Document Type : Research Paper
Abstract
Chamomile (Matricaria chamomilla L.) is a well-known medicinal plant species from Asteraceae family mentioned in 26 countries pharmacopoeia. The aim of this research is to find the best landrace, explants, hormonal combination and environmental condition for the possibility of German chamomile regeneration under in vitro conditions. In this experiment the effect of different concentrations of BAP (4.4 and 8.8µM) and Thidiazuron (TDZ) (4.4 and 8.8µM) in combination with 2.2 µm IAA were evaluated with different landraces (Isfahan, Urumia, Oshnavieh and Shahindegh). The results indicated that Isfahan landrace had the highest regeneration rate (92.48%) on media supplemented with BAP (4.4 µm) in combination with IAA (2.2 µm). The maximum mean number of shoots (25 shoots per explants) obtained in genotype landrace on media containing BAP (4.4 µm) in combination with IAA (2.2 µm). For evaluating of Basal media and plant growth regulators on rooting of regenerated shoots, MS and 1/2 MS medium with (0.5, 1 mg/l) IBA and IAA were used. Result of rooting experiment showed that maximum rooting rate (100%) was occurred on hormone free 1/2 MS medium and MS medium supplemented with 0.5 1mg/l IBA. More than 90% of the regenerated plants were successfully acclimatized and transferred to the greenhouse.
Keywords
Main Subjects
اثر تنظیمکنندههای رشد گیاهی بر باززایی مستقیم ریزنمونه نوک شاخه در چهار ژنوتیپ از گیاه بابونه آلمانی(Matricaria chamomilla L.)
الهام مرادی پور 1، بهمن حسینی1* و علیرضا پیرزاد2
1ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی، گروه علوم باغبانی
2ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت
تاریخ دریافت: 14/4/94 تاریخ پذیرش: 16/9/94
چکیده
بابونه(Matricaria chamomilla L.) ، گیاه دارویی مشهور خانواده آستراسه است که نام آن در دارونامههای 26 کشور ذکر شده است. تحقیق حاضر به منظور شناسایی، بهترین نوع و ترکیب تنظیمکننده رشد در چهار ژنوتیپ بومی مورد مطالعه و همچنین تدوین دانش فنی کشت درون شیشهای آن انجام گردید. در این آزمایش اثر دو نوع تنظیمکننده رشد شامل N6- Benzyl amino purine (BAP) و (TDZ) Thidiazuron در غلظتهای (4/4 و 8/8 میکرومولار) در ترکیب با 2/2 میکرومولار3- Indol Acetic Acid ( IAA) بر باززایی مستقیم شاخساره از ریزنمونه نوک شاخه در چهار ژنوتیپ بابونه آلمانی اصفهان، ارومیه، اشنویه و شاهیندژ بررسی شد. نتایج آنالیز دادهها نشان داد که بیشترین درصد باززایی در ژنوتیپ اصفهان (48/92 درصد)، در محیط کشت پایه MS حاوی 4/4 میکرومولار BAP در ترکیب با 2/2 میکرومولار IAAو حداکثر میانگین باززایی شاخساره در هر ریزنمونه (25 شاخساره) در ژنوتیپ ارومیه، در تیمار 4/4 میکرومولار BAP در ترکیب با 2/2 میکرومولار IAA مشاهده گردید. ریشهزایی گیاهچههای باززایی شده، در محیط کشت پایه MSو MS2/1 عاری از تنظیم کنندههای رشد و همچنین در ترکیب با غلظتهای 5/0 و 1 میکرومولارIBA و 5/0 و 1 میکرومولارIAA بررسی گردید. نتایج تجزیه واریانس نشان داد حداکثر درصد ریشهزایی (100 درصد) در محیطهای MS2/1 (2/1 غلظت عناصر محیطMS ) عاری از تنظیمکننده رشد و MS تکمیل شده با 5/0 و 1 میکرومولار IBA قابل مشاهده میباشد. بیش از 90 درصد گیاهچهها به شرایط گلخانه سازگار شدند.
واژه های کلیدی: بابونه آلمانی، باززایی مستقیم، ژنوتیپ، BAP و TDZ.
