مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)
بهینه سازی دستوالعمل رویانزایی رویشی در خرما (Phoenix dactylifera L.)، رقم استعمران
نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانش آموخته کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان، دانشکده کشاورزی، گروه تولید و ژنتیک گیاهی
2 هیات علمی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان، دانشکده کشاورزی، گروه تولید و ژنتیک گیاهی
3 هیات علمی دانشگاه شهرکرد
چکیده
تولید نخل خرما (Phoenix dactylifera L.) در ایران طی دهه 1370 افزایش چشمگیری داشت، اما به دلایلی همچون: قدیمی بودن نخلستانها، استفاده از روشهای سنتی کاشت پاچوش‌های مادری و برداشت خرما، امکان خروج ایران از چرخه بازار جهانی وجود دارد. پژوهش حاضر، در راستای بومی سازی دستور تجاری تکثیر کشت بافتی خرما، به صورت فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاٌ تصادفی، بر روی ریزنمونه رأس ساقه‌ی خرما رقم استعمران، در محیط کشت پایه موراشیگ و اسکوگ حاوی تنظیمکنندههای رشد تیدیازورون (TDZ) و 2,4.دی کلروفنوکسی استیک اسید (2,4.D)، هر یک با دو غلظت (5 و 10 میلی گرم بر لیتر) و در 3 تکرار، انجام شد. در تیمار (mgl-1) 10 2,4-D + (mgl-1) 5 TDZتولید کالوس به نسبت بالا و با کیفیت، جهت جنینزایی مشاهده شد. حداکثر القاء جنین و تمایززایی به جنین کوتیلدونی، در محیط کشت MS و با کاهش مقدار منبع کربن به (gl-1) 20، در تیمار تنظیمکنندهی رشد (mgl-1) 10 2,4.D همراه با (mgl-1) 5 TDZ رخ داد. در پژوهش حاضر مدت زمان القاء تا تشکیل کالوس به دو هفته کاهش یافت و در هفته چهارم جنینهای سوماتیکی متمایز شدند. نتایج شاهدی بر بهینه سازی دستورالعمل ریزازدیادی رقم استعمران در جهت کاهش مدت زمان جنینزایی و با استفاده از حداقل مصرف تنظیمکنندهای رشد 2,4.D و TDZ بود.
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
The optimized protocol for somatic embryogenesis in date palm (Phoenix dactylifera L.) CV. Estameran
نویسندگان [English]
- elahe Baharan 1
- Payam Pour Mohammadi 2
- Ehsan Shahbazi 3
1 Plant Production and Genetics Dept., Agricultural Sciences and Natural Resources University of Khuzestan, Ahwaz, I.R. of Iran
2 Plant Production and Genetics Dept., Agricultural Sciences and Natural Resources University of Khuzestan, Ahwaz, I.R. of Iran
3 Plant Breeding and Biotechnology Dept., Faculty of Agriculture, Shahre-kord University, Shahre-kord, I.R. of Iran
چکیده [English]
Date palm (Phoenix dactylifera L.) production was increased impressively in Iran during 1990 decade. But for some reasons, there are possibility of withdrawing from the world market cycle, such as old groves and use of traditional methods of planting and harvest dates. This study, in order to localize commercial tissue culture propagation dates, on shoot tip explants in Murashige and Skoog (1962) culture medium, supplemented with plant growth regulators including of thidiazuron (TDZ) and 2.4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4.D), at 2 concentrations (5 and 10 mgl-1), via factorial completely randomized design in 3 replicates. In treatment with 5 (mgl-1) TDZ and 2,4-D 10 (mgl-1) were observed the highest levels of callogenesis with high-quality for embryogenesis. Maximum embryo induction and differentiation to somatic embryos was occurred in MS medium with decreased carbon source to 20 mgl-1 in 10 (mgl-1) 2,4-D with 5 (mgl-1) TDZ, treatment. In this study, the time of induction up to formation of callus, was reduced in two weeks and in the fourth week were distinct somatic embryos. Results, was evidence of optimization of the micropropagation instructions in date palm, in order to reduce the duration of embryogenesity and with minimum consumption of 2,4-D and TDZ plant growth regulators.
