Document Type : Short Paper
Abstract
Copper oxide nanoparticles are widely used in industrial production, are released in the environment and can induce toxicity to aquatic organisms. In this study, effects of copper oxide nanoparticles on growth, total protein content, chlorophylls and carotene of Chlorella vulgaris in various concentrations (control, 0/01, 1. 10 and 100 mg/l) were investigated for six days. The results showed that the number of algae cells and total protein significantly decreased with increasing concentrations of copper oxide nanoparticles (P<0/05). Copper oxide nanoparticles increased the percentage interception rate in Chlorella. The total chlorophyll, chlorophyll a, b and carotene had significant reduction in different concentrations of copper oxide nanoparticles compared with control group, indicating the impact of nanoparticles on photosynthesis. There is a significant positive correlation between the growth of algae cells (Chlorella vulgaris) with chlorophyll a, chlorophyll b, total chlorophyll and carotene. The investigation concluded that copper oxide nanoparticle reduced growth and photosynthesis in Chlorella vulgaris.
Keywords
Main Subjects
مقاله کوتاه
تاثیر نانو ذره اکسید مس بر رشد، مقدار پروتئین، کلروفیلها و کاروتن جلبک گونه (Chlorella vulgaris)
محدثه میری* و هاشم خندان بارانی
زابل، دانشگاه زابل، پژوهشکده تالاب بین المللی هامون، گروه مدیریت اکوسیستمهای طبیعی
تاریخ دریافت: 7/6/94 تاریخ پذیرش: 23/9/94
چکیده
نانو ذرات اکسید مس به طور گسترده در تولیدات صنعتی استفاده میشوند که رهایش این نانو ذرات به محیط زیست باعث سمیت برای ارگانیسمهای آبزی میشود. در این مطالعه اثرات نانو ذره اکسید مس بر روی رشد، پروتئین کل، کلروفیلها و کاروتن جلبک گونه (Chlorella vulgaris) در غلظتهای مختلف (شاهد، 1/0، 1، 10 و 100 میلی گرم بر لیتر) به مدت شش روز مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که تعداد سلولها و میزان پروتئین کل جلبک با افزایش غلظت نانو ذره اکسید مس به طور معنیدار کاهش یافته است (05/0>P). نانو ذره اکسید مس باعث افزایش درصد نرخ بازدارندگی در جلبک Ch. vulgaris شده است. میزان کلروفیل کل، کلروفیل a، b و کاروتن در غلظتهای مختلف نانو ذره اکسید مس در مقایسه با گروه شاهد کاهش معنیداری داشته، که نشان دهنده تاثیر این نانو ذره بر فتوسنتز میباشد. همبستگی مثبت و معنیدار بین رشد سلولهای جلبک گونه (Ch. vulgaris) با کلروفیلa، کلروفیلb، کلروفیل کل و کاروتن وجود دارد. طبق بررسیهای انجام شده میتوان نتیجه گرفت که نانو ذره اکسید مس رشد، تکثیر و فتوسنتز را در جلبک گونه Ch. vulgaris کاهش داده است.
واژههای کلیدی: Chlorella vulgaris، نانو ذره، CuO.
* نویسنده مسئول، تلفن: 09151960554، پست الکترونیکی: mirimohadeseh@uoz.ac.ir
مقدمه
در حال حاضر نانوتکنولوژی در مقیاس بزرگی از تولیدات صنعتی و خانگی استفاده میشود و حتی در برنامه های آینده نیز کاربرد بیشتری پیدا خواهد کرد (20). نانو ذره اکسید مس به علت داشتن هدایت گرمایی خوب به عنوان مایع انتقال حرارت در ابزار و ماشین آلات استفاده میشود (6). همچنین نانو ذره اکسید مس به عنوان کاتالیزور، ابر رساناها، مواد ترموالکتریک، مواد سنسور، شیشه، سرامیک و دیگر مواد کاربرد دارد (26). به طور کلی از این نانو ذره به طور گسترده استفاده میشود. در نهایت این نانو مواد به صورت زباله های خانگی و صنعتی به بدنه آبی زمین وارد خواهند شد (4).
