Document Type : Research Paper
Author
University of Tehran
Abstract
Abstract:The present research is an attempt to study certain responses of some accessions of saffron (Crocus sativus L.) to salinity and ameliorative effects of salicylic acid. For this purpose, the effect of four concentrations (0, 100, 200 and 300 mM) of NaCl on some biochemical parameters in leaves of saffron collected from different regions of Iran (Natanz, Deyhook, Ghaenat) have been studied. For this purpose the effect of foliar application of salicylic acid with two concentrations (0.5 and 1 mM) has also been investigated. Our results showed that the contents of hydrogen peroxide, malondialdehyde and proline increased in all accessions under salinity stress and salicylic acid reduced them in Natanz. Activity of antioxidant enzymes, peroxidase, catalase, ascorbat peroxidase, polyphenol oxidase and superoxide dismutase in three accessions was measured. In Natanz the activities of antioxidant enzymes increased at first and then decreased and salicylic acid treatment reduced the activities of the enzymes. In Ghaenat the highest activities of enzymes was detected under maximum salinity and salicylic acid (1mM) reduced the activities of the enzymes. The obtained results of this analysis demonstrated that Ghaenat is the most resistant accession and salicylic acid could improve oxidative damage in saffron under salt stress.
Keywords
Main Subjects
بررسی مقایسه ای پاسخ های بیوشیمیایی جمعیت های مختلف زعفران مزروعی به تنش شوری و نقش سالیسیلیک اسید در بهبود اثر تنش
سارا ترابی پاشایی1، وحید نیکنام1*، حسن ابراهیم زاده1 و گل اندام شریفی2
1 تهران، دانشگاه تهران، پردیس علوم، دانشکده زیست شناسی، قطب تبارزائی موجودات زنده ایران
2 تهران، بنیاد دانشنامه نگاری ایران
تاریخ دریافت: 18/6/94 تاریخ پذیرش: 11/5/95
چکیده
در پژوهش حاضر اثر تنش شوری با غلظت های 0، 100، 200 و 300 میلی مولار کلرید سدیم بر برخی پارامترهای بیوشیمیایی در برگ سه جمعیت زعفران مزروعی (نطنز، قائنات، دیهوک) مورد مقایسه قرار گرفت و اثر بهبود دهندگی سالیسیلیک اسید به صورت افشانه در دو غلظت 5/0 و 1 میلی مولار مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج نشان دادکه در هر سه منطقه محتوای پراکسید هیدروژن، مالون دی آلدئید و پرولین در گیاهان تنش دیده افزایش یافت و تیمار سالیسیلیک اسید در منطقه نطنز باعث کاهش آنها شد. در منطقه نطنز فعالیت زیمایه های پاداکساینده (پراکسیداز، کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز، پلی فنول اکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز) ابتدا افزایش و سپس کاهش یافت و تیمار سالیسیلیک اسید با هر دو غلظت منجر به کاهش فعالیت در گیاهان تنش دیده شد. در جمعیت قائنات بیشترین فعالیت زیمایه ها در بالاترین غلظت نمک مشاهده شد. سالیسیلیک اسید با غلظت 1 میلی مولار فعالیت زیمایه ها را کاهش داد. بطور کلی به نظر می رسد جمعیت قائنات مقاوم ترین جمعیت است و سالیسیلیک اسید می تواند در گیاهان تحت تیمار سدیم کلرید منجر به بهبود تنش اکسایشی ناشی از شوری شود.
واژه های کلیدی: تنش، شوری، زعفران، سالیسیلیک اسید، زیمایه های پاد اکساینده
* نویسنده مسئول، تلفن: 61113637-021، پست الکترونیکی: vniknam@khayam.ut.ac.ir
مقدمه
زعفران مزروعی (Crocus sativus L.) گیاهی علفی از تیره زنبقیان است. زعفران به عنوان گرانترین محصول کشاورزی و دارویی جهان جایگاه ویژه ای در بین محصولات صنعتی و صادراتی ایران دارد و در حال حاضر ایران جزو بزرگترین تولید کننده ها و صادر کننده های زعفران در جهان است و بیش از 80 درصد تولید جهانی این محصول گرانبها به ایران اختصاص دارد (1).
رشد و عملکرد گیاهان زراعی در بسیاری از مناطق دنیا توسط تنش های زیستی و غیرزیستی محدود می شود، به طوریکه تحت تاثیر تنش های غیر زیستی، عملکرد گیاهان زراعی در سراسر جهان 50% ظرفیت ژنتیکی آنها است (28). امروزه شوری خاک یکی از مهمترین تنش های غیر زیستی است که بر تولید و کیفیت محصولات کشاورزی تاثیر نامطلوب دارد. سمیت یونی و تنش اسمزی که در شرایط تنش شوری ایجاد می شود، منجر به بر هم خوردن تعادل متابولیسمی سلول شده و در نتیجه آن تنش اکسایشی رخ می دهد (50). تنش اکسایشی یک پدیده فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی پیچیده است که حاصل تولید بیش از اندازه و تجمع انواع فعال اکسیژن می باشد و در گیاهان عالی، تحت تنش های زیستی و غیر زیستی رخ می دهد (18). انواع فعال اکسیژن علاوه بر آسیبی که به یاخته می رسانند، تحت شرایط تنش به عنوان پیک ثانویه عمل کرده و نقش مهمی در انتقال پیام های تنش ایفا می کنند(25). به منظور کم کردن آسیب های ناشی از تنش های اکسیداتیو، گیاهان مجهز به سازگان دفاعی پاداکسایشی هستند که شامل ترکیبهای غیر زیمایه ای مانند کاروتنوئید، توکوفرول، فلاوونوئیدها و همچنین ترکیبهای زیمایه ای مانند سوپراکسید دیسموتاز(SOD)، کاتالاز(CAT)، پراکسیداز (POX)، آسکوربات پراکسیداز (APX) و پلی فنل اکسیداز (PPO) هستند.گیاهان با سطح بالای پاداکساینده ها دارای مقاومت بالایی به آسیب اکسیداتیو می باشند (43). به هرحال به نظر می رسد یک سازوکار مفید برای تحمل شوری در گیاهان بایستی بر اساس اطلاع از سازوکارهای بیوشیمیایی در گیر در شوری باشد. در صورت شناخت اساس فیزیولوژیکی مقاومت به تنش شوری، متخصصین به نژادی می توانند از این صفات به منظور یک شاخص گزینشی استفاده کنند.