* نویسنده مسئول، تلفن: 04432775035، پست الکترونیکی: b.hosseini@urmia.ac.ir
مقدمه
بابونه آلمانی با نام علمی Matricaria chamomilla L. گیاهی علفی، یک ساله و متعلق به تیره کاسنی است. اسانس گلهای آن در صنایع داروسازی، آرایشی، بهداشتی و صنایع غذایی کاربرد فراوان دارد (2 و 6). منشأ اصلی این گیاه مدیترانه، ولی امروزه پراکندگی وسیعی در اروپا، آسیای غربی، آفریقایشمالی و آمریکایشمالی دارد (4 و 21). اسانس گلهای بابونه آبی رنگ و مقدار آن بین 2/0 تا 9/5 درصد در گلها متغیر میباشد (23و 29). در اسانس بابونه حدود 40 نوع ترکیب شیمیایی شناسایی شده است که مهمترین آنها کامازولن، بیسابولول، بیسابولولاکسید، پاراسیمن، بتا اوسیمن، بتا-فارنزن میباشد که در مجموع 75 درصد از ترکیب اسانس را به خود اختصاص دادهاند (11 و 22). با توجه به اینکه امروزه روشهای قدیمی و سنتی تکثیر و اصلاح گیاهان به تنهایی جوابگوی بسیاری از نیازها نمیباشد، لازم است روشهای جدیدتری جایگزین یا تکمیلکننده روشهای قبلی، مورد استفاده قرار گیرد. یکی از وسیعترین کاربردهای زیست فنآوری، در زمینه کشت بافت است (9). از میان جنبههای مختلف کشت بافت، ریزازدیادی از اهمیت بسیار زیادی برخوردار میباشد. این تکنیک از نظر صرفهجویی در زمان، راندمان بیشتر، امکان تولید گیاهان عاری از بیماری و مواد تکثیرشده خالص، بسیار کارآمد میباشد. همچنین این روش حفظ و انتقال ایمنتر ژرم پلاسم را بین کشورها، مطمئن و راحتتر کرده است (13). در ارتباط با موفقیت تولید گیاهان در شرایط درون شیشهای، فاکتورهای متعددی نظیر ژنوتیپ، نوع ریزنمونه، نوع و غلظت تنظیمکنندههای رشد، مکملهای رشد و اسیدهای آمینه مؤثر میباشند (3 و 25). Rout و همکاران (24) گزارش کردند که کاربرد غلظتهای پایین اکسین در ترکیب با سایتوکینین میزان تکثیر شاخساره را افزایش میدهد. پرآوری شاخساره بیشتر تحت تأثیر سایتوکینین است و نتایج نشان داده است که عدم حضور سایتوکینینهایی مانند BAP(N6-benzylaminopurine)، Kin(Kinetin) و حضور IAA(Indol acetic acid) به تنهایی تأثیری در پرآوری شاخساره ندارد. نتایج اولیه Cellarova و همکاران (1982) نشان داد که جهت القای باززایی از کالوسهای القاء شده بابونه در محیط کشت درون شیشهای، حداکثر باززایی در محیط کشت حاوی 1/0 میلیگرم در لیتر BAP ثبت گردید (9). در گیاه دارویی نعناع فلفلی ((Mentha piperita L.، حداکثر میزان تولید شاخساره از نمونه گرههای کشت شده در محیط MS تکمیل شده با 4/4 میکرومولار BAP 8/49 درصد گزارش شده است (30). در مطالعه دیگر جهت ازدیاد درون شیشهای گیاه Pentanema indicum بهترین محیط تنظیمکننده رشدی 4 میکرومولار BAP در ترکیب با 1 میکرومولار IAA گزارش شد (28). مطالعات Murck و همکاران (2000)، در بررسی اثر تنظیمکنندههای رشد شامل BAP و TDZ(Thidiazuron) در ترکیب با IAA بر روی باززایی مستقیم گل راعی (HyppericumPerforatum) گزارش گردید که بالاترین درصد باززایی شاخساره از ریزنمونه هیپوکوتیل در محیط کشت پایه MS حاوی 5 میکرومولار TDZ بهدست آمد (18). برای باززایی مستقیم در گیاه Arnebiae uchroma بالاترین درصد باززایی شاخساره از ریزنمونه برگ در محیط حاوی 5 میکرومولار TDZ مشاهده شد (16).
دامنه وسیعی از ظرفیت تولیدمثلی در سلسله گیاهان وجود دارد. معمولا تولید مثل گیاهان دولپهای نسبت به تک لپهایها بهتر میباشد. بین گیاهان یک گونه نیز تفاوتهای زیادی در تقسیم سلولی و توان تولیدمثلی وجود دارد (3). در تحقیقی که به منظور بررسی اثرات ژنوتیپ و تنظیمکنندههای رشد در کشت ریزنمونههای زوفا
(Hyssopus officinalis) انجام گرفته بود، نشان داده شد که در بین ژنوتیپهای موجود، ریزنمونههای ژنوتیپهای همدان و مشهد با 86 درصد شاخسارهزایی دارای بیشترین درصد باززایی میباشند (7). نتایج این تحقیق مشخص ساخت که ترکیبهای تنظیمکننده رشدی 4/4 و 2/2 میکرومولار در لیتر BAP به ترتیب برای ژنوتیپهای همدان و مشهد بهترین ترکیب برای باززایی شاخساره از ریزنمونه گره هستند. در ژنوتیپ شیراز، بهترین نتیجه (80 درصد) با ترکیب تنظیمکننده رشدیBAP با غلظت 4/4 میکرومولار گزارش گردید.
ریشهزایی توسط عوامل مختلفی مانند وجود تنظیمکنندههای رشد در محیط، سن و مرحله نموی گیاه، ترکیب نمکهای پایه، ژنوتیپ و شرایط کشت کنترل میشود (3). اکثر گیاهان برای باززایی مؤثر ریشه به اکسین نیازمندند. برای ریشهدهی گیاهان علفی اغلب از اکسین ضعیف (IAA) در غلظتهای بین 10- 1/0 میلیگرم در لیتر استفاده میشود. گیاهان چوبی نسبت به گیاهان علفی، به غلظت بالاتر اکسین نیازمندند. بهترین اکسینهای مؤثر IBA در غلظتهای بین 3- 5/0 میلیگرم در لیتر و NAA در غلظتهای بین 1- 05/0 میلیگرم در لیتر هستند (14). Pavendan و Rajasekaran (2011) گزارش کردند که در گیاه Eugenia singampattiana بالاترین درصد ریشهزایی (98درصد) و بیشترین تعداد ریشه در هر ریزنمونه و طویلترین ریشه در محیط MS شامل 5/0 میلیگرم در لیتر BAP مشاهده شد (20).
