Document Type : Research Paper
Authors
1 Department of Plant Production and Genetics, Faculty of Agriculture, University of Zanjan, Zanjan, Iran
2 Department of Pharmaceutical Biotechnology, Faculty of Pharmacy, Zanjan University of Medical Sciences, Zanjan, Iran
3 Zanjan Pharmaceutical Nanotechnology Research Center, Zanjan University of Medical Sciences, Zanjan, Iran
Abstract
The seed germination of Plantago major requires pre-treatment in the off-season. Thus, the effect of gibberellic acid, potassium nitrate, cold, daylight and different Murashige and Skoog medium (MS) salt concentrations on the germination of seeds were studied. The modified Timson index was applied to calculate the germination rate.
Effect of different concentrations of 6-Benzyl amino purine (BAP) or Thidiazuron (TDZ) in combination with α-Naphtalen acetic acid (NAA), indole-3-acetic acid (IAA) or indole-3-butyric acid (IBA) was studied for callus induction and regeneration of various explants.
The results showed that cold, daylight and full salt MS medium are more suitable for high germination of P. major. The highest percentage of callus formation (100%) was observed in the most of the explants. The highest regeneration frequency (100%) was observed in leaf explant in MS medium containing 1:0.5; 1.5:1; 1.5:2 and 2: 1 mg.L-1 TDZ: IBA, as well as, 2:0.5 mg.L-1 BAP: NAA in stem explant and in root explant at concentration of 1.5 mg.L-1 BAP, 1.5:0.2; 2:0.2 and 3:0.2 mg.L-1 TDZ: NAA and 2:1; 2:2; 3:1; 3:2 mg.L-1 TDZ: IBA. 41.67 shoot number obtained with 1: 2 mg.L-1 TDZ: IBA in leaf explants, as well as, 27 shoot number in 1.5: 1 mg.L-1 TDZ: IBA and 20 shoot number in 2:0.2 mg.L-1 TDZ: NAA were obtained in shoot and root explants, respectively. For root induction, regenerated shoots were transferred into MS medium supplementation with 0.5 mg.L-1 IBA. The survival rate of plantlets was 80% and they were acclimatized in the greenhouse.
Keywords
Main Subjects
بهبود جوانهزنی بذر، اندامزایی و باززایی گیاه داروئی بارهنگ کبیرPlantago major در شرایط درون شیشهای
سمانه راه آموز حقیقی1، خدیجه باقری1*، علی شرفی2 ، حسین دانافر3
1 ایران، زنجان، دانشگاه زنجان، دانشکده کشاورزی، گروه تولید و ژنتیک گیاهی
2 ایران، زنجان، دانشگاه علوم پزشکی، دانشکده داروسازی، گروه زیست فناوری داروئی
3 ایران، زنجان، دانشگاه علوم پزشکی، دانشکده داروسازی، گروه شیمی دارویی
تاریخ دریافت: 05/08/1399 تاریخ پذیرش: 25/10/1399
چکیده
جوانهزنی بذر بارهنگ کبیر(Plantago major) در شرایط خارج از فصل نیاز به پیش تیمارهای خاص دارد. تأثیر پیش تیمارهای اسیدجیبرلیک، پتاسیم نیترات، سرما، نور و غلظت نمک محیط Murashige and Skoog medium (MS) بر جوانهزنی بذر این گیاه بررسی شدند. از شاخص تیمسون (Timson Index) برای تعیین نرخ جوانهزنی استفاده گردید. تأثیر غلظتهای مختلف سیتوکینینهای 6-آمینو پورین (BAP) و تیدیازورون (TDZ) در ترکیب با اکسینهای آلفا-نفتالین اسید استیک (NAA)، 3-ایندول-3- استیک اسید (IAA) و اسید ایندول 3- بوتیریک (IBA) برای القاء کالوس و باززایی ریزنمونههای برگ، ساقه و ریشه مطالعه شد. یافتهها نشان داد که پیش تیمار سرما، نور روز و محیطMS کامل برای جوانهزنی بذور بارهنگ کبیر مناسبتر هستند. بیشترین درصد کالوسزایی (100 درصد) در اکثر ریز نمونهها پدیدار گردید. بالاترین فراوانی باززایی(100 درصد) در ریزنمونه برگ در محیط MS حاوی 5/0: 1؛ 1: 5/1؛ 2: 5/1 و 1: 2 میلیگرم بر لیتر TDZ: IBA، در ریزنمونه ساقه 5/0: 2 میلیگرم بر لیتر BAP: NAA و در ریزنمونه ریشه در غلظت 5/1 میلیگرم بر لیتر BAP ،2/0: 5/1 ؛2/0: 2 و 2/0 : 3 میلیگرم برلیتر TDZ: NAA و2:1؛ 2:2؛ 1: 3؛ 2: 3 TDZ: IBA مشاهده گردید. 67/41، 27 و20 تعداد شاخه به ترتیب در محیط حاوی 1:2 و 1:5/1 میلیگرم برلیتر TDZ:IBA و 2/2:0 میلیگرم برلیتر TDZ:NAA در ریزنمونههای برگ، ساقه و ریشه بدست آمد. گیاهچههای باززایی شده به محیط ریشهزایی حاوی غلظت 5/0 میلیگرم بر لیتر IBA منتقل و با نرخ بقای 80 درصد در گلخانه سازگاری یافتند.