کلیدواژه‌ها [English]
- Date palm
- Shoot tip
- Somatic embryogenesis
- Callugenesis
بهینه سازی دستورالعمل رویانزایی رویشی در خرما (Phoenix dactylifera L.) در رقم استعمران
الهه بهاران1، پیام پورمحمدی1* و احسان شهبازی2
1 اهواز، دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی رامین، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات
2 شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، دانشکده کشاورزی، گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی
تاریخ دریافت: 5/7/94 تاریخ پذیرش: 27/12/95
چکیده
تولید نخل خرما (Phoenix dactylifera L.) در ایران طی دهه 1370 افزایش چشمگیری داشت، اما به دلایلی همانند قدیمی بودن نخلستانها، استفاده از روشهای سنتی کاشت پاجوشهای مادری و برداشت خرما، امکان خروج ایران از چرخه بازار جهانی وجود دارد. این پژوهش، در راستای بومی سازی دستور تجاری تکثیر کشت بافتی خرما، به صورت فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی، بر روی ریزنمونه رأس ساقه خرما رقم استعمران در محیط کشت پایه موراشیگ و اسکوگ حاوی تنظیمکنندههای رشد تیدیازورون (TDZ) و 2,4.دی کلروفنوکسی استیک اسید (2,4.D)، هر یک با دو غلظت (5 و 10 میلی گرم بر لیتر) در 3 تکرار انجام شد. در تیمار (mgl-1) 10 2,4-D + (mgl-1) 5 TDZتولید کالوس به نسبت بالا و با کیفیت، برای جنینزایی مشاهده شد. حداکثر القاء جنین و تمایززایی به جنین کوتیلدونی، در محیط کشت MS و با کاهش مقدار منبع کربن به (gl-1) 20، در تیمار تنظیمکننده رشد (mgl-1) 10 2,4.D همراه با (mgl-1) 5 TDZ رخ داد. در این پژوهش مدت زمان القاء تا تشکیل کالوس به دو هفته کاهش یافت و در هفته چهارم جنینهای سوماتیکی متمایز شدند. نتایج شاهدی بر بهینه سازی دستورالعمل ریزازدیادی خرما در جهت کاهش مدت زمان جنینزایی و با استفاده از حداقل مصرف تنظیمکنندهای رشد 2,4.D و TDZ بود که منجر به کاهش تنوع سوماکلونال شد.
واژههای کلیدی: نخل خرما، مریستم رأس ساقه، رویانزایی رویشی، کالوسزایی.
* نویسنده مسئول، تلفن: 06136522001 پست الکترونیکی: Mohammadi@ramin.ac.ir
مقدمه
گونة نخل خرما (Phoenix dactylifera L.) درختی همیشه سبز و تکلپه، سازگار با شرایط آب و هوایی خشک و نیمه خشک است. 53% از خاک ایران استعداد کشت خرما را دارد. طی دهه 1370 تولید و صادرات خرما افزایش چشمگیری داشت و ایران از جمله تولیدکنندگان (بعد از مصر در مقام دوم) و صادرکنندگان مهم جهانی خرما بشمار میآمد، اما به دلایلی همانند قدیمی بودن نخلستانها، استفاده از روشهای سنتی کاشت پاجوشهای مادری و برداشت خرما، کمبود امکانات حمل و نقل و نبود صنایع فراوری مناسب خرما، امکان خروج ایران از چرخه بازار جهانی وجود دارد (2). یک راه قابل دسترس برای حل این معضل، بومی سازی دستور تجاری تکثیر کشت بافتی خرما میباشد. استفاده از روش کشت بافت برای تکثیر و تولید انبوه نهالهای یکسان و محافظت از ژرمپلاسم خرما مورد توجه قرار گرفته است. بدین جهت محققانی ازجمله Tisserat و Damason (1980)، Zaid و Tisserat (1983)، Mater (1983)، Ross و همکاران (1995)، مطالعه و بررسی در این زمینه را آغاز کرده و تولید کالوس جنینزا و تکامل جنینها به گیاهک را گزارش نمودند (39، 44، 24، 32). تکثیر درون شیشة خرما اغلب از طریق جنینزایی سوماتیکی انجام شده است (30، 31، 36، 10، 34، 14، 21، 17، 8، 29). در این روش به دلیل تولید جنین از سلولها، بافتها و یا اندامهای پیکری، کلونهای نامحدودی با خصوصیات انتخابی تولید خواهد شد (9).