سالیسیلیک اسید یا ارتوهیدروکسی بنزوئیک اسید یک ترکیب فنلی است که در تنظیم فرایندهای فیزیولوژیکی گیاه نقش دارد (36). ترکیبات فنلی به عنوان پاداکساینده های موثر در گیاهان در تنش های غیر زیستی از قبیل نور بالا و اشعه UV و یا در پاسخ به آلودگی فلزات سنگین افزایش می یابند (46). ترکیبات فنلی توانایی همبند کردن فلزاتی مانند مس را دارند و در نتیجه باعث افزایش تحمل گیاهان در مقادیر بالای فلزات سنگین می شوند (30). علاوه بر این، گروه های هیدروکسیل موجود در ترکیبات فنلی با خاصیت دهندگی یک پروتون و الکترون، به عنوان جاروبگر در تجزیه (ROS) نقش دارند (22). براساس بسیاری از تحقیقات سالیسیلیک اسید می تواند تحمل تنش را تسهیل کرده و بهبود ببخشد (40). در همین رابطه، خیساندن دانه های گندم در محلول SA حفاظت را هم در مقابل شوری و هم خشکی بهبود می بخشد (9). همچنین گزارش شده است که سالیسیلیک اسید حفاظت آنتی اکسیدانی را افزایش می دهد (49) و مانع تجمع یونهای Na+ و Cl- می شود (20).
با توجه به اینکه بخش اعظم زعفران مصرفی جهان در ایران تولید می شود و از طرفی بسیاری از مناطق ایران را زمین های خشک و نیمه خشک تشکیل داده و از ویژگی های این گونه مناطق، تبخیر زیاد و نزولات جوی اندک است که منجر به تجمع املاح مختلف در لایه های سطحی خاک می گردد (2)، بررسی پاسخ این گیاه مهم اقتصادی به شوری اهمیت فراوان دارد. این پژوهش با هدف بررسی مقایسه ای برخی پاسخ های بیوشیمیایی به تنش شوری در سه جمعیت مختلف زعفران در ایران و با تاکید بر انتخاب مقاوم ترین جمعیت انجام شد. بعلاوه اثر سالیسیلیک اسید به عنوان یک تنظیم کننده بر بهبود اثرات مضر تنش شوری مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
در این پژوهش بنه های زعفران از سه منطقه ایران شامل نطنز(شهرستانی از استان اصفهان در مرکز ایران)، قائنات (شهرستانی از خراسان جنوبی در شرق ایران) و دیهوک ( از توابع شهرستان طبس در غرب خراسان جنوبی در شرق ایران که پیشتر جزئی از استان یزد بوده است) تهیه شدند. با توجه به اینکه بیشترین مقدار زعفران ایران در استان خراسان تولید می شود، دو جمعیت از مناطق مختلف خراسان جنوبی و یک جمعیت از استان اصفهان، با فاصله جغرافیایی مناسب برای مقایسه میزان مقاومت آنها به تنش شوری انتخاب شد. اول مهر ماه بنه های زعفران در پرلیت کاشته شد و به مدت 15 روز یک روز در میان با آب معمولی آبیاری شد. پس از جوانه زنی بنه ها و مشاهده برگهای سبز زعفران، گیاهان به مدت یک هفته تحت غذادهی با محلول غذایی 2/1 هوگلند قرار گرفتند. سپس تیمارهای شوری با غلظتهای (صفر، 100، 200 و 300 میلی مولار) کلرید سدیم محلول در هوگلند2/1 اضافه و اعمال شد. به منظور جلوگیری از تجمع نمک پس از دو بار اعمال تیمار تنش شوری یک بار شست و شو با آب مقطر صورت گرفت و همچنین پیش از اعمال تیمار 100 میلی مولار، به منظور ممانعت از ایجاد شوک اسمزی اولین تیمار تنش از 50 میلی مولار NaCl شروع شد. پس از رسیدن به تیمار 300 میلی مولار دو هفته بعد اقدام به برداشت گیاه شد و در طی دو هفته آخر دو غلظت 5/0 و 1 میلی مولار سالیسیلیک اسید همراه با تنش شوری به صورت تیمار خارجی، دو بار و با فاصله یک هفته روی برگ ها بصورت افشانه( اسپری) استفاده شد. پس از برداشت، نمونه ها بلافاصله در ازت مایع منجمد و تا زمان انجام آزمایش ها در فریزر 70- درجه سانتی گراد نگهداری شد.
پراکسید هیدروژن: به منظور سنجش محتوای پراکسید هیدروژن ، 1/0 گرم بافت تر برگ در حمام یخ با 5/2 میلی لیتر محلول تری کلرو استیک اسید 1/0% (w/v) ساییده شد و سپس با سرعت 12000 دور به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شد. 5/0 میلی لیتر از محلول روشناور به 5/0 میلی لیتر بافر پتاسیم فسفات 10 میلی مولار با 7=pH و 1 میلی لیتر پتاسیم یدید 1 مولار اضافه شد و سپس جذب آن در 390 نانومتر خوانده شد و محتوای این ماده به صورت میکرومول بر گرم وزن تر گزارش شد (29).