واژه های کلیدی: اندامزایی شاخه، بارهنگ کبیر، باززایی درون شیشهای، جوانهزنی، کالوسزایی
* نویسنده مسئول، تلفن: خدیجه باقری تلفن : 982433054523+ ، پست الکترونیکی: bagheri.khadijeh@znu.ac.ir
مقدمه
Plantago بزرگترین جنس از خانواده Plantaginaceae است که حدود 483 گونه از این جنس در مقالات گزارش شده است (39، 43). بارهنگ کبیر (Plantago major) یکی از قدیمیترین گیاهان دارویی است که در طب سنتی بسیار مورد استفاده قرارگرفته و یکی از گستردهترین گونههای گزارش شده در مقالات میباشد (شکل1). این گیاه در سراسر جهان و در چمنزارهای معتدل اروپا، آسیا، جنوب استرالیا و همچنین شمال آفریقا و آمریکا توزیع شده است (12و 40). ترکیبات فعال بیولوژیکی مختلفی در گونههای بارهنگ وجود دارد از جمله آنها میتوان به آلکالوئیدها، مشتقات اسید کافئیک، کومارینها، چربیها، فلاونوئیدها، ایریدوئیدها، موسیلاژها، پلی ساکاریدها، استرولها و مواد فرار اشاره کرد (10). ترکیبات فیتوشیمیایی موجود در برگ، ریشه و بذرهای بارهنگ باعث خواص درمانی قابل توجهی دراین گیاه شده که شامل خواص ضد ویروس، ضد میکروب، ضد التهاب، ضد درد، ضد هیستامین، ضد روماتیسم، ضد سرطان، ضد زخم و کاهش فشار خون میشود (3و 18). همچنین از قسمتهای هوایی گونههای بارهنگ معمولاً در درمان تعدادی از بیماریهای مرتبط با پوست، دستگاه تنفس، گوارش، تولیدمثل و همچنین در برابر عفونتها استفاده میگردد (35).
شکل1- گیاه خودرو بارهنگ کبیر (Plantago major)
باتوجه به پیشینه بسیار طولانی در استفاده از بارهنگ کبیر به عنوان گیاه دارویی و همچنین به دلیل اهمیت ترکیبات فیتوشیمیایی و فعالیتهای بیولوژیکی موجود در آن، لازم است که مطالعات بیشتری بر روی این گیاه دارویی انجام گیرد. تکنیک کشت بافت به عنوان ابزاری مهم شناخته شده است که منجر به توسعه ژنوتیپهای جدید گیاهی میشود (19) همچنین متخصصان ژنتیک و پرورش دهندگان گیاهان، از این تکنیک به عنوان منبع تنوع استفاده میکنند (14). کشت بافت این گیاه میتواند به تکثیر آن در شرایط درون شیشهای کمک قابل توجهی بکند، زیرا اکثر بذرهای خریداری شده از کلکسیونها، هرباریومهای خصوصی و بانک ژن دارای قوه نامیه پایین و درصد جوانه زنی اندکی هستند و اغلب تحقیقات خارج از فصل رشد گیاه صورت میگیرد. همچنین بررسی ویژگیهای جوانه زنی در آزمایشگاه میتواند تعیین کننده میزان موفقیت تولید باشد (15). کالوسزایی متفاوت در ریزنمونههای گیاهی میتواند به دلیل فعالیتهای متابولیکی متفاوت و میزان هورمونهای درونزا باشد و ممکن است تیمار با اکسین به عنوان یک وضعیت تنشزا توسط بافت گیاه تلقی گردد و روند تقسیمات سلولی را به سوی جنینزایی تغییر دهد (23). اکثر باززاییها از ریزنمونههای گیاهی به صورت غیرمستقیم واز طریق القاء کالوس اتفاق می افتد که این روش گاهی باعث ایجاد تنوع سوماکلونی میشود. به همین منظور از روش باززایی مستقیم برای تکثیر استفاده میگردد که دارای مزیتهای بیشماری است. از آن جمله میتوان به سهولت تهیه ریزنمونه، قابلیت باززایی بالا و کاهش زمان اشاره کرد (16). اخیراً این گیاه مورد توجه محققان زیادی بوده است (42).
القاء کالوس از ریزنمونههای محور زیر لپه گونههای Plantago و باززایی از کالوس حاصل از کشتهای ریشه در محیط MS (30) همراه با 3-ایندول-3- استیک اسید IAA)) قبلاً گزارش شده است (41). تشکیل کالوس و باززایی از ریزنمونههای محور زیر لپه P.ovata نیز بررسی شده است. تولید شاخههای جانبی در محیط MS حاوی غلظتهای مختلفIAA ، اسید ایندول 3- بوتیریک (IBA) ، الفا-نفتالین اسید استیک (NAA) ، 2، 4 دی کلرو فنوکسی استیک اسید(2,4-D) ، 6-بنزیل آمینو پورین BAP و کینیتین(Kin) نیز بررسی شده است. در غلظت 5/0 میلیگرم بر لیتر IBAرشد کالوس همراه با تشکیل ریشه مشاهده شد. 2,4-D کالوسزایی را با سرعت یکنواخت با غلظت از 5/1 میلیگرم بر لیتر تا 5/2 میلیگرم بر لیتر القاء کرد (22). ریزازدیادی نوک ساقه P.asiatica در محیط MS با 1/0میلیگرم برلیترIAA و 1 میلیگرم برلیتر BAPانجام گردید (25). بالاترین مقدار باززایی شاخه از ریزنمونههای لپه و محور زیر لپه P.afra در محیط MS، حاوی 2/0 میلیگرم برلیتر تیدیازورون (TDZ) و 2/0 میلیگرم برلیتر IBA مشاهده شد. شاخههای موجود بهترین ریشهدهی را در محیط MS حاوی 6/0 میلیگرم برلیتر NAA داشتند (36). در مطالعهای دیگر، کشت درون شیشهای گیاه P.major با استفاده از محیط MS همراه با 2/0 میلیگرم برلیتر IAA و0/1 میلیگرم برلیتر TDZ گزارش شده است (21). در مطالعه اسماعیلی و همکارانش در2014، القاء کالوس در ریزنمونههای برگ و ریشه گونه P.major با استفاده از غلظتهای مختلف 2,4-D/Kin بهینه گردید. مقایسه الگوهای باندینگ مشتق شده از 6 آغازگر ISSR نشان داد که کالوسها تنوع سوموکلونال آشکاری را نشان میدهند که میتواند در نهایت برای سیستمهای انتخاب آزمایشگاهی مورد بهره برداری قرارگیرند (9).