در ایران نیز مطالعاتی در این راستا انجام شده است. ناظری و همکاران (1371)، اولین گزارش از تولید جنین سوماتیکی را در ارقام استعمران و کبکاب منتشر کردند (6). Eshraghi و همکاران (2005) تولید جنینهای سوماتیکی را در ارقام خنیزی و مردارسنگ بررسی کردند (16). مطالعه روی ارقام کبکاب، استعمران، پیارم، برحی )1)، زاهدی، کبکاب و دیری (4) انجام شده است. در تمامی این پژوهشها از غلظتهای بالای تنظیم کنندة رشد 2، 4- دیکلروفنوکسی استیک اسید (به عنوان مثال، غلظت 100 میلی‌گرم بر لیتر در مطالعه حبشی و همکاران (1385)) (1)، به همراه غلظتهای پایین از تنظیم کنندههای رشد سیتوکینین استفاده شده بود که این امر منجر به بروز تنوع سوماکلونال خواهد شد (25). در ضمن در اغلب آزمایشهای ریزازدیادی خرما به 16 تا 48 هفته زمان از شروع کشت تا تولید کالوس جنینزا نیاز دارد. به‌عنوان مثال پژوهش Al-Khateeb (2006) در 28 هفته و پژوهش Hassan و Taha (2012) در مدت 48 هفته به نتیجه رسیده است (7، 19). رقم انتخابی در این پژوهش استعمران میباشد که بیش از 65 درصد محصول خرمای خوزستان و 40 درصد از تولید کل خرمای ایران را شامل میشود. ازجمله مشخصات این رقم داشتن درصد قند و ریزمغذیهای بالا، همراه با فیبر کم است. این خرما نیمه خشک بوده و رطوبت کمتر از 17 درصد دارد، بنابراین میتوان آن را در انبارهای معمولی و بدون سردخانه برای بیش از یکسال نگهداری کرد (26)، به همین دلیل این رقم برای بهینه سازی انتخاب گردید. در این پژوهش، با توجه به گسترة پژوهشها و دستورالعملهای ارائه شده در زمینه کشت بافت نخل خرما، سعی شده دستورالعملی ارائه شود که با استفاده از حداقل تنظیم کنندههای رشد که منجر به کاهش تنوع سوماکلونال خواهد شد، جنینزایی در کمترین زمان ممکن و با کاهش هزینهها انجام شود.
مواد و روشها
پاجوشهای استعمران به وزن 5/2 کیلوگرم، ارتفاع 180 سانتیمتر (از محل جدا شدن پاجوش از درخت مادری تا انتهای بلندترین برگ) و دارای 6 برگ بالغ، از خزانه دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی رامین خوزستان جدا شدند. بعد از قطع شاخ و برگ اضافی، رأس ساقهها به مدت 1 ساعت با آب شهری به همراه چند قطره شوینده شسته شدند. برش رأس ساقه در زیر هود لامینار انجام شد و مریستم رأسی که حدود 3 سانتیمتر ارتفاع دارد (شکل1) برای سترون سازی، به‌مدت 10 دقیقه در هیپوکلرید سدیم 25/5 درصد غوطهور شده و بعد 3 مرتبه با آب مقطر سترون و هر بار 10 دقیقه آبکشی شد.
بعد از برش ریزنمونهها به صورت طولی، قطعات 1-2 سانتیمتری در محیط پایه (MS) Murashige و Skoog (1962) همراه با ((gl-1 40 ساکارز، (gl-1) 3/0 زغال فعال، (gl-1) 8 آگار-آگار و آنتیاکسیدانتهای آسکوربیک اسید و سیتریک اسید به نسبت (mgl-1) 75 :75 و 4 تیمار تنظیم کنندة رشد (جدول 1) بر اساس بررسیهای Sidky و Zaid (2011)، برای القاء کالوس جنینزا کشت شدند (27، 35). pH محیطهای کشت با استفاده از NaOH1/0 نرمال یا HCl 1/0 نرمال روی 7/5 تنظیم شده و در دمای 121 درجه سانتیگراد در فشار15 psi برای 15 دقیقه اتوکلاو گردید.