با توجه به اهمیت گیاه بابونه و کاربرد روز افزون آن در صنایع داروسازی، آرایشی و بهداشتی، عطر سازی و تهیه چاشنیهای غذایی و لزوم تولید کلونهای یکنواخت با درصد بالای متابولیتهای ثانویه از طریق ریزازدیادی، تحقیق حاضر به منظور شناسایی بهترین ژنوتیپ، نوع و ترکیب تنظیمکننده رشد و شرایط مناسب محیطی و همچنین تدوین دانش فنی کشت درون شیشهای آن انجام گرفته است.
مواد و روشها
مواد گیاهی: در این پژوهش چهار ژنوتیپ گیاه بابونه آلمانی در پژوهشکده زیست فنآوری دانشگاه ارومیه مطالعه گردید. بذور ژنوتیپ اصفهان از شرکت پاکان بذر واقع در شهر اصفهان خریداری شد. بذور ژنوتیپهای ارومیه، اشنویه و شاهین دژ توسط دکتر علیرضا پیرزاد از زیستگاههای طبیعی (جدول 1) جمعآوری گردید.
جدول 1- مختصات جغرافیایی نمونههای جمع آوری شده
شهر |
شمال |
شرق |
ارتفاع |
ارومیه |
36O 25´ 47" |
46O 04´ 25" |
1585 |
اشنویه |
37O 09´ 01" |
45O 08´ 15" |
1650 |
شاهیندژ |
36O 47´ 42" |
45O 08´ 48" |
1610 |
محیط کشت پایه و شرایط رشد: در این مطالعه از محیط کشت پایه MS (17) حاوی ویتامین B5 (نیکوتینیک اسید، تیامین و پیریدوکسین) شرکت زیست آرمان سبز استفاده گردید. 30 گرم ساکارز و 7 گرم آگار به محیط کشت پایه اضافه وpH محیط کشت بین 6/5 تا 8/5 تنظیم گردید. کلیه محیطهای کشت و گیاهچهها در اتاق رشد با دمای 2±24 درجه سانتیگراد و در شرایط دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی با شدت نور 3000 لوکس نگهداری شدند.
ضد عفونی و کشت بذرها: بهمنظور حذف آلودگیهای سطحی بذرها در زیر آب جاری بهمدت نیم ساعت قرار گرفتند و سپس جهت سترونسازی در زیر هود لامینارفلو از اتانول 70 درصد به مدت 1 دقیقه و هیپوکلریت سدیم NaClO3)) در غلظت 5 درصد حجمی (v/v) به مدت 10 دقیقه استفاده گردید و سپس سه مرتبه آبشویی با آب مقطر سترون انجام شد. بذرها در محیط کشت MS حاوی ویتامینهای B5 درون پتریدیش کشت شدند. بذرها پس از 9 روز جوانه زدند و بعد از گذشت 3 هفته از کاشت بذور در شیشه، ریزنمونه نوک شاخه از گیاهچهها تهیه شد.
بررسی اثر ترکیبهای مختلف هورمونی بر باززایی شاخساره 4 ژنوتیپ بابونه آلمانی: این آزمایش به صورت فاکتوریل و در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی در سه تکرار اجرا شد. تیمارهای آزمایش نوع ژنوتیپ در چهار سطح (اصفهان، ارومیه، اشنویه و شاهین دژ) و تنظیمکننده رشد در دو نوع BAP)و (TDZ و غلظتهای مورد استفاده از TDZو BAP در دو سطح (4/4 و 8/8 میکرومولار در لیتر) به همراه 2/2 میکرومولار IAA در محیط کشت MS حاوی ویتامینهای B5 بودند. پس از گذشت 9 هفته و انجام 3 بار واکشت، درصد و میانگین باززایی مستقیم شاخساره در هر ژنوتیپ در هر تیمار آزمایش و حداکثر شاخهزایی در هر تیمار ثبت گردید.
ریشهزایی: این آزمایش بهمنظور بررسی اثر تنظیمکنندههای رشد IBA و IAA بر میزان ریشهزایی گیاهچههای باززایی شده ژنوتیپ اصفهان در آزمایشگاه انجام گرفت و سه ژنوتیپ باقی مانده مورد بررسی آزمایش ریشهزایی قرار نگرفتند. ریشهزایی گیاهچههای باززایی شده، در دو محیط پایه MSو MS2/1 (حاوی نصف غلظت عناصر محیط MS) حاوی غلظتهای0، 5/0 و 1 میلی گرم در لیتر IBA و 0، 5/0 و 1 میلی گرم در لیتر IAA بررسی گردید. آزمایش فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی در سه تکرار انجام شد. در پایان واکشتها درصد ریشهزایی و طول ریشهها اندازهگیری گردید.