بنابراین این گونه نیازمند پروتوکل جامع و مناسبی برای بهبود جوانهزنی بذر و سپس تکثیر گیاه از طریق القاء کالوس، اندام زایی و باززایی در شرایط درون شیشهای است، لذا انجام تحقیقات مکرر و بصورت جامع برای دستیابی به روشی کارامد برای کشت بافت گیاه ضروری بنظر میرسد که بتوان از گیاهانی انبوه و عاری از هرگونه بیماری در روند تحقیقات دارویی از جمله تولید متابولیتهای ثانویه با ارزش و از لحاظ تجاری نیز سوداور استفاده کرد که این موضوع برای کشورهایی همچون ایران که دارای گیاهان دارویی متنوعی هستند، بسیار باارزش میباشد. بارهنگ کبیر نیز حاوی متابولیتهای ثانویه مهم از جمله ایریدوئیدهای اکوبین و کاتالپل است که دارای خواص متعددی از جمله ضدالتهاب، ضد سرطان و ضد میکروب هستند، بنابراین کشتهای درون شیشهای میتواند برای تولید این ترکیبات مهم باشد.
بنابراین، هدف از این مطالعه افزایش جوانه زنی بذر و معرفی یک پروتکل ساده، و جامع برای تکثیر این گیاه دارویی با ارزش از طریق القاء کالوس، اندام زایی و باززایی در شرایط بهینه است.
مواد و روشها
تهیه مواد گیاهی و ضدعفونی کردن بذرها: در ابتدا بذر گیاه بارهنگ کبیر از بانک ژن موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع استان تهران در آبان ماه سال 1396 خریداری شد. در ابتدا بذرها سه دفعه با آب مقطر استریل شستشو شدند و در اتانول 70 درصد به مدت 30 ثانیه غوطهور گشتند، سپس بذور با هیپوکلریت سدیم 5 درصد همراه با یک قطره توئین-20 به مدت 10 دقیقه و مجددا با آب مقطر استریل سه دفعه شستشو شدند.
آزمایشات جوانه زنی: در آزمایش اول 10 عدد بذر استریل روی کاغذ صافی و درون پتری دیش 10 سانتیمتری قرارگرفتند و 10 میلیلیتر از محلولهای آزمایش 1/0 میلیمولار جیبرلین (GA3) و 1 میلیمولار نیترات پتاسیم (KNO3) به مدت 24 ساعت به پتری دیشها اضافه گردید. بذرهای تیمار شده در محیط MS با 8 گرم در لیتر آگار کشت شدند. pH محیط برابر با 8/5 قبل از اضافه کردن آگار تنظیم گردید و سپس بوسیله اتوکلاو و در شرایط 121 درجه سانتیگراد بمدت 20 دقیقه استریل گردیدند. کشتها در اتاقک رشد با تناوب نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در دمای 2±22 درجه سانتیگراد و رطوبت نسبی 5±70 نگهداری شدند. تیمار با آب مقطر استریل به عنوان تیمار شاهد در نظر گرفته شد. شرایط تیمار شاهد همانند سایر تیمارها بود. برای بررسی تأثیر سرما بر جوانهزنی، بذرهای ضدعفونی شده در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت در تاریکی قرار گرفتند و سپس در محیط MS کشت شدند (37). در آزمایش دوم به منظور بررسی تأثیر نور روز بر جوانهزنی، بذرها مجددا سرمادهی شده و در محیط MSجامد کشت شدند و در شرایط روشنایی روز (16 ساعت روشنایی) و شرایط تاریکی کامل تقسیم گردیدند (10). در آزمایش سوم، بذور سرمادهی شده در محیط MS با غلظتهای مختلف نمک (کامل، ، و ) قرارگرفتند و تیمار با آب مقطر استریل به همراه آگار به عنوان تیمار شاهد در نظر گرفته شد. نمونهها به مدت 4 هفته در معرض نور روز (16 ساعت) قرارگرفتند. نرخ جوانهزنی از هفته اول تا هفته چهارم ثبت گردید. برای محاسبه نرخ جوانهزنی از شاخص تیمسون (Timson Index) اصلاح شده استفاده گردید.
Timson germination index (TGI) = ΣG/T
(G) درصد جوانهزنی بذر در فواصل 2 روزه در یک دوره 28 روزه و(T) دوره جوانهزنی کل است (8).
کشت بافت: براساس نتایج بهینه شده آزمایش جوانهزنی، بذرهای سرما دیده در محیط کاملMS کشت شدند و به مدت 4 تا 8 هفته در 16 ساعت روشنایی قرارگرفتند. ریزنمونههای برگی، ساقه و ریشه به اندازه یک سانتیمتر از گیاهچهها بریده شده و در محیط MS حاوی ترکیب سیتوکینینهای BAP یا TDZ و اکسینهای NAA، IAA یا IBA در غلظتهای مختلف کشت گردیدند. غلظت هر دو سیتوکینین 5/0، 1، 5/1، 2 و 3 میلیگرم برلیتر و برای اکسینها صفر، 2/0، 5/0، 1 میلیگرم برلیتر (NAA)، 1/0، 5/0، 1، 5/1 میلیگرم برلیتر (IAA) و 5/0، 1، 5/1، 2 میلیگرم برلیتر (IBA) بودند. برای جلوگیری از قهوهای شدن، القاء کالوس و شاخهزایی، هر دو هفته یکبار نمونهها به محیط تازه MS منتقل شدند. ریزنمونهها با باززایی مستقیم به محیط MS بدون هورمون و کالوسها به محیط کشت MS همراه با 5/0 میلیگرم برلیتر سیتوکینین مربوطه برای القاء شاخه منتقل شدند. گیاهچههای باززا شده به محیط بدون هورمون و یا محیط ریشهزایی حاوی غلظت 5/0 میلیگرم برلیتر IBA منتقل شدند. سپس گیاهچههای رشدیافته با موفقیت به گلدان حاوی مخلوطی از 80 درصد پیت ماس و 20 درصد پرلیت استریل پس از دو هفته انتقال یافتند و در فواصل منظم، گیاهچهها با محلول هوگلند آبیاری شدند.