دو واکشت اول به فاصله 3 هفته بود و کشتها در شرایط تاریکی2 ±25 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. واکشتهای بعدی با فاصله 4 هفته انجام شد و کشتها به شرایط دوره روشنایی 16/8 ساعت (روشنایی/تاریکی) منتقل شدند (23). 8 هفته بعد از کشت و پس از محاسبه درصد کالوسزایی هر تیمار، کالوسها به محیط القای جنین، شامل محیط کشت پایه MS همراه با ساکارز ((gl-1 40 و زغال فعال ((mgl-1 3/0 منتقل شد. 8 هفته بعد از جابهجایی به محیط کشت پایه MS، جنینها بر روی کالوسهای جنینزا کاملا قابل مشاهده و بررسی بودند. پس از این مرحله جنین ها به محیط کشت پایه MS همراه با ((gl-1 20 ساکارز انتقال پیدا کردند.
این آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی (CRD) با 3 تکرار اجرا شد (جدول 1).
فاکتور اول تنظیم کنندة رشد 2,4-D در دو سطح و فاکتور دوم تنظیم کنندة رشد TDZ در دو سطح بود (35). تجزیة واریانس (ANOVA) دادههای بدست آمده با نرمافزار SPSS انجام شد و مقایسة میانگینها به روش آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام و رسم نمودارها با نرم افزار Excel انجام شد.
جدول1- سطوح مختلف تنظیمکنندهی رشد بر حسب میلی گرم بر لیتر
|
شماره تیمار تنظیم کننده رشد |
2,4-D |
TDZ |
|
1 |
5 |
5 |
|
2 |
10 |
5 |
|
3 |
5 |
10 |
|
4 |
10 |
10 |
نتایج
اولین نشانههای تمایززدایی به سمت تولید کالوس، به صورت تورمهایی به رنگ زرد روی سطح ریزنمونهها، 10 روز بعد از کشت و نگهداری در شرایط تاریکی اولیه مشاهده شد، که به مرور زمان بعد از 2 تا 8 هفته به کالوسهای سفید مایل به زرد روشن و شفافی تمایز یافت.
شکل 1- محدوده رأس ساقه، مریستم رأسی و برش طولی آن در نخل خرما، رقم استعمران.
تجزیه واریانس دادههای بدست آمده از این آزمایش (جدول 2) نشان داد که بین دو سطح اکسین 2,4-D ( mgl-110 و mgl-1 5) و نیز دو سطح سیتوکینین TDZ ( mgl-110 و mgl-1 5) تفاوت معنیداری وجود ندارد، اما اثر متقابل مورد بررسی معنی‌دار بود (05/0P≤).
مقایسه میانگین دادههای کالوسزایی با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 5% (جدول 2 و شکل 2) نشان داد که بالاترین میزان کالوسزایی، اما با کیفیت کم (از لحاظ خصوصیات تعریف شده برای کالوسهای جنینزا) در تیمار (mgl-1) 5 2,4-D + (mgl-1)10 TDZ که سیتوکینین دو برابر اکسین بود بهدست آمد (شکل 3- الف). در تیمار اکسین دو برابر سیتوکینین (mgl-1)10 2,4-D + (mgl-1) 5 TDZتولید کالوس به نسبت بالا و با کیفیت، برای جنینزایی (سفید رنگ با سطح صاف) مشاهده شد (شکل 3- ب).
پس از انتقال به محیط کشت القاء جنین، پاسخدهی ابتدا با دانه دانه شدن سطح کالوس، سپس متراکم و فشرده شدن سلولها و در نهایت تولید جنین کروی شکل پدیدار شد. طی 4 هفته بعد از انتقال به محیط القاء جنین (10 تا 12 هفته بعد از کشت اولیه)، مراحل تکامل به سمت جنین قلبی و کوتیلدونی در زیر استریومیکروسکوپ قابل شناسایی و بررسی بود.
