکتریایی) به میزان 97/89 درصد توسط این پروتئین مهار گردید. همچنین فعالیت هیدرولیتیک بزاق انسانی توسط این پروتئین به میزان 07/97 درصد کاهش یافت.

مکانیسم واکنش مهارکنندگی در مورد مهار آلفا آمیلاز بوسیله مهارکننده‌های پروتئینی گیاهی به‌طور روشن درک نشده است. ولی فرضیه‌هایی مبتنی براین که قندهای احیاکننده که به‌طور کووالانسی به زنجیره پلی­پپتیدی مهارکننده متصل می‌شوند ممکن است نقش عمده‌ای در مکانیسم واکنش مهار داشته باشند ارائه گردیده است و یا این‌که پروتئین‌های مهارکننده ممکن است باعث تغییر در ساختار فضایی و سه‌بعدی مولکول آنزیم شوند. اخیراً به اثبات رسیده است که وقتی مهارکننده دو عملکردی جو به آلفا آمیلاز با منشأ درونی متصل می‌شود، بنیان اختصاصی تریپتوفانی آنزیم را که برای واکنش پیوندی آنزیم- سوبسترا ضروری است، تغییر داده و این فرایند را مختل می‌نماید. داده‌هایی که در مورد واکنش سرین پروتئیناز و مهارکننده‌های آن وجود دارد نشان می­دهد که مهارکنندگی کاملاً رقابتی بوده و در نسبت (1:1) فعالیت آنزیم کاملاً متوقف می­گردد. مطالعات کریستالوگرافی، رزونانس مغناطیسی هسته‌ای (NMR) و . . . نشان داد که مهارکننده به‌عنوان سوبسترای بسیار اختصاصی آنزیم عمل کرده و به پپتید ویژه و یگانه­ای که در جایگاه واکنش قرارگرفته متصل می­شود. برخلاف پیوند معمولی آنزیم- سوبسترا و آنزیم- فراورده که به‌آسانی ازهم‌گسسته می‌شوند پیوند آنزیم- مهارکننده بسیار پایدار می‌باشد (4، 18و5).

مهار آلفا­آمیلاز باکتریایی توسط این مهارکننده می­تواند به‌منظور کنترل طبیعی بیماری­ها و آفات گیاهی موردتوجه محققین کشاورزی قرار گیرد. همچنین کاربردهای ویژه مهارکننده­های آلفا­آمیلاز در درمان دیابت و نارسایی­های گوارشی و اصلاح رژیم­های غذایی به‌منظور کاهش وزن که امروزه در جمعیت ایران بسیار شایع می­باشند، زمینه تحقیقاتی جدیدی است که می­تواند موردتوجه محققین علوم پزشکی کشور قرارگیرد. پیشنهاد می‌شود در مطالعات و پژوهش‌های آینده، خالص‌سازی کامل مهارکننده‌های آلفاآمیلازی به‌وسیله‌ی کروماتوگرافی تبادل آنیونی و سپس HPLC فاز معکوس انجام و پروتئینهای به‌دست آمده برای سنجش اثر مهارکننده­گی جمع‌آوری شوند. همچنین اثر این مهارکننده‌ها بر روی آلفاآمیلازهای پانکراسی انسانی به‌عنوان راهبردی برای درمان دیابت نوع دوم بررسی گردند.

