Document Type : Research Paper
Authors
1 Department of Agricultural Biotechnology, Faculty of Agricultural Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran
2 Department of Water Engineering, Faculty of Agricultural Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) are small, non-coding, and regulatory molecules that play an important role in post gene expression regulation in response to biotic and abiotic stresses. Although Canola (Brassica napus) is a globally important oilseed, little is known about its regulation mechanisms target genes of drought-responsive miRNAs. Then, in this study drought-responsive miRNAs target genes of bna-miR156b, bna-miR156c, bna-miR156g, bna-miR171a, bna-miR171d, bna-miR171e, bna-miR172d, bna-miR399a, bna-miR399b, bna-miR396a, bna-miR395d, bna-miR395e and bna-miR395f in Canola were identified by bioinformatics tools. Molecular function, biological process, cellular component, proteins interaction, and relation of their pathways were investigated. In the present study were identified 225 target genes for miRNAs. Bioinformatics study showed that ribosome, proteasome, and chaperon-related genes of RPP1C, RPL36AA, RPL9D, RPS11, RPT1A, RPT2a, RPT4A, RPN11, HSF1, HSFA1E, HSF4, and HSFB2B are targets of drought-responsive miRNAs of bna-miR172d ،bna-miR156b/c/g، bna-miR860، bna-miR396a and bna-miR395d. Ribosomes, proteasomes, and chaperons are regulated by drought-responsive miRNAs for protein regulation and stress tolerance under drought conditions. Laboratory study of identified genes in this study can be a fundamental step in the production of drought-resistant Canola cultivars in inbreeding and genetic engineering programs.
Keywords
Main Subjects
شناسایی بیوانفورماتیکی ژنهای هدف miRNAهای پاسخ دهنده به تنش خشکی در کلزا (Brassica napus)
مریم پسندیده ارجمند1، حبیب اله سمیع زاده لاهیجی*1، محمد حسن بیگلویی2 و محمد محسن زاده گلفزانی1
1 ایران، رشت، دانشگاه گیلان، دانشکده علوم کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی
2 ایران، رشت، دانشگاه گیلان، دانشکده علوم کشاورزی، گروه مهندسی آب
تاریخ دریافت: 25/01/1400 تاریخ پذیرش: 14/07/1400
چکیده
miRNAها مولکولهای کوچک، غیرکدکننده و تنظیمی هستند که نقش مهمی در تنظیمات پس از بیان ژن در پاسخ به تنشهای زیستی و غیرزیستی دارند. با این که کلزا (Brassica napus) گیاه دانه روغنی بسیار مهمی در سطح جهانی است، هنوز اطلاعات کمی دربارهی مکانیسمهای تنظیمی ژنهای هدف miRNAهای پاسخ دهنده به خشکی در آن وجود دارد. لذا در این پژوهش ژنهای هدف miRNAهای پاسخ دهنده به خشکی bna-miR860،bna-miR156b ،bna-miR156c ، bna-miR156g ،bna-miR171a ،bna-miR171d ،bna-miR171e ،bna-miR172d ،bna-miR399a ، bna-miR399b،bna-miR396a ، bna-miR395d، bna-miR395e و bna-miR395f در کلزا توسط روشهای بیوانفورماتیکی شناسایی شدند. سپس عملکرد مولکولی، فرآیند بیولوژیکی، اجزای سلولی، برهمکنش پروتئینها و ارتباط مسیرهای عملکردی آنها مورد بررسی قرار گرفت. در پژوهش حاضر 225 ژن هدف برای miRNAها شناسایی شد. بررسی بیوانفورماتیکی نشان داد که ژنهای ریبوزومی، پروتئازومی و چاپرونی RPP1C،RPL36AA ، RPL9D، RPS11، RPT1A، RPT2a، RPT4A، RPN11، HSF1، HSFA1E، HSF4 و HSFB2B تحت تاثیر miRNAهای پاسخ دهنده به خشکیbna-miR172d ،bna-miR156b/c/g ، bna-miR860، bna-miR396a و bna-miR395d/e/f قرار میگیرند و در شرایط تنش خشکی ریبوزوم، پروتئازوم و انواع چاپرونها توسط miRNAها در جهت تنظیم پروتئینها و تحمل تنش تنظیم میشوند. بررسی آزمایشگاهی ژنهای شناسایی شده در این پژوهش میتواند گامی مهم و بنیادین در ایجاد ارقام مقاوم به خشکی کلزا در برنامههای بهنژادی و مهندسی ژنتیک باشد.
