Document Type : Research Paper
Authors
1 PhD student of Plant Breeding, Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University (SANRU)
2 Department of Genetic Engineering and Biology, Genetics and Agricultural Biotechnology Institute of Tabarestan (GABIT), Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University
3 Department of Biotechnology and breeding, Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University (SANRU)
4 Genetic engineering and biology department, Genetic and Agricultural Biotechnology Institute of Tabarestan (GABIT), Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University (SANRU) Sari, Iran, P. O. Box 578
Abstract
NAC (NAM, ATAF1/2, and CUC2) proteins are the plant-specific transcription factors (TFs) that play roles in diverse developmental processes and stress responses. In the present study, a total of 68 NAC genes were identified in Aeluropus littoralis, a salt secreting halophytic grass, belongs to family Poaceae. By analysis of cis regulatory elements of AlNAC genes promoter, many cis-acting regulatory elements related to growth and development, phytohormone and stresses defense were found in the promoter of AlNAC genes. These hormone-responsive elements, include P-box, TCA element, CGTCA-motif and TGACG-motif, TGA-element, ERE and ABRE, which were associated with gibberellic acid, salicylic acid, jasmonic acid, Auxin, ethylene and abscisic acid response, respectively. For stress responsive elements, TC-rich repeats, ARE, MBS, LTR; and W box, can be noted which are related to defense and stress, anaerobic induction, drought inducibility, low-temperature inducibility, and wound stress, respectively. The different types of cis regulatory elements in the promoter of AlNAC genes and the variability in transcription factors associated with these regulatory elements indicates the important role of these genes in plant development and defense against stress. By analyzing AlNAC32 candidate gene expression using RT-qPCR it was revealed that AlNAC32 was up-regulated under salt, drought and ABA phytohormone stresses in leaf, stem and root tissues, implying its role in multiple abiotic stresses tolerance. These findings provided valuable information for further research on the functions and applications of AlNACs in A. littoralis growth and adaptation to stress.
Keywords
Main Subjects
تجزیه و تحلیل عناصر تنظیمی سیس مرتبط با تنشهای غیرزیستی در پروموتر ژنهای NAC گیاه آلوروپوس لیتورالیس
سمیرا محمدی1، قربانعلی نعمتزاده2،، حمید نجفی زرینی2 و سیدحمیدرضا هاشمیپطرودی3*
1 ایران، ساری، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، اصلاح نباتات
2 ایران، ساری، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، گروه بیوتکنولوژی و بهنژادی،
3 ایران، ساری، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، پژوهشکده ژنتیک و زیستفناوری کشاورزی طبرستان، گروه مهندسی ژنتیک و بیولوژی
تاریخ دریافت: 19/05/1399 تاریخ پذیرش: 17/12/1399
چکیده
پروتئینهای NAC (NAM، ATAF1-2 و CUC2)، فاکتورهای رونویسی مختص گیاهان هستند و در فرآیندهای مختلف نمو گیاهان و پاسخ به تنشها نقش دارند. در این مطالعه، 68 ژن NAC در گیاه Aeluropus littoralis بعنوان گیاه هالوفیت متعلق به خانواده Poaceae شناسایی شدند. با تجزیه و تحلیل عناصر تنظیمی سیس در نواحی پروموتر ژنهای AlNAC، بسیاری از عناصر مرتبط با رشد و نمو، فیتوهورمونها و دفاع در برابر تنشها یافت شدند. از جمله عناصر پاسخگو به هورمونها میتوان به P-box، TCA element، موتیفهای CGTCA و TGACG، TGA-element، ERE و ABRE اشاره نمود که بترتیب در پاسخگویی به جیبرلیکاسید، سالیسیلیکاسید، جاسمونیکاسید، اکسین، اتیلن و آبسیزیکاسید نقش دارند. برای عناصر پاسخگو به تنش میتوان TC-rich repeats، ARE، MBS، LTR و W box را ذکر نمود که بترتیب مرتبط با دفاع و تنش، القای بیهوازی، القای خشکی، القای دمای پایین و تنش آسیبهای مکانیکی میباشند. انواع مختلف عناصر تنظیمی سیس در پروموتر ژنهای AlNAC و تنوع در فاکتورهای رونویسی که به این عناصر متصل میشوند، حاکی از نقش مهم این ژنها در نمو گیاه و دفاع در برابر تنشها میباشند. با تجزیه و تحلیل بیان ژن کاندید AlNAC32 با استفاده از RT-qPCR مشخص شد که این ژن تحت تنشهای شوری، خشکی و ABA، در بافتهای برگ، ساقه و ریشه، افزایش بیان نشان میدهد که بیانگر نقش این ژن در تحمل به چندین تنش غیرزیستی میباشد. این یافتهها اطلاعات ارزشمندی جهت تحقیقات بیشتر در مورد عملکرد و کاربرد ژنهای AlNAC در رشد و سازگاری به تنش در A. littoralis فراهم آورده است.