تحلیل آماری: آزمایش فاکتوریل با طرح پایه کاملاً تصادفی (CRD) با سه تکرار و 10 ریزنمونه در هر تکرار استفاده شد. درصد کالوسزایی، باززایی و تعداد شاخه در هر ریزنمونه ثبت گردید. داده ها با استفاده از تجزیه واریانس مورد تجزیه و تحلیل قرارگرفتند و میانگینها با استفاده از آزمون توکی با استفاده از نرم افزار SPSS 21 مقایسه شدند و مقایسه میانگینها از نظر آماری 5 درصد معنیدار در نظر گرفته شد.
نتایج
تأثیر عوامل مختلف بر جوانهزنی بذر بارهنگ کبیر: در ابتدا، بذرهای بارهنگ کبیر ضدعفونی شدند و با تیمارهای مختلف GA3، KNO3، سرما و آب مقطر استریل به عنوان شاهد آزمایش شدند. یافتهها نشان داد که در هفته اول، اثر پیش تیمار سرما (18 درصد جوانه زنی)،KNO3 (45/9 درصد) و GA3 (صفر درصد) بود و پس از گذشت 28روز، بترتیب 80، 65 و50 درصد جوانهزنی نسبت به شاهد (35 درصد) مشاهده شد (شکل 2).
شکل2- تأثیر پیشتیمارهای مختلفCold (4 درجه سانتیگراد)، GA3 (1/0میلی مولار)،KNO3 (1 میلی مولار) و آب مقطر استریل (کنترل) بر درصد جوانهزنی بذر گیاه بارهنگ کبیر، نتایج بصورت میانگین سه تکرار ± انحراف معیار ذکر گردید.
باتوجه به تأثیر بهتر سرمادهی بر جوانهزنی بذرها، برای آزمایش دوم، مجددا بذرها سرما دیدند و در معرض روشنایی نور روز (16 ساعت) و تاریکی کامل در محیط MS قرارگرفتند و درصد جوانهزنی به مدت دو هفته ثبت گردید.
شکل3- تأثیر نور و تاریکی بر جوانهزنی بذر گیاه بارهنگ کبیر.(Plantago major) Cold بذرهای سرما دیده و Control: گیاهان شاهد، Light: شرایط طول روز (16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی) وDark : شرایط تاریکی کامل، نتایج بصورت میانگین سه تکرار ± انحراف معیار و بر حسب آزمون توکی در سطح 5 درصد محاسبه گردید. حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت آماری دادهها میباشد
یافتهها به وضوح تأثیر بهتر روشنایی طول روز را بر جوانهزنی و سرعت جوانهزنی نشان میدهند (شکل 3).
به منظور بهینه کردن روشی برای جوانهزدن سریع و خارج از فصل، در آزمایش سوم بذرها ضدعفونی شده و با سرما تیمار شده و در محیط MS با غلظتهای مختلف نمک (1، ، و) کشت شدند. یافتهها نشان داد که محیط با درصد نمک بیشتر، جوانهزنی و رشد سریعتری را نشان میدهد، زیرا در هفته اول 50 درصد جوانهزنی مربوط به محیط MS کامل و MS بود و بعد از سه هفته، محیط MS کامل، جوانه زنی 80 درصد را نشان داد. کشت بذر در آب مقطر استریل و آگار نیز به عنوان شاهد در نظر گرفته شد و در هفته اول 54/11 درصد جوانهزنی داشت که نسبت به محیط کامل MS کمتر بود و بعد از سه هفته جوانهزنی 76/30 درصد را نشان داد که مشابه با محیط MS بود (شکل 4).
شکل4- تأثیر غلظتهای مختلف نمک محیط MSبر جوانهزنی بذر گیاه بارهنگ کبیر.(Plantago major) نتایج بصورت میانگین سه تکرار ± انحراف معیار و برحسب آزمون توکی در سطح 5 درصد محاسبه گردید. حروف متفاوت نشاندهنده تفاوت آماری تیمارها میباشند.
در نهایت شاخص نرخ جوانه زنی بذر بارهنگ کبیر برای پیش تیمارهای مختلف در آزمایش اول اندازهگیری گردید (شکل5). آزمایش اول در این مطالعه نشاندهنده بهترین پیش تیمار بوده است و آزمایشات بعدی، آزمایشات تکمیلی برای برقراری شرایط بهینه میباشند و هدف مطالعات بعدی نشان دادن سرعت جوانهزنی بهتر در شرایط پیش تیمار سرما است از طرفی نیز آزمایشات تکمیلی نیازمند برقراری شرایط نور و تاریکی در بازه زمانی موردنظر هستند، لذا در صورت اندازهگیریهای متناوب درصد جوانهزنی، این شرایط در تیمار تاریکی مختل میشدند، بنابراین شاخص نرخ جوانهزنی برای پیش تیمار سرما اندازهگیری گردید.
شکل5- نرخ جوانه زنی شاخص تیمسون اصلاح شده، نتایج بصورت میانگین سه تکرار ± انحراف معیار و برحسب آزمون توکی در سطح 5 درصد محاسبه گردید، حروف متفاوت نشاندهنده تفاوت آماری تیمارها میباشند.
یافتههای کشت بافت گیاه بارهنگ کبیر در ترکیبات مختلف تنظیم کنندههای رشدی: پس از 2 یا 3 زیرکشت، کالوسها در اکثر ریزنمونهها ظاهر شدند (شکل 6 و7). بیشترین درصد کالوسزایی (100 درصد) در اکثر ترکیبات هورمونی مشاهده شد. با این حال در ریز نمونه برگی با غلظت هورمون TDZ (5/1 میلیگرم برلیتر) در هر چهار سطح NAA مقدار کالوس 100 درصد القاء شد. در ریزنمونه ساقه، القاء کالوس نمایانتر بود به این صورت که در هورمون TDZ (3 میلیگرم برلیتر) در تمام سطوح NAA و (5/1و 3 میلیگرم برلیتر) در سطوح IAA ، کالوسزایی 100 درصد مشاهده شد و در ریزنمونه ریشه، القاء کالوس در اکثر ترکیبات هورمونی رخ داد. چنانچه که در هورمونBAP (5/1 و 2 میلیگرم برلیتر) در سطوح NAA وBAP (2 میلیگرم برلیتر) و همچنین TDZ (3 میلیگرم برلیتر) برای تمام سطوح IAA و (2 و 5/1 میلیگرم برلیتر) در سطوحIBA کالوس تشکیل شد. هورمون TDZ (5/1 و 3 میلیگرم برلیتر) و BAP (5/1 و 2 میلیگرم برلیتر)، NAA (5/0 و 1 میلیگرم برلیتر) ، IAA (1و 5/1میلیگرم برلیتر) و IBA (5/1 میلیگرم برلیتر) در ترکیب با هم کالوسزایی بیشتری را القاء کردهاند.
