Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)

In vitro micropropagation of an endangered orchid species (Orchis catasetum) through protocorm: the effect of plant growth regulators and iron Nano-chelate

Document Type : Research Paper

Abstract

Many orchid species are threatened with the danger of extinction. Here, a protocol was developed for high frequency in vitro multiplication of an endangered orchid, Orchis catasetum using plant growth regulators and iron Nano-chelate. Protocorms, as explants were cultured on Murashige and Skoog (MS) medium fortified with different concentrations of N6-benzyladenine (BA), α-naphthaleneacetic acid (NAA) and indole-3-butyric acid (IBA) either individually or in combination and iron Nano-chelate. A combination of 0.5 mg l-1 BA and 0.5 mg l-1 NAA was found to be suitable for maximum protocorm-like bodies (PLBs) regeneration (18.84/plantlet) from protocorm explants. The maximum number of root (6.94/plantlet) and leaf (9.50/plantlet), also the highest plant height (124.10 mm/plantlet) and root length (178.90 mm/plantlet) were obtained on MS medium supplemented with 0.5 mg l-1 BA a long with 0.5 mg l-1 NAA. Related to the effect of iron Nano-chelate, maximum plant height (82.79 mm/plantlets), maximum root number (4.76/plantlets) and root length (87.53 mm/plantlets) were observed in explants cultured in MS medium enriched with 0.13 mg l-1. Plantlets were transplanted to pots filled with perlite, wood pieces, ionolite and mineral cartridge shell (1:1:1:1), also perlite individually and transferred to the greenhouse. Upon ex vitro transfer, 100% of plants survived.

Keywords

Main Subjects

ریزازدیادی درون­شیشه­ای گونه­ای از ارکید در حال انقراض (Orchis catasetum) توسط پروتوکورم­ها: اثر تنظیم­کننده­های رشد گیاهی و نانوکلات آهن

بهزاد کاویانی1*، ناصر نگهدار2، احمد باکر3 و نینا مسافر1

1 رشت، دانشگاه آزاد اسلامی واحد رشت، دانشکده کشاورزی، گروه باغبانی 

2 آمل،  موسسه تحقیقاتی علوم کشاورزی و بیوتکنولوژی هیرکان

3 تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده کشاورزی، گروه باغبانی 

تاریخ دریافت: 15/2/94                تاریخ پذیرش: 27/2/95

چکیده

خطر انقراض برخی از گونه­های ارکید را تهدید می­کند. در اینجا یک روش کارامد برای تکثیر درون­شیشه­ای نوعی ارکید در حال انقراض (Orchis catasetum) با استفاده از تنظیم­کننده­های رشد گیاهی و نانوکلات آهن ارائه می­شود. پروتوکورم­ها، به­عنوان ریزنمونه، بر روی محیط موراشیگ و اسکوگ (MS) حاوی غلظت­های مختلف بنزیل آدنین (BA)، نفتالین استیک اسید (NAA)، ایندول بوتیریک اسید (IBA) و نانوکلات آهن کشت شدند. بیشترین باززایی اجسام شبه-­پروتوکورم (PLBs) (84/18 عدد در گیاهچه) از ریزنمونه­های پروتوکورم در محیط کشت حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA مشاهده شد. بیشترین تعداد ریشه (94/6 عدد در گیاهچه)، طول ریشه (90/178 میلی­متر در گیاهچه)، تعداد برگ (50/9 عدد در گیاهچه) و ارتفاع گیاهچه (10/124 میلی­متر در گیاهچه) در ریزنمونه­های کشت­شده در محیط MS غنی­شده با 5/0 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA به­دست آمد. در ارتباط با اثر نانوکلات آهن، بیشترین ارتفاع گیاهچه (79/82 میلی­متر در گیاهچه)، بیشترین تعداد ریشه (76/4 عدد در گیاهچه) و طول ریشه (53/87 میلی­متر در گیاهچه) در ریزنمونه­های کشت­شده در محیط MS غنی­شده با 13/0 میلی­گرم در لیتر مشاهده شد. تعداد اجسام شبه­-پروتوکورم و تعداد برگ در تیمارهای نانوکلات آهن نسبت به شاهد افزایشی را نشان ندادند. برای سازگاری، گیاهچه­ها به گلدان­های پرشده با پرلیت، خاک­اره، یونولیت و پوکه معدنی به نسبت مساوی منتقل شدند. گیاهچه­های سازگارشده، در گلدان­های حاوی پرلیت قرار گرفته و به گلخانه منتقل گردیدند. در شرایط درون­خاکی، 100 درصد گیاهان زنده ماندند و تغییر مورفولوژیکی نسبت به گیاهان مادری در آنها مشاهده نشد.

واژه­های کلیدی: بنه اولیه، تکثیر درون­شیشه­ای، نانوکودها، تنظیم­کننده­های رشد گیاهی  

* نویسندهمسئول، تلفن تماس: 09111777482، پست الکترونیکی: kaviani@iaurasht.ac.ir

مقدمه

 