سازگاری
بهمنظور استقرار گیاهچههای ریشهدار شده ژنوتیپ اصفهان از مرحله باززایی، از بستر پرلیت اتوکلاو شده استفاده گردید. در ابتدا گیاهچهها را داخل لیوانهای پلاستیکی حاوی پرلیت قرار داده و سپس به منظور حفظ رطوبت، داخل جعبه پلاستیکی دربدار قرار داده و جعبه به گلخانه انتقال داده شد. برای آبیاری برگی گیاهچههای در حال سازگاری از محلول MS2/1 استفاده شد و کف جعبه دو الی سه سانتیمتر آب ریخته تا گیاه بتواند از کف جعبه آب جذب کند. روزانه دو الی سه ساعت درپوش جعبه پلاستیکی برداشته شد تا گیاه به شرایط گلخانه با دمای 25 درجه سانتیگراد با رطوبت نسبی 90 درصد سازگار شود. سازگاری به تدریج و طی 4 هفته صورت گرفت و گیاهچهها از داخل جعبه به داخل گلدان حاوی خاک سبک منتقل و در فضای گلخانه با دمای 25 درجه سانتیگراد و طول دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی استقرار یافتند.
تجزیه و تحلیل آماری دادهها و نرم_افزارهای مورداستفاده: تجزیه واریانس دادههای آزمایش براساس امید ریاضی طرح پایه و با استفاده از نرمافزار آماری SAS ورژن 1/9 و مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 1 درصد انجام گرفت.
نتایج و بحث
نتایج تجزیه واریانس نشان داد که اثر غلظتهای مختلف هورمون، ژنوتیپ و اثرات متقابل آنها بر درصد باززایی شاخساره درسطح احتمال 1 درصد معنیدار بود (جدول 2). این نتایج نشان داد که اختلاف معنیداری در بین ژنوتیپهای مورد استفاده جهت ازدیاد در شرایط درون شیشه وجود دارد.
جدول 2- نتایج تجزیه واریانس باززایی گیاه بابونه آلمانی
منابع تغییرات |
درجات آزادی |
میانگین مربعات |
|
درصد باززایی |
میانگین باززایی |
||
ژنوتیپ (a) |
3 |
**69/304 |
**742/347 |
تیمار هورمونی (b) |
4 |
** 34/12259 |
**822/571 |
اثر متقابل (a×b) |
12 |
**39/493 |
**57/49 |
اشتباه آزمایشی |
|
40 |
47/2 |
ضریب تغییرات (درصد) |
|
561/6 |
64/11 |
اثر ترکیبهای هورمونی و نوع ژنوتیپ بر درصد باززایی شاخساره بابونه آلمانی: آنالیز دادهها نشان داد که ژنوتیپهای مورد استفاده از نظر میزان درصد باززایی دارای اختلاف معنیداری میباشند (جدول 2 و 3). حداکثر باززایی در ژنوتیپ اصفهان و حداقل باززایی در ژنوتیپ شاهیندژ ثبت گردید. در ژنوتیپ اصفهان بیشترین درصد باززایی 48/92 درصد و کمترین درصد باززایی 47/58 درصد به ترتیب در محیط کشتMS حاوی 4/4 میکرومولارBAP و محیط کشتMS حاوی 8/8 میکرومولار TDZ مشاهده گردید (شکل 1). در ژنوتیپ ارومیه حداکثر درصد باززایی با 21/84 درصد در محیط MS تکمیل شده با 4/4 میکرومولار TDZ و کمترین درصد باززایی73/54 درصد در محیط MS حاوی 8/8 میکرومولار TDZ مشاهده گردید. در ژنوتیپ اشنویه بیشترین درصد باززایی با 32/88 درصد در محیط MS تکمیل شده با 4/4 میکرومولار BAP و کمترین مقدار آن 26/49 درصد در محیط کشت MS حاوی 8/8 میکرومولار TDZ بهدست آمد. در ژنوتیپ شاهیندژ بیشترین درصد باززایی 55/86 درصد در محیط کشت حاوی 4/4 میکرومولار BAP و کمترین درصد باززایی 31/36 درصد در محیط MS حاوی 4/4 میکرومولار TDZ مشاهده گردید (جدول 3).
اثر ترکیبهای هورمونی و نوع ژنوتیپ بر میانگین باززایی شاخساره بابونه آلمانی: در بین ژنوتیپهای مورد مطالعهژنوتیپ اشنویه با میانگین، 5/16 گیاهچه در هر ریزنمونه در مجموع 4 تیمار هورمونی حداکثر شاخهزایی را در بین ژنوتیپهای مورد نظر نشان داد. ژنوتیپهای ارومیه، شاهیندژ و اصفهان به ترتیب با میانگین 13/15، 04/11 و 27/6 گیاهچه در هر ریزنمونه در 4 تیمار آزمایش در ردههای بعدی قرار گرفتند (شکل 2).
جدول 3- بررسی اثر ژنوتیپ، نوع و غلظت تنظیم کننده های رشد بر میزان باززایی ریزنمونه نوک شاخه گیاه بابونه آلمانی.