مالون دی آلدئید: 2/0 گرم بافت تر برگ در 2 میلی لیتر تری کلرواستیک اسید 1/0 درصد عصاره گیری و به مدت 10 دقیقه در 13000 دور در دمای محیط سانتریفیوژ شد. 1 میلی لیتر از روشناور با 2 میلی لیتر از محلول 20 درصد تری کلرواستیک اسید محتوی 5 درصد تیوباربیتوریک اسید مخلوط شد و سپس به مدت 30 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی گراد نگهداری و بلافاصله به حمام یخ منتقل شد. نمونه ها مجددا به مدت 10 دقیقه در 10000 دور سانتریفیوژ شدند. جذب نمونه ها در طول موج 532 و 600 نانومتر ثبت شد. محتوای مالون دی آلدئید با استفاده از اختلاف بین طول موج های جذبی و ضریب خاموشی 155 میلی مول بر سانتی متر محاسبه شد (45).
پرولین: 5/0 گرم ماده تر برگ با 10 میلی لیتر محلول سولفوسالیسیلیک اسید 3 % سائیده و همگن شد. به 2 میلی لیتر از عصاره حاصل، 2 میلی لیتر اسید نین هیدرین و 2 میلی لیتر استیک اسید خالص اضافه شد و به مدت یک ساعت در بن ماری در دمای 100 درجه قرار داده و سپس سریعا به حمام آب یخ منتقل شد. جذب فاز رنگی در طول موج 520 نانومتر به کمک اسپکتروفتومتر خوانده شد و مقدار پرولین با استفاده از منحنی استاندارد محاسبه گردید (13).
عصاره گیری جهت سنجش فعالیت زیمایه ای: به این منظور 3/0 گرم از ماده تر برگ با 5 میلی لیتر بافر تریس- کلریدریک اسید با pH 8/6 در حمام یخ ساییده شد و سپس به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه با سرعت 13000 دور سانتریفیوژ شد. حجم روشناور حاصل اندازه گیری و سپس در دمای 70 – درجه سانتی گراد نگهداری شد.
تهیه بافر Tris-HCl: برای تهیه 200 میلی لیتر بافر تریس (وزن مولکولی 14/121 گرم)، ابتدا 288/24 گرم تریس در 100 میلی لیتر آب مقطر حل شد و پیش از آنکه به حجم 200 میلی مولار برسد، توسط HCl، محلول در 8/6= pH تنظیم شد.
فعالیت زیمایه سوپراکسید دیسموتاز (SOD): میزان فعالیت زیمایه سوپراکسید دیسموتاز با قابلیت آن در بازدارندگی واکنش احیایی فتوشیمیایی نیتروبلوتترازولیوم NBT)) تعیین می شود. در این روش، محلول واکنش شامل بافر فسفات 50 میلی مولار باpH 5/7، متیونین 13 میلی مولار، 1/0 میلی مولار EDTA و ریبوفلاوین 75 میکرومولار می باشد که در تاریکی کامل نگهداری شد. در دو کووت شیشه ای 3 میلی لیتر از محلول فوق بدون عصاره زیمایه ای ریخته شد، یکی دور از نور در داخل دستگاه قرار داده شد و دیگری در حضور نور به عنوان شاهد در نظر گرفته شد. پس از اینکه لوله شاهد در 30 سانتی متری نور فلوئورسنت قرار گرفت، هر دو دقیقه یک بار جذب محلول در مد فتومتریک و طول موج 560 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر خوانده شد. این روش بر اساس تبدیل NBT به فورمازان در حضور نور و تشکیل رنگ است. در صورتیکه سوپراکسید دیسموتاز در محیط وجود داشته باشد، از انجام واکنش مذکور ممانعت کرده و ظهور رنگ را کاهش می دهد. مشاهده شد که پس از 16 دقیقه جذب ثابت ماند. در این مرحله، در لوله های دیگر 3 میلی لیتر از محلول فوق و 100 میکرولیتر عصاره زیمایه اضافه گردید و به مدت 16 دقیقه در مقابل نور قرار داده و جذب آنها در طول موج 560 نانومتر خوانده شد. یک واحد فعالیت زیمایه ای مقداری از زیمایه است که موجب 50 درصد ممانعت احیای NBT در 560 نانومتر می شود. میزان فعالیت زیمایه برحسب یک واحد در دقیقه به ازای میلی گرم پروتئین محاسبه شد (19).
فعالیت زیمایه پراکسیداز: ابتدا 4 میلی لیتر بافر استات سدیم 200 میلی مولار با pH=5 همراه با 400 میکرولیتر آب اکسیژنه 3 درصد و 200 میکرولیتر بنزیدین 20 میلی مولار در متانول 50 درصد و 50 میکرولیتر بافر Tris-HClبه یک کووت شیشه ای اضافه شد و به وسیله آن دستگاه اسپکتروفتومتر در مد سینتیک در طول موج 530 نانومتر صفر شد. برای اندازه گیری فعالیت پراکسیداز، به جای 50 میکرولیتر بافر Tris-HCl، 50 میکرولیتر از عصاره زیمایه استخراج شده اضافه شد و در نهایت فعالیت زیمایه بر حسب واحد زیمایه ای در میلی گرم پروتئین محاسبه شد (6).
فعالیت زیمایه پلی فنل اکسیداز: ابتدا 5/2 میلی لیتر از بافر فسفات پتاسیم با 8/6 =pHکه دمای آن 40 درجه بود به همراه 200 میکرولیتر پیروگالول و 20 میکرولیتر بافر Tris-HCl برای صفر کردن دستگاه اسپکتروفتومتر در مد سینتیک و طول موج 430 نانومتر استفاده شد. برای اندازه گیری فعالیت زیمایه به جای Tris-HCl، 20 میکرولیتر عصاره زیمایه ای اضافه شد و بعد از 60 ثانیه فعالیت زیمایه بر حسب تغییرات جذب در دقیقه رسم شد و در نهایت فعالیت زیمایه ای در میلی گرم پروتئین گزارش شد (37).