واژه های کلیدی: پروتئازوم، چاپرون، ریبوزوم، IntaRNA، STRING
* نویسنده مسئول، تلفن: 01333690281، پست الکترونیکی: hsamizadeh@guilan.ac.ir
مقدمه
تنشهای محیطی مانند خشکی، گرما، شوری و غیره سبب کاهش تولید گیاهان زراعی از جمله کلزا (Brassica napus) میشوند (16). کلزا یکی از مهمترین محصولات روغنی در سراسر جهان است که به خشکی حساس بوده و هر ساله تنش خشکی سبب کاهش شدید عملکرد آن میشود (70). در شرایط تنش مجموعهای از مکانیسمهای تنظیمی ژن مانند تنظیم پس از بیان بمنظور حفظ هموستازی در گیاه اتفاق میافتد (38 و 68). خاموشی پس از بیان ژن (PTGS) (Post-transcriptional gene silencing) یک مکانیسم تنظیمی برای سرکوب RNA پس از بیان است. این مکانیسم در مراحل رشد و نمو و در پاسخ به تنشهای محیطی مانند خشکی نقش بسیار مهمی دارد. این مکانیسم مهم توسط RNAهای مداخله کننده کوچک (siRNA) (Small interfering RNA) و miRNA (MicroRNA) انجام میشود (26). miRNAها مولکولهای کوچک، غیرکدکننده و تنظیمی با طول حدود 18 تا 26 نوکلئوتید هستند که از RNAهای بزرگتری که کدکننده پروتئین نیستند، مشتق میشوند (7). miRNAها نقش مهمی در جنبههای مختلف رشد و نمو گیاهان اعم از مرفولوژی برگ، تشکیل ریشههای جانبی، علامتدهی هورمونی، انتقال از مرحله رویشی به زایشی، تنظیم زمان گلدهی و تولیدمثل برعهده دارند. یکی از نقشهای مهم miRNA گیاهان تنظیمات پس از بیان ژن در پاسخ به تنشهای زیستی و غیرزیستی است (24، 30، 50 و 52). روشهای بیوانفورماتیکی در شناسایی miRNAهای حفاظت شده در گیاهان و جانوران و همچنین شناسایی ژنهای هدف آنها بسیار موفق بوده است (4، 46 و 51). شناسایی miRNAها و ژنهای هدف آنها در گیاهان از این جهت بسیار حائزاهمیت است که اکثر ژنهای هدفmiRNA ها، ژنهای بسیار مهم مانند فاکتورهای بیانی هستند (53). این موضوع سبب میشود کهmiRNA ها در مرکز تنظیم بیان ژنها قرار گیرند (46). هنوز در مورد این که تنظیم تولید پروتئینها بطور کامل تحت کنترل miRNAهاست، تردید وجود دارد. اما با استفاده از تکنولوژیهای با کارایی بالا مشخص شده است کهmiRNAها بر پاسخهای پروتئینی در شرایط تنش بسیار موثر هستند (16). در آرابیدوپسیس پروتئینهای ریبوزومی توسط ژنهای گوناگون کد میشوند. ژنهای پروتئینهای ریبوزومی برای نگهداشتن سطح طبیعی پروتئین ریبوزومی در سلول نقش تنظیمی دارند. یکی از این ژنهای مهم RPS11 (Ribosomal protein small subunit) است که پروتئینی ضروری در ساختار ریبوزوم است و با پروتئینهای مهاجم در شرایط تنش برهمکنش ایجاد میکند (14). در پژوهشی مشخص شد که اعمال تنش خشکی در آرابیدوپسیس سبب افزایش چشمگیر پروتئینهای ریبوزومی میشود (6). همچنین مطالعه پروتئومیکس نشان داد که در شرایط تنش خشکی خانواده پروتئینی ریبوزوم L6 (RPL) (Ribosomal protein large subunit) افزایش مییابند. تاخیر رشد مراحل ابتدایی نمو و مرگ رویان با موتاسیون در RPL9C و RPL9D نشان میدهد که تعداد نسخه و فراوانی این ژنها در سلول بسیار حیاتی و مهم است (14). RPP2B (Ribosomal protein P2B) نیز ژنهای ریبوزومی مهمی هستند که در شرایط تنشهای محیطی توسط miRNAها مورد هدف قرار میگیرند (55). ارتباط تنظیمی مهمی بین ژنهای کدکننده پروتئین ریبوزومی و فاکتور شوک حرارتی (HSF)( Heat-shock transcription factor) وجود دارد که میتواند در شرایط تنش نقش محافظت از پروتئینهای ریبوزومی را داشته باشد. پروتئینهای شوک حرارتی (HSP)( Heat- shock proteins) نقش بسیار کلیدی در بیوژنز ریبوزوم و پردازش rRNA دارند. از طرفی HSPها با چندین مسیر علامتدهی سلولی، فاکتورهای بیانی و پروتئینهای پاسخ به استرسهای سلولی در ارتباط هستند (42). بدون تردید برای حفظ حیات موجود، کارکرد ریبوزومها و پروتئینهای سنتز شده توسط آنها باید تنظیم شوند (8). مطالعات نشان داده است که ریبوزومها خود توسط سیستم یوبیکوئیتین-پروتئازوم تنظیم میشوند (25، 36، 49 و 63). در آرابیدوپسیس PRN11 (Regulatory particle non-triple-A ATPases) ژن هدف miRNA156 است (3). RPN11 نوعی آنزیم DUBs (Deubiquitinating enzymes) مرتبط با پروتئازوم است که با حذف یوبیکوئیتین از پروتئین شرایط را برای دیوبیکوئیتینه شدن فراهم میکند (48). miRNA156با اثر بر ژن PRN11 سبب دیوبیکوئیتینه شدن پروتئینها میشود. نقش miRNA162 بر آنزیمهای یوبیکوئیتینه شدن و miRNA408 و miRNA398 بر زیرواحدهای پروتئازوم در شرایط تنش محیطی ثابت شده است (3). اخیراً نقشی از سیستم یوبیکوئیتین-پروتئازوم در رابطه با سنتز پروتئین در ریبوزومها عنوان شده است که سوالات زیادی را درباره چگونگی کارکرد این دو سیستم بطور مستقل یا با هم ایجاد کرده است (8). گیاهان از مسیرهای انتقال سیگنال برای درک محرکهای محیطی و تغییرات بیان ژن برای ایجاد یک پاسخ هماهنگ استفاده میکنند و این موضوع نقش miRNAها در هماهنگی تنظیم بیان ژن در شرایط تنش را بطور واضحتری نمایان میکند (3 و 48). تنش خشکی در کلزا سالانه سبب کاهش چشمگیر عملکرد میشود. شناسایی مکانیسمهای تنظیمی پاسخ به تنش بسیار حائزاهمیت هستند. لذا در این پژوهش انواع miRNAهای موثر در تنش خشکی در گیاهان بویژه کلزا که در سایر مطالعات شناسایی شدهاند تعیین میشوند و ژنهای هدف آنها توسط روشهای بیوانفورماتیکی شناسایی شده و ارتباط مسیرهای عملکردی آنها مورد بحث قرار خواهد گرفت.