واژههای کلیدی: آلوروپوس لیتورالیس، الگوی بیان ژن، خانواده ژنی، فاکتور رونویسی، هالوفیت
* نویسنده مسئول، تلفن: 01133687747، پست الکترونیکی: shr.hashemi@sanru.ac.ir
مقدمه
گیاهان در طول دوره رشد و نمو خود، تحت تأثیر شرایط نامساعد محیطی و یا تنشها قرار میگیرند و گیاهان با تغییرات مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی از جمله، بیان ژنهای تنظیمی و عملکردی جهت کارکرد بیولوژیکی پایدار، پاسخ به آنها را مدیریت میکنند (1). مطالعات زیادی نشان میدهند که، فاکتورهای رونویسی (TFها) در فرآیندهای فیزیولوژیکی گیاهان از جمله تنشهای زیستی و غیرزیستی و پاسخهای هورمونی مشارکت مینمایند (5). فاکتورهای رونویسی که حاوی دمینهای متصلشونده به DNA و تنظیمکننده رونویسی هستند، میتوانند با شناسایی و اتصال به عناصر سیس موجود در پروموترهای ژن هدف، بیان ژنهای پاییندست خود را تنظیم کنند (57). فاکتورهای رونویسی NAC (NAM، ATAF1-2 و CUC2) یکی از بزرگترین خانوادههای فاکتورهای رونویسی مختص گیاهان با بیش از 100 عضو در آرابیدوپسیس و برنج (37)، صنوبر (20)، سویا (26) و ارزن ایتالیایی (40) شناسایی شدند. پروتئینهای خانواده ژنی NAC، شامل یک دمین متصلشونده به DNA بسیار حفاظتشده در انتهای آمینی و یک دمین بسیار متغیر در انتهای کربوکسیلی هستند. دمین انتهای آمینی متشکل از حدود 150 تا 160 اسید آمینه با پنج زیردمین A-E بوده که برای اتصال این فاکتورها به DNAضروری میباشند (39)، در حالیکه دمین انتهای کربوکسیلی، برای خاصیت ترانساکتیواسیون (فعالسازی از راه دور) (Trans-activation) این پروتئینها حیاتی میباشد (46).
شواهد فراوانی وجود دارد که نشان میدهد، فاکتورهای رونویسی NAC، نقشهای مهمی در تنظیم طیف وسیعی از فرآیندهای بیولوژیکی مانند توسعه مریستم انتهایی شاخه (44)، رشد بذر (45)، پیری برگ (14)، تشکیل گل (41)، رشد فیبر (25) و پاسخ به تنشهای زیستی و غیرزیستی (19،35) ایفا میکنند. بعنوان مثال، بیشبیان AlNAC4 از گیاه Aeluropus lagopoides تحمل توتون تراریخت را به تنش اکسیداتیو بهبود بخشید (23). بیشبیان ژن MdNAC047 از Malus hupehensis با تنظیم پاسخ به اتیلن میتواند تحمل به شوری را در Arabidopsis thaliana تراریخته افزایش دهد (6)؛ بیشبیان AhNAC3 از Arachis hypogaea با افزایش ترشح سوپراکسید موجب افزایش تحمل گیاه توتون در برابر تنش خشکی و کمآبی میگردد (30). مطالعات مختلف نشان دادهاند که برخی از فاکتورهای رونویسی NAC قادرند به تنشهای غیرزیستی مختلف پاسخ دهند. بعنوان مثال، در آرابیدوپسیس، سه ژن ANAC019، ANAC055 و ANAC072 در تنشهای خشکی، شوری و آبسیزیکاسید (ABA) بطور همزمان القاء شدند (48). ژنهای ThNAC در گیاه هالوفیت Tamarix hispida در پاسخ به تنشهای شوری، خشکی، فلزات سنگین و ABA بیان شدند و این امر نشان میدهد که، ژنهای NAC در پاسخ به تنشهای غیرزیستی، نقشهای تنظیمی ایفا میکنند و در مسیرهای پیامدهی تنش وابسته به ABA دخیل میباشند (51).
عناصر تنظیمی سیس (CRE= Cis-acting regulatory element) در نواحی پروموتر ژنها، سوئیچهای مولکولی مهمی بوده که با تنظیم رونویسی ژنها، شبکه بزرگی از ژنهای دخیل در پدیدههای مختلف بیولوژیکی از جمله فرآیندهای رشد و نمو و پاسخ به تنشها را، کنترل میکنند (7). تجزیه و تحلیل فعالیت پروموتر OsNAC6 به روش الحاق به ژن گزارشگر (Reporter gene) GUS نشان میدهد که این ژن توسط ABA، جاسمونیکاسید (JA) و تنشهای محیطی مختلف القاء میشود. بررسی اینسیلیکو توالی پروموتر، مؤید حضور عناصر تنظیمی سیس پاسخگو به تنشهای محیطی مختلف بوده است (35). همچنین تجزیه و تحلیل فعالیت پروموتر فاکتور رونویسی NAC پنبه (GhNAC4) بر مبنای ژن گزارشگر GUS نشان میدهد که، تنظیم این پروموتر تحت تیمار فیتوهورمونها و تنشهای محیطی القاء میشود (49).
آلوروپوس لیتورالیس (Aeluropus littoralis) یک گیاه هالوفیت چندساله C4 متعلق به خانواده Poaceae میباشد. این گیاه معمولاً در باتلاقهای شور رشد میکند و میتواند سطوح بالای شوری (عمدتاً کلرید سدیم) را تا بیش از 600 میلیمولار تحمل نماید (2،12). این گیاه، علاوهبر مقاومت به شوری، بعنوان گیاهی مقاوم به خشکی و گرما نیز محسوب میشود (18-16، 59). با توجه به اینکه هالوفیتها با ساختار ژنتیکی متمایز خود، پتانسیل بالایی جهت بقا و تکمیل چرخه زندگی خود در زیستگاههای با شوری بالا دارند، شناسایی و تعیین خصوصیات فاکتورهای رونویسی پاسخگو به تنش در این گیاهان بسیار مهم میباشد. این ژنها با تنظیم ژنهای پاسخگو به تنش و افزایش تحمل به تنش قادرند در مهندسی ژنتیکی محصولات زراعی استفاده شوند (3،4). بنابراین در مطالعه حاضر، جهت درک مکانیسمهای تحمل به تنشهای غیرزیستی، ژنهای NAC در ژنوم A. littoralis شناسایی و توالیهای پروموتر آنها برای یافتن عناصر تنظیمی سیس بالقوه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند و جهت دستیابی به اطلاعات بیشتر در زمینه مکانیسمهای تنظیمی احتمالی خانواده ژنی AlNAC، برهمکنشهای تنظیمی بالقوه بین فاکتورهای رونویسی و ژنهای AlNAC پیشبینی شد. در نهایت، جهت دستیابی به اطلاعات بیشتر در زمینه تأثیر تنشهای خشکی و شوری و همچنین فیتوهورمون ABA بر بیان ژنهای AlNAC، تجزیه و تحلیل بیان ژن کاندید AlNAC32 بعنوان یک همولوگ از ژن OsNAP (Os03g0327800) که بطور قابل توجهی در اثر تنشهای ABA و غیرزیستی القاء شده است (9)، با استفاده از RT-qPCR انجام گردید.