ارکید با نام علمی Orchids catasetumاز خانواده Orchidaceae  و راسته  Gynandralesاست. گیاهان این خانواده تک­لپه، علفی و پایا هستند که  به­صورت انگل، ساپروفیت و خاکزی مشاهده می­شوند (6). ارکیدها با بیش از 800 جنس و 25000 گونه در سطح جهان، یکی از متنوع­ترین و تکامل­یافته­ترین خانواده­های گیاهان عالی هستند (6). پراکنش اکولوژیکی این گیاه در مناطق جنوب شرق آسیا و کشورهایی مانند چین، تایوان، هنگ­کنگ، تایلند، فیلیپین، مالزی و سنگاپور است. ارکیدها به­عنوان گیاهان زینتی رشد داده می­شوند و به­دلیل زیبایی و طول عمر بالای پس از برداشت­شان، به­صورت گل­های شاخه­بریده مورد استفاده قرار می­گیرند (6). تکثیر در مقیاس بالای ارکیدها، به­ویژه گونه­های هیبرید و در حال انقراض با استفاده از فنون کشت بافت، باعث شده است تا این گیاهان به­عنوان یکی از 10 گل شاخه­بریده­ برتر جهان مطرح باشند (6). تکثیر ارکید با بذر باعث تولید گیاهان هتروزیگوس می­شود. بنابراین، تکثیر درون­شیشه­ای یک روش متناوب مناسب برای ازدیاد ارکیدها می­باشد. دستورالعمل­های مختلفی برای ریزازدیادی گونه­های مختلف ارکید از طریق کشت درون­شیشه­ای بخش­های مختلف گیاه شامل سرشاخه، انتهای ریشه، ساقه، برگ، گره، جوانه، گل­آذین، ریزوم، جنین­های زیگوتی، کالوس و لایه­ نازک سلولی ارائه شده است (5، 8، 10، 11، 13، 15، 24، 25، 31، 32، 35، 37، 40، 41). ریزازدیادی از طریق اجسام شبه-پروتوکورم (PLBs)، به­دلیل اینکه این اجسام می­توانند بر روی محیط کشت جامد یا مایع به­سرعت تکثیر شوند و تعداد زیادی اجسام شبه-­پروتوکورم دیگر در یک دوره­ زمانی کوتاه تولید شوند، در مقایسه با نمو گیاهچه از بذر یا شاخه­های نابجا، مؤثرتر است (18). پروتوکورم­ها یا بنه­های اولیه غده­هایی هستند که توسط بذرها و از رویش آنها تولید می­شوند. چنانچه از این پروتورکورم­ها یا سایر اندام­های رویشی برای تکثیر درون­شیشه­ای استفاده شود، ابتدا اجسام شبه-­پروتوکورم به­وجود می­آید که برای استفاده­ به­عنوان ریزنمونه بسیار مناسب هستند. مطالعات فراوان آشکار کرده است که بهینه­سازی ترکیب محیط کشت، یک رویکرد مهم برای اصلاح مراحل ریزازدیادی ارکیدها با کشت­کردن اجسام شبه-­پروتوکورم است که همچنین به گونه و رقم بستگی دارد (17، 34). تلاش­های زیادی برای دستیابی به روش مناسب برای ریزازدیادی مؤثر اجسام شبه-­پروتوکورم به­ویژه با تغییر ترکیب تنظیم­کننده­های رشد گیاهی مانند BA، تیدیازورون (TDZ)، بنزیل­آمینوپورین (BAP)، NAA، 3-ایندول استیک اسید (IAA) و اسید ژیبرلیک (GA3) انجام شده است (19، 22، 23، 26، 28، 29، 30، 36). سیتوکینین­ها مهمترین عوامل اصلاح باززایی گیاهان از اجسام شبه-­پروتوکورم هستند (17، 21، 22).

کاربرد موفقیت­آمیز انواع ذرات نانو در پزشکی، توجه را به­سمت استفاده از فناوری نانو (نانوتکنولوژی) در کشاورزی برای افزایش کمی و کیفی محصولات زراعی و باغی معطوف کرد. این فناوری موجب آزادشدن ترکیبات شیمیایی موجود در این ذرات به­صورت هدفمند شده و بعد جذب گیاه می­شوند و در بدنه­ گیاه نیز به بافت­های مورد نظر می­رسند و باعث کاربرد مؤثر مواد معدنی و افزایش رشد گیاه می­شوند. کاربرد مؤثر مواد غذایی، افزایش رشد کمی و کیفی گیاه را به­دنبال دارد. تغییر شکل مواد در مقیاس نانو، ویژگی­های فیزیکی، شیمیایی، بیولوژیکی و فعالیت­های کاتالیتیک آنها را تغییر می­دهد. ناحیه سطحی ویژه­ اغلب مواد در مقیاس نانو، فعالیت شیمیایی و زیستی­شان را افزایش می­دهد. بنابراین، خواص جدید در ذرات نانو مانند حلالیت بیشتر، فعالیت شیمیایی بیشتر و توانایی نفوذ به­درون غشای سلول ظاهر می­شود. نانوکلات آهن می­تواند به­عنوان یک منبع غنی و قابل اطمینان آهن بی­والنت برای گیاه، به­دلیل پایداری بالا و رهاسازی تدریجی آهن در طیف وسیعی از اسیدیته (11-3) مورد بررسی بیشتر قرار گیرد. مزیت دیگر نانوکلات آهن، میزان بیشتر آهن فروس نسبت به آهن فریک در سطح کلات است که سنتز بیشتر کلروفیل را در گیاه باعث می­شود. البته کاربرد کودهای نانو در شرایط کشت درون­شیشه‌ای بسیار محدود است. پیشرفت در این زمینه، نیازمند مطالعات بیشتر می­باشد. خطر انقراض نسل، بسیاری از گونه­های ارکید از جمله Orchis catasetum را تهدید می­کند (17، 21، 22). در این پژوهش، تکثیر و رشد ارکید Orchis catasetum تحت شرایط کنترل­شده­ کشت بافت در حضور و غیاب BA، IBA و NAA مورد ارزیابی قرار گرفته است. همچنین به اثر غلظت­های مختلف نانوکلات آهن در شرایط درون­شیشه­ای روی برخی صفات مورفولوژیکی و باززایی اجسام شبه­-پروتوکورم پرداخته شده است.

مواد و روشها

پروتوکورم­های سالم و گندزدایی­شده­ ارکید، از یک آزمایشگاه تجاری و تحقیقاتی کشت بافت گیاهی واقع در شهر محلات تهیه شدند و به­عنوان ریزنمونه مورد استفاده قرار گرفتند. پروتوکورم­ها در محیط کشت موراشیگ و اسکوگ (MS) همراه با 3 درصد (وزن به حجم) سوکروز و 8/0 درصد آگار-آگار کشت شدند. اسیدیته (pH) محیط­های کشت، قبل از اتوکلاو، با اسید کلریدریک یا هیدروکسید سدیم بر روی 2/0 ± 7/5 تنظیم شد. محیط­های کشت در اتوکلاو با دمای 121 درجه­ سانتی‌گراد و فشار 105 کیلوگرم در سانتی­متر مربع به­مدت 20 دقیقه ضدعفونی شدند. تمام کشت­ها در اتاقک رشد با دمای 2 ± 24 درجه سانتی­گراد تحت نور سفید فلورسنت (56 میکرومول بر متر مربع بر ثانیه) با دوره­ نوری 16 ساعت قرار داده شدند.

