Document Type : Research Paper
Authors
1 PhD student of Mohaghegh Ardabili University
2 Assistant Professor, Shahid Beheshti University, Faculty of Life Sciences and Biotechnology, Department of biotechnology
3 4- Assistant Professor, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran
4 Assistant Professor, Department of Agronomy & Plant Breeding, Faculty of agriculture and natural resources, University of Mohaghegh Ardabili, Ardabil, Iran
Abstract
Water stress is one of the most important factors affecting the metabolic pathways in the plant and thus alters the synthesis and accumulation of natural compounds such as fatty acids and hydrocarbons in medicinal plants. This study aimed to investigate the effect of different levels of water stress (Full irrigation at field capacity, irrigation at 70% of field capacity and irrigation at 40% of field capacity) on fatty acid and hydrocarbon quantities of Milk thistle. Drought stress was applied at flowering stage. Then the oil extract was extracted from the seeds using Soxhlet method and analyzed by GC-MS. Information about the pathway of the reactions of the identified compounds was extracted from bioinformatics databases. The results showed that the yield of fatty acids and hydrocarbons increased with increasing drought stress intensity. The predominant fatty acids identified in Milk thistle oil extract was linoleic acid (15.2-27.4%) and its dominant hydrocarbon was dodecane (12.3-14.1%). The percentage of fatty acids detected under stress was reduced, probably due to their degradation into hydrocarbons to maintain osmotic pressure under dehydration.
Keywords
Main Subjects
مقایسه اسیدهای چرب و هیدروکربنهای گیاه دارویی خارمریم در سطوح
مختلف تنش آبی
راحله قنبری محب سراج1، مهدی بهنامیان1*، اسدالله احمدی خواه2، وحید شریعتی3 و سارا دژستان1
1 ایران، اردبیل، دانشگاه محقق اردبیلی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه علوم باغبانی
2 ایران، تهران، دانشگاه شهید بهشتی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، گروه بیوتکنولوژی
3 ایران، تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک، گروه بیوتکنولوژی مولکولی گیاهی
تاریخ دریافت: 20/11/1398 تاریخ پذیرش: 07/07/1399
چکیده
تنش آبی یکی از مهمترین عواملی است که مسیرهای متابولیکی را در گیاه تحت تاثیر قرار میدهد و بنابراین، سنتز و تجمع ترکیبات طبیعی از جمله اسیدهای چرب و هیدروکربنها را در گیاهان دارویی تغییر میدهد. در این پژوهش، اثر سطوح مختلف تنش آبی (آبیاری کامل در حد ظرفیت زراعی، آبیاری در حد 70 درصد ظرفیت زراعی و آبیاری در حد 40 درصد ظرفیت زراعی) بر میزان اسیدهای چرب و هیدروکربنهای گیاه دارویی خارمریم مورد ارزیابی قرار گرفت. اعمال تنش خشکی در مرحله گلدهی انجام شد. سپس عصاره روغنی از بذور گیاهان به روش سوکسله استخراج و با استفاده از دستگاه GC-MS تجزیه و تحلیل شد. در نهایت ترکیبات شناسایی شده مورد آنالیز بیوانفورماتیکی قرار گرفت و مسیر واکنشها و آنزیمهای دخیل در این واکنشها شناسایی شد. نتایج بدست آمده در این آزمایش بیانگر افزایش عملکرد اسیدهای چرب و هیدروکربنها با افزایش شدت تنش بود. اسید چرب غالب شناسایی شده در عصاره روغنی خارمریم شامل لینولئیک اسید (4/27-2/15 درصد) و هیدروکربن غالب آن نیز شامل دودکان (1/14-3/12 درصد) بود. درصد اسیدهای چرب شناسایی شده تحت تاثیر تنش کاهش یافت که احتمالا به دلیل تجزیه آنها به هیدروکربنها به منظور حفظ فشار اسمزی در شرایط کم آبی بود.
واژه های کلیدی: آنالیز بیوانفورماتیکی دودکان، عصاره روغنی، لینولئیک اسید، Silybum marianum
* نویسنده مسئول، تلفن: مهدی بهنامیان، 09144145072 ، پست الکترونیکی: mbehnamian@uma.ac.ir
مقدمه
گیاهان دارویی مخازن اساسی بسیاری از ترکیبات و مواد دارویی میباشند که این ترکیبات علاوه بر عوامل ژنتیکی تحت تأثیر عوامل محیطی نیز قرار میگیرند (3 و 49). خارمریم (Silybum marianum L.) متعلق به خانواده Asteraceae که با نامهای خارشیری و ماریتیغال شناخته میشود، گیاهی یکساله و در بعضی رقم ها دوساله بوده و بومی نواحی مدیترانه است و در سرتاسر جهان گسترش یافته است (19 و 40). میوه این گیاه، فندقه به رنگ قهوهای براق یا خاکستری است و معمولاً بهعنوان داروی گیاهی استفاده میشود (25). فندقههای طبیعی این گیاه حاوی حدود 2/0 تا 6/0 درصد ترکیب سیلیمارین است (30). ماریتیغال و روغن حاصل از آن در درمان بیماری های کبدی (22) و کاهش میزان کلسترول بد خون (41) کاربرد داشته و دارای خواص آنتی اکسیدانی و ضدسرطانی (20) میباشد. بیوسنتز و تجمع ترکیبات فعال در بافتهای گیاهی به میزان زیادی به شرایط محیطی همبستگی دارد (16 و 55). تنشهای محیطی، مسیرهای متابولیکی مربوط به متابولیتهای ثانویه را تحت تاثیر قرار داده و بنابراین، سنتز و تجمع ترکیبات طبیعی در گیاهان را تغییر میدهد (9).