مواد و روشها
شناسایی ژنهای NAC در گیاه آلوروپوس لیتورالیس: در این تحقیق از توالی ژنوم مرجع گیاه A. littoralis موجود در پژوهشکده ژنتیک و زیستفناوری کشاورزی طبرستان (منتشر نشده) برای شناسایی ژنهای NAC بالقوه در ژنوم A. littoralis استفاده گردید. بدین منظور، توالیهای پروتئینی NAC در گیاهان مدل برنج و آرابیدوپسیس، بترتیب از پایگاههای داده RGAP (http://rice.plantbiology.msu.edu/) و TAIR (https://www.arabidopsis.org/) دریافت شدند. سپس از توالیهای دریافت شده بعنوان توالی مورد نظر (Query) در توالی ژنوم گیاه آلوروپوس لیتورالیس برای جستجوهای tBLASTn Local با استفاده از نرمافزارBioEdit (15) با E-value کمتر از 1E-10 استفاده شدند. پس از حذف پروتئینهای ناقص و تکراری، حضور دمین (NAM) NAC، با استفاده از پایگاههای اطلاعاتی InterProScan (https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/) (22)، Pfam (http://pfam.xfam.org/) (13) و SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) (29) تأیید شد.
تجزیه و تحلیل توالی پروموتر ژنهای AlNAC : تجزیه و تحلیل عناصر سیس (Cis element) در پروموتر ژنهای AlNAC به درک اطلاعات مربوط به تنظیم بیان ژن کمک مینماید. پس از تعیینتوالی ژنومی هر یک از اعضای خانواده AlNAC، 2000 جفتباز بالا دست کدون شروع (ATG) ژنها بعنوان توالی پروموتر در نظر گرفته شده و شناسایی عناصر تنظیمی سیس با استفاده از PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) انجام گردید (28). جهت مقایسه، توالی پروموتر گیاه مدل آرابیدوپسیس نیز مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. در نهایت، نقشه توزیع عناصر سیس در پروموتر ژنهای AlNAC با استفاده از ابزار MAST (http://meme-suite.org/tools/mast/) (8) انجام گردید.
پیشبینی برهمکنشهای تنظیمی بالقوه بین فاکتورهای رونویسی و ژنهای AlNAC : فاکتورهای رونویسی (TFs) با تنظیم بیان ژنهای مرتبط، نقش اصلی، در بسیاری از فرآیندهای سلولی و بیولوژیکی ایفا مینمایند. جهت دستیابی به اطلاعات بیشتر در زمینه مکانیسمهای تنظیمی احتمالی خانواده ژنی AlNAC، برهمکنشهای تنظیمی بالقوه بین فاکتورهای رونویسی و ژنهای AlNAC با استفاده از ابزار آنلاین Promoter Analysis نرمافزار PlantPAN2.0 (http://plantpan2.itps.ncku.edu.tw/promoter_multiple.php) پیشبینی گردید (10).
آنالیز بیان ژن کاندید AlNAC32 با استفاده از RT-qPCR: در این بررسی از نمونههای کلون آلوروپوس لیتورالیس استفاده گردید. کشت نمونههای کلونشده در محلول هوگلند با شرایط دمایی 3±25 درجه سانتیگراد، و دوره نوری 8 ساعت تاریکی/16 ساعت روشنایی و شدت نوری µmol m-2 S-1 240 صورت پذیرفت. سپس نمونههای کلونشده به محلول هوگلند منتقل شدند و پس از دو ماه، تنش شوری (کلرید سدیم 250 و 600 میلیمولار) و تنش خشکی (PEG 20 درصد) اعمال گردید. تیمار ABA نیز با اسپری هورمون ABA 100 میکرومولار روی برگها انجام شد. سپس نمونهبرداری از بافتهای برگ، ساقه و ریشه (3 تکرار بیولوژیکی)، در سری زمانی صفر (شاهد)، 3 و 6 ساعت بعد از اعمال تنش انجام شد و نمونهها برای انجام مراحل بعدی در فریزر 80- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
استخراج RNA کل از نمونهها با استفاده از کیت تریزول (Threezol, Riragene) انجام شد. کمیت و کیفیت نمونههای RNA بهترتیب با روش اسپکتوفتومتری و الکتروفورز ژل آگارز 5/1 درصد صورت گرفت. جهت حذف DNA ژنومی، از تیمارDNase I (Thermo Scientific) استفاده گردید. سنتز cDNA بهوسیله کیت شرکت ترمو (Thermo Scientific) طبق دستورالعمل شرکت، انجام و به نسبت 4 برابر رقیق گردیدند. طراحی آغازگر اختصاصی ژن AlNAC32 (Forward: GGTCAACAACGCCAACAG; Reverse: CGCCGCTCTCTTCTGAT) با استفاده از نرمافزار AlleleID انجام شد. هر واکنش در حجم 10 میکرولیتر حاوی 5 میکرولیتر از The Maxima SYBR Green/ROX RT-qPCR Master Mix (Thermo Scientific)، 2 میکرولیتر cDNA رقیق شده، 3/0 میکرولیتر آغازگر و 7/2 میکرولیتر آب عاری از RNase، با استفاده از چرخه دمایی 95 درجه سانتیگراد 10 دقیقه، 95 درجه سانتیگراد 15 ثانیه، 60 درجه سانتیگراد 1 دقیقه در 40 چرخه بوده و 6 کنترل منفی (NTC) نیز، در نظر گرفته شد. آنالیز منحنی ذوب نمونهها و سیکل آستانه با نرمافزار CFX(Bio-Rad) محاسبه و ژن UBQ بعنوان کنترل داخلی در نظر گرفته شد. میزان بیان نسبی ژن مورد مطالعه نیز، با روش ΔΔCt-2 محاسبه گردید. تجزیه واریانس میزان بیان ژنها با استفاده از روش فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با 5 تیمار در 3 تکرار بیولوژیکی با استفاده از نرمافزار SAS 9.0 و مقایسه میانگین با آزمون t-test در اکسل انجام شد.