مواد و روشها
تعیین miRNAهای پاسخ دهنده به تنش خشکی: پس از جمع آوری اطلاعات و مرور منابع و همچنین بررسی پایگاه داده miRBase (http://miRbase.org/)، miRNAهایی که تغییر بیان آنها در تنش، بویژه در تنش خشکی در چندین گیاه از جمله کلزا با روش تعیین توالی miRNA (miRNA sequencing) ثابت شده بود، انتخاب شدند (جدول 1).
بر این اساسmiRNA هایbna-miR860 ،bna-miR156b ،bna-miR156c ،bna-miR156g ،bna-miR171a ،bna-miR171d ،bna-miR171e ،bna-miR172d ، bna-miR399a، bna-miR399b، bna-miR396a، bna-miR395d،bna-miR395e و bna-miR395f بمنظور بررسی انتخاب شدند و توالی این miRNAها از پایگاه داده miRBase (http://miRbase.org/) بدست آمد.
جدول 1- اسامی miRNAهای انتخابی در منابع مختلف
References |
Stresses |
miRNAs |
Plants |
(22) |
Drought |
miRNA860 |
Brassica napus |
(5 و 22) |
Heat, Drought |
miRNA156b/c/g |
Brassica rapa Brassica napus |
(17، 22 و 69)
|
Drought |
miRNA171a/d/e
|
Brassica napus Arabidopsis thaliana Oryza sativa |
(5، 10، 18، 22 و 69)
|
Heat, drought
|
miRNA172d |
Brassica rapa Brassica napus Brassica Juncea Oryza sativa Arabidopsis thaliana |
(9 و22) |
ABA treatment, Drought, Salinity |
miRNA399a/b |
Arabidopsis thaliana Brassica napus |
(28 و 69) |
Drought |
miRNA396a |
Arabidopsis thaliana Oryza sativa |
(22 و 69) |
Drought |
miRNA395d/e/f |
Brassica napus Oryza sativa |
شناسایی ژنهای هدف miRNAها : بمنظور شناسایی ژنهای هدف miRNAهای تعیین شده، ابتدا از سرور psRNATarget (http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/) استفاده شد (13) و برای هرکدام از miRNAها ژنهای هدف بالقوه شناسایی شد. ژنهای شناسایی شده دارای منشا گیاهی انتخاب و توالی آنها ذخیره شد. سپس برای اطمینان از صحت اتصالmiRNA ها و ژنهای هدف از دو نرم افزار RNAhybrid و IntaRNA نیز با استفاده از پارامترهای پیشفرض استفاده شد. در هر دو نرم افزار از حداقل انرژی آزاد (mfe) (Minimum free energy) برای پیش بینی اتصال استفاده شده است (31 و 43).
تعیین اسم ژنها: برای تعیین اسم ژنها از دو سایت NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) و UniProt (https://www.uniprot.org/) استفاده شد. هر کدام از ژنها با نام UniRef بدست آمده از psRNATarget جستجو شدند. در صورتی که با نام UniRef قابل جستجو نبودند، از طریق نام کامل در توضیحات موجود در uniprotKB یا براساس BLASTn توالی در NCBI مورد جستجو قرار گرفتند (41 و 54).
بررسی هستی شناسی ژنها (GO) و شناسایی مسیرهای عملکردی ژنهای هدف: بمنظور طبقهبندی عملکرد مولکولی، فرآیند بیولوژیکی، اجزای سلولی و پروتئین از سیستم رده بندی PANTHER (http://www.pantherdb.org ) استفاده شد (34). جهت بررسی هستی شناسی ژنهای شناسایی شده از پایگاه بیوانفورماتیک DAVID (v6.8) (https://david.ncifcrf.gov/) و سایت KEGG (https://www.genome.jp/kegg/) با استفاده از پارامترهای پیشفرض استفاده شد (23).
بررسی برهمکنش پروتئین- پروتئین (PPI): برای رسم شبکه ژنی از STRING (نسخه 11) (https://string-db.org/) و همچنین افزونهSTRING در نرم افزار Cytoscape (نسخه 2.8.3) با پارامترهای پیشفرض استفاده شد (37 و 56). سپس شبکه ژنی آنالیز شد و ژنهای با درجه ارتباط بیشتر یا مساوی 5 انتخاب شدند. برای شناسایی ژنهای مهم در شبکه از افزونه CytoHubba در نرم افزار Cytoscape و با استفاده از روش MCC (Maximal clique centrality) استفاده شد (40).
کنترل صحت ژنهای انتخاب شده: پس از انتخاب ژنها بمنظور تعیین صحت وجود ژن در کلزا ابتدا توالی ژنها در NCBI بلاست شد و پس از آن توالی ژن در کلزا بدست آمد و مورد هدف قرارگرفتن ژن توسط miRNA مورد نظر در psRNATarget، RNAhybrid و IntaRNA نیز تایید شد. سپس برهمکنش پروتئینی ژنهای انتخاب شده و ارتباط مسیرهای عملکردی ژنها مورد بررسی قرارگرفت.