تنش آبی یکی از جدیترین تنشهای غیرزیستی است که رشد گیاهان را محدود کرده و کمیت و کیفیت محصول را کاهش میدهد (53 و 37). تنشهای محیطی با تغییر ساختمان غشا از لحاظ کمیت و کیفیت اسیدهای چرب و پروتئینها، بر رشد گیاه تاثیر دارند (42)، به طوری که Rezaeizad (52) و Sibi (57) نشان دادند که درصد روغن دانه در گل آفتابگردان و گلرنگ در اثر تنش خشکی دچار کاهش شد. کاهش عملکرد دانه و درصد روغن در شرایط تنش خشکی در فاز زایشی از گلدهی به بعد در کاهش عملکرد روغن سهیم می باشد (6). دانشیان و جباری (12) و عباسی سیه جانی و همکاران (7) نیز گزارش کردند که حداکثر عملکرد روغن در گل آفتابگردان از گیاهان شاهد آبیاری شده حاصل شد و اعمال تنش شدید کم آبیاری به ترتیب باعث کاهش 77 و 65 درصدی عملکرد روغن شد. با توجه به ارزش اسیدهای چرب در صنایع داروسازی، غذایی و بهداشتی، روشهای تهیه و تامین آن از منابع طبیعی و سنتزی دارای اهمیت است. از جمله این روشها دستیابی به منابع گیاهی است که به علت فقدان اطلاعات لازم و کافی در مورد ساختار شیمیایی و ترکیبات آن ها کمتر مورد توجه قرار گرفتهاند (15). اسیدهای چرب به طور گستردهای در طبیعت و مواد محتوی چربی پراکندهاند. مهمترین شاخص یک روغن خوراکی محتوی اسید چرب و تنوع این اسیدها در روغن است (24).
در پژوهشی که توسط گلی و همکاران (5) روی گیاه ماریتیغال انجام شد مشخص شد که میزان اسید لینولئیک (2/51 درصد) و اولئیک (8/28 درصد) بیش از اسیدهای چرب دیگر است. در پژوهشی دیگر علیرضالو و همکاران (4) میزان اسیدهای چرب روغن دانه ماریتیغال را اندازهگیری کرده و مشاهده کردند که در بین اسیدهای چرب اندازهگیری شده، بیشترین آنها مربوط به لینولئیک اسید (39 درصد) و اولئیک اسید (7/36 درصد) بود. سایر اسیدهای چرب شامل پالمتیک اسید (1/10 درصد)، استئاریک اسید (8/6 درصد)، لینولنیک اسید (6/3 درصد)، آراشیدیک اسید (9/2 درصد) و بهنیک اسید (57/0 درصد) بودند. گزارشها نشان میدهد که روغن گیاه خارمریم شامل اسیدهای چرب ضروری و غیرضروری مانند لینولئیک اسید، اولئیک اسید، لینولنیک اسید، استئاریک اسید، پالمتیک اسید و ترکیباتی مثل توکوفرولها و فیتواسترول ها است که میتواند بعنوان روغن خوراکی مورد مصرف قرار بگیرد (17).
یکی دیگر از سازوکارهای گیاه برای مقابله با تنش خشکی، تنظیم اسمزی می باشد. با تنظیم اسمزی تا حدی شرایط لازم برای ادامه جذب آب از محیط ریشه و حفظ و ادامه آماس سلول فراهم می شود (23). برای این منظور، گیاهان از ترکیبات آلی و معدنی استفاده میکنند. برخی انواع کربوهیدراتها در بین ترکیبات از اهمیت زیادتری برخوردار هستند زیرا با فتوسنتز مرتبط میباشند (51). توزیع مواد هیدروکربنی بطور مستقیم تحت تاثیر کمبود آب و بطور غیرمستقیم تحت تاثیر هورمون گیاهی قرار میگیرند. تجمع ترکیبات آلی مانند کربوهیدراتها و آمینو اسیدها در سیتوپلاسم نقش مهمی در تنظیم فشار اسمزی گیاهان دارند (18) سازوکارهای فوق منجر به رشد و نمو گیاه خارمریم با کمترین میزان دریافت آب و بدون کاهش عملکرد می شود (8 و 29). بنابراین، هدف از این تحقیق، بررسی میزان روغن و آنالیز محتوای اسیدهای چرب و هیدروکربنهای موجود در بذر گیاه دارویی خارمریم تحت سطوح مختلف تنش آبی بود.
مواد و روشها
تهیه و کشت بذر: بذور گیاه دارویی خارمریم از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه شد و در مزرعه ای با مساحت 150 متر مربع، با فاصله 25 سانتیمتر از یکدیگر در قسمت داغاب پشتههایی به عرض یک متر در عمق 3 سانتیمتری خاک کشت شده و هر 3 روز یکبار به طور کامل آبیاری گردید. ترکیبات تشکیل دهنده خاک شامل 3/1 رس، 3/1 شن و 3/1 کمپوست برگی بود. میانگین دمای هوا، بارندگی، رطوبت نسبی و سرعت باد برای هر ماه از سایت هواشناسی ثبت شد (جدول1). پس از رشد گیاهان و رسیدن به مرحله گلدهی، تنش آبی روی آنها اعمال شد.