اثر تنظیم­کننده­های رشد گیاهی و نانوکلات آهن افزوده­شده به محیط MS بر روی تکثیر پروتوکورم و رشد و نمو بعدی گیاهچه­ها ارزیابی شد. پروتوکورم­ها در محیط MS حاوی BA (0، 2/0، 5/0، 1، 5/1 و 3 میلی­گرم بر لیتر)، IBA (0 و 5/0 میلی­گرم بر لیتر)، NAA (0 و 5/0 میلی­گرم بر لیتر) و نانوکلات آهن (0، 13/0، 34/0 و 70/0 میلی­گرم بر لیتر) کشت شدند. برای هر تیمار، 3 ظرف پتری در نظر گرفته شد و در هر ظرف پتری، 4 پروتوکورم کاشته شد. ریزنمونه­ها ترکیبات فنولیک را به­درون محیط­های کشت ترشح می­کنند، بنابراین، 5/0 میلی­گرم بر لیتر ذغال فعال­شده به محیط­ها افزوده شد. ذغال فعال­شده، ترکیبات فنولیک را جذب می­کند. 60 روز بعد از آغاز کشت، تعداد اجسام شبه-­پروتوکورم باززایی­شده، ارتفاع گیاه، تعداد برگ، تعداد ریشه و طول ریشه اندازه­گیری شدند.

واحدهای آزمایشی در یک طرح بلوک کاملا تصادفی (RCBD) آرایش یافتند. هر آزمایش در 3 تکرار انجام شد و هر تکرار شامل 4 نمونه بود (در مجموع 12 نمونه برای هر تیمار). داده­ها توسط تجزیه­ واریانس (ANOVA)، با استفاده از نرم­افزار MSTAT-C آنالیز شدند و میانگین آنها با استفاده از آزمون چند دامنه­ا­ی دانکن (DMRT) در سطح احتمال 99 درصد مورد مقایسه قرار گرفتند.

نتایج

اثر BA و IBA یا NAA بر روی باززایی پروتوکورم و تولید اجسام شبه-پروتوکورم: تعداد اجسام شبه-پروتوکورم تحت تأثیر حضور BA، IBA و NAA در محیط MS قرار دارد. اثر BA، IBA و NAA، به­تنهایی یا در ترکیب با یکدیگر روی باززایی و رشد پروتوکورم در جدولهای 1 و 2 نشان داده شده است. یک ترکیب از 5/0 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA، بیشترین باززایی اجسام شبه-پروتوکورم (84/18 عدد در گیاهچه) را القا کرد (شکل 1). در میان تمام تیمارهای BA، بالاترین باززایی اجسام شبه-پروتوکورم (20/12 عدد در گیاهچه) از پروتوکورم در محیط حاوی 2/0 میلی­گرم در لیتر آن به­دست آمد. غلظت­های بالاتر BA، باززایی بیشتر اجسام شبه-پروتوکورم را باعث نشدند. کمترین تعداد اجسام شبه-پروتوکورم (10/5 و 15/5 عدد در گیاهچه) به­ترتیب در محیط­های غنی­شده با 5/1 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA و 3 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA مشاهده شد. ارتباط مثبتی بین افزایش غلظت BA و افزایش تعداد اجسام شبه-پروتوکورم وجود ندارد (جدول 1). تجزیه­ واریانس داده­ها نشان داد که اختلاف معنی­داری (p≤0.01) در میان غلظت­های مختلف BA همچنین اثر متقابل BA و IBA یا NAA برای تعداد اجسام شبه-پروتوکورم وجود دارد. اثر IBA و NAA بر روی تعداد اجسام شبه-پروتوکورم معنی­دار نبود (جدول 2).

اثر BA و IBA یا NAA بر روی ارتفاع گیاهچه: اثر BA، IBA و NAA بر روی ارتفاع گیاهچه معنی­دار نبود (جدول 2). در میان غلظت­های مختلف BA، 2/0 میلی­گرم بر لیتر، بیشترین تأثیر را بر روی افزایش ارتفاع گیاهچه­ها (102 میلی­متر در گیاهچه) داشت (جدول 1). بالاترین ارتفاع گیاهچه­ها (10/124 میلی­متر در گیاهچه) در محیط حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA آن به­دست آمد (جدول 1).

 

 

جدول 1- اثر ساده و متقابل BA و IBA یا NAA بر روی تکثیر و رشد ارکید Orchis catasetum

طول ریشه

(میلی­متر)

تعداد ریشه

تعداد برگ

ارتفاع گیاهچه

(میلی­متر)

تعداد اجسام شبه-پروتوکورم

 

تنظیم­کننده­های رشد گیاهی (میلی­گرم در لیتر)

 

 

 

 

 

 