در نهایت براساس مسیرهای عملکردی شناسایی شده از پایگاه بیوانفورماتیک DAVID، بررسی برهمکنش ژنها در شبکه پروتئینی و همچنین مرور منابع در مورد ژنهای انتخاب شده در سایر گیاهان، تعداد 12 عدد از مهمترین ژنهای موثر در تنش خشکی بعنوان کلیدیترین ژنهای هدف miRNAهای پاسخ دهنده به تنش خشکی در کلزا انتخاب شدند و ارتباط مسیرهای عملکردی آنها مورد بحث قرار گرفت.
نتایج
پس از انتخاب miRNAهای پاسخ دهنده به تنش خشکی و جمع آوری اطلاعات از تغییر بیان آنها در شرایط تنش در مطالعات miRNA-seq، توالی miRNA بالغ از طریق پایگاه داده miRBase بدست آمد. پس از جستجوی امکان اتصال توالی بالغ miRNAها به ژنهای هدف در psRNATarget، تعداد 571 ژن هدف برای miRNAها شناسایی شد. پس از بررسی مجدد ژنها در UniProt و NCBI، تعداد 225 ژن انتخاب شدند و سایر ژنها بدلایل مختلف مانند ناشناخته بودن ژنها یا فاقد توالی شناسایی شده کامل حذف شدند. اتصال miRNA به توالی هدف براساس حداقل انرژی آزاد
در RNAhybrid و IntaRNA نیز مورد بررسی قرار گرفت.
در نهایت بترتیب برایbna-miR860 ،bna-miR156b/c/g ، bna-miR171a/d/e ، bna-miR172d ،bna-miR399a/b، bna-miR396a، bna-miR395d/e/f تعداد 17، 50، 16، 36، 13، 59 و 34 ژن هدف شناسایی شد. پس از آن ژنهای شناسایی شده از نظر مسیرهای عملکردی و برهمکنش پروتئین نیز مورد بررسی قرار گرفتند. عملکرد مولکولی ژنها مربوط به فعالیت آداپتور مولکولی GO:0060090))( Molecular adaptor activity)، اتصال (GO:0005488) (Binding)، فعالیت مولکول ساختاری (GO:0005198) (Structural molecule activity)، تنظیم کننده عملکرد مولکولی GO:0098772))، فعالیت کاتالیزوری (GO:0003824) و فعالیت ترانسپورتری (GO:0005215) بود. فرآیندهای بیولوژیکی ژنهای شناسایی شده نیز شامل فرآیندهای سلولی (GO:0009987)، جانمایی (Localization)(GO:0051179) ، تعامل بین گونهای ارگانیسمها (Interspecies interaction between organisms) (GO:0044419)، تنظیم بیولوژیکی GO:0065007))، پاسخ دهنده به محرکها (GO:0050896)، علامتدهی (GO:0023052)، فرآیندهای نموی (GO:0032502)، فرآیندهای ارگانیسمی پرسلولی (Multicellular organismal process) (GO:0032501) و فرآیندهای متابولیکی (GO:0008152) بود. اجزای سلولی نیز شامل ساختار سلول (Cellular anatomical entity) (GO:0110165)، کمپلکس پروتئینی (Protein-containing complex) (GO:0032991) و درون سلولی (Intracellular) (GO:0005622) بود. بیشترین فراوانی در عملکرد مولکولی ژنها مربوط به فعالیت کاتالیزوری (GO:0003824) (4/%45) و اتصالGO:0005488) ) (%30) بود. همچنین بیشترین فراوانی در فرآیندهای بیولوژیکی مربوط به فرآیندهای سلولی (GO:0009987)(5/%39)، فرآیندهای متابولیکی GO:0008152)) (5/%33) و تنظیم بیولوژیکی GO:0065007)) (5/%13) بود. بیشترین فراوانی اجزای سلولی نیز شامل ساختار سلولی (GO:0110165) (5/47 %) و درون سلولی (GO:0005622) (5/%41) بود (شکل 1).
طبقهبندی پروتئینها در PANTHER نیز نشان داد که پروتئینها شامل آنزیمهای تغییردهنده پروتئین (PC00260)، ترانسپورتر (PC00227)، پروتئینهای غشایی (PC00150)، چاپرون (PC00072)، پروتئینهای متابولیسم اسیدنوکلئیک (PC00171)، گیرنده علامتدهی غشا (Transmembrane signal receptor) (PC00197)، پروتئینهای متصل شونده به کلسیم (PC00060)، پروتئینهای اسکلت سلولی (PC00085)، تنظیم کننده بیان اختصاصی ژن (PC00264)، پروتئینهای تنظیمی (PC00263)، آنزیمهای تبدیل متابولیتی (PC00262) و کروماتین/ اتصال کروماتین یا پروتئینهای تنظیمی مرتبط با کروماتینها (Chromatin/chromatin-binding, or -regulatory protein) (PC00077) بود. بیشترین فراوانی طبقهبندی پروتئینها مربوط به آنزیمهای تغییردهنده متابولیتها (PC00262) (1/%28)، آنزیمهای تغییردهنده پروتئین (PC00260) (%18)، ترانسپورتر (PC00227) (3/%13)، پروتئینهای متابولیسم اسیدنوکلئیک (PC00171) (7/%11) و تنظیم کننده بیان اختصاصی ژن (PC00264) (5/%12) بود (شکل 1). بررسی هستی شناسی ژنها در DAVID نیز نشان داد که بیشترین فرآیند بیولوژیکی ژنهای مورد بررسی مربوط به بیان و تنظیم بیان بود. همچنین بیشتر ژنهای مورد بررسی در مسیر متابولیکی نقش داشته و در هسته و سیتوسول حضور دارند و بیشتر آنها از نظر عملکرد مولکولی نقش اتصال به ATP، پروتئین و فعالیت فاکتور بیانی و اتصال به جایگاه اختصاصی در DNA را دارا میباشند. بررسی مسیر عملکردی ژنها در DAVID نشان داد که اکثر ژنهای شناسایی شده مربوط به مسیرهای متابولیکی هستند.