جدول1- اطلاعات اتمسفری مزرعه دانشگاه شهید بهشتی، منطقه شمیرانات در سال های 97-96
اطلاعات اتمسفری |
اسفند |
فروردین |
اردیبهشت |
خرداد |
میزان بارندگی (mm) |
5/60 |
7/76 |
0 |
3/26 |
میانگین دمایی (°C) |
7/12 |
6/19 |
8/25 |
1/28 |
رطوبت (%) |
53 |
41 |
19 |
28 |
سرعت باد (mps) |
10 |
17 |
12 |
10 |
تعیین میزان آب خاک: در این آزمایش، میزان آب خاک به روش وزنی تعیین گردید (1 و 2). برای این منظور، ابتدا کل زمین بطور کامل و اشباع آبیاری گردید و پس از رسیدن خاک به حد ظرفیت زراعی، هر روز به میزان یک کیلو خاک از عمق صفر تا 30 سانتی متری در سه تکرار از نقاط مختلف زمین برداشته و وزن شد. سپس نمونههای خاک در آون با دمای 90 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت نگهداری شده و در نهایت، وزن خشک آنها اندازهگیری گردید. زمانی که خاک در سطح ظرفیت زراعی بود میزان آب آن در سطح 100 درصد در نظر گرفته شد و سپس نمونه برداری از خاک تا زمانی که میزان آب آن به 40 درصد ظرفیت زراعی رسید، انجام گرفت. برای محاسبه میزان آب موجود در خاک ابتدا وزن تر خاک اندازه گیری شد سپس وزن خشک خاک نیز اندازه گیری و از وزن تر خاک کسر گردید. این عمل به مدت 10 روز انجام شد. در روز دوم خاک به 100 درصد ظرفیت زراعی رسید و در روزهای ششم و هشتم به ترتیب به 70 و 40 درصد ظرفیت زراعی رسید.
نحوه اعمال تنش آبی و نمونهبرداری: به منظور اعمال تنش آبی، نمونههای گیاهی مربوط به تیمار 100 درصد ظرفیت زراعی به صورت یک روز در میان با 250 لیتر آب (میزان آب تا پر شدن کامل جوی) آبیاری شدند و گیاهان مربوط به تیمار 70 درصد ظرفیت زراعی به فاصله هر چهار روز با 175 لیتر آب و نمونههای مربوط به تیمار 40 درصد ظرفیت زراعی به فاصله هر شش روز با 100 لیتر آب آبیاری شدند. پس از گذشت 8 روز، نمونهبرداری جهت استخراج عصاره انجام گرفت. مراحل انجام این آزمایش، از کشت بذر تا برداشت نمونه سه ماه به طول انجامید. به منظور نمونه برداری، 4 بوته گیاه به طور تصادفی روی هر پشته انتخاب شده و بذرهای آنها پس از برداشت با هم ترکیب شده و به مدت یک ماه در دمای اتاق خشک گردید (1 و 2).
استخراج عصاره روغنی از بذور خارمریم: نمونههای بذر خشک شده با استفاده از دستگاه آسیاب به طور کامل پودر گردید و استخراج عصاره روغنی گیاه با استفاده از دستگاه سوکسله انجام شد. برای این منظور 2 گرم بذر از هر نمونه در کاغذ صافی پیچیده شد و در محفظه دستگاه قرار گرفت. سپس 80 میلی لیتر حلال هگزان به آن اضافه شده و عمل عصارهگیری در دمای 70 درجه سانتیگراد به مدت 6 ساعت انجام گردید. پس از این مدت، شیر سوکسله بسته شد تا هگزان موجود در عصاره بخار شود و عصاره بدست آمده تا زمان تجزیه در شیشههای تیره رنگ در یخچال نگهداری شد.
آمادهسازی عصارههای روغنی و تجزیه توسط دستگاه GC-MS : تجزیه عصارههای روغنی با دستگاه GC-MS (TRACE/DSQ, Thermo Finnigan, USA) مجهز به ستون DB1 (Agilent company, United States) به طول 60 متر، قطر داخلی 25/0 میلیمتر و ضخامت 25/0 میکرومتر انجام شد. برای این منظور، ابتدا 5/1 میلی لیتر هگزان به هر نمونه اضافه و کمی تکان داده شد. سپس به منظور آبگیری نمونهها، یک میلی لیتر از فاز رویی برداشته شده و به همراه نیم گرم سدیم سولفات به مدت پنج دقیقه با سرعت 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ گردید و در نهایت یک میکرولیتر از فاز رویی به دستگاه تزریق شد. سپس نتایج GC-MS در پژوهشکده گیاهان دارویی شهید بهشتی تجزیه و تحلیل شد و ترکیبات با بیشترین مقدار شناسایی و مورد بررسی قرار گرفت.
آنالیز بیوانفورماتیکی ترکیبات شناسایی شده: ترکیبات شناسایی شده حاصل از GC-MS با استفاده از پایگاه داده KEGG و METACYC آنالیز شد و واکنشهای تولید کننده این ترکیبات، مسیر این واکنشها و آنزیمهای دخیل شناسایی گردید.