NAA

IBA

BA

88/81d-g

30/4c-f

30/7b-d

50/75b-d

80/10b-d

0

0

0

10/102b-d

30/5b-d

86/8ab

00/102a

20/12c-e

0

0

2/0

13/50fg

08/2i

00/4i

00/40f

80/10c-e

0

0

5/0

50/90d-g

20/4d-g

60/5d-i

50/64c-f

10/8e-g

0

0

1

50/60e-g

10/5c-e

00/7b-f

30/46ef

20/9d-g

0

0

5/1

40/101b-e

70/4c-f

70/5c-i

37/47ef

10/10de

0

0

3

20/88d-g

30/4d-g

80/6ab

02/42f

00/11c-e

0

5/0

0

35/74d-g

80/3e-h

40/4g-i

77/38f

20/12b-d

0

5/0

2/0

12/93c-f

60/5bc

08/8a-c

95/66c-f

50/14bc

0

5/0

5/0

92/48fg

90/2g-i

70/4f-i

25/49d-f

00/9d-g

0

5/0

1

25/46g

60/2hi

12/4i

00/41f

60/9d-g

0

5/0

5/1

67/73d-g

00/4e-h

20/5e-i

75/57c-f

10/10c-e

0

5/0

3

20/90d-g

50/4d-g

88/6ab

00/49d-f

50/12b-d

5/0

0

0

58/56fg

08/3g-i

40/4hi

58/51d-f

00/6gh

5/0

0

2/0

90/178a

94/6a

50/9a

10/124a

84/18a

5/0

0

5/0

20/124bc

95/5ab

00/8a-d

13/84bc

60/15b

5/0

0

1

77/57bc

90/3e-h

20/7b-e

73/64c-f

10/5h

5/0

0

5/1

67/64d-g

40/3f-i

60/5d-i

92/53d-f

15/5h

5/0

0

3

در هر ستون میانگین­هایی که دارای حروف همسان هستند در سطح احتمال 5 درصد آزمون چند دامنه­ای دانکن تفاوت معنی­داری با هم ندارند.

جدول 2- تجزیه واریانس اثر غلظت­های مختلف تنظیم­کننده­های رشد گیاهی روی تکثیر و رشد ارکید Orchis catasetum

منبع تغییرات

درجه­ آزادی

تعداد اجسام شبه­-پروتوکورم

ارتفاع گیاهچه

تعداد برگ

تعداد ریشه

طول ریشه

اکسین (A)

3

ns70/7

*69/1101

*84/6

**40/3

*36/2583

سیتوکینین ( (B

5

**30/66

**96/1192

**32/6

ns69/1

**12/3673

A × B

15

**23/475

**60/963

**46/8

**64/5

**77/3519

خطا

48

51/182

18/283

11/2

73/0

27/725

ضریب تغییرات  (%)

-

70/19

21/26

17/22

03/19

78/31

**: معنی­دار در سطح 01/0، *: معنی­دار در سطح 05/0 وns : عدم معنی­داری

 

شکل 1- ریزازدیادی ارکید Orchis catasetum با استفاده از پروتوکورم. 1: پروتوکورم استفاده­شده به­عنوان ریزنمونه (مقیاس = 1 سانتی­متر)؛ 2: یک پروتوکورم در حال توسعه (مقیاس = 1 سانتی­متر)؛ 3: گیاهچه­های به­دست­آمده از محیط­های کشت غنی­شده با غلظت­های مختلف تنظیم­کننده­های رشد (مقیاس = 2 سانتی­متر). در این گیاهچه­ها تفاوت ارتفاع مشخص است؛ 4: سرشاخه­های ریزازدیادی­شده از پروتوکورم کشت­شده بر روی محیط MS حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA، (مقیاس = 1 سانتی­متر). در این شکل، برگ­های توسعه­یافته کاملا مشخص است؛ 5: گیاهچه­های به­دست­آمده از محیط­های کشت غنی­شده با غلظت­های مختلف تنظیم­کننده­های رشد (مقیاس = 2 سانتی­متر). در این گیاهچه­ها تفاوت ارتفاع و ریشه­ها مشخص است؛ 6: مراحل سازگاری گیاهچه­های تولیدشده در شرایط درون­شیشه­ای به شرایط درون­خاکی (مقیاس = 2 سانتی­متر).


5/0 میلی­گرم در لیتر BA و 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA، به­تنهایی برای القای ارتفاع بهینه­ گیاهچه مناسب نبودند، زیرا آنها تنها 40 و 49 میلی­متر طول را در هر گیاهچه تحریک کردند (جدول 1). کمترین ارتفاع گیاهچه­ها (77/38 میلی­متر در گیاهچه) در محیط حاوی 2/0 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر IBA ثبت شد (جدول 1). 

اثر BA و IBA یا NAA بر روی تعداد برگ: ریزنمونه­های کشت­شده در حضور 5/0 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA، بیشترین تعداد برگ (50/9 برگ در هر گیاهچه) را تولید کردند، که این تعداد بیش از 2 برابر تعداد برگ­های تولیدشده در ریزنمونه­های کشت­شده در محیط حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر BA، به­تنهایی است (جدول 1). در میان تمام تیمارهای BA، بیشترین تعداد برگ (86/8 عدد در گیاهچه) در محیط حاوی 2/0 میلی­گرم در لیتر آن به­دست آمد. تجزیه­ واریانس داده­ها، اختلاف معنی­داری را در میان غلظت­های مختلف BA (p≤0.01)، IBA و NAA (p≤0.05)، همچنین اثر متقابل BA و IBA یا NAA (p≤0.01) بر روی تعداد برگ نشان داد (جدول 2).

اثر BA و IBA یا NAA بر روی تعداد و طول ریشه: تعداد و طول ریشه، تحت تأثیر حضور BA، IBA و NAA در محیط MS قرار دارند. اثر BA، IBA و NAA، به­تنهایی یا در ترکیب با یکدیگر بر روی تعداد و طول ریشه در جدول 1 نشان داده شده است. یک ترکیب از 5/0 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA، بیشترین تعداد ریشه (94/6 عدد در گیاهچه) و بالاترین طول ریشه (90/178 میلی­متر در گیاهچه) را القا کرد. ترکیبی از 1 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر NAA، تیمار مناسبی برای القای تعداد ریشه (95/5 عدد در گیاهچه) و طول ریشه (20/124 میلی­متر در گیاهچه) بود. در میان تمام تیمارهای BA، بیشترین تعداد ریشه (30/5 عدد در گیاهچه) و طول ریشه (10/102 میلی­متر در گیاهچه) در محیط MS حاوی 2/0 میلی­گرم در لیتر آن محاسبه شد (جدول 1؛ شکل 1). غلظت­های بالاتر BA، تعداد و طول بیشتر ریشه را القا نکرد. کمترین تعداد ریشه (08/2 عدد در گیاهچه) در محیط­ غنی­شده با 5/0 میلی­گرم در لیتر BA مشاهده شد. همچنین، کمترین طول ریشه (25/46 میلی­متر در گیاهچه) در محیط­های غنی­شده با 5/1 میلی­گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی­گرم در لیتر IBA محاسبه شد (جدول 1). ارتباط مثبتی بین افزایش غلظت BA و افزایش تعداد و طول ریشه وجود ندارد (جدول 1). تجزیه­ واریانس داده­ها نشان داد که اختلاف معنی­داری (p≤0.01) در میان غلظت­های مختلف BA همراه با IBA یا NAA برای تولید ریشه وجود دارد (جدول 2).