غلظت تنظیمکنندههای رشد در محیط کشتMS |
ژنوتیپ |
درصد باززایی شاخساره(%) |
میانگین باززایی شاخساره (گیاهچه در هر ریزنمونه) |
4/4 BAP + 2/2 IAA |
اصفهان |
48/92 a |
33/10d |
4/4 BAP + 2/2 IAA |
ارومیه |
80e |
23ab |
4/4 BAP + 2/2 IAA |
اشنویه |
32/88b |
25a |
4/4 BAP + 2/2 IAA |
شاهین دژ |
55/86c |
5/16c |
8/8 BAP + 2/2 IAA |
اصفهان |
42/75f |
40/8e |
8/8 BAP + 2/2 IAA |
ارومیه |
04/73g |
21b |
8/8 BAP + 2/2 IAA |
اشنویه |
25/81e |
23ab |
8/8 BAP + 2/2 IAA |
شاهین دژ |
06/76c |
5/14cd |
4/4 TDZ + 2/2 IAA |
اصفهان |
59/89b |
83/3fg |
4/4 TDZ + 2/2 IAA |
ارومیه |
21/84d |
10d |
4/4 TDZ + 2/2 IAA |
اشنویه |
20/86c |
5/10d |
4/4 TDZ + 2/2 IAA |
شاهین دژ |
31/36l |
15/5f |
8/8 TDZ + 2/2 IAA |
اصفهان |
47/58i |
5/2g |
8/8 TDZ + 2/2 IAA |
ارومیه |
73/54j |
5/6ef |
8/8 TDZ + 2/2 IAA |
اشنویه |
26/49k |
6f |
8/8 TDZ + 2/2 IAA |
شاهین دژ |
70h |
8e |
حروف غیر مشابه نشان دهنده تفاوت معنیدار در سطح احتمال 1 درصد میباشند.
شکل 1- تأثیر ژنوتیپهای مختلف و محیط هورمونی بر درصد باززایی شاخساره از ریزنمونه نوک شاخه بابونه آلمانی. حروف غیر مشابه نشان دهنده تفاوت معنیدار در سطح احتمال 1 درصد می باشد.
شکل 2- تأثیر ژنوتیپهای مختلف بر میانگین باززایی شاخساره از ریزنمونه نوک شاخه گیاه بابونه آلمانی. حروف غیر مشابه نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح احتمال 1 درصد می باشند.
در میان دو نوع هورمون سیتوکینینی BAP و TDZ، بیشترین میانگین باززایی شاخساره با 72/17 گیاهچه در هر ریزنمونه به هورمون BAP اختصاص داشت. هورمون TDZ دارای میانگین 56/6 گیاهچه در هر ریزنمونه در تیمارهای مورد مطالعه بود (شکل 3). این مطالعه آشکار ساخت که در بابونه آلمانی هورمونهای مورد استفاده دارای اثرات متفاوت معنیدار در میانگین باززایی شاخساره میباشند.
اثر متقابل بین محیط کشت پایه، نوع و غلظتهای مختلف تنظیمکننده رشدی بر درصد باززایی شاخساره در سطح احتمال 1 درصد معنیدار بود، اما اثر ژنوتیپ، نوع و غلظتهای مختلف تنظیمکننده رشدی هر کدام به تنهایی بر میانگین باززایی شاخساره در سطح احتمال 5 درصد معنیدار بود.
شکل 3- مقایسه میانگین باززایی شاخساره ازریزنمونه نوک شاخه گیاه بابونه آلمانی تحت تاثیر سیتوکینینهای BAP و TDZ. حروف غیر مشابه نشاندهنده تفاوت معنیدار در سطح احتمال 1 درصد میباشند.
آنالیز غلظتهای مختلف هورمونی نیز نشان داد که اختلاف معنیداری در بین غلظتهای مورد استفاده برای دو هورمون مورد استفاده TDZ و BAP وجود دارد. غلظت 4/4 میکرومولار با 04/13 گیاهچه در هر ریزنمونه نسبت به غلظت 8/8 میکرومولار با 24/11 گیاهچه در هر ریزنمونه، غلظت بهینه جهت تولید شاخساره در بابونه آلمانی از ریزنمونه نوک شاخه مشخص گردید (شکل های 4 و 5).
شکل -4 تأثیر غلظتهای مختلف هورمونی بر میانگین باززایی شاخساره از ریزنمونه نوک شاخه گیاه بابونه آلمانی. A: غلظت 4/4 میکرومولار دو هورمون BAP و TDZ، B: غلظت 8/8 میکرومولار دو هورمون BAP و TDZ. حروف غیر مشابه نشاندهنده تفاوت معنیدار در سطح احتمال 5 درصد میباشند.
|
الفالف |
ب |
ج |
د |
شکل 5- مقایسه باززایی ژنوتیپهای مختلف بابونه آلمانی در محیط MS حاوی4/4 میکرومولار .BAPالف: ژنوتیپ اصفهان ب: ژنوتیپ اشنویه ج: ژنوتیپ ارومیه د:شاهین دژ
جدول تجزیه واریانس نشان داد که اثر متقابل بین دو محیط MS وMS 2/1 )غلظت نمک) و مقادیر مختلف تنظیمکننده رشدی IBA و IAAو اثر متقابل آنها بر درصد ریشهزایی در سطح احتمال 1 درصد معنیدار بود (جدول 4).