فعالیت زیمایه آسکوربات پراکسیداز: طبق این روش محلول آزمایش شامل 2 میلی لیتر بافر 05/0 میلی مولار فسفات پتاسیم با 7 pH=، 200 میکرولیتر آب اکسیژنه 3 درصد و 200 میکرولیتر آسکوربات 50 میکرومولار و 50 میکرولیتر عصاره زیمایه ای بود. آسکوربات در اثر واکنش زیمایه ای به صورت اکسید شده در می آید و فعالیت زیمایه بر اساس کاهش جذب در طول موج 290 نانومتر و با استفاده از ضریب خاموشی mM-1.cm-1 8/2 محاسبه شد (15)
فعالیت زیمایه کاتالاز: مطابق با این روش مخلوط آزمایش شامل 625 میکرولیتر بافر فسفات پتاسیم 50 میلی مولار با pH برابر 7، 75 میکرولیتر آب اکسیژنه 3 درصد و 10 میکرولیتر عصاره زیمایه ای بود. در نمونه شاهد 10 میکرولیتر Tris-HCl اضافه و دستگاه صفر شد. منحنی تغییرات در طول موج 240 نانومتر با استفاده از ضریب خاموشیmM-1 cm-1 4/39 تعیین گردید و توسط دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. فعالیت بر حسب واحد زیمایه ای در میلی گرم پروتئین محاسبه شد (11).
آنالیزهای آماری: تمام آزمایش های این پژوهش در قالب طرح کاملا تصادفی با 4 تکرار انجام شد. دادههای حاصل از بررسیها به روش آنالیز واریانس یک طرفه توسط نرم افزار آماری SPSS (نسخه 19) مورد تجزیه وتحلیل قرار گرفت. مقایسه میانگین دادهها در سطح خطای 5 % ( 5%> P) با آزمون دانکن (DMRT) انجام شد. اعدادی که دارای حروف مشابه هستند از نظر آماری تفاوت معناداری ندارند.
نتایج
اولین پارامترهای مورد بررسی در این پژوهش وزن تر و وزن خشک و محتوای نسبی آب برگ گیاه بود. بر اساس نتایج حاصل وزن تر، وزن خشک و محتوای نسبی آب برگ ها در مدت زمان این آزمایش ها (15 روز بعد از تیمار ها) هیچ تغییر معنی داری را نشان ندادند. لذا نتایج این پارامترها در مقاله ارائه نشده است. در ادامه جهت بررسی پاسخ های فیزیولوژیکی و بیوشیمیائی جمعیت های مختلف زعفران در این پژوهش، محتوای پراکسید هیدروژن و مالون دی آلدئید (MDA) برگ به عنوان شاخص های تنش و محتوای پرولین به عنوان مهمترین اسمولیت سلولی جهت تنظیم اسمزی سلول های گیاه و نیز به عنوان یک ترکیب موثر در بهبود اثرات تنش و آنزیم های آنتی اکسیدان به عنوان سیستم دفاعی گیاه در برابر تنش اکسیداتیو حاصل از شوری مورد ارزیابی قرار گرفت (جدول های 1 تا 3).
جدول 1- میانگین محتوای پراکسید هیدروژن(H2O2)، پرولین، مالون دی آلدئید (MDA) و فعالیت زیمایه های پاداکساینده سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز(CAT)، پراکسیداز(POX)، آسکوربات پراکسیداز (APX)، پلی فنل اکسیداز (PPO) در برگ زعفران منطقه نطنز. N: نمک و S سالیسیلیک اسید می باشد. در هر گروه تیمارها با حروف یکسان اختلاف معناداری ندارند.
PPO (U mg-1 Protein) |
APX (U mg-1 Protein) |
POX (U mg-1 Protein) |
CAT (U mg-1 Protein) |
SOD (U mg-1 Protein) |
MDA (mmol g-1 FW) |
Proline (mmol g-1 FW) |
H2O2 (mmol g-1 FW) |
تیمار |
0014/0a |
49/10cd |
0042/0a |
37/1b |
05/0a |
44/2ab |
3/37ab |
19/0a |
N0+S0 |
097/0e |
38/12d |
079/0e |
49/2c |
043/0a |
89/2bcd |
3/140f |
38/0cd |
N0+S0.5 |
0181/0abc |
09/2a |
008/0a |
72/0a |
059/0a |
24/3cd |
83/96e |
40/0cd |
N0+S1 |
178/0f |
34/18e |
34/0g |
56/3d |
24/0d |
32/3cd |
6/106e |
43/0d |
N100+S0 |
086/0e |
26/6b |
09/0ef |
93/1bc |
26/0d |
58/2ab |
16/99e |
26/0abc |
N100+S0.5 |
041/0cd |
7/1a |
097/0f |
72/1b |
18/0c |
8/2ab |
08/109e |
22/0ab |
N100+S1 |
021/0abc |
45/8c |
015/0ab |
78/1b |
13/0b |
58/3d |
52bc |
31/0a-d |
N200+S0 |
028/0bc |
28/2a |
034/0c |
64/1b |
11/0b |
26/2a |
58/55bc |
35/0abc |
N200+S0.5 |
007/0ab |
54/1a |
054/0d |
62/0a |
15/0b |
3/2a |
4/20a |
36/0abc |
N200+S1 |
054/0d |
6/5b |
025/0bc |
58/1b |
66/0f |
3bcd |
16/104e |
33/0a-d |
N300+S0 |
008/0ab |
55/1a |
0041/0a |
41/0a |
26/0d |
94/2bcd |
106e |
33/0a-d |
N300+S0.5 |
004/0ab |
92/0a |
012/0ab |
31/0a |
42/0e |
8/2abc |
66cd |
21/0ab |
N300+S1 |
پراکسید هیدروژن : مقایسه محتوای پراکسید هیدروژن در سه منطقه مختلف در مواجهه با تنش نشان داد که بیشترین میزان، مربوط به منطقه نطنز بود و لذا می توان نتیجه گرفت که حساسیت گیاه به تنش شوری در این منطقه بالا است. با توجه به نقش پراکسید هیدروژن در ترارسانی علامت تنش، بیشترین فعالیت زیمایه های پاداکساینده در منطقه نطنز در شوری 100 میلی مولار (جدول1) و در منطقه قائنات در 300 میلی مولار (جدول2 )که محتوای پراکسید هیدروژن بالایی داشتند مشاهده شد.