مشخصات ظاهری کالوسها نشان دهنده سن کالوس و قدرت باززایی آنها در محیط کشت میباشد. کالوسهای زرد رنگ معمولاً نیاز به چند دوره زیرکشت در محیط حاوی سیتوکینین دارند. کالوسهایی که در محیط حاوی اکسین به تنهایی و یا مقدار اکسین بیشتر شکل میگیرند، تمایل بیشتری به تشکیل ریشه نشان دادند. بااین حال کالوسهای سبزرنگ از ریزنمونههای مختلف معمولاً نیازی به زیرکشت نداشتند و پتانسیل تشکیل نوساقه در محیط کشت پایه MS حاوی غلظتهای مختلف سیتوکینین/اکسین خوبی را نشان دادند. در این مطالعه اکثر کالوسهای TDZ/IBA نیازی به زیرکشت نداشتند و کشتهای حاوی اکسین NAA معمولاً کالوسهای بزرگتری را تشکیل دادند (شکل 6). بدینترتیب ریزنمونههای مختلف تحت تأثیر تنظیمکنندههای رشدی متفاوت، میزان متفاوتی از کالوسدهی را نشان دادند.
شکل6- کالوسزایی ریزنمونهها با ترکیبات هورمونی مختلف، (A) کالوس درترکیب هورمونی ;BAP/NAA (B,C) ;BAP/IBA (D) ;BAP/IAA (E) کالوس چهارهفتهایBAP/NAA (F) BAP/IAA
باززایی از کالوسها پس از 2 هفته در هر سه ریزنمونه ظاهر شد و بیشترین درصد باززاییها (باززایی که حروف a را در آزمون مقایسه میانگین دانکن به خود اختصاص دادهاند) در هر ترکیب هورمونی سیتوکینین/ اکسین در جدول های 1، 2و 3 آورده شد. در هر جدول بالاترین باززایی به همراه درصد شکل گیری کالوس مرتبط با آن و نوع باززایی از نوع مستقیم و یا غیرمستقیم و تعداد شاخه از هر ریزنمونه نیز ذکر شده است.
بالاترین فراوانی باززایی در ریزنمونه برگ (100 درصد) در محیط MS حاوی 5/0: 1؛ 1: 5/1؛ 2: 5/1 و 1: 2 میلی گرم برلیتر TDZ: IBA مشاهده گردید. میزان کمی از باززایی (2 درصد) در ترکیب 1: 5/0 میلیگرم برلیتر IAA : BAP مشاهده شد (شکل8).
جدول 1- بیشترین مقادیر باززایی در ریزنمونه برگ در ترکیبات هورمونی مختلف به همراه درصد تشکیل کالوس و تعداد شاخهزایی مرتبط با هر باززایی
تعداد جوانه در هر ریزنمونه (عدد) |
باززایی غیرمستقیم (درصد) |
باززایی مستقیم (درصد) |
باززایی (درصد) |
کالوس زایی (درصد) |
سیتوکینین/اکسین (میلی گرم بر لیتر) |
سیتوکینین |
اکسین |
2/6± 60/7 |
3/6± 33/53 |
8/3± 20/11 |
6/64 ±1/9 |
50± 5/2 |
5:0/1 |
BAP |
none |
3/3± 33/12 |
6/2± 83/45 |
3/33± 67/6 |
52±4/5 |
85±4/3 |
5/1:0 |
BAP |
NAA |
11±2/1 |
3/2± 67/16 |
33/8± 67/46 |
33/63 ±13/3 |
2/8± 67/46 |
1/1:0 |
BAP |
IAA |
2/6± 6/15 50/17 |
60±4/4 58±5/5 |
30±5/5 28±2/1 |
90±2/0 2/2± 86 |
5/3± 70 66± 8/4 |
2:1 5/2:0 |
BAP |
IBA |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
TDZ |
none |
9±3/0 |
100±0/0 |
0/0±0/0 |
50±14/3 |
100±0/0 |
5:1/1 |
TDZ |
NAA |
3/3± 3/5 |
8/2± 14/27 |
50±5/3 |
14/77 ±2/4 |
50±5/1 |
5/1:0 |
TDZ |
IAA |
4/8± 2/17 3/8± 25/14 6/3± 05/22 6/2± 01/18 |
100±0/0 3/3± 33/73 5/2± 70 3/12± 5/67 |
0±0/0 3/6± 66/26 2± 30 5/7± 5/32 |
100±0/0 100±0/0 100±0/0 100±0/0 |
100±0/0 3/3± 33/73 80±4 5/5± 95/30 |
2:1 5:2/1 5:1/ 1 5/1:0 |
TDZ |
IBA |
نتایج بصورت میانگین ± انحراف معیار بیان شدند
جدول 2- بیشترین مقادیر باززایی در ریزنمونه ساقه در ترکیبات هورمونی مختلف به همراه درصد تشکیل کالوسزایی و تعداد شاخهزایی مرتبط با هر باززایی
تعداد جوانه در هر ریزنمونه (عدد) |
باززایی غیرمستقیم (درصد) |
باززایی مستقیم (درصد) |
باززایی (درصد) |
کالوس زایی (درصد) |
سیتوکینین/اکسین (میلی گرم بر لیتر) |
سیتوکینین |
اکسین |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
BAP |
none |
1/5± 25 |
100±0/0 |
0/0±0/0 |
100±0/0 |
100±0/0 |
5/2:0 |
BAP |
NAA |
32±2/2 |
70±10 |
0/0±0/0 |
70±6/4 |
100±0/0 |
5/5:1/1 |
BAP |