درصد ریشهزایی: مقایسه میانگین دادههای آزمایش نشان داد که حداکثر درصد ریشهزایی 100 درصد در محیط کشت MS، حاوی 5/0 و 1 میلیگرم در لیتر IBAو محیط کشت MS 2/1 فاقد هورمون و کمترین درصد ریشهزایی 83 درصد در محیط کشت MS حاوی 1 میلیگرم در لیتر IAA مشاهده شد (جدول 5).
جدول 4- تجزیه واریانس درصد ریشهزایی و طول ریشه در پاسخ به انواع غلظت نمک و تیمارهای تنظیمکننده رشد.
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
میانگین مربعات (MS) |
|
درصدریشه زایی |
میانگین طول ریشه(cm) |
||
غلظت نمک((A |
1 |
** 70/14 |
ns516/4 |
غلظت هورمونی(B) |
5 |
**64/81 |
ns566/0 |
A×B |
5 |
**17/133 |
ns506/0 |
اشتباه آزمایشی |
20 |
70/0 |
694/0 |
برش دهی اثر متقابلA×B)) |
|||
1/2 MS |
5 |
** 176/49 |
ns539/0 |
MS |
5 |
**636/165 |
ns534/0 |
ضریب تغییرات (CV%) |
|
889/0 |
251/23 |
ns،**: به ترتیب نشان دهنده عدم وجود اختلاف معنیدار و معنیدار در سطح احتمال 1 درصد میباشد.
میانگین طول ریشه: جدول تجزیه واریانس نشان داد که اثر تیمارهای مختلف تنظیمکنندههای رشدIBA و IAA و اثر متقابل آن با غلظت نمکهای ماکرو و میکرو محیط کشت MS، بر طول ریشههای تشکیل شده در سطح احتمال 1 درصد معنیدار نمیباشد و تنها اثر غلظت نمک در سطح احتمال 1 درصد معنیدار بود (جدول 4). میانگین طول ریشه در محیط1/2 MS و MS به ترتیب 93/3 و12/3 سانتیمتر گزارش شد (شکل های 6 و 7).
شکل 6- مقایسه میانگینهای طول ریشه تحت تأثیر غلظت نمک درگیاهچههای بابونه آلمانی ژنوتیپ اصفهان. حروف غیر مشابه نشان دهنده تفاوت معنیدار در سطح احتمال 1 درصد در بین میانگینها میباشند.
سازگاری به شرایط گلخانه به تدریج و طی 4 هفته صورت گرفت. بیش از 90 درصد از گیاهچهها در شرایط سازگاری زنده مانده و پس از انتقال به گلدان در شرایط گلخانه قرار گرفتند (شکل 8).
الف |
ب |
شکل 7- مقایسه محیطهای مختلف از لحاظ ریشه زایی در گیاه بابونه آلمانی الف: گیاهچه ریشهدارشده در محیط MS 1/2 پس از سه هفته ب: گیاهچه ریشهدار شده در محیط MSپس از سه هفته |
شکل 8- گیاهچه در حال سازگاری بابونه آلمانی ژنوتیپ اصفهان در شرایط سازگاری.
|
بحث
در ارتباط با موفقیت تولید گیاهان در شرایط درون شیشهای، فاکتورهای متعددی نظیر ژنوتیپ، نوع ریز نمونه، نوع تنظیمکنندههای رشد و غلظت و ترکیب آنها، مکملهای رشد و اسیدهای آمینه مؤثر میباشند (3). سیتوکینینها باعث تسریع تقسیم سلولی، تشکیل اندام هوایی و ریختزایی میشوند. در حالی که اکسینها برای القای رشد و طویلشدن در سلول و به شکل متداول برای ریشهزایی مورد استفاده قرار میگیرد. سیتوکینینهای مورد استفاده اغلب کینتین یا BAP میباشند (8).
جدول 5- تأثیر غلظت نمکها و تیمارهای مختلف تنظیمکنندههای رشد بر درصد ریشهزایی گیاهچههای بابونه آلمانی ژنوتیپ اصفهان.
تیمار هورمونی |
درصد ریشه زایی |
|
MS |
IAA0 |
88c |
IAA0.5 |
95b |
|
IAA1 |
83d |
|
IBA0 |
88 c |
|
IBA0.5 |
100a |
|
IBA1 |
100a |
|
1/2 MS |
IAA0 |
100a |
IAA0.5 |
88 c |
|
IAA1 |
95b |
|
IBA0 |
100a |
|
IBA0.5 |
95b |
|
IBA1 |
95b |
حروف غیر مشابه نشاندهنده تفاوت معنیدار در سطح احتمال 1 درصد در بین میانگینها میباشند.
ترکیبهای اکسین بهطور متداول در ترکیب با سیتوکینین مورد استفاده قرار میگیرند. با اعمال تغییراتی در نوع و غلظت نسبی اکسینها و سیتوکینینها در محیط کشت، امکان القای رشدهای تمایز نیافته و با ریختزایی فراهم میگردد (10). هورمونهای سیتوکینینی نظیر، BAPوKin در ترکیب با غلظتهای خیلی کم از هورمونهای اکسینی مانند، IAA و NAAبرای شاخسارهزایی تعداد بیشماری از گیاهان مورد استفاده قرار گرفته است (12،20و33).