اثر نانوکلات آهن بر روی باززایی پروتوکورم: باززایی پروتوکورم­ها تحت تأثیر نانوکلات آهن در محیط MS قرار گرفت. بیشترین تعداد اجسام شبه-پروتوکورم (20/10 عدد در گیاهچه) در تیمار شاهد به­دست آمد (جدول 3، شکل 2). در میان تمام تیمارهای نانوکلات آهن، بالاترین باززایی اجسام شبه-پروتوکورم (18/10 عدد در گیاهچه) در محیط حاوی 13/0 میلی­گرم در لیتر آن به­دست آمد. کمترین تعداد اجسام شبه-پروتوکورم (61/6 عدد در گیاهچه) در تیمار 70/0 میلی­گرم به­دست آمد (جدول 3). تجزیه­ واریانس داده­ها نشان داد که اختلاف معنی­داری (p≤0.01) در میان غلظت­های مختلف نانوکلات آهن روی تعداد اجسام شبه-پروتوکورم وجود دارد (جدول 4).

 

 

شکل 2- اثر غلظت­های مختلف نانوکلات آهن بر ریزازدیادی ارکید Orchis catasetum با استفاده از پروتوکورم. 1: اثر نانوکلات آهن بر ارتفاع گیاهچه (مقیاس = 1 سانتی­متر)؛ 2: ریشه­ توسعه­یافته در محیط حاوی نانوکلات آهن (مقیاس = 1 سانتی­متر)؛ 3: اثر نانوکلات آهن بر تعداد اجسام شبه-­پروتوکورم (مقیاس = 2 سانتی­متر)؛ 4: اثر نانوکلات آهن بر تعداد برگ (مقیاس = 2 سانتی­متر). در این شکل، برگ­های توسعه­یافته کاملا مشخص است؛ 5: اثر نانوکلات آهن بر تعداد ریشه؛ 6: مراحل سازگاری گیاهچه­های تولیدشده در شرایط درون­شیشه­ای به شرایط درون­خاکی (مقیاس = 2 سانتی­متر).


اثر نانوکلات آهن بر روی ارتفاع گیاهچه: اثر نانوکلات آهن بر روی ارتفاع گیاهچه معنی­دار بود (p≤0.01) (جدول 4). بالاترین ارتفاع گیاهچه­ها (79/82 میلی­متر در گیاهچه) در محیط حاوی 13/0 میلی­گرم در لیتر نانوکلات آهن به­دست آمد (جدول 3). کمترین ارتفاع گیاهچه­ها (78/65 میلی­متر در گیاهچه) در محیط حاوی 34/0 میلی­گرم در لیتر نانوکلات آهن ثبت شد (جدول 3).

اثر نانوکلات آهن بر روی تعداد برگ: ریزنمونه­های کشت­شده در محیط کشت بدون نانوکلات آهن (شاهد)، بیشترین تعداد برگ (76/6 برگ در هر گیاهچه) را تولید کردند (جدول 3). در میان تمام تیمارهای نانوکلات آهن، بیشترین تعداد برگ (64/6 عدد در گیاهچه) در محیط حاوی 13/0 میلی­گرم در لیتر آن به­دست آمد. کمترین تعداد برگ (05/4 عدد در گیاهچه) در محیط حاوی 34/0 میلی­گرم در لیتر نانوکلات آهن به­دست آمد. تجزیه­ واریانس داده­ها، اختلاف معنی­داری را در میان غلظت­های مختلف نانوکلات آهن (p≤0.01) بر روی تعداد برگ نشان داد (جدول 4).

اثر نانوکلات آهن بر روی تعداد و طول ریشه: غلظت 13/0 میلی­گرم در لیتر نانوکلات آهن، بیشترین تعداد ریشه (76/4 عدد در گیاهچه) و بالاترین طول ریشه (53/87 میلی­متر در گیاهچه) را القا کرد (جدول 3). کمترین تعداد ریشه (17/3 عدد در گیاهچه) در محیط­ غنی­شده با 70/0 میلی­گرم در لیتر نانوکلات آهن مشاهده شد. همچنین، کمترین طول ریشه (53/72 میلی­متر در گیاهچه) در محیط­های غنی­شده با 34/0 میلی­گرم در لیتر نانوکلات آهن محاسبه شد (جدول 3). تجزیه­ واریانس داده­ها نشان داد که اختلاف معنی­داری در میان غلظت­های مختلف نانوکلات آهن برای تولید ریشه وجود ندارد (جدول 4). این اختلاف در ارتباط با طول ریشه معنی­دار بود .(p≤0.01)

 

جدول 3- اثر ساده­ غلظت­های مختلف نانوکلات آهن روی تکثیر و رشد ارکید Orchis catasetum

طول ریشه

(میلی­متر)

تعداد ریشه

تعداد برگ

ارتفاع گیاهچه

(میلی­متر)

تعداد اجسام شبه-پروتوکورم

نانوکلات آهن (میلی­گرم در لیتر)

56/79b

22/4a

76/6a

77/76a

20/10a

0

53/87a

76/4a

64/6a

79/82a

18/10a

13/0

42/72c

07/4a

87/5a

78/65b

33/8b

34/0

67/73bc

17/3a

05/4b

61/66b

61/6c

70/0

در هر ستون میانگین­هایی که دارای حروف همسان هستند در سطح احتمال 5 درصد آزمون چند دامنه­ای دانکن تفاوت معنی­داری با هم ندارند. 