آنالیز شبکه پروتئینی و تعیین درجه اتصال 225 ژن شناسایی شده در Cytoscape نشان داد که ژنهای RPP1C،RPL36AA ، RPL9D، RPS11، RPT1A، RPT2a، RPT4A، RPN11، HSF1، HSFA1E، HSF4 و HSFB2B برهمکنش بسیار زیادی در شبکه پروتئینی داشته و با سایر ژنها ارتباط زیادی دارند (شکل 2 و 4). ژن HSP81.4 نیز برهمکنش زیادی در شبکه پروتئینی داشت و بعنوان ژن هدف miRNA396a در psRNATarget و IntaRNA شناسایی شد.
|
|||||||||||
|
شکل 1- نمودار دایرهای هستی شناسی ژنهای هدف miRNAها در A .PANTHER: عملکرد مولکولی، B: فرآیندهای بیولوژیکی، C: اجزای سلولی، D: طبقه بندی پروتئین
اما در RNAhybrid موردتایید قرار نگرفت. لذا جهت افزایش صحت انتخاب بعنوان مهمترین ژنها معرفی نگردید. پس از آنالیز شبکه پروتئینی، صحت وجود ژنهای مذکور در کلزا و موردهدف قرارگرفتن آن توسط miRNAهای پاسخ دهنده به خشکی (جدول 2 و شکل 3) و همچنین مسیرهای عملکردی آنها (شکل 5) نیز مورد بررسی قرار گرفت.
بررسی هستی شناسی 12 ژن کاندید نشان داد که عملکرد مولکولی 7/46 درصد مربوط به اتصال GO:0005488)) و 7/26 درصد مربوط به تنظیم کننده عملکرد مولکولی (GO:0098772)، 3/13 درصد فعالیت مولکول ساختاری (GO:0005198) و 3/13 درصد ژنها نیز مربوط به فعالیت کاتالیزوری (GO:0003824) میباشد.
شکل 2- برهمکنش شبکه پروتئین-پروتئین با استفاده از STRING برای ژنهای شناسایی شده
|
||||||||||
|
||||||||||
|
||||||||||
|
||||||||||
شکل 3- اتصال miRNA به ژن هدف براساس حداقل انرژی آزاد در RNAhybrid |
جدول 2- اطلاعات کلی اتصال miRNAها به توالیهای هدف بر اساس حداقل انرژی آزاد در intaRNA
Hybridization Energy (kcal/mol) |
Energy (kcal/mol) |
Target RNA position |
miRNA position |
miRNA |
Gene |
-20.53 |
-18.59 |
584-599 |
1-16 |
bna-miR156b/c/g
|
1-AT5G47700 (RPP1C)
|
-16.99 |
-14.78 |
444-458 |
4-18 |
bna-miR156b/c/g
|
2-AT3G23390 (RPL36AA)
|
-18.23 |
-14.6 |
142-155 |
2-15 |
bna-miR172d |
3-AT4G10450 (RPL9D)
|
-20.44 |
-15 |
515-534 |
1-20 |
bna-miR860
|
4-AT5G23740 (RPS11)
|
-21.99 |
-14.01 |
988-1006 |
1-19 |
bna-miR172d
|
5-AT1G53750 (RPT1A) |
-15.7 |
-15.01 |
1328-1338 |
8-18 |
bna-miR396a
|
6-AT4G29040 (RPT2a)
|
-18.66 |
-11.57 |
230-248 |
2-20 |
bna-miR396a
|
7-AT5G43010 (RPT4A)
|
-21.42 |
-17.96 |
1045-1062 |
1-18 |
bna-miR156b/c/g
|
8-AT5G23540 (RPN11)
|
-28.58 |
-25.71 |
265-281 |
2-18 |
bna-miR395d/e/f |
9-AT4G17750 (HSF1)
|
-19.06 |
-13.44 |
915-927 |
1-13 |
bna-miR395d/e/f
|
10-AT3G02990 (HSFA1E) |
-23.36 |
-20.64 |
504-520 |
2-18 |
bna-miR395d/e/f
|
11-AT4G36990 (HSF4)
|
-23.28 |
-20.76 |
710-726 |
2-18 |
bna-miR395d/e/f |
12-AT4G11660 (HSFB2B) |
شکل 4- برهمکنش شبکه پروتئین-پروتئین با استفاده از STRING برای ژنهای معرفی شده |
فرآیندهای بیولوژیکی بترتیب 8/34، 8/34، 1/26 و 3/4 درصد ژنها مربوط به فرآیندهای سلولی (GO:0009987)، فرآیندهای متابولیکی (GO:0008152)، تنظیم بیولوژیکی (GO:0065007) و پاسخ به محرکها (GO:0050896) بود. همچنین بررسی اجزای سلولی ژنهای کاندید نشان داد که بترتیب 3/42، 8/30 و 9/26 درصد ژنها مربوط به فضای بین سلولی (GO:0005622)، ساختار سلول (GO:0110165) و کمپلکسهای پروتئینی (GO:0032991) بود. طبقهبندی پروتئین ژنهای کاندید نیز نشان داد که بترتیب 7/41، 3/33 و 25 درصد ژنها، پروتئینهای ترجمه (PC00263)، تنظیم کننده بیان اختصاصی ژن (PC00264) و آنزیم تغییردهنده پروتئین (PC00260) (Protein modifying enzyme) بود. مسیرهای عملکردی شناسایی شده ژنهای کاندید شامل پروتئازوم، ریبوزوم و چاپرونها بود. برخی از ژنهای کاندید در سیتوپلاسم و برخی نیز فقط در هسته فعالیت دارند.