IAA |
4/2± 24 5/2± 5/26 6/1± 28 |
54±3/8 5/1±52 55±5/0 |
0/0±0/0 |
54±3/8 5/1±52 55±5/0 |
72±2 1/1± 94 70±3.3 |
2:2 5:1/1 5/5:0/1 |
BA |
IBA |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
TDZ |
none |
1/3 15± |
3/7± 25/81 |
0/0±0/0 |
8/10 ±25/81 |
100±0/0 |
1:1 |
TDZ |
NAA |
5/2± 5/7 |
32±3 |
0/0±0/0 |
32±4/2 |
100±0/0 |
1/3:0 |
TDZ |
IAA |
3/1± 37/27 |
14± 66/86 |
0/0±0/0 |
3/3 ± 66/86 |
95 ±2/5 |
5:1/1 |
TDZ |
IBA |
جدول 3- بیشترین مقادیر باززایی در ریزنمونه ریشه در ترکیبات هورمونی مختلف به همراه درصد تشکیل کالوسزایی و تعداد شاخهزایی مرتبط با هر باززایی
تعداد جوانه در هر ریزنمونه (عدد) |
باززایی غیرمستقیم (درصد) |
باززایی مستقیم (درصد) |
باززایی (درصد) |
کالوس زایی (درصد) |
سیتوکینین/اکسین (میلی گرم بر لیتر) |
سیتوکینین |
اکسین |
14±6/0 |
100±0/0 |
0/0±0/0 |
100±0/0 |
100±0/0 |
5/1 |
BAP |
none |
21±5/7 |
100±0/0 |
0/0±0/0 |
100±0/0 |
100±0/0 |
1:5/1 |
BAP |
NAA |
8±2/4 |
0/0±0/0 |
100±0/0 |
100±0/0 |
0/0±0/0 |
1/5:0/1 |
BAP |
IAA |
6±2/1 |
100±0/0 |
0/0±0/0 |
50±0/15 4/5±50 |
100±0/0 |
5:1/1 1:1 |
BAP |
IBA |
- |
- |
- |
- |
- |
TDZ |
none |
|
12±4/3 20±4 5/0± 5/5 |
100±0/0 |
0/0±0/0 |
100±0/0 |
100±0/0 |
2/0: 2 2/5:0/1 2/3:0 |
TDZ |
NAA |
10±2 |
100±0/0 |
0/0±0/0 |
100±0/0 |
100±0/0 |
5:1/1 |
TDZ |
IAA |
12±3/0 5/2±10 0/9±1 15±2/3 |
100±0/0 |
0/0±0/0 |
100±0/0 |
100±0/0 |
3:2 3:1 2:2 2:1 |
TDZ |
IBA |
نتایج بصورت میانگین ± انحراف معیار بیان شدند
شکل 7- کالوسزایی و باززایی از ریزنمونههای برگ، ساقه و ریشه بارهنگ کبیر.(Plantago major) (A-C) القاء کالوس و باززایی از کالوس در ریزنمونه برگ (غیرمستقیم) در غلظت 5/1:0 میلی گرم بر لیتر BAP:IAA و (D-E) باززایی مستقیم در غلظت 5/1میلی گرم بر لیتر BAP ، (F) باززایی مستقیم در غلظت 1میلیگرم بر لیتر BAP. (G-I) القاء کالوس از ریزنمونه ساقه و باززایی غیرمستقیم از کالوس در نمونه ساقه در غلظت 1/5:0/1 میلیگرم بر لیترTDZ:IBA ، (J-L) باززایی مستقیم از ساقه در غلظت 5:1/1 TDZ:IBA،(M, N) باززایی مستقیم ریشه در غلظت 1/5:0/1 میلیگرم برلیتر BAP:IAA و (O) تشکیل کالوس و باززایی از ریشه در غلظت5:1/1 میلیگرم برلیتر TDZ:IBA
5/0: 2 میلیگرم برلیتر BAP: NAA و 1: 5/0میلیگرم برلیتر TDZ: NAA به ترتیب بیشترین (100 درصد) و کمترین باززایی (33/8 درصد) را در ریزنمونه ساقه نشان دادند (شکل 9). در ریزنمونه ریشه (100 درصد باززایی) در غلظت 5/1 میلیگرم برلیتر BAP، 1: 5/1 BAP: NAA، 1/0: 5/1BAP: IAA ،2/0: 5/1 ؛2/0: 2 و 2/0 : 3 میلیگرم برلیتر TDZ: NAA، 1: 5/1 TDZ: IAA و 2:1؛ 2:2؛ 1: 3؛ 2: 3 TDZ: IBA مشاهده گردید (شکل 10). فراوانی بالای تعداد شاخههای باززا شده 67/ 41 و 22 در محیط حاوی 1:2 و 5:1/1 میلیگرم برلیتر TDZ:IBA در ریزنمونه برگ و به ترتیب 27 و 20 تعداد شاخه در ترکیب 1:5/1 میلیگرم برلیتر TDZ:IBA در ریزنمونه ساقه و 2/2:0 میلی گرم برلیتر TDZ:NAA در ریزنمونه ریشه بدست آمد.
شکل 8- درصد باززایی در ریزنمونه برگی بارهنگ کبیر.(Plantago major) A) تیمارهای مختلف BAP:NAA، B) TDZ:NAA، C) BAP:IAA، D) TDZ:IAA، E) BAP:IBA و F) TDZ:IBA در محیط MS. نتایج (باززایی مستقیم و غیرمستقیم) بصورت میانگین سه تکرار ± انحراف معیار و بر حسب آزمون توکی در سطح 5 درصد ذکر گردید.
بعضی از گیاهچههای باززا شده در محیط بدون هورمون، ریشهدار شدند و نیازی به انتقال به محیط هورمون دار نداشتند با این حال گیاهچههای بدون ریشه به محیط ریشهزایی حاوی غلظت 5/0 میلیگرم برلیتر IBA منتقل شدند (شکل11).