جدول 4- تجزیه واریانس اثر غلظت­های مختلف نانوکلات آهن روی تکثیر و رشد ارکید Orchis catasetum

منبع تغییرات 

درجه­ آزادی

تعداد اجسام شبه­-پروتوکورم

ارتفاع گیاهچه

تعداد برگ

تعداد ریشه

طول ریشه

تکرار

4

28/7

13/2

29/1

02/2

55/0

تیمار

3

**44/15

**02/8

**50/13

ns15/1

**36/10

خطا

12

-

-

-

-

-

ضریب تغییرات  (%)

-

09/11

31/10

75/15

92/33

22/8

**: معنی­دار در سطح 01/0، *: معنی­دار در سطح 05/0 وns : عدم معنی­داری


بحث

اجسام شبه-­پروتوکورم (PLBs) می­توانند برای ازدیاد سریع ارکیدها مورد استفاده قرار گیرند. افزودن غلظت­های کم BA و NAA، تکثیر و رشد گیاهچه­های ارکید Orchis catasetum را تحریک کرد. استفاده­ ترکیبی از BA و NAA، برای ریزازدیادی این ارکید در حال انقراض، پیشنهاد می­شود. اگرچه، این مقاله می­تواند غلظت 2/0 میلی­گرم در لیتر BA را به­عنوان یک تنظیم­کننده­ رشد گیاهی منفرد برای تحریک تشکیل سرشاخه و تولید ریشه معرفی کند. اما نتایج مشابهی توسط کالیموتو و همکاران (12) بر روی ارکید  Oncidium sp.به­دست آمد. این محققان نشان دادند که بیشترین تشکیل اجسام شبه-­پروتوکورم و بیشترین تعداد سرشاخه و ریشه در محیط­ غنی­شده با 2/0 میلی­گرم در لیتر BAP مشاهده شد. BAP به­تنهایی نسبت به ترکیب آن با NAA بهتر بود. البته، 2 میلی­گرم در لیتر BAP به­تنهایی یا در ترکیب با 5/1 میلی­گرم در لیتر NAA تعداد ریشه­ مشابهی (100 درصد) را بر روی سرشاخه القا کرد. از آنجایی­که بذر ارکید بدون آندوسپرم است، بنابراین به شرایط محیطی و مغذی ویژه­ای برای جوانه­زنی نیاز دارد (4). اجسام شبه-­پروتوکورم، یک اندام ناقص و ابتدایی است که به شاخه­ جدید تمایز می­یابد. سلول­های اجسام شبه­-پروتوکورم بسیار مریستمی هستند، بنابراین می­تواند برای ازدیاد افزایش­یافته و تولید هم­زمان گیاهچه­های ارکید به­کار رود (38). اجسام شبه-­پروتوکورم توسط بسیاری از محققان به­عنوان ریزنمونه برای ریزازدیادی بسیاری از گونه­های کمیاب و در خطر انقراض ارکید به­کار برده می­شوند (7، 9، 20، 28، 31، 33، 39). ارکیدها برای نمو گیاهچه به اکسین­ها و سیتوکینین­ها نیاز دارند (28). نوع و غلظت تنظیم­کننده­های رشد گیاهی نقش مهمی در طی ریزازدیادی بسیاری از ارکیدها ایفا می­کنند (3). این مطالعه­ اثر مثبت BA را برای تولید بیشینه­ اجسام شبه-­پروتوکورم نشان داد. BA در ترکیب با NAA مؤثرتر عمل کرد. این یافته­ها با برخی یافته­های دیگر در طی ریزازدیادی ارکیدها مطابقت دارد (28، 31). مطالعه­ لو و همکاران (17) بر روی ریزازدیادی ارکید Dendrobium huoshanense نشان داد که بیشترین تشکیل سرشاخه در محیط کشت حاوی 15-5 میکرومولار iP-2 تشکیل شد. چندین مطالعه، اثر مثبت BAP، NAA، TDZ و کینتین (KIN) را برای باززایی گیاهچه از اجسام شبه-­پروتوکورم نشان داد (6، 16، 21). BAP و NAA بیشترین کاربرد را در ریزازدیادی اغلب ارکیدها دارند (6). این تنظیم­کننده­های رشد گیاهی نقش مؤثری در ریزازدیادی سایر گیاهان زینتی ایفا می­کنند (1، 2). لو و همکاران (16) نشان دادند که 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP برای القای اجسام شبه­-پروتوکورم (15 عدد در ریزنمونه­ ساقه) طی 6 هفته، بهترین بود. 5/0 میلی­گرم در لیتر KIN نیز برای تشکیل اجسام شبه-­پروتوکورم مناسب بود. BAP در ترکیب با NAA برای دستیابی به بیشترین تعداد اجسام شبه-­پروتوکورم طی برخی مطالعات پیشنهاد شده است (14، 27). البته یافته­های ما در تناقض با این نتایج است. اگرچه لو و همکاران (16) نشان دادند که NAA افزوده­شده به محیط حاوی غلظت بهینه­ BAP به­طور معنی­داری پاسخ ریزنمونه­های Dendrobium densiflorum را اصلاح نکرد و حتی تولید اجسام شبه-پروتوکورم در غلظت­های بیش از 1 میلی­گرم در لیتر کاهش یافت. در برخی ارکیدها، IBA ریشه­زایی را القا کرد. در این مطالعه­، NAA برای ریزازدیادی Orchis catasetum، بسیار مؤثرتر از IBA بود. مطالعه­ روی و همکاران (28) بر روی نوعی وانیل (Vanda coerulea)، یک ارکید در خطر انقراض، نشان داد که یک ترکیب سازگار بین 36/5 میکرومولار از NAA و 80/3 میکرومولار BAP موجب تولید حداکثری اجسام شبه-­پروتوکورم شد. 