شکل 5- مسیر KEGG ژنهای ریبوزوم و پروتئازوم در DAVID |
بحث و نتیجه گیری
ژنهای هدف miRNAهای پاسخ دهنده به خشکی میتوانند نقش مهمی در شبکه تنظیمی پاسخ گیاه به خشکی را ایفا کنند. شناسایی ژنهای تنظیمی مهم در این پژوهش بعنوان ژن هدف miRNAها، نشان دهنده این است که ژنهای تنظیمی خود توسط تنظیمکنندههای دیگری مانند miRNAها تنظیم میشوند. ژنهای ریبوزومی، پروتئازومی و چاپرونی از ژنهای بسیار مهم تنظیمی هستند (8، 21 و 48). در جانوران حدود 60 درصد از ژنهای کدکننده پروتئین توسطmiRNA ها تنظیم میشوند. در گیاهان تعداد ژنهایی که توسطmiRNA ها تنظیم میشوند، بسیار کمتر شناسایی شدهاند (53). بنابراین شناسایی مهمترین ژنهای تنظیمی در واکنش به تنش خشکی میتواند درک بهتری از مکانیسم شبکه تنظیمی در پاسخ به تنش را ایجاد کند. 81 پروتئین ریبوزومی مختلف در آرابیدوپسیس شناسایی شده است که نقش بسیار مهمی در ساخت پروتئین دارند (45). نتایج پژوهش حاضر نشان داده است که ژن RPP1C توسط bna-miR156b/c/g سرکوب میشود. در شرایط تنش خشکی ژنهای کدکننده پروتئینهای ریبوزومی خانواده S60 مانند RPP1C نقش مهمی برعهده دارند و تنش خشکی سبب افزایش RPP1C و RPL36AA میشود (6). همچنین در تنش خشکی میزان بیان bna-miR156b/c/g در کلزا افزایش مییابد (22). احتمالاً افزایش بیان پروتئینهای ریبوزومی در شرایط تنش نوعی مکانیسم پاسخ دهنده در جهت افزایش سنتز پروتئینهای موردنیاز موجود است و افزایش bna-miR156b/c/g میتواند نقش تنظیمی برای کاهش بیش از حد پروتئینهای ریبوزومی داشته باشد. در پژوهشی مشخص شد که RPL9D از ژنهای مهم در ساخت پروتئینهای ریبوزومی است (14) که مورد هدف miRNA172d قرار میگیرد. در تنش خشکی بیان bna-miR172d در کلزا افزایش مییابد (22). افزایش بیان bna-miR172d سبب برش و سرکوب ژن ریبوزومی RPL9D میشود. بالعکس در خشکی بیان bna-miR860 در کلزا کاهش مییابد (22). با کاهش بیان bna-miR860 انتظار میرود که بیان ژن RPS11 افزایش یابد و یا حداقل کمتر تحت اثر این miRNA قرار بگیرد. کاهش bna-miR860 نشان میدهد که تغییر بیان miRNAهای موثر بر ژنهای ریبوزومی نمیتواند کاهش سنتز پروتئینها توسط ریبوزومها را به اثبات برساند. با این حال تغییر بیان miRNAهای سرکوب کننده ژنهای ریبوزومی نشان از اهمیت زیرواحدهای ریبوزومی در تنظیم پاسخ به تنش خشکی دارد و این موضوع اهمیت مطالعه بیشتر در زمینه تغییر بیان زیرواحدهای ریبوزومی در تنش خشکی را مطرح میکند. در پژوهشی آنالیز فیلوژنتیکی ژنهای ریبوزومی RPL9 در براسیکاسه و سایر گیاهان دولپه و تک لپه نشان داد که تعداد نسخههای تکثیر ژن RPL9 در گونههای مختلف متفاوت است و وجود چندین کپی از ژنهای ریبوزومی خانواده ژنی RPL4، RPL5، RPL27a، RPL36a و RPS6 در براسیکاسه بسیار حفاظت شده بوده و حاصل دوبرابر شدن ژنوم و یا حذف ژن در طی تکامل گونه است. همچنین نتایج این تحقیق نشان داد که عملکرد خانواده ژنی RPL9 بسیار وابسته به تعداد نسخههای ژنی در سلول است (14). بنابراین miRNA172d بعنوان یکی از عوامل تنظیمی، میتواند در تنظیم عملکرد RPL9 موثر باشد. با توجه به مورد هدف قرارگرفتن پروتئینهای ریبوزومی و همچنین تغییر بیان ژنهای سازنده پروتئینهای ریبوزومی در تنش خشکی، به احتمال زیاد ژنهای کدکننده پروتئینهای ریبوزومی نقش بسیار مهمی را در مکانیسم دفاعی پاسخ به تنش برعهده دارند.