نتایج
شناسایی ژنهای NAC در گیاه آلوروپوس لیتورالیس: جهت شناسایی ژنهای NAC بالقوه در ژنوم آلوروپوس لیتورالیس، آنالیز همولوژی بر مبنای پروتئینهای NAC آرابیدوپسیس و برنج با ژنوم آلوروپوس، منجر به شناسایی 68 ژن گردید. با بررسی این پروتئینها در پایگاههای InterProScan، Pfam و SMART، دمین اختصاصی NAM (PF02365) یا NAC (PF01849) مشاهده گردید. برای نامگذاری این ژنهای NAC، پیشوند Al قرار گرفته و بهصورت AlNAC.01 تا AlNAC.68 نامگذاری شدند.
عملکردهای متنوع عناصر تنظیمی سیس در پروموترهای AlNAC : جهت شناسایی عناصر تنظیمی سیس ژنهای AlNAC، 2000 جفتباز بالادست توالی ژنومی کدون شروع هر ژن بعنوان منطقه پروموتر در نظر گرفته شد. از 68 ژن شناساییشده اطلاعات مربوط به توالیهای پروموتر 38 ژن، کامل بوده و در این بررسی فقط این تعداد ژنهایی که دارای توالی پروموتر کامل (2000 جفتباز) بودند، مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. در این بررسی، جعبههای CAAT و TATA که بترتیب در نواحی افزاینده (Enhancer regions) و عنصر پروموتر مرکزی (Core promoter element) قرار داشته در نواحی پروموتر تمام ژنهای مورد بررسی، مشاهده شد. تقریباً تمام ژنهای AlNAC مورد بررسی در پروموترهای خود، عناصر تنظیمی سیس پاسخگو به نور، تنش آبی و تنش خشکی را دارا بودند. عناصر تنظیمی سیس پاسخگو به تنشهای القای بیهوازی (Anoxic)، پاتوژن و آسیبهای مکانیکی در نواحی پروموتری حدود 90 درصد از ژنهای AlNAC مشاهده شد. علاوهبر این، 37/97 درصد از ژنها دارای عناصر تنظیمی سیس پاسخگو به تنشهای گرما، pH پایین، کمبود مواد مغذی و تنش اسمزی در نواحی پروموتر خود بودند. عناصر پاسخگو به ABA، سالیسیلیکاسید (SA) و JA در نواحی پروموتر حدود 90 درصد از ژنهای AlNAC مشاهده شد. عناصر پاسخگو به اتیلن (ETH)، جیبرلین (GA) و اکسین (Auxin) در بسیاری از پروموتر ژنهای مورد بررسی (بترتیب 32/26 درصد، 79/65 درصد، 26/55 درصد) یافت شدند. عناصر TC-rich repeats (دفاعی و پاسخگو به تنش) و (LTR= Low Temperature Response) (پاسخگو به دمای پایین) بترتیب در 47/39 و 89/57 درصد از پروموترهای ژنها مشاهده گردید. بیش از 89 درصد ژنها دارای عناصر مرتبط با چرخه سلولی و تکثیر سلولی در نواحی پروموتر خود بودند. فقط ژن (Alg10334) AlNAC47 دارای عناصر تنظیمی مرتبط با پاسخ به یونهای فلزی سنگین بود (جدول 1).
تجزیه و تحلیل عناصر سیس، روشی مؤثر جهت پیشبینی مکانیسمهای تنظیمی در مرحله رونویسی است (48). در بین عناصر شناسایی شده، ARBE در پاسخ به تنشهای خشکی و ABA، و عنصر DRE نیز در تنشهای خشکی و اسمزی القاء میشوند، همچنین MBS بعنوان جایگاه اتصال MYB در پاسخ به تنش خشکی دخیل میباشد. پروموتر AlNAC28 دارای 7 عنصر ARBE، 4 عنصر DRE و یک عنصر MBS میباشد. در مجموع، 10 پروموتر دارای هر 3 عنصر ARBE، DRE و MBS بودند (شکل 1). بیشتر ژنهای AlNAC دارای عناصر تنظیمی ARBE (34 ژن، عنصر سیس پاسخگو به آبسیزیکاسید)، CGTCA motif (33 ژن، عنصر تنظیمی پاسخگو به جاسمونیکاسید، G-Box (26 ژن، عنصر سیس پاسخگو به نور) و ARE (30 ژن، عنصر تنظیمی ضروری برای القای بیهوازی) بودند (شکل 1).