آنالیز آماری دادهها: آنالیز آماری دادهها با استفاده از نرم افزار R 3.6.1 و RStudio 1.1.463 انجام شد. آزمایش در قالب طرح پایه بلوکهای کامل تصادفی در سه تکرار اجرا گردید. مقایسه میانگین دادهها با استفاده از آزمون چند دامنهای دانکن با پکیج agricolae در سطح معنیداری 05/0 انجام شد و شکلها و جداول با استفاده از برنامههای Word و Excel رسم گردید.
نتایج
ترکیب شیمیایی بذور خارمریم تحت شرایط متغیر آبیاری: نتایج تجزیه واریانس نشان داد بین تیمارهای سطوح مختلف آبیاری (ظرفیت زراعی، 70% ظرفیت زراعی و 40% ظرفیت زراعی) از لحاظ مقادیر اسیدهای چرب لینولئیک اسید، سیس-13-اکتادکانوئیک اسید، پالمیتیک اسید، استئاریک اسید (جدول 2) و هیدروکربنهای دودکان، دکان، اکتان، تترادکان، هگزادکان، اکتادکان و 3-متیل هپتان (جدو ل 3) تفاوت معنیداری وجود داشت ولی بین بلوکها در هیچ یک از ترکیبات اندازهگیری شده تفاوت معنیدار مشاهده نشد.
نتایج تجزیه GC-MS نشان داد که محتوای کل روغن استخراج شده در شرایط ظرفیت زراعی 41/365، در شرایط 70% ظرفیت زراعی به میزان 07/530 و در نهایت در شرایط 40% ظرفیت زراعی به میزان 58/616 سطح پیک بود.
جدول2- جدول تجزیه واریانس برخی از اسیدهای چرب اندازه گیری شده در گیاه دارویی خارمریم
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
Linoleic acid |
cis-13-Octadecenoic acid |
Palmitic acid |
Stearic acid |
بلوک |
2 |
ns16/5 |
ns82/4 |
ns01/5 |
ns61/4 |
تیمار تنش |
2 |
**77/42 |
**46/273 |
**003/2 |
**682/8 |
خطا |
4 |
02/0 |
001/0 |
012/0 |
07/0 |
ضریب تغییرات |
|
16/1 |
25/7 |
30/1 |
03/2 |
** معنی دار در سطح 001/0 * معنی دار در سطح 005/0 ns: عدم معنی داری |
جدول3- جدول تجزیه واریانس برخی از هیدروکربن های اندازه گیری شده در گیاه دارویی خارمریم
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
Dodecane |
Decane |
Octane |
Tetradecane |
Hexadecane |
Octadecane |
3-methyl-Heptane |
بلوک |
2 |
ns2/5 |
ns36/4 |
ns06/6 |
ns36/5 |
ns16/5 |
ns01/5 |
ns71/4 |
تیمار تنش |
2 |
**3/135 |
**9/216 |
**3/278 |
**2/487 |
**34/89 |
**093/3 |
**90/17 |
خطا |
4 |
03/0 |
009/0 |
023/0 |
019/0 |
037/0 |
012/0 |
057/0 |
ضریب تغییرات |
|
47/9 |
60/1 |
45/1 |
42/9 |
12/1 |
54/4 |
80/1 |
** معنی دار در سطح 001/0 * معنی دار در سطح 005/0 ns: عدم معنی داری |
اسیدهای چرب غالب شناسایی شده در عصاره روغنی خارمریم شامل لینولئیک اسید (4/27-2/15 درصد)، سیس-13-اکتادکانوئیک اسید (2/9-5/8 درصد)، پالمیتیک اسید (2/5-3/3 درصد) و استئاریک اسید (7/2-2 درصد) بوده و هیدروکربنهای غالب آن نیز شامل دودکان (1/14-3/12 درصد)، دکان (2/15-2/11 درصد)، اکتان (2/16-7/10 درصد)، تترادکان (5/9-2/9 درصد)، هگزادکان (4-8/3 درصد)، اکتادکان (7/1-3/1 درصد) و 3-متیل هپتان (2/1-7/0 درصد) بود که در سه سطح مختلف تنش شامل آبیاری در حد 40 درصد ظرفیت زراعی، آبیاری در حد 70 درصد ظرفیت زراعی و آبیاری در حد ظرفیت زراعی متغیر بود.
اثر سطوح مختلف آبیاری بر محتوای اسیدهای چرب بذور گیاه دارویی خارمریم: نتایج حاصل از GC-MS نشان داد که عصاره روغنی خارمریم حاوی تعداد زیادی اسیدهای چرب می باشد که غالبترین آنها لینولئیک اسید، اکتادکانوئیک اسید، پالمتیک اسید و استئاریک اسید بود (جدول4). در مطالعه حاضر، بیشترین درصد اسیدهای چرب در هر سه سطح آبیاری مربوط به لینولئیک اسید و کمترین درصد آن مربوط به استئاریک اسید بود. با مقایسه درصد اسیدهای چرب در هر سه سطح آبیاری مشخص شد که با افزایش شدت تنش درصد اسیدهای چرب در عصاره روغنی کاهش یافت (جدول4).