مالون دی آلدئید (MDA): محتوای مالون دی آلدئید در گیاهان تنش دیده در هر سه منطقه نسبت به شاهد افزایش یافت (جدول های 1 تا 3). تیمار سالیسیلیک اسید در منطقه نطنز همانطور که در مورد پراکسید هیدروژن مشاهده شد، با هر دو غلظت منجر به کاهش محتوای مالون دی آلدئید شد. در دو منطقه قائنات و دیهوک تیمار سالیسیلیک اسید با هر دو غلظت منجر به افزایش معنی دار محتوای مالون دی آلدئید شد.
جدول 2- میانگین محتوای شاخص های تنش پراکسید هیدروژن(H2O2)، پرولین، مالون دی آلدئید (MDA) و فعالیت زیمایه های پاداکساینده سوپراکسید دیسموتاز(SOD)، کاتالاز(CAT)، پراکسیداز(POX)، آسکوربات پراکسیداز (APX)، پلی فنل اکسیداز (PPO) در برگ زعفران منطقه قائنات. : N نمک و S سالیسیلیک اسید می باشد. در هر گروه تیمارها با حروف یکسان اختلاف معناداری ندارند.
PPO (U mg-1 Protein) |
APX (U mg-1 Protein) |
POX (U mg-1 Protein) |
CAT (U mg-1 Protein) |
SOD (U mg-1 Protein) |
MDA (mmol g-1 FW) |
Proline (mmol g-1 FW) |
H2O2 (mmol g-1 FW) |
تیمار |
0005/0a |
015/0a |
006/0a |
439/0a |
275/0ab |
53/2a |
9/49a |
096/0a |
N0+S0 |
006/0abc |
085/0a |
0268/0a |
979/0bc |
316/0ab |
13/3ab |
32a |
33/0g |
N0+S0.5 |
0185/0de |
082/0a |
0149/0a |
1/1c |
380/0ab |
8/2a |
6/53a |
25/0f |
N0+S1 |
024/0e |
096/0a |
070/0a |
549/0ab |
247/0ab |
83/2ab |
9/114 c |
13/0b |
N100+S0 |
016/0cde |
106/0a |
1/0a |
872/0abc |
696/0b |
87/3cd |
57/82b |
186/0cd |
N100+S0.5 |
0265/0e |
272/0b |
02/0a |
02/1c |
221/0ab |
16/4cd |
92/30a |
176/0c |
N100+S1 |
011/0bcd |
146/0ab |
06/0a |
555/0ab |
066/0a |
89/3cd |
58/187d |
213/0cd |
N200+S0 |
0037/0ab |
423/0c |
16/0a |
91/1de |
553/0ab |
67/3c |
63/40a |
176/0c |
N200+S0.5 |
0197/0de |
46/0cd |
44/0b |
53/1d |
49/0ab |
2/4d |
75/45a |
25/0 ef |
N200+S1 |
060/0g |
45/1e |
98/0c |
74/7f |
01/3c |
21/3b |
12/270ef |
216/0de |
N300+S0 |
0067/0abc |
76/1f |
15/1d |
1/9g |
02/4d |
06/4cd |
53/290f |
263/0f |
N300+S0.5 |
0188/0de |
58/0d |
499/0b |
19/2e |
587/0ab |
71/3c |
12/246e |
227/0de |
N300+S1 |
جدول3 - میانگین محتوای شاخص های تنش پراکسید هیدروژن(H2O2)، پرولین، مالون دی آلدئید (MDA) و فعالیت زیمایه های پاداکساینده سوپراکسید دیسموتاز(SOD)، کاتالاز(CAT)، پراکسیداز(POX)، آسکوربات پراکسیداز (APX)، پلی فنل اکسیداز (PPO) در برگ زعفران منطقه دیهوک.N .: نمک و S سالیسیلیک اسید می باشد. در هر گروه تیمارها با حروف یکسان اختلاف معناداری ندارند.
PPO (U mg-1 Protein) |
APX (U mg-1 Protein) |
POX (U mg-1 Protein) |
CAT (U mg-1 Protein) |
SOD (U mg-1 Protein) |
MDA (mmol g-1 FW) |
Proline (mmol g-1 FW) |
H2O2 (mmol g-1 FW) |
تیمار |
032/0a |
524/0f |
016/0ab |
45/1d |
26/0def |
45/1a |
49/16f |
2/0ab |
N0+S0 |
044/0a |
142/0abc |
019/0ab |
83/0a |
19/0cd |
75/1ab |
10/9abc |
27/0bc |
N0+S0.5 |
048/0a |
247/0d |
045/0abc |
8/1e |
29/0ef |
41/4ef |
95/14bcd |
32/0c |
N0+S1 |
146/0ab |
225/0cd |
006/0a |
96/0ab |
027/0a |
2/2bcd |
76/98g |
13/0a |
N100+S0 |
165/0ab |
413/0e |
068/0cd |
16/1bc |
13/0bc |
70/4f |
44/22d |
28/0bc |
N100+S0.5 |
221/0b |
434/0e |
17/0e |
8/2f |
047/0a |
88/2d |
24/11a-d |
18/0ab |
N100+S1 |
4/0c |
114/0ab |
1/0d |
94/1e |
087/0ab |
57/2cd |
65/69e |
22/0abc |
N200+S0 |
45/0c |
386/0e |
18/0e |
31/5g |
35/0f |
2/4ef |
38/10a-d |
23/0abc |
N200+S0.5 |
056/0a |
223/0cd |
09/0d |
89/1e |
085/0ab |
07/4ef |
23/3ab |
31/0c |
N200+S1 |
618/0d |
199/0bcd |
068/0cd |
96/1e |
0052/0a |
6/1ab |
44/82cd |
31/0c |
N300+S0 |
016/0a |
078/0a |
067/0cd |
88/1e |
25/0def |
1/2abc |
24/1a |
14/0a |
N300+S0.5 |
014/0a |
104/0a |
089/0cd |
72/1e |
24/0de |
69/3e |
4/10a-d |
19/0ab |
N300+S1 |
پرولین: در هر سه منطقه افزایش معنادار پرولین در برگ گیاه تحت تنش نسبت به حالت شاهد مشاهده شد (جدول های 1 تا 3). تیمار سالیسیلیک اسید باعث کاهش معنادار محتوای پرولین به ویژه در منطقه دیهوک شده است. به نظر می رسد تیمار سالیسیلیک اسید باعث بهبود وضعیت گیاه و کاهش شدت تنش شده است و به همین دلیل محتوای پرولین کاهش یافته است.