جلبکها تولیدکنندگان اولیه هستند که خط اولیه زنجیره غذایی اکوسیستم و منشا تجمع زیستی را تشکیل میدهند و نقش مهمی در تعادل اکوسیستم دارند. جلبکها به دلیل حساسیت زیاد، کوتاه بودن چرخه رشد، قابلیت کشت به صورت جداگانه و مشاهده اثرات سمی در سطح سلولی به عنوان یکی از فاکتورهای حساس به مواد سمی در محیط زیست مورد استفاده قرار میگیرند (22). جلبک Chlorella به علت داشتن مقاومت بالا معمولا برای ارزیابی مواد سمی و مضر به کار میرود (8). این ارگانیسمها به حضور گونههای مختلف مس در محیط بسیار حساس میباشند (7، 21). در حال حاضر مطالعه اثرات سمی نانو ذره اکسید مس بر روی جلبک کلرلا اندک است. بنابراین در این مطالعه اثرات سمی نانو ذره اکسید مس بر جلبک گونه (Ch. vulgaris) با هدف ارزیابی ایمنی مواد نانو مورد بررسی قرار گرفته است تا شواهدی بر استفاده از نانو مواد استاندارد فراهم گردد.
مواد و روشها
آماده سازی نانو ذره اکسید مس: نانو ذرات اکسید مس (CuO-NPs) مورد استفاده در این تحقیق با نام تجاری (US NANO) از شرکت پیشگامان نانو مواد ایران خریداری شد. سایز نانو ذرات 40 نانومتر میباشد. ابتدا محلول همگنی از نانو ذرات در محیط کشت Guillard F/2 (23) تهیه شد و قبل استفاده توسط دستگاه التراسونیک مدل (Bandelin)، فرایند التراسونیک به مدت 30 دقیقه صورت گرفت (4، 9). این فرایند برای تهیه سوسپانسیونی همگن از نانو ذره اکسید مس انجام شد.
کشت جلبک: جلبک سبز گونه (Ch. vulgaris) در محیط کشت Guillard F/2 و شرایط آزمایشگاهی با دمای 25 درجه سانتیگراد، 2000 لوکس روشنایی و دوره 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی و هوادهی مداوم پرورش یافت. به منظور کشت انبوه، 10 میلیلیتر از استوک خالص جلبک به ارلن مایر حاوی 500 میلیلیتر محیط کشت استریل انتقال داده شد. بعد از گذشت 5 روز میزان جلبکها دو برابر شده و به فاز یکنواختی رسیدند. سپس یک میلی گرم بر لیتر از جلبک در یک لیتر محیط کشت حاوی غلظت های مختلف نانو ذره اکسید مس قرار داده شد. این آزمایش شامل 5 تیمار از غلظتهای مختلف اکسید مس 100، 10، 1، 1/0 (میلی گرم بر لیتر) و شاهد با سه تکرار از هر تیمار بوده است. تراکم سلولها توسط لام هموسیتومتر و میکروسکوپ نوری در هر روز مورد محاسبه قرار گرفت.
اندازهگیری رنگیزهها: به منظور اندازهگیری رنگیزههای کلروفیل a، b و کاروتن، 3 میلیلیتر از سوسپانسیون جلبکی داخل لوله آزمایش منتقل و در 3000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه توسط دستگاه سانتریفیوژ مدل (Eppendorf) سانتریفیوژ گردید. سپس محلول رویی خارج و به رسوب جلبکی 3 میلیلیتر استون (Merck 90%) اضافه و توسط همزن مخلوط گردید و مجدد عمل سانتریفیوژ به مدت 10 دقیقه انجام شد. محلول حاصله را جدا نموده و با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Jenway)، جذب نوری در طول موجهای مختلف 412، 431، 460، 480، 645، 663 و 665 خوانده و میزان رنگیزهها توسط فرمولهای مربوطه بر حسب میلی گرم بر میلی لیتر محاسبه شد (11).