ریزازدیادی ارکیدهای کمیاب و در خطر انقراض در مقیاس وسیع، به­دلیل ارزش تجاری­ و حفاظت آنها باید توسعه یابد. یک نسبت مناسب از اکسین­ها و سیتوکینین­ها برای تکثیر بهینه­ اجسام شبه-­پروتوکورم مورد نیاز است. کارایی نوع و غلظت تنظیم­کننده­های رشد گیاهی برای گونه­ها و ارقام مختلف ارکید، متفاوت است. BA و NAA در غلظت ویژه برای تولید و رشد اجسام شبه-­پروتوکورم Orchis catasetum مناسب هستند.

با توجه به جدیدبودن فناوری نانو و روند رو به رشد مطالعات در این فناوری، گزارش­های زیادی درباره­ اثر این کود بر روی شاخص­های رشد و نمو گیاهان وجود ندارد. گزارش‌های موجود در ارتباط با کشت خاکی برخی گیاهان و اثر نانوکودها بر روی مورفولوژی و فیزیولوژی آنها می­باشد. مطالعه روی اثر نانوذرات به­ویژه نانوکلات آهن در شرایط کشت بافت بسیار محدود است. مقایسه­ نتایج حاصل از اثر تنظیم­کننده­های رشد گیاهی و نانوکلات آهن در این مطالعه­ نشان داد که تنظیم­کننده­های رشد گیاهی از پتانسیل بسیار بالاتری برای تغییر مثبت صفات اندازه­گیری­شده در ارکید برخوردار هستند. این بررسی نشان داد که تعداد اجسام شبه-­پروتوکورم، ارتفاع گیاهچه، تعداد برگ، تعداد ریشه و طول ریشه در گیاهچه­های رشدکرده در محیط­های کشت حاوی تنظیم­کننده­های رشد گیاهی بسیار بیشتر از گیاهچه­های رشدکرده در محیط­های کشت حاوی نانوکلات آهن بودند. بنابراین استفاده از نانوکلات آهن در ریزازدیادی ارکید Orchis catasetumتوصیه نمی­شود.

1-      قلی­زاده، ف.، غلامی، ل. و کیارستمی، خ.، 1393. بررسی اثر محیط­های کشت پایه و تیمارهای مختلف هورمونی بر ریزازدیادی گل محمدی (Rosa damascene Mill.). مجله پژوهش­های گیاهی (مجله زیست­شناسی ایران). 27 (1): 121-129.
2-      کاویانی، ب. و غفاری ایسی­زاد، س.، 1394. اثر غلظت­های مختلف نفتالن­استیک­اسید و کینتین بر روی ریزازدیادی گیاه زینتی لیسیانتوس (Eustoma grandiflorum). مجله پژوهش­های گیاهی (مجله زیست­شناسی ایران). 28 (4): مقاله آماده انتشار.
 