1- Barrett, M. L., and Udani, J. K., 2011. A proprietary alpha-amylase inhibitor from white bean (Phaseolus vulgaris), a review of clinical studies on weight loss and glycemic control. Nutrition Journal, Dec, 10(1), 24 p.
2- Dayler, C. S., Mendes, P. A., Prates, M. V., Bloch, C., Franco, O. L., and Grossi-de-Sá, M. F., 2005. Identification of a novel bean α‐amylase inhibitor with chitinolytic activity, FEBS letters, Oct 24, 579(25), PP: 5616-20.
3- Doonan, S. H., 1996. Methods in molecular biology. Volume 59. Humana press.Totowa, New Jersey.
4- Franco, O .L., Rigden, D. J. R., Melo, F., Bloch, C., Silva, C. P., Grossi de Sá, M. F., 2000. Activity of wheat α‐amylase inhibitors towards bruchid α‐amylases and structural explanation of observed specificities. The FEBS Journal, Apr 1, 267(8), PP: 2166-73.
5- Franco, O. L., Rigden, D. J., Melo, F. R., Grossi‐de‐Sá, M. F., 2002. Plant α‐amylase inhibitors and their interaction with insect α‐amylases. The FEBS journal, Jan 1, 269(2), PP: 397-412.
6- Hames, B.D. ed., 1998. Gel electrophoresis of proteins: a practical approach (Vol. 197). OUP Oxford.
7- Iulek, J., Franco, O. L., Silva, M., Slivinski, C. T., Bloch, J. r. C., Rigden, D. J., and de Sá, M. F., 2000. Purification, biochemical characterisation and partial primary structure of a new α-amylase inhibitor from Secale cereale (rye), the international journal of biochemistry and cell biology, Dec 1, 32(11-12), PP: 1195-204.
8- Kluh, I., Horn, M., Hýblová, J., Hubert, J., Dolečková-Marešová, L., Voburka, Z., Kudlı́ková, I., Kocourek, F., and Mareš, M., 2005. Inhibitory specificity and insecticidal selectivity of α-amylase inhibitor from Phaseolus vulgaris, Phytochemistry, Jan 1, 66(1), PP: 31-9.
9- Kondo, N. K., and Ida, E. I., 1995. Extraction, purification and some partial characterization of alpha-amylase inhibitors from wheat Iapar 28-Igapó, Archivos latinoamericanos de nutricion, Dec, 45(4), PP: 310-6.
10- Korot'ko, G. F., and Bulgakova, V. A., 2002. Use of a salivary alpha-amylase inhibitor in the saliva biochemical study. Klinicheskaia laboratornaia diagnostika. Mar (3), PP: 20-2.
11- Maeda, K., Tamakoshi, K., Yamashita, A., and Fukumoto, T., 1985. Monoclonal antibodies against an α-amylase inhibitor from wheat kernel. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology, Apr 29, 828 (3), PP: 222-8.
12- Moreno, J., Altabella, T., and Chrispeels, M. J., 1990. Characterization of α-amylase-inhibitor, a lectin-like protein in the seeds of Phaseolus vulgaris. Plant physiology, Mar 1, 92(3), PP: 703-9.
13- Morton, R. L., Schroeder, H. E., Bateman, K. S., Chrispeels, M. J., Armstrong, E., and Higgins, T. J., 2000. Bean α-amylase inhibitor 1 in transgenic peas (Pisum sativum) provides complete protection from pea weevil (Bruchus pisorum) under field conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. Apr 11, 97(8), PP: 3820-5.
14- Franco, O. L., Rigden, D. J. R., Melo, F., Bloch, C., Silva, C. P., and Grossi de Sá, M. F., 2000. Activity of wheat α‐amylase inhibitors towards bruchid α‐amylases and structural explanation of observed specificities. The FEBS Journal. Apr 1, 267(8), PP: 2166-73.
15- Franco, O. L., Rigden, D. J., Melo, F. R., and Grossi‐de‐Sá, M. F., 2002. Plant α‐amylase inhibitors and their interaction with insect α‐amylases. The FEBS journal. Jan 1, 269(2), PP: 397-412.
16- Oneda, H., Lee, S., and Inouye, K., 2004. Inhibitory effect of 0.19 α-amylase inhibitor from wheat kernel on the activity of porcine pancreas α-amylase and its thermal stability. The journal of biochemistry. Mar, 135(3), PP: 421-7.
17- Petrucci, T. A., Sannia, G., Parlamenti, R., Silano, V., 1978. Structural studies of wheat monomeric and dimeric protein inhibitors of α-amylase. Biochemical Journal. Jul 1,173(1), PP: 229-35.
18- Pelegrini, P. B., Lay, F. T., Murad, A. M., Anderson, M. A., and Franco, O. L., 2008. Novel insights on the mechanism of action of α‐amylase inhibitors from the plant defensin family. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. Nov 15, 73(3), PP: 719-29.
19- Ramasubbu, N., Ragunath, C., Mishra, P. J., Thomas, L. M., Gyémánt, G., and Kandra, L., 2004. Human salivary α‐amylase Trp58 situated at subsite− 2 is critical for enzyme activity. The FEBS Journal, Jun 1, 271(12), PP: 2517-29.
20- Richardson, M., 1991.Methods in plant biochemistry.Volume 5 Academic press, PP: 259-305.
21- Roy, I., and Gupta, M. N., 2000. Purification of adouble-headed'inhibitor of α-amylase/Proteinase K from wheat germ by expanded bed chromatography. Bioseparation, Jul 1, 9(4), PP: 239-45.
22- Riseh, N. S., and Ghadamyari, M., 2012. Biochemical characterization of α-amylases from gut and hemolymph of Rhynchophorus ferrugineus Olivieri (Col.: Curculionidae) and their inhibition by extracts from the legumes Vigna radiata L. and Phaseolus vulgaris L. ISJ. Jan 1, 9, PP: 72-81.
23- Sharma, P., Shankar, P. R., Subramaniam, G., Kumar, A., Tandon, A., Suresh, C. G., Rele, M. V., and Kumar, L. S., 2009. Cloning and sequence analysis of the amylase gene from the rice pest Scirpophaga incertulas Walker and its inhibitor from wheat (Variety Mp (Variety MP Sehore). International Journal of Insect Science 2010, 1, PP: 29-44.
24- Strobl, S., Maskos, K., Wiegand, G., Huber, R., Gomis-Rüth, F. X., Glockshuber, R., 1998. A novel strategy for inhibition of α-amylases: yellow meal worm α-amylase in complex with the Ragi bifunctional inhibitor at 2.5 Å resolution. Structure. Jul 15, 6(7), PP: 911-21.
25- Unnikrishnan, P. S., Suthindhiran, K., and Jayasri, M. A., 2015. Alpha-amylase inhibition and antioxidant activity of marine green algae and its possible role in diabetes management. Pharmacognosy magazine, Oct, 11(Suppl 4), S511p.
مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)
دوره 33، شماره 1
اردیبهشت 1399
صفحه 70-82
  • تاریخ دریافت: 04 اردیبهشت 1397
  • تاریخ بازنگری: 01 مرداد 1397
  • تاریخ پذیرش: 18 مهر 1397