نرخ بازدارندگی رشد جلبک: نرخ بازدارندگی رشد جلبکها در غلظت های مختلف اکسید مس از فرمول زیر محاسبه شده (9):
(N0/N-1)×100= درصد نرخ بازدارندگی رشد
N: تراکم سلولها در هر میلی لیتر در غلظت های مختلف اکسید مس ، N0: تراکم سلول ها در هر میلی لیتر در کنترل
سنجش پروتئین: 50 میلیلیتر از هر غلظت برداشت و از صافی با مش 25 میکرون عبور داده شد و به مدت یک روز در دمای 4 درجه سانتی گراد به منظور از دست دادن آب اضافی جلبک ها نگه داری شدند و سپس در دمای 20- درجه سانتی گراد تا زمان سنجش پروتئین در آنجا نگه داری شد. میزان پروتئین به روش کلدال سنجیده شد. 20 میلیگرم وزن خشک جلبک با 6 گرم کاتالیزور (3.5 g K2SO4 + 0.4 g CuSO4×5H2O) و 15 میلیلیتر اسید سولفوریک در دمای 400 درجهسانتیگراد به مدت 45 دقیقه هضم شد. سپس با دستگاه کلدال مدل (V40) عملیات تقطیر و با محلول (HCL 0/1M) فرایند تیتراسیون انجام شد و میزان نیتروژن کل به دست آمد. با استفاده از فرمول زیر میزان پروتئین کل محاسبه گردید (16):
Total protein=N× N factor
N= میزان نیتروژن موجود در نمونهها
N factor= فاکتور تبدیل نیتروژن به پروتئین، 25/6 برای جلبک میباشد.
تحلیل آماری: آنالیز دادههای آماری توسط نرم افزار SPSS(16) انجام شد. پس از تعیین نرمال بودن دادهها توسط آزمون آنالیز واریانس دو طرفه (Two-Way ANOVA) اختلاف بین تیمارهای مختلف و روزهای متفاوت در سطح (05/0>P) مورد تحلیل قرار گرفت. همبستگی بین رشد سلولهای جلبک گونه (Ch. vulgaris) با کلروفیلa، کلروفیلb، کلروفیل کل و کاروتن با استفاده از پس آزمون Pearson انجام شد.
نتایج
نمودار (1) رشد میکروجلبک (Ch. vulgaris) در 4 تیمار با غلظتهای مختلف نانو ذره اکسید مس در مقایسه با شاهد در روزهای دوم، چهارم و ششم را نشان میدهد. بین غلظتهای مختلف نانوذره اکسید مس و گروه شاهد در هر روز اختلاف معنیدار مشاهده شده است (05/0>P). بیشترین و کمترین میزان رشد سلولهای جلبکی به ترتیب در گروه شاهد به میزان 106×74/1 (سلول در میلیلیتر) در روز ششم و به میزان 106×21/0 (سلول در میلیلیتر) در غلظت 100 (میلی گرم بر لیتر) نانو ذره اکسید مس در روز دوم مشاهده شد. روز ششم بیشترین میزان رشد جلبک نسبت به روزهای دوم و چهارم مشاهده شد (نمودار 1).
نرخ بازدارندگی رشد میکروجلبک (نمودار 2) با افزایش غلظت نانوذره اکسید مس افزایش مییابد. بیشترین و کمترین میزان بازدارندگی به ترتیب در روز دوم و روز ششم مشاهده شده است. به طوری که در روز ششم نرخ بازدارندگی در نقطه صفر و منفی است (نمودار 2).
مقایسه میانگین میزان پروتئین کل جلبکها در روز ششم در غلظتهای مختلف اختلاف معنیدار نشان نداد (05/0<P). بیشترین و کمترین میزان پروتئین به ترتیب در گروه شاهد به میزان 38/0 (میکروگرم بر گم وزن خشک) و غلظت 100 به میزان 19/0 (میکروگرم بر گم وزن خشک) مشاهده شد (نمودار 3).
نمودار1- مقایسه میانگین رشد سلولهای جلبک (Ch. vulgaris) در غلظتهای مختلف نانو ذره اکسید مس (میلی گرم بر لیتر) در سه زمان متفاوت (میانگین ± خطای استاندارد).
طبق بررسی انجام شده در مورد اثر غلظتهای متفاوت نانوذره اکسید مس بر میزان کلروفیلهای جلبک Chlorella مشخص شد که با افزایش میزان غلظت نانوذره اکسید مس میزان کلروفیلها در هر روز به طور معنیداری کاهش مییابد (05/0>P). میزان کلروفیلها با گذشت زمان افزایش یافته اما اختلاف معنیدار بین روزهای مختلف مشاهده نشد (05/0<P). بیشترین و کمترین میزان کلروفیل a به ترتیب در گروه شاهد در روز ششم به میزان 05/0±12/2 و غلظت 100 میلی گرم بر لیتر نانو ذره اکسید مس در روز دوم به میزان 009/0±09/0 مشاهده شد.
نمودار 2- مقایسه میانگین نرخ بازدارندگی رشد جلبک (Ch. vulgaris) در غلظتهای مختلف نانو ذره اکسید مس (میلی گرم بر لیتر) در سه زمان متفاوت (میانگین ± خطای استاندارد).