سوپراکسید دیسموتاز : در منطقه نطنز فعالیت زیمایه سوپراکسید دیسموتاز در برگ گیاهان تنش دیده نسبت به شاهد افزایش یافت. این زیمایه در منطقه قائنات فقط در غلظت 300 میلی مولار نسبت به شاهد افزایش معنا دار داشت در حالیکه در منطقه دیهوک با تیمار تنش شوری کاهش فعالیت این زیمایه مشاهده شد. تیمار سالیسیلیک اسید در منطقه نطنز، با هر دو غلظت، در 300 میلی مولار شوری باعث کاهش معنادار فعالیت زیمایه شد( جدول1). در منطقه قائنات نیز در غلظت 300 میلی مولار شوری، سالیسیلیک اسید با غلظت 1 میلی مولار اثر کاهشی اما با غلظت 5/0 میلی مولار اثر افزایشی داشته است (جدول 2). در منطقه دیهوک سالیسیلیک اسید به ویژه با غلظت 5/0 میلی مولار بر گیاهان تنش دیده اثر افزایشی داشت. سالیسیلیک اسید منجر به افزایش محتوای مالون دی آلدئید و پراکسید هیدروژن در این منطقه شده است که می تواند به عنوان علامتی برای افزایش فعالیت زیمایه عمل کند (جدول 3).
در منطقه نطنز بیشترین فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدان مربوط به غلظت شوری 100 میلی مولار بود و تیمار سالیسیلیک اسید با هر دو غلظت منجر به کاهش معنی دار فعالیت آنها در گیاهان تنش دیده شده است.
در منطقه قائنات فعالیت زیمایه پلی فنل اکسیداز در همه غلظتهای شوری نسبت به شاهد افزایش معنادار داشت و سالیسیلیک اسید با هر دو غلظت باعث کاهش فعالیت آن شد. فعالیت زیمایه های کاتالاز ، آسکوربات پراکسیداز و پراکسیداز در غلظت 300 میلی مولار به طور معناداری نسبت به شاهد افزایش یافت و سالیسیلیک اسید با غلظت 1 میلی مولار فعالیت آنها را کاهش داد اما با غلظت 5/0 میلی مولار منجر به افزایش شد. همانطور که اشاره شد سالیسیلیک اسید با غلظت 5/0 میلی مولار محتوای پراکسید هیدروژن را در غلظت 300 میلی مولار شوری در این منطقه افزایش داد که می تواند به عنوان علامتی جهت افزایش فعالیت زیمایه ای عمل کند.گزارش شده است هر چه میزان فعالیت زیمایه های پاد اکساینده بالاتر باشد گیاه مقاومت بیشتری به تنش شوری دارد. بنابراین به نظر می رسد سالیسیلیک اسید در جمعیت قائنات با غلظت 5/0 میلی مولار موثرتر عمل کرده است.
در منطقه دیهوک فعالیت زیمایه کاتالاز ابتدا کاهش و سپس افزایش یافت (جدول 3). همچنین فعالیت زیمایه های پراکسیداز و پلی فنل اکسیداز با افزایش غلظت شوری نسبت به شاهد افزایش معناداری یافت درحالیکه فعالیت زیمایه آسکوربات پراکسیداز کاهش یافت. تیمار سالیسیلیک اسید با غلظت 5/0 میلی مولار باعث افزایش فعالیت زیمایه کاتالاز در 200 میلی مولار شوری ، افزایش فعالیت زیمایه های پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز در غلظتهای 100 و 200 میلی مولار نمک شد. اما در غلظت 300 میلی مولار شوری، سالیسیلیک اسید با هر دو غلظت منجر به کاهش قابل توجه فعالیت زیمایه های آسکوربات پراکسیداز و پلی فنل اکسیداز شده است .
بحث
در خصوص تاثیر تیمار سالیسیلیک اسید در کاهش محتوای پراکسید هیدروژن می توان گفت که سالیسیلیک اسید با خاصیت دهندگی یک الکترون و یک پروتون در تجزیه انواع فعال اکسیژن عمل می کند (22) و بنابراین می تواند به طور مستقیم در پاکسازی رادیکالها نقش داشته باشد. به نظر می رسد سالیسیلیک اسید در منطقه نطنز با این سازوکار عمل کرده است. از طرف دیگر سالیسیلیک اسید در جمعیت قائنات و همچنین در منطقه دیهوک در همه غلظتهای نمک به جز در 300 میلی مولار شوری، اثر افزایشی بر محتوای پراکسید هیدروژن داشته است. بطور مشابه گزارش شده است که سالیسیلیک اسید در گیاه آرابیدوپسیس منجر به انباشتگی پراکسید هیدروژن می شود و ترکیب اخیر با دخالت در ترارسانی علامت، سبب افزایش سنتز یا فعالیت زیمایه های پاداکساینده می گردد (49).
در خصوص افزایش محتوای پراکسید هیدروژن در غلظت های بالای شوری مانند 300 میلی مولار می توان گفت که این افزایش می تواند به عنوان علامتی جهت افزایش فعالیت زیمایه های پاداکساینده عمل کند.گزارش شده است هر چه میزان فعالیت زیمایه های پاد اکساینده بالاتر باشد گیاه مقاومت بیشتری به تنش شوری خواهد داشت (8).