در این پژوهش بیشترین نرخ باززایی مستقیم شاخساره در محیط MS حاوی 4/4 میکرومولار BAP در ترکیب با 2/2 میکرومولار IAA و کمترین نرخ باززایی در محیط MS حاوی 4/4 میکرومولار TDZ در ترکیب با 2/2 میکرومولار IAA مشاهده شد. در ازدیاد درون شیشهای گیاه علفی Pentanema indicum، بهترین محیط هورمونی 4 میکرومولار BAP در ترکیب با 1 میکرومولار IAA گزارش شد (28). جهت باززایی مستقیم در گیاه
Centaurium eryyhraeaبالاترین درصد باززایی شاخساره از ریزنمونه مریستم انتهایی در محیط حاوی 4/4 میکرومولار BAPمشاهده شد که با نتایج این بررسی مطابقت داشت (31). باززایی یک فرآیند فوق العاده پیچیده است که عوامل متعدد کمی و کیفی مانند خصوصیات ژنتیکی گیاه، موقعیت اولیه قلمه روی گیاه، سن قلمه، فصل، سال، میزان هورمونهای درونزا، اندازه قلمه، مقدار مواد تنظیمکننده رشد و غیره بر آن تأثیر میگذارند هورمون BAP به عنوان یک هورمون سیتوکینی قوی در مطالعات شناخته شده است و در اغلب تحقیقات کشت بافت گیاهی جهت بهبود باززایی مستقیم مورد استفاده قرار میگیرد.
Murck و همکاران (2000)، در بررسی اثر تنظیمکنندههای رشد شاملBAP ، IAA و TDZ بر روی باززایی مستقیم گل راعی گزارش کردند که بالاترین درصد باززایی شاخساره از ریزنمونه هیپوکوتیل در محیط هورمونی حاوی 5 میکرومولار TDZ به دست آمد (18). TDZ نسبت بهBAP وIAA در باززایی مؤثرتر بودکه با نتایج این مطالعه مغایرت داشت. جهت باززایی مستقیم در گیاه Arnebia euchroma، بالاترین درصد باززایی شاخساره از ریزنمونه برگ در محیط حاوی 5 میکرومولار TDZثبت گردیدکه با نتایج این مطالعه مغایرت نشان داد (16). این مغایرت عمدتا به تفاوتهای ژنتیکی گیاهان مورد مطالعه میتواند مربوط باشد و اثر مهم ژنوتیپ در قابلیت باززایی در شرایط درون شیشه باشد. در تحقیقی که بهمنظور بررسی اثر TDZ بر روی پرآوری شاخساره از ریزنمونه گره گیاه علفی Psoralea corylifoliaصورت گرفته بود از غلظتهای مختلف (5,3,2,1 ,5/0میکرومولار) TDZ استفاده شد. بیشترین تعداد شاخساره 6/13 در هر ریزنمونه در محیط حاوی 2 میکرومولارTDZ مشاهده گردید که با نتایج ما مطابقت داشت (15). یکی از فاکتورهای مؤثر بر روی رشدونمو در کشت درون شیشهای، تأثیر مواد گیاهی به ویژه ژنوتیپ میباشد. دامنه وسیعی از ظرفیت تولیدمثلی در سلسله گیاهان وجود دارد. معمولا تولید مثل گیاهان دولپهای نسبت به تکلپهایها بهتر میباشد. بین گیاهان یک گونه نیز تفاوتهای زیادی در تقسیم سلولی و توان تولیدمثلی وجود دارد (3). در ژنوتیپ اصفهان بیشترین درصد باززایی در محیط MS حاوی 4/4 میکرومولارBAP در ترکیب با 2/2 میکرومولار IAA به دست آمد. بیشترین درصد باززایی در ژنوتیپ ارومیه در محیط حاوی 4/4 میکرومولار TDZ در ترکیب با 2/2 میکرومولار IAA گزارش شد. بیشترین درصد باززایی در ژنوتیپ اشنویه در محیط 4/4 میکرومولار BAP در ترکیب با 2/2 میکرومولار IAA گزارش شد. در ژنوتیپ شاهیندژ بیشترین درصد باززایی در محیط حاوی 4/4 میکرومولار BAP در ترکیب با 2/2 میکرومولار IAA مشاهده شد. در همین راستا، اصغری (1389) نشان داد که اثر ژنوتیپهای مختلف ریحان (Ocimum basilicum) بر درصد و میانگین باززایی معنیدار میباشد که مشابه همین نتایج در این مطالعه نیز مشاهده گردید (1). مطالعه 4 ژنوتیپ مختلف از ریحان شامل ارومیه، همدان، اردبیل و مجارستان در محیط MS تکمیل شده با غلظتهای متفاوت BAP (صفر، 5/2، 5 و 5/7 میلیگرم در لیتر) بیشترین درصد باززایی را در ژنوتیپ مجارستان و در غلظت 5/2 میلیگرم در لیتر BAP با 90 درصد و میانگین 1/7 گیاهچه در هر ریزنمونه ثبت کردند. کالوسزایی در ریزنمونه های مختلف رز گالیکا نیز تحت تأثیر هورمونی تغییر یافت و بالاترین درصد کالوس زایی در تیمارهای حاوی 3-2 میلیگرم توفوردی مشاهده گردید (5). در تحقیقی که به منظور بررسی اثرات ژنوتیپ و تنظیمکنندههای رشد در کشت ریزنمونههای زوفا (Hyssopus officinalis) انجام گرفته بود، نشان داده شد که در بین ژنوتیپهای موجود، ریزنمونههای ژنوتیپهای همدان و مشهد با 86 درصد شاخسارهزایی دارای بیشترین درصد باززایی میباشند. نتایج این تحقیق مشخص ساخت که ترکیبات هورمونی 4/4 و 2/2 میکرومولار در لیتر BAP به ترتیب برای ژنوتیپهای همدان و مشهد بهترین ترکیب برای باززایی شاخساره از ریزنمونه گره هستند. در ژنوتیپ شیراز بهترین نتیجه (80 درصد) با ترکیب هورمونیBAP با غلظت 4/4 میکرومولار BAP گزارش گردید که با نتابج این مطالعه مطابقت دارد (7). بهنظر میرسد وجود تفاوتهای ژنتیکی در بین ژنوتیپهای مورد مطالعه و تاثیر غیر قابل انکار ژنهای دخیل در فرآیند باززایی باعث وجود تغییرات متنوع درصد باززایی در بین ژنوتیپهای مورد مطالعه باشد.