شکل 9- درصد باززایی در ریزنمونه ساقه بارهنگ کبیر.(Plantago major) A) تیمارهای مختلف BAP:NAA، B) TDZ:NAA، C) BAP:IAA، D) TDZ:IAA ، E) BAP:IBA و F) TDZ:IBA در محیط MS. نتایج (باززایی مستقیم و غیرمستقیم) بصورت میانگین سه تکرار ± انحراف معیار و بر حسب آزمون توکی در سطح 5 درصد ذکر گردید.
یک هفته بعد، گیاهچههای ریشهدار شده برای رشد بیشتر به محیط MS بدون هورمون انتقال یافتند و سپس گیاهچههای رشدیافته با موفقیت در گلدان پس از دو هفته قرار گرفتند و با نرخ بقای 80 درصد در گلخانه سازگاری یافتند (شکل12).
شکل 10- درصد باززایی در ریزنمونه ریشه بارهنگ کبیر.(Plantago major) A) تیمارهای مختلف BAP:NAA، B) TDZ:NAA، C) BAP:IAA، D) TDZ:IAA، E) BAP:IBA و F) TDZ:IBA در محیط MS. نتایج (باززایی مستقیم و غیرمستقیم) بصورت میانگین سه تکرار ± انحراف معیار و بر حسب آزمون توکی در سطح 5 درصد ذکر گردید.
بررسی مورفولوژی گیاهچه سازگار شده در شرایط درون شیشهای در مقایسه با گیاهان رشد یافته از بذور تیمار شده و گیاهان وحشی نشان داد که گیاهان بازایی شده جوانههای جانبی بیشتری داشتند. گیاه وحشی دارای برگهای عریضتر و رگبرگهای برجستهتری است.
شکل11- مقایسه ریشهزایی گیاه باززا شده در محیط ریشهزایی، (A) باززایی مستقیم از ریزنمونه برگی، (B) ریزنمونه رشد یافته در محیط MS عاری از تنظیم کننده رشدی (PGRs) و محیط حاوی 5/0 میلیگرم برلیتر IBA، (C) گیاهچه رشدیافته
شکل 12- مرحله سازگاری و انتقال گیاهچههای باززاشده از محیط ریشهزایی به گلدان A: گیاهان باززا شده رشد یافته در شرایط درون شیشهای، B: گیاهچه منتقل شده به گلدان و سازگار شده در شرایط اتاقک رشد (یک هفته) و گلخانه، C: گیاه وحشی رشد یافته از بذر در گلخانه و D: گیاه رشد یافته از بذر و تحت شرایط اپتیمم در شرایط درون شیشهای در اتاقک رشد.
نتایج ما نشان داد که بیشترین و معنیدارترین (تفاوت در سطح 5 درصد) باززایی درترکیب TDZ: IBA برای هر سه ریزنمونه بدست آمد. به طورکلی، ریزنمونه ریشه نسبت به دو ریزنمونه برگ و ساقه باززایی کمتری را نشان میدهد و همچنین بیشترین باززاییها از نوع غیرمستقیم بودند. ریزنمونه برگی بیشتر از دو ریزنمونه دیگر باززایی مستقیم را نشان داده است بطوری که در غلظت سیتوکینین 1 و 5/1 میلیگرم برلیتر BAP باززایی مستقیم قابل توجهی مشاهده گردید (شکلD-F 7). تیمار ریزنمونهها با هورمون سیتوکینینBAP باززایی مستقیم بیشتری را موجب میشود اما تیمار با سیتوکینین TDZ باززایی بیشتر از نوع غیرمستقیم را نشان دادند.
بحث
بذر بارهنگ کبیر به دلیل اهمیت فراوان برای تحقیقات متعددی استفاده میگردد و اغلب از کلکسیونهای خصوصی، باغهای گیاه شناسی و موسسات تحقیقاتی جمعآوری میگردد، همچنین از گیاهان وحشی و یا از پرورش دهندگان متخصص خریداری میشود (10). بنابراین، این بذرها ممکن است از جوانهزنی پایینی برخوردار باشند که خود نیازمند روشی مناسب برای جوانهزنی بذر و تکثیر در شرایط آزمایشگاهی هستند.
برخی از محققین برای افزایش درصد جوانهزنی بذر و به منظور شکستن خواب بذر از GA3 استفاده کردهاند (13).Pons (1992) بیان کرد تأثیر پیش تیمار 10 میلی مولار KNO3 بر جوانهزنی بذرهای بارهنگ کبیر در شرایط نور ناکافی، مفید بوده است (32). همچنین اثر این دو پیش تیمار بر جوانهزنی بذرها آزمایش گردید و یافتههای مطالعه حاضر نشان داد که پیش تیمار با KNO3 باعث افزایش درصد جوانهزنی در مقایسه با پیش تیمارGA3 شد. نتایج محققان نشان داده است که پیش تیمار بذرها در دمای 5 درجه سانتیگراد به مدت 7 تا 14 روز جوانهزنی بارهنگ کبیر را افزایش میدهد (29و 33) و همچنین سرمادهی بذرهای بارهنگ کبیر، جوانه زنی آن را بهبود بخشید (32). در مطالعه حاضر نیز، پیش تیمار سرما، میزان جوانهزنی در هفته اول را 18 درصد افزایش داد، اما در شاهد هیچگونه درصد جوانهزنی مشاهده نشد و همچنین بذرهای سرما دیده نسبت به سایر پیش تیمارها سرعت و درصد جوانهزنی بالاتری داشتند. محققان بیان کردند که پیش تیمار با دمای پایین علاوه بر بهبود جوانهزنی بذور، میتواند القای ساقه و ریشه را نیز بر روی کشتهای کالوس افزایش دهد (11). یافتههای بسیاری از محققان نشان دادند که شرایط تاریکی برای جوانهزنی بذر گیاه بارهنگ مهم است (38و 41) در حالی که در مطالعات دیگر، بیان شد که اکثر بذرهای بارهنگ در شرایط روشنایی طول روز نیز جوانه میزنند و بذرهای بارهنگ کبیر در تاریکی جوانه نزده (4) و یا جوانهزنی اندکی داشتند (5 درصد) (33) .