مالون دی آلدئید یک فراورده سیتوتوکسیک پراکسیداسیون لیپیدی و شاخص تولید رادیکال آزاد و میزان آسیب بافت است (34). سنجش محتوای مالون دی آلدئید، که شاخص افزایش پراکسیداسیون لیپیدی است، اغلب به عنوان روشی برای ارزیابی شدت تنش اکسایشی و درجه حساسیت گیاه به تنش شوری مورد استفاده قرار می گیرد(41). افزایش محتوای مالون دی آلدئید در شرایط تنش خشکی در ذرت (3) و همچنین تحت تنش شوری در گندم نیز مشاهده شده است و بر طبق این گزارش ارقام متحمل گندم ، بیشترین میزان فعالیت زیمایه های پاداکساینده و کمترین میزان مالون دی آلدئید را داشته اند (25). در گیاه ذرت نیز تیمار سالیسیلیک اسید خارجی منجر به کاهش مالون دی آلدئید شده است (20). همچنین گزارش شده است که تیمار سالیسیلیک اسید در شاخه بریده گل سرخ با جلوگیری از پراکسیداسیون لیپیدی پیری گل را به تاخیر می اندازد(4). کاهش محتوای مالون دی آلدئید درمنطقه نطنز احتمالا به دلیل جاروب کردن انواع فعال اکسیژن توسط سالیسیلیک اسید می باشد. گزارش شده است که سالیسیلیک اسید با افزایش محتوای پراکسید هیدروژن و مالون دی آلدئید در ترارسانی علامت تنش نقش دارد و باعث بیان ژن PR-1 می شود (10). احتمال می رود که سالیسیلیک اسید در دو منطقه قائنات و دیهوک چنین اثری داشته است اما جهت نتیجه گیری قطعی اندازه گیری بیان ژن در پژوهش های بعدی پیشنهاد می شود.
بر طبق نتایج ما سالیسیلیک اسید در غیاب تنش شوری در هر دو غلظت منجر به افزایش محتوای مالون دی آلدئید در هر سه جمعیت شده است (جدول های 1 تا 3). لذا می توان نتیجه گرفت که این ترکیب در غیاب تنش شوری منجر به وخیم شدن وضعیت گیاهان و افزایش شدت تنش اکسایشی می شود. در حضور تنش نقش سالیسیلیک اسید (به ویژه در غلظت 5/0 میلی مولار) در کاهش مالون دی آلدئید تنها در جمعیت نظنز به وضوح به چشم می خورد و در سایر جمعیت ها اثر بهبود دهندگی این ترکیب قابل مشاهده نیست. در تطابق با این نتیجه گزارش شده است که سالیسیلیک اسید با غلظت پایین (5/0 میلی مولار) موجب افزایش مقاومت گلرنگ به تنش شوری شده، اما در غلظت های بالاتر (1 میلی مولار) موجب تشدید تنش شوری و در نتیجه کاهش رشد بیشتر گیاه شده است (5).
انباشته شدن پرولین در شرایط تنش که در این پژوهش نیز مشاهده می شود یکی از ویژگی های عمومی در بسیاری از گیاهان تک لپه ای است (8). افزایش محتوای پرولین در دانه رست های بسیاری از گیاهان منجمله برنج تحت تنش شوری نیز گزارش شده است (35). در توافق با نتیجه تحقیق حاضر در گیاه ذرت نیز تیمار سالیسیلیک اسید منجر به کاهش محتوای پرولین شده است (18). در مورد پرولین لازم به ذکر است که این آمینو اسید یک ترکیب با اثرات چندگانه است و علاوه بر نقش آفرینی به عنوان یک اسمولیت سازگار، در تنظیم تعادل اکسید و احیای سلول، در سیگنالینگ و ترارسانی علامت تنش و در محافظت اسمزی از ماکرومولکول های گیاهان نیز شرکت می کند. کاهش محتوای پرولین در گیاه تحت تیمار سالیسیلیک اسید می تواند نشانه خروج گیاه از وضعیت تنش و نشان دهنده نقش سالیسیلیک اسید در بهبود اثرات تنش شوری باشد.
در خصوص تغییرات آنزیم های آنتی اکسیدان تحت تاثیر تنش شوری منجمله در گیاه نخود فرنگی(23) و گوجه فرنگی (26) افزایش فعالیت سوپراکسید دیسموتاز گزارش شده است. در توافق با نتایج تحقیق حاضر در گیاه گندم در تنش کم آبی گزارش شده است که سالیسیلیک اسید با غلظت 3 میلی مولار باعث کاهش فعالیت زیمایه سوپراکسید دیسموتاز می شود اما در غلظت های 1 و 2 میلی مولار اثر افزایشی دارد (42).
کاربرد خارجی سالیسیلیک اسید و پراکسید هیدروژن باعث القای تحمل بالاتر گیاهان سیب زمینی به دمای بالا شده است. این نتایج نشان می دهد که سالیسیلیک اسید ممکن است دارای مسیرهای ترارسانی رسانی علامت مشترک با واسطه تشکیل رادیکال های آزاد اکسیژن باشد. به هر حال حفاظت گیاهان در برابر تنش اکسایشی با افزایش در زیمایه های پاداکساینده مرتبط می باشد و فعالیت این زیمایه ها سطح نهایی رادیکال های آزاد و پراکسید هیدروژن در گیاه را کاهش می دهند (21 ،47).
مقادیر اضافی پراکسید هیدروژن توسط زیمایه هایی نظیر پراکسیداز، کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز و پلی فنل اکسیداز حذف می شود(31). گزارش های متعددی حکایت از افزایش فعالیت زیمایه های پاداکساینده تحت تنش های غیر زیستی دارد (7، 17). به نظر می رسد بالا رفتن فعالیت زیمایه در غلظت پایین شوری و افت آن در غلظت های بالاتر نشانه حساسیت گیاه به غلظت های بالای تنش شوری می باشد. اثر مهاری سالیسیلیک اسید بر زیمایه های پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز در نخود فرنگی (44) ، پلی فنل اکسیداز در گوجه فرنگی (38) و کاتالاز در گیاهان، قارچ ها و جانوران (39) نیز گزارش شده است.