جدول 4- درصد اسیدهای چرب گیاه دارویی خارمریم در سطوح مختلف آبیاری
اسید چرب |
درصد اسیدهای چرب |
||
ظرفیت زراعی |
70 درصد ظرفیت زراعی |
40 درصد ظرفیت زراعی |
|
Linoleic acid |
4/27 |
9/18 |
2/15 |
cis-13-Octadecenoic acid |
2/9 |
7/7 |
5/8 |
Palmitic acid |
2/5 |
9/3 |
3/3 |
Stearic acid |
7/2 |
4/2 |
2 |
مقدار کل سطح پیک در اسیدهای چرب اندازهگیری شده در عصاره روغنی در تیمار ظرفیت زراعی، 49/162، در تیمار 70% ظرفیت زراعی، 91/173 و در تیمار 40% ظرفیت زراعی، 11/179 بود. مقدار بالای مجموع اسیدهای چرب در تیمارهای تنش به دلیل وجود مقادیر بالای اکتادکانوئیک اسید در روغن استخراج شده بود (شکل 1).
شکل 1- میزان اسیدهای چرب گیاه دارویی خارمریم در سطوح مختلف آبیاری
اثر سطوح مختلف آبیاری بر محتوای هیدروکربنی بذور گیاه دارویی خارمریم: تجزیه عصاره روغنی گیاه دارویی خارمریم نشان داد که نمونهها حاوی مقادیر متفاوتی هیدروکربن (آلکان) بودند (جدول 5).
جدول 5- درصد هیدروکربنهای گیاه دارویی خارمریم در سطوح مختلف آبیاری
هیدروکربن |
درصد هیدروکربنها |
||
ظرفیت زراعی |
70 درصد ظرفیت زراعی |
40 درصد ظرفیت زراعی |
|
Dodecane |
3/12 |
3/13 |
1/14 |
Decane |
2/11 |
2/14 |
2/15 |
Octane |
7/10 |
14 |
2/16 |
Tetradecane |
2/9 |
3/9 |
5/9 |
Hexadecane |
8/3 |
4 |
4 |
Octadecane |
7/1 |
4/1 |
3/1 |
3-methyl-Heptane |
7/0 |
9/0 |
2/1 |
در این میان، دودکان، دکان، اکتان، تترادکان، هگزادکان، اکتادکان و 3-متیل هپتان بیشترین سهم را به خود اختصاص دادند. بیشترین درصد ترکیبات هیدروکربنی در عصاره روغنی این گیاه در شرایط ظرفیت زراعی مربوط به دودکان مشاهده شد ولی در شرایط 70 درصد و 40 درصد ظرفیت زراعی، بیشترین مقدار هیدروکربن به ترتیب متعلق به دکان و اکتان بود، در حالیکه کمترین درصد ترکیبات هیدروکربنی در همه تیمارها به 3-متیل هپتان تعلق داشت. در مجموع، نتایج نشان داد که درصد هیدروکربنها در عصاره روغنی گیاه با افزایش شدت تنش آبی، افزایش یافت.
در این مطالعه، بیشترین سطح پیک در مجموع هیدروکربن ها (27/379) در تیمار 40 درصد ظرفیت زراعی و کمترین آن (90/180) در تیمار ظرفیت زراعی مشاهده شد (شکل 2).
شکل 2- میزان هیدروکربنهای گیاه دارویی خارمریم در سطوح مختلف آبیاری
آنالیز بیوانفورماتیکی اسیدهای چرب و هیدروکربنهای شناسایی شده: در زیستفناوری همواره به بررسی مسیرهای تولید ترکیبات طبیعی توجه میشود. یکی از روشهایی که امروزه بیش از هر موضوع دیگری در زمینه بررسی ترکیبات فیتوشیمیایی گیاهی مورد توجه قرار دارد، آنالیز بیوانفورماتیکی ترکیبات میباشد. لذا در این مطالعه با توجه به اهمیت ترکیبات شناسایی شده در این گیاه، به شناسایی واکنشهای تولید کننده این ترکیبات، مسیرهای واکنش و همچنین آنزیمهای دخیل در این واکنشها پرداخته شد. بررسی نتایج نشان داد که لینولئیک اسید غالبا در مسیر متابولیسم لینولئیک اسید و مسیرهای متابولیک فعال است، ولی سیس 13-اکتادکنوئیک اسید در مسیر بیوسنتز اسیدهای چرب و بیوسنتز کوتین، سوبرین و واکس نقش دارد. پالمیتیک اسید نیز در مسیر متابولیسم اسیدهای چرب، مسیرهای متابولیک و متابولیسم رتینول فعالیت دارد، در حالی که استئاریک اسید فقط در مسیر بیوسنتز اسیدهای چرب نقش دارد. مهمترین آنزیمهای فعال در مسیر تولید اسیدهای چرب شامل لینولئات لیپوکسیژناز، میکروزومال مونواکسیژناز، پالمیتویل کوآ- هیدرولاز، آسیل ACP هیدرولاز، امگا-مونوکسیژناز اسیدهای چرب با زنجیره طولانی، پالمیتویل پروتئین هیدرولاز، آدنیلاز/ ترانسفراز اسیدهای چرب با زنجیره طولانی میباشند. بعلاوه، تمامی هیدروکربنهای شناسایی شده در این آزمایش در مسیر بیوسنتز آلکان فعالیت دارند و مهمترین آنزیم فعال در این مسیر آلدهید دکربونیلاز میباشد (جدول 6). لذا با توجه به اطلاعات بدست آمده در این آزمایش و همچنین اهمیت اسیدهای چرب در صنایع غذایی و دارویی، میتوان با استفاده از تکنیک مهندسی ژنتیک و افزایش بیان آنزیمهای دخیل در این واکنشها، بیان ژنهای سنتز کننده این ترکیبات را افزایش داد. همچنین میتوان این واکنشها را در آزمایشگاه بازسازی کرد و ترکیبات را به صورت گسترده تولید نمود.