کالوسهای حاصل از برخی تیمارها مانند (mgl-1) 5 2,4-D + (mgl-1) 10 TDZ و (mgl-1) 10 2,4-D+ (mgl-1)10 TDZ با انتقال به محیط کشت القاء جنین، قهوهای شدند (شکل 4- الف و ب)، اما تیمارهای دیگر، مانند کالوسهای حاصل از (mgl-1) 5 2,4-D + (mgl-1) 5 TDZ با تغییر رنگ کالوس به زرد روشن، کالوس جنینزا تولید نمودند اما مراحل تکامل جنین را طی نکردند (شکل 4- پ).
جدول 2- تجزیه واریانس تأثیر 2,4-D و TDZ بر روی کالوسزایی در کشت مریستم رأسی نخل خرما، رقم استعمران.
|
میانگین مربعات |
درجه آزادی |
منبع تغییر |
|
|||
|
کالوسزایی |
|
|||||
|
|
ns333/0 |
1 |
2,4-D(a) |
|||
|
|
ns 333/0 |
1 |
TDZ(b) |
|||
|
|
* 000/3 |
1 |
2,4-D×TDZ ( a×b ) |
|||
|
|
500/0 |
8 |
خطای آزمایش |
|||
|
|
5/38 |
ضریب تغییرات (درصد) |
||||
*- معنی دار در سطح احتمال 5%
شکل 2- مقایسهی میانگین تأثیر تیمارهای تنظیمکنندهی رشد 2,4-D و TDZ بر کالوسزایی مریستم رأسی نخل خرما، رقم استعمران با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 5%، میانگینهای دارای حداقل یک حرف مشترک تفاوت معنیداری ندارند.
شکل 3- تأثیر تنظیم کنندههای رشد2,4-D و TDZ، بر القاء کالوس در مریستم رأسی نخل خرما، رقم استعمران. الف، تشکیل کالوس جنینزا با کیفیت کم در تیمار (mgl-1) 5 2,4-D +(mgl-1)10 TDZ. ب، تشکیل کالوس جنینزا با کیفیت بالا در تیمار (mgl-1) 10 2,4-D + (mgl-1) 5.TDZ
بر اساس این مشاهدات، کالوسهایی که تحت تیمار
(mgl-1) 10 2,4-D + (mgl-1) 5 TDZ تشکیل شده بودند، دارای بهترین جنینزایی بودند (شکل 4- ت).
جدول 3- تیمارهای محیط القاء کالوس (mgl-1) و کیفیت تولید کالوس جنینزا، از مریستم رأسی نخل خرما، رقم استعمران.
|
2,4-D |
5 |
10 |
5 |
10 |
|
TDZ |
5 |
5 |
10 |
10 |
|
کیفیت کالوسزایی |
3 |
4 |
1 |
2 |
رتبه بندی کیفیت تولید کالوس جنینزا: 1- ضعیف، 2- خوب، 3-
متوسط، 4- عالی (35).
به‌طورکلی دو نوع کالوس قابل تشخیص است: کالوس جنینزا که دارای ساختاری گره دار و فشرده هستند و دارای رشد آهستهتر بوده و توانایی ایجاد جنین تحت شرایط مناسب را دارند وکالوس غیرجنین‌زا که ساختاری کلوخه‌ای و ترد و شکننده دارند و اندازه آنها بسیار بزرگتر از کالوس های جنینزا میباشد و قادر به ایجاد جنین رویشی نمیباشند (5).
شکل 4- چگونگی جنینزایی در محیط کشت پایه MS، حاصل از کالوسهای مریستم رأسی نخل خرما، رقم استعمران. الف و ب، قهوهای شدن کالوس در تیمار (mgl-1) 5 + 2,4-D(mgl-1) 10 TDZ و ((mgl-1 10 + 2,4-D (mgl-1)10 TDZ. پ، تولید کالوس جنینزا در تیمار (mgl-1) 5 2,4-D + (mgl-1) 5 TDZ. ت، القاء و تشکیل جنین در تیمار (mgl-1) 10 2,4-D + (mgl-1) 5 TDZ. ث، تکامل جنینها تا مرحله کتیلدونی در محیط کشت پایه MS دارای (mgl-1) 20 ساکارز بعد از دو ماه. ج، قهوهای شدن جنینها با ادامه واکشت در محیط کشت پایه MS دارای (mgl-1) 20 ساکارز بعد از 3 ماه.