تحقیقات اخیر نشان داده است که پروتئینها پس از ساخته شدن در ریبوزومها میتوانند برای تنظیم به سیستم یوبیکوئیتین-پروتئازوم یا سیستم اتوفاژی وارد شوند (8). انتقال پروتئین از ریبوزوم به مسیر پروتئازوم یا اتوفاژی اهمیت نقش miRNAها را در تنظیم و هماهنگی این مسیرها بیش از پیش نمایان میکند. سیستم یوبیکوئیتین-پروتئازوم یک کمپلکس پروتئینی وابسته به ATP برای تغییر و یا تخریب پروتئین است (12). در شرایط تنش خشکی، پروتئینها تغییر شکل داده و در سلول تجمع مییابند. در یوکاریوتها تجزیه اکثر پروتئینها توسط پروتئازوم انجام میشود (11). تغییر در ساختار، جایابی و پایداری پروتئین میتواند بر عملکرد آن موثر باشد و عملکرد صحیح پروتئینها وابسته به تجزیه آنها است (62). با تغییر پروتئین در شرایط تنش خشکی، پروتئین هدف توسط آنزیمهای E1 (ubiquitin-activating enzyme; UBA)، E2 (ubiquitin-conjugating enzyme; UBC) و E3 (ubiquitin ligase; UBL) توسط یک یا چند مولکول یوبیکوئیتین یوبیکوئیتینه میشود (48). بر خلاف اتصال برگشت پذیر زنجیره یوبیکوئیتین، مرحله دوم اتصال محکمتری به پروتئازوم را توسط RPT1-6 ایجاد میکند و شرایط را برای تخریب پروتئین فراهم میکند (39). پلیمر یوبیکوئیتین بصورت کووالانسی به پروتئین هدف متصل میشود. اتصال یوبیکوئیتین به پروتئین نوعی نشانهگذاری برای تجزیه پروتئین در پروتئازوم است (62). اتصال سوبسترا باعث ایجاد تغییرات ساختاری در 19S RP (بخش تنظیمی) میشود که باعث فعال شدن پروتئازوم و باز شدن مسیر برای ورود پلی پپتید به 20S CP (بخش مرکزی) میشود (32). ابتدا پروتئین باز شده و سپس توسط فعالیت پروتئازی20S CP به پپتیدهای کوتاه 3 تا 20 آمینواسیدی شکسته میشود (48). RPT1A و RPT2a نقش تنظیمی در عملکرد پروتئازوم ایفا میکنند و نتایج این پژوهش نشان داد که این بخشهای تنظیمی نیز خود توسط miRNAها مورد هدف قرار میگیرند.miRNA172d با mRNA ژن RPT1A پروتئازومی مکمل شده و آن را برش میزند. در شرایط تنش خشکی bna-miR172d در کلزا بطور چشمگیری افزایش بیان پیدا میکند (22). افزایش این miRNAها سبب اتصال بیشتر به توالی هدف میشود و در نتیجه تعداد بیشتری از نسخههای بیان شده ژن را سرکوب میکند. بنابراین انتظار میرود که کاهش mRNA ژن RPT1A در خشکی اهمیت زیادی داشته باشد. کاهش بیان ژنهای تنظیمی پروتئازوم سبب افزایش فعالیت PTGS میشود (26). برش ژن RPT2a و RPT4A توسطmiRNA396a میتواند سبب سرکوب این ژن تنظیمی در پروتئازوم و کاهش شناسایی پروتئینهای هدف توسط پروتئازوم شود. درنتیجه ATP مصرفی برای شناسایی و اتصال پروتئین آسیب دیده به پروتئازوم کاهش مییابد و پروتئینهای آسیب دیده توسط مکانیسم خاموشی بیان ژن در مرحله بیان و پس از بیان تنظیم میشوند (26).RPT2a در مسیر علامتدهی نقش مهمی در افزایش مقاومت گیاه به تنشهای محیطی دارد. نقشRPT2a درتحمل به تنش گرما، کمبود روی و بیماری به اثبات رسیده است (27، 44 و 64).miRNA ها میتوانند با اثر بر پروتئینهای پروتئازومی بر تجزیه پروتئین نیز اثر بگذارند. در شرایط تنش زیرواحد RPT2a شروع کننده خاموشی پس از بیان است و ایجاد موتاسیون در این ژن سبب سرکوب PTGS میشود و در نتیجه این عمل سبب تجمع پروتئین در سلول میشود.RPT2a عملکرد خاصی را به پروتئازوم در PTGS میدهد (26) و با اثر بر افزایش تجمع siRNAها سبب افزایش PTGS میشود. در واقع RPT2a با سرکوب ماشین کنترل کیفی سبب افزایش PTGS در شرایط تنش میشود (26). بنابراین میتوان مورد هدف قرار گرفتن ژن RPT2a توسط miRNA را عاملی برای افزایش siRNAها و مرکز اصلی شروع فرآیند PTGS دانست. ممکن است سرکوب شدن بیان RPT1A نیز مرتبط با افزایش PTGS در تنش باشد. در واقع افزایش بیانmiRNA172d در تنش خشکی، سبب سرکوب بیشتر RPT1A که مسئول شناسایی ژنهای هدف برای تخریب است، میشود و فعالیت پروتئازوم بنفع PTGS کاهش مییابد. دیوبیکوئیتینه شدن پروتئین نیز توسط آنزیم DUBs انجام میشود (48). miRNA156 سبب سرکوب ژن RPN11 که ژن دیوبیکوئیتینه است، میشود. در پژوهشی موتاسیون اجزای RP در پروتئازوم سبب کاهش تحمل به تنش در آرابیدوپسیس شد. آرابیدوپسیسی که دارای ژن موتانت RPN10 بود، تحمل کمتری نسبت به شوری، گرما و پرتو UV داشت (47). همچنین موتانت RPN1a به تنش شوری و گرما حساس بود (61). در پژوهش دیگر موتاسیون در RPN12a و RPT2a سبب کاهش تحمل تنش گرما (27) و موتاسیون در RPT5a سبب