جدول 6- واکنشها، مسیر واکنش و آنزیمهای درگیر در تولید اسیدهای چرب و هیدروکربنها
ترکیبات |
واکنش |
مسیر واکنش |
آنزیم های دخیل |
لینولئیک اسید |
Linoleate + Oxygen <=> (9Z,11E)-(13S)-13-Hydroperoxyoctadeca-9,11-dienoic acid |
متابولیسم لینولئیک اسید مسیرهای متابولیک |
لینولئات S13 لیپوکسیژناز آراشیدونات 15 لیپوکسیژناز |
Linoleate <=> Rumenic acid |
متابولیسم لینولئیک اسید |
لینولئات ایزومراز |
|
Linoleate + Oxygen <=> (9Z,12Z)-(11S)-11-Hydroperoxyoctadeca-9,12-dienoic acid |
متابولیسم لینولئیک اسید |
لینولئات 11 لیپوکسیژناز |
|
Linoleate + 2 Ferrocytochrome b5 + Oxygen + 2 H+ <=> Crepenynate + 2 Ferricytochrome b5 + 2 H2O |
متابولیسم لینولئیک اسید |
آسیل-لیپید دلتا12-اسستیلناز |
|
Linoleate + Oxygen + NADPH + H+ <=> 9(10)-EpOME + NADP+ + H2O |
متابولیسم لینولئیک اسید مسیرهای متابولیک |
میکروزومال مونواکسیژناز |
|
Linoleate + Oxygen + NADPH + H+ <=> 12(13)-EpOME + NADP+ + H2O |
متابولیسم لینولئیک اسید مسیرهای متابولیک |
میکروزومال مونواکسیژناز |
|
Linoleate + Oxygen <=> 9(S)-HPODE |
متابولیسم لینولئیک اسید |
لینولئات S9 لیپوکسیژناز |
|
Linoleate + Oxygen <=> 8(R)-HPODE |
متابولیسم لینولئیک اسید |
لینولئات R8 لیپوکسیژناز |
|
Linoleate + Reduced acceptor + Oxygen <=> (6Z,9Z,12Z)-Octadecatrienoic acid + Acceptor + 2 H2O |
متابولیسم لینولئیک اسید مسیرهای متابولیک |
آسیل کوآ 6- دستوراز |
|
Phosphatidylcholine + H2O <=> 1-Acyl-sn-glycero-3-phosphocholine + Linoleate |
متابولیسم لینولئیک اسید مسیرهای متابولیک |
فسفولیپاز A2 |
|
Linoleoyl-CoA + H2O <=> CoA + Linoleate |
بیوسنتز اسیدهای چرب غیراشباع |
پالمیتویل کوآ- هیدرولاز |
|
Linoleate + Oxygen <=> (8E,10R,12Z)-10-Hydroperoxy-8,12-octadecadienoate |
متابولیسم لینولئیک اسید |
لینولئات R10 لیپوکسیژناز |
|
Linoleate + Oxygen <=> (8E,10S,12Z)-10-Hydroperoxyoctadeca-8,12-dienoate |
- |
اولئات S10 لیپوکسیژناز |
|
سیس 13-اکتادکنوئیک اسید |
(R)-10-Hydroxystearate <=> (9Z)-Octadecenoic acid + H2O |
- |
اولئات هیدراتاز |
Oleoyl-[acyl-carrier protein] + H2O <=> Acyl-carrier protein + (9Z)-Octadecenoic acid |
بیوسنتز اسیدهای چرب |
آسیل ACP هیدرولاز |
|
Oleoyl-CoA + H2O <=> CoA + (9Z)-Octadecenoic acid |
بیوسنتز اسیدهای چرب غیراشباع |
پالمیتویل کوآ هیدرولاز |
|
(9Z)-Octadecenoic acid + [Reduced NADPH---hemoprotein reductase] + Oxygen <=> 18-Hydroxyoleate + [Oxidized NADPH---hemoprotein reductase] + H2O |
بیوسنتز کوتین، سوبرین و واکس |
امگا-مونوکسیژناز اسیدهای چرب با زنجیره طولانی |
|
(9Z)-Octadecenoic acid + Lipid hydroperoxide <=> cis-9,10-Epoxystearic acid + Alcohol |
بیوسنتز کوتین، سوبرین و واکس |
پروکسیژناز بذر گیاه |
|
Oleamide + H2O <=> (9Z)-Octadecenoic acid + Ammonia |
- |
آمیدهیدرولاز اسیدچرب |
|
(9Z)-Octadecenoic acid + Oxygen <=> (8E,10S)-10-Hydroperoxyoctadeca-8-enoate |
- |
اولئات S10 لیپوکسیژناز |
|
پالمیتیک اسید |
Palmitoyl-CoA + H2O <=> CoA + Hexadecanoic acid |
طویل شدن اسیدهای چرب بیوسنتز اسیدهای چرب غیراشباع مسیرهای متابولیک متابولیسم اسیدچرب |
پالمیتویل کوآ هیدرولاز پالمیتویل پروتئین هیدرولاز
|
ATP + Hexadecanoic acid + CoA <=> AMP + Palmitoyl-CoA + Diphosphate |
بیوسنتز اسیدهای چرب تخریب اسیدهای چرب مسیرهای متابولیک متابولیسم اسیدهای چرب |
آسیل کوآ سینتتاز |
|
Hexadecanoic acid + 2 Hydrogen peroxide <=> Pentadecanal + CO2 + 3 H2O |