در این آزمایش از این لحاظ هر دو نوع کالوس مشاهده شد. کالوس غیر جنینزا در تیماری با دو برابر غلظت سیتوکینین به اکسین و کالوس جنینزا در تیمار اکسین دو برابر سیتوکینین (mgl-1) 10 2,4-D + (mgl-1) 5 TDZکه کالوسی سفید رنگ با سطح صاف همچنین با حداکثر میزان پاسخدهی بود، مشاهده شد.
پس از انتقال کالوسهای تولیدی به محیط کشت القاء جنین، دو نوع جنین سوماتیکی از لحاظ مورفولوژی تمایز یافت. در برخی از تیمارها (مانند تیمار (mgl-1) 52,4-D +(mgl-1) 5 TDZ، شکل 4- پ)، تورمهای کروی دارای مراکز قهوهای رنگ، روی سطح کالوس تولید کردند، این جنینها در مرحله کروی باقی ماندند و بهتدریج از بین رفتند (شکل 5- الف). در تعدادی از تیمارها (مانند تیمار (mgl-1) 10 2,4-D + (mgl-1) 5 TDZ، شکل 4- ت)، کالوسهای حاصل با انتقال به محیط جنینزایی تورمهای شاخی شکل تولید کردند، که پس از چندی از انتها به فرم کروی، قلبی و کوتیلدونی (اژدری) تکامل یافتند (شکل 5- ب).
شکل 5- کیفیت جنینهای تولید شده در محیط کشت پایه MS، حاصل از کالوسهای مریستم رأسی نخل خرما، رقم استعمران. الف، القاء تورمهای کروی با مراکز قهوهای رنگ، که مراحل تکامل جنین را طی نکردند. ب 1. و ب 2، القاء تورمهای شاخی شکل، که جنین سوماتیکی تولید کردند.
جنینهای تولید شده بعد از یک ماه، پرورش در محیط کشت پایه MS حاوی (gl-1) 40 ساکارز به محیط کشت پایه MS دارای (gl-1) 20 ساکارز منتقل شدند. کاهش مقدار ساکارز در ابتدا منجر به تکامل بیشتر جنینهای سوماتیکی تا مرحله کوتیلدونی شد و بعد از 2 ماه اندکی تغییر رنگ به سبز روشن مشاهده شد (شکل 4- ث)، اما با ادامه واکشت در محیط کشت با ساکارز ((gl-1 20 جنینها قهوهای شده و 3 ماه بعد از جابهجایی از بین رفتند (شکل 4- ج).
بحث
بعد از قرار دادن ریزنمونهها روی محیط کشت، قهوهای شدن و خروج ممانعت کنندههای رشدی از آنها به محیط کشت مشاهده میشود. قهوهای شدن بافت در مجاورت محیط کشت، به علت اکسیداسیون پلیفنولها و تشکیل کوئینینها میباشد، که برای ریزنمونهها کشنده است (43). مشخص شده که سیتریک اسید، آسکوربیک اسید و زغال فعال در تعامل مثبت با هم بوده و اثر مثبت بر زنده ماندن ریزنمونهها دارند. آسکوربیک اسید به‌عنوان ممانعت کننده از اکسیداسیون فنولها عمل کرده و کوئینین تشکیل شده را خارج میکند (3) . احتمالا سیتریک اسید به‌عنوان عامل کلاته کننده عمل کرده و تخریب آسکوربیک اسید را به تأخیر میاندازد (23). اثرات مثبت زغال فعال، در از بین بردن ترکیبات مهارکننده است، همچنین باعث کاهش شدید اکسیداسیون فنولها میشود. استفاده از (gl-1)3/0 زغال فعال باعث افزایش قدرت زیست ریزنمونهها در برگ نابالغ خرما (29) و افزایش اثر اکسین در محیط و تغییر خواص محیط در جهت کاهش جذب تنظیمکنندههای رشد و دیگر ترکیبات میشود (22). در مطالعه دیگری کاربرد ((gl-1 3 زغال فعال در محیط کشت، فقط منجر به کاهش اکسیداسیون فنولها شد (34). در این مطالعه نیز استفاده از ترکیبات آنتی اکسیدانت و زغال فعال منجر به سالم ماندن مریستم ها و عدم ترشح ترکیبات فنولیک در آنها شد.