شکل 1- تجزیه و تحلیل تعداد عناصر سیس در ژنهای NAC گیاه آلوروپوس لیتورالیس. رنگها و اعداد مختلف، تعداد عناصر مختلف موجود در پروموتر ژنهای AlNAC را نشان میدهد.
جدول 1- عناصر تنظیمی سیس شناسایی شده در نواحی پروموتر ژنهای NAC در آلوروپوس لیتورالیس و آرابیدوپسیس همراه با عملکرد بالقوه آنها.
Element Species (ID of CARE) |
Number (Percentage) of Elements in Promoters of NAC Genes |
|
|
Arabidopsis thaliana |
Aeluropus littoralis |
Core promoter/enhancer element (AT-TATA-box, CAAT-box, TATA, TATA-box) |
113(100.0%*) |
38(100.0%) |
Water response (AT-rich element, MYB) |
87(77.00%) |
37(97.37%) |
Drought response (ACTCATCCT sequence, as-1, DRE core, DRE1, MBS, MYB recognition site, MYC) |
104(92.04%) |
38(100.0%) |
Cold response (LTR) |
36(31.86%) |
22(57.89%) |
Heat, osmotic stress, low pH, nutrient starvation stresses response (STRE) |
40(35.40%) |
37(97.37%) |
Anoxic response (ARE, GC-motif) |
81(71.68%) |
34(89.47%) |
Cd response (AP-1) |
5(4.42%) |
1(2.63%) |
Defense response (TC-rich repeats) |
33(29.20%) |
15(39.47%) |
Wounding and pathogen response (box S, W box, WRE3, WUN-motif) |
72(63.72%) |
36(94.74%) |
Light response (3-AF1 binding site, AAAC-motif, ACE, AE-box, AT1-motif, ATC-motif, ATCT-motif, Box 4, Box II, CAG-motif, chs-CMA1a/2a, GA-motif, Gap-box, GATA-motif, G-Box, GT1-motif, GTGGC-motif, I-box, LAMP-element, MRE, Pc-CMA2a, 4cl-CMA2b, Sp1, TCCC-motif, TCT-motif, chs-Unit 1 m1) |
113(100.0%) |
38(100.0%) |
Circadian response (circadian) |
7(6.19%) |
6(15.79%) |
ETH response (ERE) |
46(40.71%) |
10(26.32%) |
ABA response (ABRE, ABRE2, ABRE3a, ABRE4, AT-ABRE, CARE) |
78(69.03%) |
34(89.47%) |
GA response (GARE-motif, P-box, TATC-box, CARE) |
31(27.43%) |
25(65.79%) |
JA response (CGTCA-motif, TGACG-motif, JERE) |
65(57.52%) |
35(92.11%) |
SA response (SARE, TCA-element) |
38(33.63%) |
34(89.47%) |
Auxin response (TGA-element, TGA-box, AuxRR-core) |
43(38.05%) |
21(55.26%) |
Cell cycle and cell proliferation response (CCGTCC motif, dOCT, E2Fb, MSA-like, Myb-binding site, NON, OCT, re2f-1, HD-Zip 1, O2-site, MBSI) |
62(54.87%) |
34(89.47%) |
Tissue specific/preferential expressed (AC-I, AC-II, CAT-box, GCN4_motif, RY-element, Unnamed_1) |
36(31.86%) |
26(68.42%) |
No functional description (AAGAA-motif, CCAAT-box, A-box, Unnamed__1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, MYB-like sequence, TCA, F-box, CTAG-motif, 3-AF3 binding site, Box III, plant_AP-2-like, E2F, HD-Zip 3, Box II –like sequence, AT-rich sequence, GC-repeat, Y-box) |
113 (100.0%) |
38(100.0%) |
*درصد برآوردشده از تقسیم تعداد پروموترهای دارای عناصر تنظیمی سیس مورد نظر بر تعداد کل پروموترها بهدست آمده است. |
11 عنصر ABRE در پروموتر ژن AlNAC68 و 10 عنصر ABRE بترتیب در AlNAC24 و AlNAC25، و عنصر TC-rich دخیل در دفاع و پاسخ به تنش در پروموتر 15 ژن AlNAC یافت شدند. 2 عنصر TC-rich در پروموترهای AlNAC15، AlNAC49 و AlNAC51 یافت شد. MBS جایگاه اتصال MYB درگیر در تنش خشکی در پروموتر 20 ژن مشاهده گردید، با این حال، 3 عنصر MBS در پروموترهای AlNAC15، AlNAC45 و AlNAC49 یافت شدند. عنصر CGTCA در پروموتر 35 ژن شناسایی و 6 مورد از این عنصر در پروموترهای AlNAC07 و AlNAC08 یافت گردید (شکل 1).
به منظور درک بهتر مکانیسمهای تنظیمی احتمالی ژنهای AlNAC تحت تنشهای غیرزیستی، 8 عنصر سیس as-1، core DRE، DRE1، MBS، STRE، TC-rich repeats، ABRE و GCTCA-motif را انتخاب کرده و نواحی پروموتر (2000 جفتباز بالادست جایگاه شروع رونویسی) ژنها بررسی و نتیجه در شکل 2 نشان داده شده است.
شکل 2- شمای عناصر سیس مرتبط با تنش در پروموتر ژنهای AlNAC. عناصر سیس مختلف با رنگهای مختلف نشان داده شدهاند.