- |
پروکسیداز اسیدچرب |
|
Hexadecanal + NAD+ + H2O <=> Hexadecanoic acid + NADH + H+ |
تخریب اسیدچرب |
آلدهید دهیدروژناز زنجیره های طولانی |
|
Hexadecanoic acid + Protein <=> Palmitoyl-protein + H2O |
- |
پالمیتویل پروتئین هیدرولاز |
|
Hexadecanoyl-[acp] + H2O <=> Acyl-carrier protein + Hexadecanoic acid |
بیوسنتز اسیدچرب مسیرهای متابولیک متابولیسم اسیدچرب |
سیستم سینتاز اسیدچرب آسیل ACP هیدرولاز |
|
Retinyl palmitate + H2O <=> Retinol + Hexadecanoic acid |
متابولیسم رتینول |
- |
|
11-cis-Retinyl palmitate + H2O <=> 11-cis-Retinol + Hexadecanoic acid |
متابولیسم رتینول |
11- سیس رتینیل پالمیتات هیدرولاز |
|
S-Palmitoylprotein + H2O <=> Hexadecanoic acid + [Protein]-L-cysteine |
- |
پالمیتویل پروتئین هیدرولاز |
|
Hexadecanoic acid + [Reduced NADPH---hemoprotein reductase] + Oxygen <=> 16-Hydroxypalmitate + [Oxidized NADPH---hemoprotein reductase] + H2O |
بیوسنتز کوتین، سوبرین و واکس مسیرهای متابولیک |
امگا-مونوکسیژناز اسیدهای چرب با زنجیره طولانی |
|
ATP + Hexadecanoic acid <=> Diphosphate + (Palmitoyl)adenylate |
- |
آدنیلاز/ ترانسفراز اسیدهای چرب با زنجیره طولانی |
|
ATP + Hexadecanoic acid + Holo-[(hydroxy)phthioceranic acid synthase] <=> AMP + Diphosphate + Palmitoyl-[(hydroxy)phthioceranic acid synthase] |
- |
آدنیلاز/ ترانسفراز اسیدهای چرب با زنجیره طولانی |
|
استئاریک اسید |
Octadecanoyl-[acyl-carrier protein] + H2O <=> Acyl-carrier protein + Octadecanoic acid |
بیوسنتز اسید چرب |
آسیل ACP هیدرولاز |
Stearoyl-CoA + H2O <=> CoA + Octadecanoic acid |
بیوسنتز اسیدهای چرب غیراشباع |
پالمیتویل کوآ هیدرولاز
|
|
ATP + Octadecanoic acid <=> Diphosphate + (Stearoyl)adenylate |
- |
آدنیلاز/ ترانسفراز اسیدهای چرب با زنجیره طولانی |
|
ATP + Octadecanoic acid + Holo-[(hydroxy)phthioceranic acid synthase] <=> AMP + Diphosphate + Stearoyl-[(hydroxy)phthioceranic acid synthase] |
- |
آدنیلاز/ ترانسفراز اسیدهای چرب با زنجیره طولانی |
|
دودکان، دکان اکتان، تترادکان 3- متیل هپتان
|
a long-chain fatty aldehyde + 2 NADPH + oxygen + H+ → an alkane + formate + 2 NADP+ + H2O |
بیوسنتز آلکان |
آلدهید دکربونیلاز |
بیوسنتز آلکان |
آلدهید دکربونیلاز |
||
هگزادکان اکتادکان
|
a long-chain fatty acid + hν + H+ → a long-chain alkane + CO2 |
- |
فتودکربوکسیلاز اسید چرب |
a long-chain fatty aldehyde + 2 NADPH + oxygen + H+ → an alkane + formate + 2 NADP+ + H2O |
بیوسنتز آلکان |
آلدهید دکربونیلاز |
|
بیوسنتز آلکان |
آلدهید دکربونیلاز |
بحث و نتیجه گیری
گیاهان به طور مداوم در معرض تنشهای محیطی نامطلوب از جمله زخمی شدن، حمله عوامل بیماریزا، خشکی، سرما، شوری، نور بیش از حد و محدودیت غذایی قرار دارند. برای زنده ماندن در این شرایط، گیاهان باید تنشهای محیطی را بشناسند و به سرعت واکنشهای دفاعی متعددی را انجام دهند. همچنین، آنها مجبورند آسیب سلولی ناشی از تنش را کاهش دهند. چربیها ترکیبات اصلی و حیاتی سلولی هستند، زیرا پایه ساختار غشای سلولی و انرژی ذخیرهای برای متابولیسم را فراهم میسازند. آنها همچنین میتوانند شرایط خارج سلولی را حس کنند. پیامرسانی بواسطه چربیها در پاسخ به تنشهای محیطی رخ میدهد. پیشنهاد شده است که لیزوفسفولیپید، اسید چرب، اسید فسفاتیدیک، دی اسیل گلیسرول، اینوزیتول فسفات، اکسی لیپین ها، اسفینگولیپید و N اسیلتانولامین به عنوان چربیهای پیامرسان عمل میکنند (33، 35، 45، 47، 59 و 60).