نمودار 3- مقایسه میانگین پروتئین کل جلبک (Ch. vulgaris) در غلظتهای مختلف نانو ذره اکسید مس (میلی گرم بر لیتر) در روز ششم (میانگین ± خطای استاندارد).
بیشترین و کمترین میزان کلروفیل b به ترتیب مربوط به گروه شاهد در روز ششم به میزان 02/0±86/0 و غلظت 10 و 100 میلی گرم بر لیتر نانو ذره اکسید مس در روز دوم به میزان 004/0±02/0 (میلیگرم بر لیتر) بود و در مورد کلروفیل کل هم به ترتیب در گروه شاهد در روز ششم 009/0±98/2 و غلظت 100 میلیگرم بر لیتر نانو ذره اکسید مس در روز دوم به میزان 008/0±11/0 (میلیگرم بر لیتر) مشاهده شد. کاروتن در جلبک Chlorella با افزایش میزان غلظت نانو ذره اکسید مس بین تیمارهای مختلف به طور معنیدار کاهش یافته است. به طوریکه بیشترین و کمترین میزان کاروتن به ترتیب در گروه شاهد در روز ششم 02/1±26/101 و در غلظت 1/0 میلی گرم بر لیتر نانو ذره اکسید مس در روز دوم به میزان 1/0±13/15 (میلیگرم بر لیتر) مشاهده شد (نمودار 4).
نتایج همبستگی بین رشد سلولهای جلبک گونه (Ch. vulgaris) با کلروفیلa، کلروفیلb، کلروفیل کل و کاروتن در جدول 1 آمده است. رشد جلبک Chlorella با کلروفیلها و کاروتن همبستگی مثبت و معنیدار نشان داد.
نمودار 4- مقایسه میانگین کلروفیلa، کلروفیلb، کلروفیل کل و کاروتن در جلبک (Ch. vulgaris) در غلظتهای مختلف نانو ذره اکسید مس (میلی گرم بر لیتر) در سه زمان متفاوت (میانگین ± خطای استاندارد).
جدول 1- همبستگی بین رشد سلولهای جلبک گونه (Ch. vulgaris) با کلروفیلa، کلروفیلb، کلروفیل کل و کاروتن
کاروتن |
کلروفیل کل |
کلروفیل b |
کلروفیل a |
|
757/0=r2 *00/0=P |
640/0=r2 *00/0=P |
620/0=r2 *00/0=P |
607/0=r2 *00/0=P |
رشد سلولهای جلبک گونه (Chlorella vulgaris) |
* اختلاف معنیداری در سطح 01/0 میباشد.
بحث
میزان رشد و تقسیمات سلولی و کلروفیل از مهمترین شاخصهای فیزیولوژیک هستند که در علم سم شناسی برای ارزیابی خطر سموم در محیط استفاده میشود (13، 14). کاروتن نیز از رنگیزههای مهم در جلبکها است که نقش حیاتی در رشد آنها دارد (5، 26). بنابراین با توجه به رشد سریع و گسترده نانو مواد و به خصوص کاربرد گسترده نانو ذره اکسید مس در تولیدات صنعتی (23) و ورود به اکوسیستمهای آبی و تاثیر بر تولیدکنندگان اولیه زنجیره غذایی، بررسی تاثیر این نانو مواد بر متابولیسم و شاخصهای فیزیولوژیک حائز اهمیت میباشد (7، 15).
در مطالعه حاضر، میزان رشد جلبک Chlorella با افزایش غلظت نانوذره اکسید مس به طور معنی دار (05/0>P) کاهش یافته بود و با گذشت زمان این میزان افزایش یافته است (نمودار 1). Oukarrom و همکاران (2012)، نشان دادند که نانو ذره نقره می تواند به طور مستقیم بر روی سطح جلبک Chlorella تاثیر میگذارد (17). در نتیجه سلولها بزرگتر و متراکم به نظر میرسند. زیرا نانو ذره نقره که 50 نانومتر است ممکن است نتواند وارد سلول شود اما میتواند به عنوان یک پل ارتباطی به سلول دیگر باشد که در نهایت باعث سرعت بخشیدن در تجمع سلولی میشود (12، 17). تجمع نانو ذرات اکسید روی و اکسید تیتانیوم باعث محصور شدن دریچههای سلولی جلبک Chlorella شده است (12). همچنین نانو ذره اکسید سلیسیم توسط سطح جلبک Chlorella جذب شده و این باعث کاهش رشد شده است (24). با جذب سطحی نانوذرات توسط جلبکهای Chlorella و Scenedesmus نرخ جذب نور کاهش یافته، که میتواند دلیل کاهش رشد و افزایش نرخ بازدارندگی باشد (12، 24). بنابراین خاصیت تراکم نانو ذرات و جذب سطحی توسط جلبکها از دلایل سمیت نانو ذره اکسید مس برای جلبک گونه
Ch. vulgaris است.