پیشبینی برهمکنشهای تنظیمی بالقوه بین فاکتورهای رونویسی و ژنهای AlNAC : جهت دستیابی به اطلاعات بیشتر در زمینه مکانیسمهای تنظیمی احتمالی خانواده ژنی AlNAC، برهمکنشهای تنظیمی بالقوه بین فاکتورهای رونویسی و ژنهای AlNAC با استفاده از ابزار آنلاین Promoter Analysis نرمافزار PlantPAN2.0 پیشبینی شد. نتایج نشان میدهد که، ژنهای AlNAC میتوانند توسط 50 خانواده فاکتور رونویسی تنظیم شوند (شکل 3). فاکتورهای رونویسی از جمله AT-Hook، ARR-B، C2H2، HD-ZIP، bZIP، bHLH، Myb/SANT، WRKY، Dehydrin، Trihelix و ERF میتوانند تمام ژنهای AlNAC را تنظیم کنند. بسیاری از خانوادههای فاکتورهای رونویسی ذکر شده در جنبههای مختلف رشد و نمو گیاه، انتقال سیگنال هورمونی، دفاع از گیاه و پاسخ به تنشها دخیل میباشند. این امر نشان میدهد که، ژنهای AlNAC با برهمکنش با این فاکتورهای رونویسی میتوانند در نمو گیاه و فرآیندهای متنوع دفاع گیاه در برابر تنش مشارکت نمایند.
شکل 3- تعداد ژنهای AlNAC تنظیمشده توسط خانوادههای مختلف عوامل رونویسی (TFs).
آنالیز بیان ژن کاندید AlNAC32 با استفاده از RT-qPCR: جهت دستیابی به اطلاعات بیشتر در زمینه تأثیر تنشهای خشکی و شوری و همچنین فیتوهورمون ABA بر بیان ژن کاندید AlNAC32، تجزیه و تحلیل بیان با استفاده از RT-qPCR انجام گردید. 3 ساعت بعد از تنش شوری ناشی از اعمال سدیمکلرید در سطح 250 میلیمولار، افزایش بیان 42/42، 51/6 و 19/8 برابری ژن AlNAC32 نسبت به شاهد بترتیب در بافتهای برگ، ساقه و ریشه مشاهده گردید، اما 6 ساعت بعد از اعمال تنش، این مقادیر بترتیب به 74/0، 8/1 و 85/9 تغییر پیدا نمود. اما اعمال سدیمکلرید در سطح 600 میلیمولار منجر به افزایش بیان 17/77، 47/6 و 6/10 برابری این ژن بترتیب در بافتهای برگ، ساقه و ریشه، 3 ساعت بعد از اعمال تنش گردید، اما 6 ساعت بعد از اعمال تنش، مقادیر بیان در بافتهای برگ و ریشه بترتیب به 13/10 و 03/6 کاهش پیدا نمود، اما در بافت ساقه با بیان 65/6 تغییر چندانی مشاهده نگردید. تنش خشکی ناشی از پلیاتیلنگلیکول (PEG) منجر به افزایش بیان 56/15، 2/4 و 36/1 برابری ژن AlNAC32 بترتیب در بافتهای برگ، ساقه و ریشه، 3 ساعت بعد از اعمال تنش گردید، اما 6 ساعت بعد از اعمال تنش، بیان در بافت برگ با مقدار 28/7، کاهش بیان، و در بافت ساقه با مقدار 05/4 کاهش بسیار اندکی و در بافت ریشه با مقدار 32/4، افزایش بیان نشان دادند. سطح رونوشت AlNAC32 3 ساعت بعد از اعمال تیمار ABA در بافتهای برگ، ساقه و ریشه، بترتیب افزایش بیان 83/5، 18/4 و 32/2 برابری نشان داد. در حالیکه 6 ساعت بعد از اعمال تیمار، بیان این ژن در بافتهای برگ و ساقه بترتیب به 86/0و 76/0 برابرکاهش پیدا نمود ولی در بافت ریشه، افزایش بیان (55/2 برابری) مشاهده گردید (شکل 4).
بحث و نتیجه گیری
مکانیسمهای مولکولی دخیل در تحمل گیاهان در برابر تنشها بسیار پیچیده بوده و ژنهای زیادی در این میان نقش ایفا میکنند (1). تنظیم بیان ژنها، چندسطحی بوده و تنظیم رونویسی، مکانیسم اصلی تنظیم بیان ژنهای گیاهی میباشد.
شکل4- الف) الگوی بیان ژن AlNAC32 تحت تیمارهای سدیمکلرید 250 و 600 میلیمولار، ABA 100 میکرومولار و PEG 20 درصد (p < 0.05*، p < 0.01**، p < 0.001***). ب) منحنی ذوب (Melt curve) ژن AlNAC32 در بافتهای برگ، ساقه و ریشه.