3-      Arditti, J. and Ernst, R., 1993. Micropropagation of orchids. John Wiley and Sons. New York.
4-      Arditti, J., Ernest, R., Yam, T.W. and Glabe, C., 1990. The contribution to orchid mycorhizal fungi to seed germination: a speculative review, Lindleyana. 5: 249-255.
5-      Bhadra, S.K. and Hossain, M.M., 2003. In vitro germination and micropropagation of Geodorum densiflorum (Lam.) Schltr., an endangered orchid species. Plant Tissue Cult., 13: 165-171.
6-      Chugh, S., Guha, S. and Rao, U., 2009. Micropropagation of orchids: A review on the potential of different explants. Sci. Hortic., 122: 507-520.
7-      Dev, C.R. and Temjensangba, 2006. In vitro propagation of threatened terrestrial orchid Malaxis khasiana Soland ex. Swartz through immature seed culture. Ind. J. Exp. Biol., 44: 762-766.
8-      Geetha, S. and Shetty, S.A., 2000. In vitro propagation of Vanilla planifolia, a tropical orchid. Curr. Sci., 71: 886-889.
9-      Hossain, M.M., Sharma, M., Teixeira da Silva, J.A. and Phthak, P., 2010. Seed germination and tissue culture of Cymbidium giganteum Wall. Ex. Lindl. Sci. Hortic., 123: 479-487.
10-   Janarthanam, B., Seshadri, S., 2008. Plantlet regeneration from leaf derived callus of Vanilla planifolia Andr. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant, 44: 84-89.
11-   Kalimuthu, K., Senthikumar, R. and Murugalatha, N., 2006. Regeneration and mass multiplication of Vanilla planifolia Andr.-a tropical orchid. Curr. Sci., 91: 1401-1403.
12-   Kalimuthu, K., Senthikumar, R. and Vijayakumar S., 2007. In vitro micropropagation of orchid, Oncidium sp. (Dancing Dolls). Afr. J. Biotech., 6 (10): 1171-1174.
13-   Ket, N.V., Hahn, E.J., Park, S.Y. and Paek, K.Y., 2004. Micropropagation of an endangered orchid Anectochilus formosanus. Biol. Plant, 48: 339-344.
14-   Kim, M.S. and Kim, J.Y., 2003. Micropropagation of Dendrobium hybrids through shoot tip culture. Acta Hortic., 624: 527-533.
15-   Kuo, H.I., Chen, J.T. and Chang, W.C., 2005. Efficient plant regeneration through direct somatic embryogenesis from leaf explants of Phalaenopsis 'Little Steve'. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant, 41: 453-456.
16-   Luo, J.P., Wang, Y., Zha, X.Q. and Huang, L., 2008. Micropropagation of Dendrobium densiflorum Lindle. ex Wall. through protocorm-like bodies: effect of plant growth regulators and lanthanoids. Plant Cell Tiss. Organ Cult., 93: 333-340.
17-   Luo, J.P., Wawrosch, C. and Kopp, B., 2009. Enhanced micropropagation of Dendrobium huoshanense C.Z. Tang et S.J. Cheng through protocorm-like bodies: The effect of cytokinins, carbohydrate sources and cold pretreatment. Sci. Hortic., 123: 258-262.
18-   Luo, J.P., Zha, X.Q. and Jiang, S.T., 2003a. Suspension culture of protocorm-like bodies from the endangered medicinal plant Dendrobium huoshanenese. China J. Chinese Mater. Med., 28: 611-614.
19-   Malabadi, R.B., Mulgund, G.S. and Kallappa, N., 2005. Micropropagation of Dendrobium nobile from shoot tip sections. J. Plant Physiol., 162: 473-478.
20-   Nagaraju, V. and Mani, S.K., 2005. Rapid in vitro propagation of orchid Zygopetalum intermedium. J. Plant Biochem. Biotech., 14: 27-32.
21-   Nasiruddin, K.M., Begum, R. and Yasmin, S., 2003. Protocorm-like bodies and plantlet regeneration from Dendrobium formosum leaf callus. Asian J. Plant Sci., 2: 955-957.
22-   Nayak, N.R., Sahoo, S., Patnaik, S. and Rath, S.P., 2002.  Establishment of thin cross section (TCS) culture method for rapid micropropagation of Cymbidium alofolium (L.) SW. and Dendrobium nobile Lindl. (Orchidaceae). Sci. Hortic., 94: 107-116.
23-   Nge, K.L., New, N., Chandrkrachang, S. and Stevens, W.F., 2006. Chitosan as a growth stimulator in orchid tissue culture. Plant Sci., 170: 1185-1190.
24-   Park, S.Y., Murthy, H.N. and Paek, K.Y., 2003. Protocorm-like body induction and subsequent plant regeneration from root tip cultures of Doritaenopsis. Plant Sci., 164: 919-923.
25-   Park, S.Y., Yeung, E.C., Chakrabarty, D. and Paek, K.Y., 2002b. An efficient direct induction of protocorm-like bodies from leaf sub-epidermal cells of Doritaenopsis hybrid using thin-section culture. Plant Cell Rep., 21: 46-51.
26-   Prakash, L., Lee, C.I., Loh, C.S. and Goh, C.J., 1996. In vitro propagation of commercial orchids: an assessment of current methodologies and development of a novel approach-thin cross section culture. In: Islam, A.S. (Ed.), Plant Tissue Cult., Oxford Publishing Co. Pvt. Ltd., New Delhi.
27-   Puchooa, D., 2004. Comparison of different culture media for the in vitro culture of Dendrobium (Orchidaceae). Ind. J. Agric. Biol., 6: 884-888.
28-   Roy, A.R., Patel, R.S., Sajeev, S. and Deka, C., 2011. Asymbiotic seed germination, mass propagation and seedling development of Vanda coerulea Griff ex. Lindle. (Blue Vanda): An in vitro protocol for an endangered orchid. Sci. Hortic., 128: 325-331.
29-   Roy, J. and Banerjee, N., 2003. Induction of callus and plant regeneration from shoot tip explants of Dendrobium fimbriatum Lindl. var. Oculatum H.K.f. Sci. Hortic., 97: 333-340.
30-   Saiprasad, G.V.S., Raghuveer, P., Khetarpal, S. and Chandra, R. 2004. Effect of various polyamines on production of protocorm-like bodies in orchid- Dendrobium 'Sonia'. Sci. Hortic., 100: 161-168.
31-   Seeni, S. and Latha, P.G., 2000. In vitro multiplication and ecorehabilitation of the endangered Blue Vanda. Plant Cell Tissue Org. Cult., 61: 1-8.
32-   Sheela, V.L., Rajmohan, K., Anita, S. and Sarada, S., 2004. Effect of growth regulators on development and multiplication of protocorm like bodies in Dendrobium cv. Sonia. J. Orchid Soc., India. 18: 21-23.
33-   Sheelavantmath, S.S., Murthy, H.N., Pyati, A.N., Ashok Kumar, H.G. and Ravishanker, B.V., 2000. In vitro propagation of the endangered orchid, Geodorum densiflorum (Lam.) Schltr. through rhizome section culture. Plant Cell Tissue Org. Cult., 60: 151-154.
34-   Shimura, H. and Koda, Y., 2004. Micropropagation of Cypripedium macranthos var. Rebunerse through protocorm-like bodies derived from mature seed. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 78: 273-276.
35-   Sinha, P., Hakim, M.K. and Alam, M.F., 2007. Efficient micropropagation of Phalaenopsis amabilis (L.) B.L. cv. 'Cool Breeze' using inflorescence axis thin section as explants. Prop. Ornamental Plants. 7: 9-15.
36-   Subramanium, G. and Taha, R.M., 2003. Morphogenesis of Cymbidium atropurpureum in vitro. Malays. J. Sci., 22: 1-5.
37-   Teixeira, da Silva, J.A., 2003. Thin cell layer technology in ornamental plant micropropagation and biotechnology. Afr. J. Biotech., 2: 683-691.
38-   Teixeira, da Silva, J.A., Yam, T., Fukai, S., Nayak, N. and Tanaka, M., 2005. Establishment of optimum nutrient media for in vitro propagation of Cymbidium Sw (Orchidaceae) using protocorm-like body segments. Prop. Ornamental Plants, 5: 129-136.
39-   Teixeira, da Silva, J.A., Singh, N. and Tanaka, M., 2006. Priming biotic factors for optimal protocorm-like body and callus induction in hybrid Cymbidium (Orchidaceae), and assessment of cytogenetic stability in regenerated plants. Plant Cell Tissue Org. Cult., 84: 135-144.
40-   Wang, Y.F., Lu, R.J., Sun, Y.F., Zhou, R.M. and Huang, J.H., 2004. The induction and cultivation of cell-derived regenerates of Dendrobium huoshanenese. Acta Agric. Shanghai, 20: 8-10.
Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 30, Issue 1
June 2017
Pages 132-142
  • Receive Date: 05 May 2015
  • Revise Date: 17 May 2016
  • Accept Date: 22 August 2016