مطالعات روی این گونههای چربی ناشی از تنش نشان داده است که هر دسته از چربیها دارای ارتباط بیولوژیکی خاص، مکانیسمهای بیوسنتزی و آبشارهای پیامرسان هستند که واکنش دفاعی را در سطح رونویسی فعال میکنند (47، 59 و 60). علاوه بر نقش آنها در پیامرسانی، چربیها همچنین به عنوان کاهشدهنده شدت تنش عمل میکنند (20، 21، 46، 48 و 50). برای کاهش تنشهای خاص، چربیهای منحصربفرد که در مقادیر کم تحت شرایط رشد طبیعی تجمع مییابند اغلب سنتز آنها تحت شرایط تنش افزایش مییابد.
همچنین نشان داده شده است که اسیدهای چرب در پاسخ به تنش نقش دارند (31). اسیدهای چرب آزاد بطور معمول در دوران پیری در سلولهای حساس به خشکی تجمع یافته و علت کاهش یکنواختی غشا هستند (58).
با توجه به نتایج ارائه شده در شکل 1، مجموع اسیدهای چرب موجود در عصاره روغنی با افزایش شدت تنش آبی در گیاه دارویی خارمریم افزایش ولی درصد این اسیدهای چرب کاهش پیدا کرد (جدول2) که احتمالا به دلیل نقش آنها در تخفیف تنش میباشد. ماهیت اسیدهای چرب که غشاهای لیپیدی گیاهان را تشکیل میدهند بستگی به دما و در دسترس بودن آب دارد (36). از طرف دیگر، این عوامل نقش بسیار مهمی در حفظ پیکربندی عملکردی اسید چرب دارند (27). کمبود آب می تواند لیپید های غشای پلاسمایی را تغییر دهد (34 و 13). به همان اندازه اندامکهای مختلف سیتوپلاسمی بر عملکرد آنها و همچنین متابولیسم مناسب سلولی تأثیر میگذارد. افزایش درجه اسیدهای چرب اشباع شده و کاهش اسیدهای چرب اشباع نشده باعث ایجاد تغییرات در ساختار غشایی میشود، به طوری که غشاهای سلولی که دارای سطح اشباع نشده هستند در اثر تنشهای محیطی مانند تنش آبی تغییر میکنند (14). اسید چربهای استئاریک و پالمیتیک جزو اسیدهای چرب اشباع شده میباشند اما لینولئیک اسید و سیس-13-اکتادکانوئیک اسید جزو اسیدهای چرب اشباع نشده می باشند. اسیدهای چرب اشباع شده در شرایط تنش پایداری بیشتری نسبت به اسیدهای چرب اشباع نشده دارند، لذا در شرایط تنش از اهمیت بالاتری برخوردار هستند. در این مطالعه لینولئیک اسید در شرایط تنش کاهش پیدا کرده است اما سه اسید چرب دیگر افزایش پیدا کرده اند (شکل1). نتایج حاصل از این تحقیق با نتایج ملک زاده و همکاران (43) مطابقت دارد.
هیدروکربن های حاصل از اسیدهای چرب (مانند آلکانها و آلکنها) در بافتهای بیرونی گیاهان و حشرات فراوان بوده و اغلب نشاندهنده بخش عمده مومهای کوتیکولی هستند (26 و 39). تقریبا تمام قسمتهای هوایی گیاهان با یک لایه هیدروکربنی که به طور عمده از موم و کوتین تشکیل شده است، پوشیده شده و به کاهش تنش ناشی از کمبود آب از طریق محدود کردن تعرق کمک میکند. موم و کوتین نقش مهمی در تحمل به خشکی گیاهان دارند (54)، و تنش خشکی، شوری و تیمار ABA اغلب منجر به افزایش این لایههای هیدروکربنی در گیاهان متحمل میشود (11، 38، 56 و 61). همانطور که در شکل 2 نشان داده شده است مجموع هیدروکربن های موجود در عصاره روغنی در شرایط تنش آبی در گیاه دارویی خارمریم افزایش پیدا کرده است. بنابراین با توجه به نتایج بدست آمده در این آزمایش، تنش آبی منجر به افزایش عملکرد اسیدهای چرب و هیدروکربن ها در گیاه دارویی خارمریم می شود که به دلیل پاسخ و مقابله با تنش می باشد.
امروزه هیدروکربنهای گیاهی بویژه هیدروکربنهای دارای تعداد کربن زوج به عنوان جایگزین برای تولید انرژی توسط محققین مورد توجه قرار گرفتهاند (32). هیدروکربن ها همچنین به عنوان پوشش محافظ برای حفظ رطوبت گیاه، عوامل کاهش دهنده نفوذپذیری آب، مولکول پیام رسان در حشرات (28) و بازدارنده اتلاف آب در گرده و تضمین زنده مانی آن، در نهایت بر فعل و انفعالات پاتوژن در گیاه تاثیر می گذارد (38 و 10). با توجه به نتایج بدست آمده در این تحقیق، می توان از اسیدهای چرب این گیاه در اهداف تغذیه ای و دارویی و از هیدروکربن ها نیز جهت تولید انرژی و پوشش محافظ به منظور اهداف مختلف استفاده کرد.