اولین نشانههای تمایززایی به سمت تولید کالوس، به صورت نواحی تیرهتر، 10 روز بعد از کشت اولیه مشاهده شد، که به مرور زمان بعد از 2 هفته به کالوسهای سفید و شفافی تمایز یافت. پس از انتقال به محیط القاء جنین، کالوسها ظاهری دانه دانه پیدا کرده و سلولهای آن متراکم، فشرده و به رنگ زرد متمایل شدند. 4 هفته بعد مراحل اولیه جنینزایی بهصورت تورمهای کروی با مراکز قهوهای نمایان شد. از 12 تا 16 هفته بعد از کشت اولیه، مراحل تکامل به سمت جنین قلبی و اژدری در زیر بینوکولر قابل شناسایی و بررسی بود. در مطالعه روی رأس ساقه خرما رقم Dhakki، بعد از 1 هفته بافت متورم شده و بعد از 2 هفته افزایش اندازه پیدا کرد. القاء کالوس از هفته 3 شروع و در هفته 5 تکمیل شد (23). در مطالعات دیگری روی برگهای جوان، نتایج مشابهی بهدست آمد (رقم Ahmar در مطالعات Gueye و همکاران (2009) و رقم DegletBey در پژوهشهای Fki و همکاران (2003) (18، 17). در این پژوهش مدت زمان القاء تا تشکیل کالوس به 2 هفته کاهش یافته است و در هفته چهارم از کشت جنینهای سوماتیکی متمایز شدند. دلیل این کاهش مدت زمان پاسخدهی، علاوه بر تفاوتهای ژنتیکی ناشی از نوع رقم، به تنظیمکنندهای رشدی استفاده شده در این پژوهش نیز وابسته است. TDZ باعث افزایش انباشتگی و سنتز سیتوکینینهای پورینی شده و تبدیل آدنین به آدنوزین را افزایش میدهد (13). مشخص شد که TDZ ظرفیت دوگانهای در القاء جنین سوماتیکی دارد، فعالیت شبه سیتوکینی آن تقسیم سلولی را افزایش میدهد و کمی فعالیت شبه اکسینی دارد، که به‌نظر میرسد برای القاء جنین بسیار مهم است (42).
طبق بررسیهای انجام شده، استفاده از TDZ با غلظت (mgl-1) 10 در هر دو سطح 2,4-D، کیفیت تولید کالوس جنینزا را کاهش داد، همچنین کالوسهای تولید شده در این تیمارها با انتقال به محیط جنینزایی در اثر افزایش ترشحات فنولیک از بین رفتند. تولید حداکثری کالوس با استفاده از غلظت دو برابری 2,4-D نسبت به TDZ و کاهش آن همراه با افزایش غلظت بکار رفته از TDZ در مطالعات Sidky و Zaid (2011) نیز همانند این پژوهش مشاهده شده است (35). اکسین 2,4-D (در غلظتهای (mgl-1) 5 یا بیشتر) مناسبترین تنظیم کنندة رشد برای انگیزش کالوسزایی در نخل خرماست (15، 36).