همچنین در مطالعات دیگری گزارش شده است که نور جوانهزنی بذرها را افزایش میدهد (4). نتایج تحقیق فعلی، گزارشهای قبلی محققان درباره گونه بارهنگ کبیر را تأیید میکند، زیرا مشاهده گردید که شرایط روشنایی طول روز (16 ساعت) برای جوانهزنی گیاه مفیدتر بود و علاوه بر جوانهزنی، رشد بهتر گیاه را به همراه داشت. محققان بسیاری از محیطهای مختلفی برای کشتهای درون شیشهای گونههای بارهنگ استفاده کردند از جمله این محیط ها NT (31) وMS (30) هستند (5). با این وجود استفاده از محیط MS ارجح است (24)، محیط MS معمولاً برای مراحل مختلف ریزازدیادی، از جمله القاء کالوس (6)، تکثیر ساقههای جانبی (27) و القاء ریشه (10و 19) در مطالعات تغییر یافته است. دراین پژوهش محیط MS برای کشت این گیاه انتخاب گردید و برای بهینه ساختن شرایط تکثیر و جوانهزدن بذرها، غلظتهای مختلفی از آن تهیه شد. یافتهها بهتر بودن محیط کامل MS را نشان دادند. محققان تنظیم کنندههای رشدی مختلفی را به منظور القاء کالوس و ریشهزایی در ریزنمونههای برگ بارهنگ کبیر آزمایش کردند. بهترین نتیجه از تکثیر کالوس با (2 میلیگرم برلیتر 2,4-D ، به همراه 5/0 میلیگرم برلیتر Kin)، ساقهزایی (5/0 میلیگرم برلیتر IAA به همراه 1 میلیگرم برلیتر Kinو ریشهزایی (2 میلیگرم برلیتر IBA به همراه 1 میلیگرم برلیتر NAA) بدست آمده است (34). محقق دیگری نیز از ریزنمونههای برگ برای القاء کالوس و سپس تکثیر جوانه و تشکیل ریشه استفاده کرد و یافتههای بهینه با استفاده از 8/0 تا 2/1 میلیگرم برلیتر NAA برای القاء کالوس و به همراه 5/3 تا 5/4 میلیگرم برلیتر BAP بدست آمد (20). در مطالعه دیگر کالوسهای بارهنگ کبیر، برای تشکیل ریشه و ساقهزایی بر روی محیط MS به همراه 1میلیگرم برلیتر2,4-D و 5/0 میلیگرم برلیتر BAP زیرکشت شدند و سپس به محیط حاوی 5/0 میلیگرم برلیترBAP منتقل شدند (26). ساقهزایی و ریشهزایی از کشتهای نوک ساقه بارهنگ کبیر بر روی محیطMS تغییریافته به همراه 1/0 میلی گرم برلیتر BAP و سپس 18/0 میلیگرم برلیتر NAA بدست آمد (28). پس از مطالعه نتایج سایر محققان، نتایج ارزشمندی حاصل گردید، که نشان میدهد بارهنگ کبیر پتانسیل خوبی برای تکثیر در شرایط درون شیشهای دارد و میتواند به طور مستقیم و غیرمستقیم اندام زایی کند. ریشهزایی خوب نیز میتواند به دلیل محتوای بالای تنظیم کنندههای رشدی درون زا باشد (7). نتایج سلیمانی و همکارانش (1398) نشان داد که القای اندام هوایی در Narcissus tazetta به مقادیر هورمون NAA وابسته نبوده ولی مقادیر هورمون BAP در القاء موثر بوده است (2). در پژوهش حاضر نیز مشاهده گردید که هورمونBAP به تنهایی باعث ایجاد باززایی مستقیم در ریزنمونههای برگی شده است. بنابراین با مقایسه ترکیبات تنظیم کنندههای رشدی آزمایش شده، بهترین و کارآمدترین ترکیب هورمونی مشخص گردید که باززایی سریعتر و بهتری در این گیاه ایجاد شود. بنابراین، بسیاری از گیاهان باززا شده در مطالعه حاضر در محیط عاری از هورمون ریشهدار شدند به جز در مورد تیمار با TDZ، همانطور که قبلاً بیان شده است که TDZ کاملاً از رشد ریشه جلوگیری میکند (17). همچنین در مطالهای دیگر یافتههای محققان نشان دادند که تمام گیاهچههای باززایی شده از ریزنمونههای سنبل الطیب، به راحتی در محیط فاقد هورمون قادر به ریشه زایی بودند (1).
نتیجه گیری کلی
تحقیقات جامع به منظور بهبود جوانهزنی و روشی بهینه برای القاء کالوس، اندامزایی مستقیم و یا از طریق کالوس میتواند راه گشای انجام مراحل پیشرو در روند تحقیقات درون شیشهای باشد. متابولیتهای ثانویه با ارزشی درP.major وجود دارند که می توان با تولید انبوه از طریق ریزازدیادی، تولید و خالصسازی گردند. این گیاه پتانسیل خوبی برای پاسخ به هورمونهای برون زا نشان داده است و برای تولید نوساقههای فراوان و بازده زمانی کوتاهتر میتوان از ترکیب TDZ/IBA نسبت به دیگر هورمونهای مورد مطالعه استفاده نمود. بنابراین در مطالعات پیشرو قصد داریم بصورت پیوسته روشی بهینه جهت تکثیر ریشههای ترانسژن شده توسط اگروباکتریوم رایزوژنز و ازدیاد این متابولیتهای با ارزش و ارزیابیهای فیتوشیمیایی و دارویی در شرایط درون شیشهای و برون تنی ارائه نماییم.
سپاسگزاری
این مطالعه بخشی از پایان نامه دوره دکتری در دانشگاه زنجان است. همچنین نویسندگان مراتب قدردانی خود را از دانشکده داروسازی ، دانشگاه علوم پزشکی زنجان اعلام می دارند.