اکثر گیاهان برای القای مؤثر ریشهزایی به اکسین نیازمندند. برای ریشهدهی گیاهان علفی اغلب از اکسین ضعیف (IAA) در غلظتهای بین 10-1/0 میلیگرم در لیتر استفاده میشود. گیاهان چوبی نسبت به گیاهان علفی، به غلظت بالاتر اکسین نیازمندند. بهمنظور القای ریشه در گیاهان علفیIBA در غلظتهای بین 3-5/0 میلیگرم در لیتر و NAA در غلظتهای بین 1-05/0 میلیگرم در لیتر مؤثر هستند (14).
بیشترین درصد ریشهزایی، در محیطهای حاوی MS2/1 فاقد هورمون ،MS حاوی 5/0 و 1 میلیگرم در لیتر IBA مشاهده شد. بین MS و MS2/1 اختلاف معنیداری ملاحظه می شود. در مطالعه روی ریشهزایی گیاهچههای تولید شده کشت بافتی گیاه Alpinia officinarumبا سه نوع هورمون IAA، NAA و IBA در محیط 1/2 MS مشخص گردید بیشترین درصد ریشهزایی مربوط به هورمون IBA با غلظت 5/0 میلیگرم در لیتر بود که با نتایج ما مطابقت داشت (26). در ریشهزایی گیاهچههای ریزازدیادی شده Hemides musindicus، Spilanthes acmella و Naringi crenulata، محیط کشت 1/2 MS حاوی 1 میکرومولار IBA استفاده شد که با نتایج ما مطابقت داشت (19، 25 و 27).Pavendan و Rajasekaram (2011)،گزارش کردند که در گیاه
Eugenia singampattiana، بالاترین درصد ریشهزایی (98 درصد) و بیشترین تعداد ریشه در هر ریزنمونه (6/11 عدد) و بلندترین طول ریشه (3/6 سانتیمتر) در محیط کشت MS حاوی 5/0 میلیگرم در لیتر BAP مشاهده شد(20). در ریشهزایی گیاهچههای پرآوری شده Hydrastis camadensis از غلظتهای مختلف هورمون IBA استفاده شد. نتایج نشان داد بیشترین میزان توسعه ریشه در محیط 1/2 MS تکمیل شده با 1 الی 2 میکرومولار IBA به دست آمد. بیشترین درصد ریشهزایی (5/63 درصد) در غلظت 2 میکرومولار با حدود 8/3 ریشه در هر ریزنمونه با متوسط 4/8 میلیمتر به دست آمد. غلظت بهینه IBA برای ریشهزایی در این گیاه 1 میکرومولار با 2/58 درصد ریشهزایی و بیش از 4 ریشه در هر ریزنمونه به طول متوسط 2/13 میلیمتر بوده است که با نتایح این مطالعه مطابقت دارد (27).
نتیجهگیری نهایی
نتایج این مطالعه نشان داد که هم ژنوتیپهای مورد مطالعه و هم نوع و غلظت هورمونهای مورد استفاده از نظردرصد، میانگین باززایی و القای ریشه دارای تفاوت معنیدار میباشند. در بین ژنوتیپهای مورداستفاده، ژنوتیپ اصفهان دارای حداکثر باززایی شاخساره وژنوتیپ شاهیندژ دارای حداقل باززایی شاخساره بودند. در بین ترکیبهای مورد استفاده جهت القای باززایی نیز، ترکیب 4/4 میکرومولار BAP، دارای قابلیت باززایی بالاتری نسبت به سایر ترکیبهای مورد استفاده میباشد. همچنین محیط کشت پایه MS حاوی هورمون IBA، بالاترین درصد ریشهزایی را درژنوتیپ اصفهان تولید نمود.