در توافق با افزایش آنزیم کاتالاز در زعفران های منطقه دیهوک در گیاه Cassia angustifolia تحت تنش شوری نیز افزایش فعالیت کاتالاز گزارش شده است (7). به علاوه افزایش فعالیت زیمایه پراکسیداز در ذرت خوشه ای تحت تنش شوری نیز مشاهده شده است (14). در خصوص اینکه سالیسیلیک اسید محتوای پراکسید هیدروژن را در منطقه دیهوک در غلظت 300 میلی مولار کاهش داده است، بنابراین احتمالا سالیسیلیک اسید در غلظت بالای شوری می تواند به طور مستقیم منجر به پاکسازی انواع فعال اکسیژن شود.
به طور کلی در بین سه منطقه مقایسه شده، جمعیت دیهوک زعفران با کمترین محتوای مالون دی آلدئید در شرایط شاهد و تحت غلظت های مختلف شوری به عنوان مقاوم ترین جمعیت زعفران می تواند در نظر گرفته شود و وضعیت دو جمعیت دیگر یعنی نظنز و قائنات تقریباً مشابه است و از حساسیت بیشتری نسبت به تنش شوری برخوردار هستند. با مقایسه تغییرات محتوای پرولین در جمعیت های مختلف زعفران می توان مشاهده کرده که در بین جمعیت های مختلف، افزایش پیوسته، منظم و وابسته به غلظت پرولین در جمعیت قائنات قابل مشاهده است. در مجموع نیز جمعیت قائنات دارای بیشترین محتوای پرولین در بین جمعیت ها می باشد. در دو جمعیت دیگر اگرچه افزایش پرولین تحت تنش شوری در برگ هر سه جمعیت نسبت به شاهد مشاهده می شود ولی این افزایش تحت تنش شوری بصورت پیوسته نیست.
به علاوه جمعیت نطنز زعفران با بالا بودن محتوای مالون دی آلدئید و با کمترین فعالیت زیمایه های پاداکساینده در غلظت بالای شوری حساس ترین و جمعیت قائنات که تنها در بالاترین غلظت تحت تاثیر تنش قرار گرفته است، می تواند مقاوم ترین جمعیت در نظر گرفته شود. احتمال می رود گیاه در جمعیت اخیر، در غلظت های پایین نمک با ساز وکارهای دیگری از جمله پاداکساینده های غیر زیمایه ای به مقابله با تنش شوری بپردازد. نکته مهم اینکه نقش سالیسیلیک اسید در کاهش محتوای مالون دی آلدئید تنها در جمعیت نظنز که حساس ترین جمعیت با توجه به پارامترهای مختلف است به وضوح به چشم می خورد و در سایر جمعیت ها اثر بهبود دهندگی این ترکیب قابل مشاهده نیست. بنابراین پیشنهاد می شود در ادامه این پژوهش، سنجش ترکیبات فنلی، گلوتاتیون، آسکوربات، آلفا توکوفرول انجام شود. پاداکساینده های غیر زیمایه ای ممکن است به عنوان ترکیبات احیا کننده عمل کنند یعنی زنجیر رادیکال های آزاد را از هم بگسلند و یا از تشکیل انواع فعال اکسیژن جلوگیری کنند (43). لذا سالیسیلیک اسید به عنوان ترکیب فنلی می تواند به طور مستقیم در جاروب کردن انواع فعال اکسیژن نقش داشته باشد (22). در جمعیت نطنز با کاهش محتوای پراکسید هیدروژن و مالون دی آلدئید و از طرفی کاهش فعالیت زیمایه ها با این نقش ظاهر شده است اما در جمعیت های دیهوک و قائنات، غلظت 5/0 میلی مولار باعث افزایش محتوای مالون دی آلدئید و پراکسید هیدروژن شده که متعاقبا فعالیت برخی از زیمایه های پاداکساینده ها را افزایش داده است. بنابراین احتمال می رود که سالیسیلیک اسید در جمعیت های اخیر در رابطه با ترارسانی علامت تنش در پاسخ گیاه نقش داشته است.
1-سرمدنیا، غ. ح. (1372). اهمیت تنش های محیطی در زراعت. مقالات کلیدی اولین کنگره زراعت و اصلاح نباتات ایران، دانشگاه کشاورزی کرج، دانشگاه تهران: 169- 157
2- بینا، غ. 1381. بررسی اثر سرما و جیبرلین بر توده های محلی زعفران در شهرهای قائن، بیرجند و گناباد. اولین جشنواره زعفران- قائن. صفحه 25
3- دولت آبادیان، آریا، مدرس ثانوی، سید علی محمد، شریفی، مظفر، (1388). اثر تنش کم آبی و محلول پاشی اسید آسکوربیک بر میزان فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدان و برخی تغییرات بیوشیمیایی در برگ ذرت دانه ای (Zea maize L.). مجله زیست شناسی ایران، 22 (3): 407- 422.
4- گرایلو، سمیه، قاسم نژاد، محمود، شیری، محمد علی. (1393). تاثیر تیمار کوتاه مدت سالیسیلیک اسید در به تاخیر انداختن پیری گل های شاخه بریده رز (Rosa hybrid) رقم یلوآیسلند. مجله پژوهش های گیاهی. 27 (2):299-309
5- دانشمند، فاطمه، جواد آروین، محمد، کرامت، بتول (1393). تغییرات ایجاد شده توسط سالیسیلیک اسید در گیاهان گلرنگ (Carthamus tinctorius L.) تحت تنش شوری. مجله پژوهش های گیاهی. 27 (2):204-215