کاهش تحمل کمبود روی شد (44). miRNAهای سرکوب کننده ژنهای پروتئازوم در کلزا بطور هماهنگ افزایش بیان مییابند (22). افزایش بیان این miRNAها در خشکی میتواند نشان دهنده کاهش فعالیت پروتئازوم و در نتیجه افزایش فعالیت PTGS باشد. بنظر میرسد تنظیم پروتئازوم نقش بسیار مهمی در مقاومت به تنش خشکی برعهده دارد. برای محدود کردن اثرات مخرب گسترش و تجمع پروتئینها در تنش خشکی، سلولها چندین مسیر تاشدگی و تجزیهشدن را برای بازگشت بحالت طبیعی بکار میگیرند (35). مسیر دیگر برای بهبود و محدودکردن تجمع پروتئینهای آسیب دیده، استفاده از چاپرونها است. چاپرونها مولکولهایی هستند که بازشدن برگشت ناپذیر پروتئین را محدود میکنند و با ممانعت از تجمع پروتئینها سبب تاشدن صحیح پروتئینها میشوند و در صورت عدم ترمیم پروتئینهای آسیب دیده آنها را از بین میبرند (19). همچنین ترکیباتی که مانند چاپرون عمل میکنند، میتوانند سبب حفظ پایداری آنزیمهای تثبیت کننده CO2، کاهش تجمع ROS، حفظ ساختار پروتئینها، افزایش فعالیت آنزیمها و در نهایت کاهش اثر تنش شوند (1 و 2). HSPها همچنین برای پاکسازی پروتئینهای تجمع یافته به پروتئازومها وابسته هستند. فاکتور شاتلUbiquilin 2 اتصالاتHSP70 را شناسایی کرده و آنها را برای تجزیه به مجموعه پروتئازوم میرساند (19). هم افزایی HSPها و پروتئازوم در برهمکنش با تنشهای محیطی سبب کاهش تجمع پروتئینهای آسیب دیده در سلول میشود (33). در آرابیدوپسیس ژنهای HSF1و HSFA1E بطور مداوم بیان میشوند و مسئول تحریک و راه اندازی پاسخ به تنش حرارتی هستند. این فاکتورهای بیانی به فاکتورهای تنش حرارتی متصل میشوند (65). bna-miR395d/e/fدر شرایط تنش خشکی کاهش مییابد (22). بنابراین انتظار میرود که بیان ژنهای HSF1، HSFA1E، HSF4 و HSFB2B در این شرایط افزایش یابد. در آرابیدوپسیس HSF4 و HSFB2B سبب سرکوب تحریک HSPها در زمان ریکاوری پس از تنش میشوند (20). آنالیز بیان ژن نشان داده است که ایزوفرمهای HSF70 در شرایط خشکی، گرما، شوری و ABAموثر هستند (57). مطالعات بیش بیانی و سرکوب بیان ژنهای HSF70 در گیاهان توتون، سویا و مرکبات نقش محافظتی آنها را در طول تنش خشکی نشان میدهد (66). از طرفی bna-miR395d/e/f کلزا در خشکی افزایش یافته و انتظار میرود که بیان HSP81-4 کاهش یابد. در برنج بیان ژنهای OsHSP90-2 و OsHSP90-4 که مشابه HSP81-4 است، در خشکی، سرما، گرما و شوری افزایش یافت (67). HSFA1E، HSFA7b و HSFB2B بوسیله افزایش بیان HSFA3 تحریک میشوند، بیان بیش از حد HSFA3 در شرایط معمول باعث افزایش بیان HSFA1E میشود. اما بیان HSFA2 را که توسط HSFA1E پس از گرما یا تنش نور زیاد ایجاد میشود را افزایش نمیدهد. این اتصالات پیچیده و حلقههای بازخورد نشان میدهد که چندین سیگنال ورودی میتوانند پاسخهای همپوشان اما متفاوت HSF / HSP را فعال کنند (21). احتمالاً پس از سنتز پروتئینها در ریبوزوم بخش مهمی از پاسخ گیاهان در برابر تنش خشکی مربوط به تغییر یا تجزیه پروتئینها در ارتباط با چاپرونها و پروتئازوم است. تنظیم هماهنگی بین این واحدها نیز خود در گرو عوامل تنظیمی دیگر مانند miRNAهای پاسخ دهنده به خشکی است. بطور کلی نتایج بررسی بیوانفورماتیکی در این پژوهش نشان داد که ژنهای ریبوزومی، پروتئازومی و چاپرونی RPP1C،RPL36AA ، RPL9D، RPS11، RPT1A، RPT2a، RPT4A، RPN11، HSF1، HSFA1E، HSF4 و HSFB2B تحت تاثیر miRNAهای پاسخ دهنده به خشکیbna-miR156b/c/g ،bna-miR172d ، bna-miR860، bna-miR396a و bna-miR395d/e/f قرار میگیرند و احتمالاً در شرایط تنش زیرواحدهای سازنده ریبوزوم، پروتئازوم و انواع چاپرونها جهت کاهش یا افزایش تجزیه پروتئینها بنفع سیستم تنظیمی PTGSو برای حفظ حیات موجود تغییر مییابند. در سایر مطالعات نقش miRNAهای مورد بررسی در این پژوهش در شرایط خشکی با روشهای پیشرفته آزمایشگاهی در کلزا و سایر گیاهان به اثبات رسیده است (جدول 1). این پژوهش بمنظور شناسایی ژنهای هدف این miRNAها و بررسی ارتباط مسیرهای عملکردی آنها نسبت به یکدیگر انجام شده است. بر اساس نتایج بدست آمده پیشنهاد میشود که با اعمال تنش خشکی در ارقام مختلف گیاه کلزا، بیان miRNAهای پیشنهادشده و ژنهای هدف شناسایی شده در این پژوهش با روشهای آزمایشگاهی بررسی شود تا بتواند گامی مهم و بنیادین برای شناسایی ژنهای مهم جهت ایجاد ارقام مقاوم به خشکی کلزا در برنامههای بهنژادی و مهندسی ژنتیک باشد.