برهمکنش میان جایگاههای اتصال پروموتر و فاکتورهای رونویسی، نقش مهمی در تنظیم ژنها در سطح رونویسی ایفا مینماید. القاء (فعال/غیرفعال) پروموترهای القایی توسط سیگنالهای خارجی بوده، که بهواسطه عناصر تنظیمی سیس موجود در پروموترها که از اختصاصیت و پایداری عملکرد بالایی برخوردارند، صورت میگیرد (52). ارزیابی عناصر سیس موجود در ناحیه پروموتر ژنهای AlNAC میتواند به درک بهتر تنظیم این ژنها توسط فیتوهورمونهای مختلف کمک نماید. تجزیه و تحلیل عناصر تنظیمی سیس نشان داد که تمام ژنهای AlNAC در نواحی پروموتر خود دارای یک یا چند عنصر سیس پاسخگو به فیتوهورمون مانند اکسین، جاسمونیکاسید، جیبرلین، آبسیزیکاسید، سالیسیلیکاسید و اتیلن میباشند. بعنوان مثال، عناصر P-box و GARE-motif مرتبط با مسیر انتقال سیگنال GA، و CGTCA-motif و TGACG-motif با پاسخ به MeJA همراه هستند (56). تعداد زیادی از مطالعات نشان میدهند که، این عناصر نقش مهمی در بسیاری از فرآیندهای فیزیولوژیکی مانند نمو گیاه، پیری و بلوغ، متابولیسم ثانویه گیاهان و همچنین پاسخ به تنشهای محیطی مختلف ایفا میکنند (56). MeJA در وساطت بیان ژنهای مرتبط با پاسخ گیاهان به آسیب (11) و اکسین با القاء نرم شدن دیواره سلولی در تنظیم خواص دیواره سلولی نقش دارند (31). در این تحقیق چندین عنصر پاسخگو به ABA مانند ABRE، ABRE2، ABRE3a، ABRE4 و AT-ABRE در پروموتر ژنهای AlNAC پیشبینی شد. مشخص شده است عنصر ABRE که با مسیر پیامدهی وابسته به ABA همراه است، پاسخ گیاه را به تنش خشکی و شوری افزایش میدهد (43). در بررسی دیگری جهش در موتیف ABRE در پروموتر OsNAC5 برنج، منجر به لغو فعالسازی پروموتر توسط ABA گردید (47). علاوهبر این، در مجموع 1340 عنصر تنظیمی سیس مرتبط با تنش، شناسایی و به چند گروه تقسیم شدند (جدول 1). عنصر پاسخگو به کمآبی (DRE) که در پروموتر ژنهای AlNAC یافت شد، نمونه دیگری از عناصر سیس است که در رونویسی پاسخگو به تنش اسمزی درگیر است (34). این عنصر برای اولین بار بعنوان یک عنصر سیس ضروری در پروموتر ژن (RD29A= RESPONSIVE TO DESSICATION 29A) برای بیان مستقل از ABA در پاسخ به تنشهای خشکی و سرما شناخته شد (54). TC-rich repeat یک عنصر پروموتری است که در دفاع و پاسخگویی به تنش در ژن (DREB= Dehydrating Responsive Element Binding) آرابیدوپسیس نقش دارد (42). عنصر TCA-element علاوهبر پاسخ به فاکتورهای مختلف تنشهای غیرزیستی، مسئول میانجیگری مسیر پیامدهی سالیسیلیکاسید است (33). علاوهبر این سایر عناصر سیس درگیر در تنش اسمزی مانند MBS نیز در پروموترهای AlNAC مشاهده شدند. تمام پروموترها حاوی بیش از یک عنصر مرتبط با پاسخ به خشکی و ABA مانند عناصر MYC و MYB بودند. تشخیص این عناصر سیس پاسخگو به تنش نشاندهنده نقش کارکردی ژنهای AlNAC در تحمل گیاه آلوروپوس لیتورالیس به تنش خشکی و شوری میباشد.
جایگاههای اتصال برای چند TF شناخته شده دیگر مانند GATA،AT-Hook ، WOX، Dof، C2H2 و WRKY در نواحی پروموتر ژنهای AlNAC پیشبینی گردید که قادرند نقشهای مهمی در اندامزایی و بیانهای اختصاصی بافت ایفا نمایند. بعنوان مثال، موتیف GATA که جایگاه اتصال فاکتور رونویسی GATA میباشد، در پاسخگویی به نور و اختصاصیت بافت نقش دارد و در نمو وابسته به نور بافت آبکش نیز نقشآفرینی میکند (55). فاکتور رونویسی AT-Hook در بیان اختصاصی بافت آوندی نقش دارد و فاکتور رونویسی WOX در چندین فرآیند نموی کلیدی دخیل میباشد (49). فاکتورهای رونویسی Dof نیز فرآیندهای مرتبط با ایجاد و حفظ سیستم آوندی را بطور مستقیم یا غیرمستقیم تنظیم میکنند (27). فاکتورهای رونویسی C2H2 مانندZAT7 ، ZAT10 و ZPT2 در تنظیم پاسخ به تنشهای زیستی و غیرزیستی نقش دارند (24). فاکتورهای رونویسی WRKY به موتیف W box در پروموتر ژن ERF3 توتون متصل و موجب فعالسازی سریع آن هنگام آسیبهای مکانیکی میشود (36). پروموتر ژن OsNAC6 برنج القاءشده تحت آسیبهای مکانیکی دارای چهار نسخه از W-box بود (35).
نتایج آنالیز بیان ژن کاندید AlNAC32 با استفاده از RT-qPCR نشان داد که در بافت برگ 3 ساعت بعد از اعمال تیمارهای سدیم کلرید 250 و 600 میلیمولار، PEG و فیتوهورمون ABA، مقادیر بیان ژن کاندید افزایش مییابد اما 6 ساعت بعد از اعمال تنش، این مقادیر، کاهش نشان دادند. با این حال، در بافت ساقه، 3 ساعت بعد از اعمال تیمارهای سدیم کلرید 250 میلیمولار و ABA، افزایش بیان مشاهده شد اما 6 ساعت بعد، این مقادیر تقلیل پیدا نمودند، در حالیکه تحت تیمارهای سدیم کلرید 250 میلیمولار و تنش خشکی، افزایش بیان نشان داده شده در 3 ساعت بعد از اعمال تنش، بدون تغییر چندانی در 6 ساعت بعد از اعمال تنش نیز مشاهده گردید. اما در بافت ریشه تحت تیمارهای سدیم کلرید 250 میلیمولار، ABA و تنش خشکی، 6 ساعت بعد از تنش، افزایش بیان بالاتری در مقایسه با 3 ساعت بعد از تنش مشاهده گردید. اگرچه تحت تیمار سدیم کلرید 600 میلیمولار، در مدت زمان 6 ساعت بعد از تنش در مقایسه با 3 ساعت، مقدار بیان کاهش پیدا نمود (شکل 4). ژن کاندید AlNAC32 یک همولوگ از ژن OsNAP (Os03g0327800) محسوب میشود که بطور قابل توجهی در اثر تنشهای ABA و غیرزیستی، از جمله شوری بالا، خشکی و دمای پایین القاء شده است (9). این امر میتواند بیانگر کارکرد مهم AlNAC32 بعنوان یک ژن کاربردی متحمل به تنشهای غیرزیستی باشد.