فتوسنتز از عوامل موثر رشد جلبکها است. کلروفیل a ماده اساسی فتوسنتز است که مقدارش نشان دهنده وضعیت رشد جلبکها است (23). نمودار 4 تغییرات میزان کلروفیلa، b و کاروتن را تحت تاثیر نانو ذره اکسید مس در شش روز نشان میدهد. میزان کلروفیلها و کاروتن با افزایش غلظت نانو ذره اکسید مس کاهش یافته است. نتایج مطالعه Wang و همکاران (2013)، مشابه مطالعه حاضر است. آنها کاهش میزان کلروفیلa و b را در جلبک Chlorella در غلظتهای بالای نانو ذره اکسید مس در 96 ساعت مشاهده و بیان کردند که نانو ذره اکسید مس با کاهش کلروفیل، فتوسنتز را در جلبک گونه Ch.vulgaris مهار مینماید (23). Shi و همکاران (2011)، گزارش کردند که میزان کلروفیل در خزه با حضور نانو ذره اکسید مس به دلیل افزایش رهایی یونهای مس از نانو ذرات کاهش یافته است (22). همچنین Gang و همکاران (2011) و Arouja و همکاران (2009) نیز کاهش رشد و کلروفیل را در جلبکهای در معرض قرار گرفته با نانو ذرات به دلیل کاهش فتوسنتز گزارش کردند (4، 9). یونهای مس رها شده از نانو ذرات با کاهش مهار آب از فتوسیستم دو بر روی فتوسنتز جلبک تاثیر میگذارند. به علاوه با حضور نانو ذره اکسید مس میزان مواد فتوشیمیایی فتوسیستم دو کاهش می یابد (2). طبق مطالعاتی که Perreault و همکاران (2010) و Patsikka و همکاران (2002) انجام دادند نانو ذره اکسید مس بر روی عملکرد رادیکالهای اکسیژن ROS داشته و استرس اکسیداتیو را به علت ترکیب شدن با آهن به عنوان یک عنصر ضروری افزایش داده است (15، 18، 19). استرس اکسیداتیو نقش مهمی در سمیت نانو ذره اکسید مس در ارگانیسمهای فتوسنتتیک گیاه دارد (23) که با توجه به نقش آنتی اکسیدانی کاروتنوئیدها (1، 8)، شاید دلیل افزایش کاروتن در روز ششم در غلظتهای مختلف نانو ذره اکسید مس در جلبک Ch. vulgaris باشد (9). مقادیر پروتئین در جلبک مورد مطالعه در غلظتهای مختلف نانو ذره در مقایسه با کنترل کاهش یافته اما اختلاف معنیدار مشاهده نشده است (05/0<P). نتایج مطالعات Gang و همکاران (2011) نیز با مطالعه حاضر مطابقت دارد. آنها بیان کردند که پروتئین میتواند بعنوان یک فاکتور مهم در فرآیند تجزیه زیستی مورد ارزیابی قرار گیرد (9). همچنین یداللهی و همکاران (1390)، گزارش کردند که پروتئین در جلبک (Dunaliella salina) با افزایش غلظت آلومینیوم افزایش معنیداری نداشته است (2). همبستگی بین رشد سلولهای جلبک Chlorella با کلروفیلa، کلروفیلb، کلروفیل کل و کاروتن وجود دارد.
نتیجهگیری نهایی
نتایج به دست آمده از این تحقیق نشان داد که نانو اکسید مس مانع رشد جلبک کلرلا شده است و میزان سلولها در حضور نانو ذرات کمتر از گروه شاهد است. هممچنین میزان کلروفیل a، b و کاروتن در غلظت های مختلف نانو ذره اکسید مس کاهش یافته است. بنابراین باعث کاهش فتوسنتز در جلبک کلرولا شده است. با توجه به این نتایج باید تحقیقات بیشتری بر روی ایمنی نانو مواد انجام شود.