از اکسینها به تنهایی یا همراه با سایر سیتوکینینها در القای جنینزایی در خرما استفاده شده است (10، 11، 12، 14، 37، 41، 45). به نظر میرسد سطوح کمتر 2,4-D استفاده شده در محیط کالوسزایی، به القای جنین در کالوسها کمک کرده است (36). بر اساس مطالعات Norgaard و Krogstrup (1991)، 2,4-D فقط در مرحله انگیزش جنینزایی لازم است و در بعضی موارد،2,4-D و دیگر اکسینها مانع از جنینزایی سوماتیکی خواهند شد (28). همچنین McClintock (1984) گزارش داد که افزایش غلظت 2,4-D در محیط کشت، باعث افزوده شدن تنوع سوماکلونال در انگور (Vice versa) میشود (25). از آنجا که یکی از مشکلات تکثیر کشت بافتی خرما، بروز تنوع سوماکلونال در گیاهچههای حاصل میباشد (33)، پس در این پژوهش محیط کشت کالوسزایی حاوی حداقل اکسین و سیتوکینین بکار رفت و محیط کشت القای جنین فاقد تنظیم کنندة رشد بود، تا از اثرات منفی حضور اکسین فنوکسی 2,4-D که محرکی قوی در القاء کالوس میباشد، جلوگیری شده و احتمال ایجاد تنوع سوماکلونال در نتاج کشت بافتی خرما کاهش یابد.
نوع منابع کربوهیدرات و همچنین غلظت آنها روی توانایی سلولها برای القای جنینزایی سوماتیکی و تکامل آنها مؤثر است (40، 20). مطابق نتایج بدست آمده از کاهش مقدار ساکارز مصرفی برای تکامل جنینهای تولیدی، به نظر میرسد در محیط القای جنین، وجود فشار اسمزی ناشی از غلظت بالای ساکارز، ابتدا باعث افزایش غلظت مواد درون سلولی و بهبود جنینزایی شده است، اما در ادامه به علت تجمع مواد قندی زیاد در سلولها و جذب آب بیشتر، توانایی جنینزایی کاهش یافته است. Veramendi و Novarro (1996) در مطالعات خود روی تأثیر شرایط فیزیکی محیط کشت و غلظت ساکارز بر جنینزایی سوماتیکی نخل خرما، با اذعان بر اینکه شرایط فیزیکی محیط کشت، غلظت و گرسنگی ساکارز از عوامل مهم در تکامل جنین است، نتیجه گرفتند که بهترین شرایط برای تکامل جنین در محیط کشت مایع (تکان در rpm 100 برای 2 هفته) و بدون ساکارز میباشد (41). در نتیجه برای تکامل جنینها از کاهش مقدار ساکارز مصرفی استفاده شد، که تنها در تمایز جنینها تا مرحله کوتیلدونی مؤثر بود. لذا پیشنهاد میشود که با استفاده از مواد اسمززا مانند سوربیتول این روند را حفظ نمود و جنینزایی در کالوسها را افزایش داد، همان طور که Hassan و Taha (2012) نشان دادند در طول مرحله تکثیر و جوانهزنی جنین سوماتیکی حاصل از مریستم رأسی نخل خرما، بالاترین تعداد جنینهای جوانهزده با استفاده از
(gl-1) 2/19 ساکارز + (gl-1) 4/38 سوربیتول به دست میآید (19).
نتایج این تحقیق بیانگر تأثیر غلظت تنظیمکنندههای رشد در القاء کالوس، تشکیل کالوس جنینزا از مریستم رأس ساقه پاجوش استعمران و تسریع تشکیل کالوس جنینزا بود و بهترین ترکیب (mgl-1) 10 2,4.D همراه با (mgl-1)5 TDZ برای جنین زایی در این رقم بود. همچنین مشخص شد که میزان تولید کالوس جنینزا و مدت زمان لازم برای سپری شدن این فرایند تحت تأثیر ترکیبات محیط کشت شامل مقدار زغال فعال، حضور آسکوربیک و سیتریک اسید و همچنین نوع تنظیمکنندههای رشدی اضافه شده میباشد. برای القای جنینزایی و ایجاد تمایز به جنین کوتیلدونی میتوان از محیط کشت فاقد تنظیمکنندة رشد و نیز کاهش مقدار منبع کربن استفاده کرد.
(علمی)', './data/plant/coversheet/921524568338.jpg'))
دوره 31، شماره 1
اردیبهشت 1397صفحه 24-34
- تاریخ دریافت: 05 مهر 1394
- تاریخ بازنگری: 16 آبان 1395
- تاریخ پذیرش: 16 اسفند 1395