فیتوهورمون ABA نقش مهمی در رشد و نمو گیاهان و پاسخ به تنشهای غیرزیستی، مانند شوری، خشکی و سرما دارد (32). شواهد نشان میدهد که فاکتورهای رونویسی NAC در انتقال پیام وابسته به ABA درگیر میباشند. چندین NAC در آرابیدوپسیس تنظیم فرآیندهای وابسته به ABA را نشان دادهاند (21). پاسخ ژن کاندید AlNAC32 به تیمار ABA، بیانگر نقش احتمالی این ژن در پیامدهی ABA میباشد.
ژنهای SgNAC1 و SgNAC2 نیز بطور قابل توجهی در طول تنش سرما افزایش بیان نشان دادند (58). بیان ژن OsNAC6 برنج توسط تیمارهای ABA، JA، سرما، خشکی، شوری بالا و آسیبهای مکانیکی القاء شد (38). بیان SlNAC11 گوجهفرنگی در اثر گرما، کمآبی و سرما القاء شد (50). ژن TaNAC4 گندم توسط تیمارهای اتیلن، MeJA و ABA، سرما، شوری بالا، آسیبهای مکانیکی و پاتوژن زنگ نواری افزایش بیان نشان داد و بیان این ژن در ریشه گیاهچههای گندم در مقایسه با برگ و ساقه، بالاتر بود. این نتایج نشان داد که ژن TaNAC4 بعنوان یک فعالکننده رونویسی دخیل در پاسخ گندم به تنشهای زیستی و غیرزیستی ایفای نقش مینماید (53). افزایش بیان GhNAC4 تحت تنشهای مختلفی از جمله خشکی، شوری، تنش اسمزی، ROS و آسیبهای مکانیکی نشان میدهد که این ژنها ممکن است در مسیرهای پیامدهی چندین تنش محیطی، نقش بالقوهای داشته باشد (49).
انواع مختلف عناصر تنظیمی سیس در نواحی پروموتر ژنهای AlNAC و تنوع در فاکتورهای رونویسی که به این عناصر تنظیمی متصل میشوند، نشان میدهد که بیان این ژنها توسط طیف وسیعی از فیتوهورمونها و سیگنالهای تنشهای زیستی و غیرزیستی تنظیم میشود و این امر حاکی از نقش مهم این ژنها در نمو گیاه و دفاع در برابر تنشها میباشد. با تجزیه و تحلیل بیان ژن کاندید AlNAC32 با استفاده از RT-qPCR نیز مشخص شد که این ژن تحت تنشهای شوری، خشکی و ABA، در بافتهای برگ، ساقه و ریشه، افزایش بیان نشان میدهد که بیانگر نقش این ژن در تحمل به چندین تنش غیرزیستی میباشد. این یافتهها اطلاعات پایهای جهت تحقیقات بیشتر در مورد کارکرد ژنهای NAC در رشد و تحمل به تنشهای غیرزیستی در A. littoralis فراهم میآورد.
سپاسگزاری
این پژوهش با حمایت مالی پژوهشکده ژنتیک و زیستفناوری کشاورزی طبرستان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری در قالب طرح تحقیقاتی مصوب به شمارهT234/96 انجام شده است و بدینوسیله نویسندگان بر خود لازم میدانند مراتب تشکر و قدردانی خود را اعلام نمایند.
1- بنده حق، ع.، ش. علیپور قربانی، م. تورچی و ر. شکری قره لو. 2018. تجزیه پروتئوم بذر کلزا تحت تنش شوری. مجله پژوهشهای گیاهی، 31(2): 433-422.
2- دشتبانی، ف.، ر. حاجی بلند و ن. علی اصغرزاد. 2018. جوانهزنی، فتوسنتز و رشد دو گونه هالوفیت پوکسنلیا دیستانس و آلوروپوس لیتورالیس تحت شرایط شوری و همزیستی آنها با قارچهای میکوریز آربوسکولدار در شرایط طبیعی زیستگاه در دشت تبریز. مجله پژوهشهای گیاهی، 30(4): 833-817.
3- هاشمی پطرودی، ح.ر و س. محمدی. 2020. شناسایی خانواده ژنی ERF در گیاه شورزیست Aeluropus littoralis و بررسی الگوی بیان آنها در پاسخ به تنش شوری. زیستفناوری گیاهان زراعی، 9(3): 66-53.
4- هاشمی پطرودی، ح.ر.، ق.ع. نعمتزاده، س. محمدی و م. کولمن. 2019. بررسی الگوی بیانی خانواده ژنی فاکتورهای رونویسی شوک حرارتی (HSFs) در گیاه آلوروپوس لیتورالیس تحت تنش شوری. تنشهای محیطی در علوم زراعی، 13(2): 581-571.