Document Type : Research Paper
Authors
1 Department of Biology, Faculty of Science, Ferdowsi University of Mashhad
2 Department of Pharmacognosy, School of Pharmacy, Mashhad University of Medical Sciences
3 Department of Biology, Farhangian University, Tehran
Abstract
Perovskia abrotanoides Kar. is a perennial species, which belongs to Lamiaceae family. Some pharmaceutical properties (antimicrobial, anti-diabetes, anti-inflammatory and anti-cancer activities) attributed to this plant roots are related to the presence of diterpenoid tanshinones. This study was aimed to investigate the effect of single and combination treatments of AgNO3 (Ag+) and yeast extract (YE) on growth and tanshinone production in adventitious root cultures of P. abrotanoides. Leaf explants were induced to form adventitious roots on a solid MS medium containing 2 mg/L NAA. Regenerated roots were subsequently transferred to a liquid MS medium, for multiplication. In the first experiment, adventitious roots were treated with 25 μM Ag+ for 24, 48 and 168 hours (one week), and the one-week treatment was chosen as the best condition to promote root growth and tanshinone production. In combination treatments, 12, 24 and 48 hours after Ag+ pre-treatment, 200 mg/L YE was added to the cultures, and roots were harvested one week after the first elicitation. Single treatments improved root growth and tanshinone production (six-fold increase compared with the control). Maximum amount of tanshinone-IIA (12 times higher than control) was obtained after a one-week treatment with Ag+. Under the combination treatments, amount of different tanshinones varied depending the time period of YE elicitation. In the best case, two-fold increase in total tanshinone content (over the single treatments) was found 12 hours after addition of YE to Ag+-pre-treated cultures, which was due to the remarkable increase in tanshinone-I. No significant changes were measured in cryptotanshinone levels.
Keywords
تولید درون شیشهای تانشینونها در ریشههای نوپدید گیاه برازمبل
(Kar. abrotanoides Perovskia) با استفاده از نیترات نقره و عصاره مخمر
بهناز بایسته1، پروانه ابریشم چی1*، جواد اصیلی2 و آرزو ذاکر3
1 ایران، مشهد، دانشگاه فردوسی مشهد، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی
2 ایران، مشهد، دانشگاه علوم پزشکی مشهد، دانشکده داروسازی، گروه فارماکوگنوزی
3 ایران، تهران، دانشگاه فرهنگیان، گروه آموزش زیست شناسی
تاریخ دریافت: 4/8/1398 تاریخ پذیرش: 5/9/1398
چکیده
گیاه برازمبل (Perovskia abrotanoides Kar.)، گونهای چندساله از تیره نعناعیان (Lamiaceae) است که به خاطر غنی بودن ریشهها از ترکیبات ترپنوئیدی به نام تانشینونها، ویژگیهای دارویی متعددی نظیر خاصیت ضد میکروبی، ضد دیابت، ضد التهاب و ضد سرطان دارد. در پژوهش حاضر، اثر تیمارهای انفرادی و ترکیبی نیترات نقره (Ag+) و عصاره مخمر (YE) بر رشد و تولید تانشینونها در ریشههای نوپدید گیاه برازمبل بررسی شد. ریشههای نوپدید، در محیط کشت MS جامد حاوی mg/L NAA 2، از ریزنمونههای برگ القاء و برای رشد بیشتر و تیمار با تازنها، به محیط MS مایع منتقل شدند. در بخش اول پژوهش، پس از تیمار ریشهها با (Mµ 25) Ag+، به مدت 24، 48 و 168 ساعت، تیمار یک هفتهای با این تازن، بهعنوان بهترین تیمار برای رشد و تولید تانشینونها انتخاب شد. در تیمارهای ترکیبی، افزودن (mg/L 200) YE به محیط، 12، 24 و 48 ساعت پس از پیش تیمار با Ag+ انجام شد و ریشهها یک هفته پس از تیمار با اولین تازن، برداشت شدند. کاربرد انفرادی تازنها رشد ریشهها را بهبود بخشید ومحتوای تانشینون کل را حدود 6 برابر کنترل افزایش داد. نقره با افزایش 12 برابری در تجمع تانشینون II-A، بهترین تیمار برای تولید این متابولیت بود. تیمارهای ترکیبی، بسته به مدت زمان حضور YE، تأثیر متفاوتی بر محتوای تانشینونها داشتند، اما در بهترین حالت (کاربرد YE دوازده ساعت بعد از Ag+)، مقدار کل تانشینونها به 2 برابر تیمارهای انفرادی ارتقاء یافت که ناشی از افزایش چشمگیر تانشینون I بود. هیچکدام از تیمارها تأثیر معنیدار بر مقدار کریپتوتانشینون نداشتند.
واژه های کلیدی:Perovskia abrotanoides ، تانشینون، ریشه نوپدید، نیترات نقره، عصاره مخمر.
* نویسنده مسئول: تلفن: 989151246726+، پست الکترونیک: abrisham@um.ac.ir
مقدمه
کشور ایران به علت تنوع اقلیمی و جغرافیایی خاص خود، رویشگاه بسیاری از گیاهان دارویی است که بخش بزرگی از آنان، بومی ایران هستند. برازمبل (Perovskia abrotanoides Kar.)، گیاه دارویی باارزشی است که در ایران (استانهای گلستان، مازندران، اصفهان، خراسان و سیستان و بلوچستان)، افغانستان، پاکستان، ترکمنستان، قرقیزستان، تبت و هیمالیا پراکنده شده است (1). این گونه، گیاهی معطر، بوتهای-درختچهای و چند ساله متعلق به زیرتیره Nepetoideae از تیره نعناعیان (Lamiaceae) است که در سال 2017، براساس مطالعات فیلوژنتیک مولکولی، به عنوان گونهای از جنس مریم گلی (Salvia) و با نام علمی Salvia abrotanoides (مریم گلی روسی) معرفی شده است (12).
گیاه برازمبل در ایران و سایر کشورهای آسیایی، بهطور سنتی برای درمان مالاریا، سالک، بیماریهای انگلی، تیفوس، تهوع، تصلب شرائین، بیماریهای قلبی و عروقی، فیبروز کبدی، سرفه، عفونت ادراری و به عنوان ضدعفونی کننده آرامبخش، تببر و مسکن درد و التهاب مورد استفاده قرار میگیرد (19، 33و 45). بخش عمدهای از خواص بیولوژیکی و دارویی این گونه را، به حضور ترکیبات فنلی و ترپنوئیدی مختلف در آن، نسبت دادهاند (5و 38).
تانشینونها، دی ترپنهای کینونی هستند که در گیاهان زیرتیره Nepetoidae از تیره نعنائیان و برخی از گیاهان متعلق به تیره گاوزبان (Boraginaceae) یافت میشوند و اولین بار از ریشه گیاه مریم گلی چینی (Salvia miltiorrhiza Bunge) جداسازی شدند. گونه فوق که تاکنون به عنوان غنیترین منبع تانشینون در نظر گرفته شده است، حاوی بیش از 40 نوع مختلف از این متابولیتها از جمله کریپتوتانشینون (CT)، تانشینون I (T-I) و تانشینون II-A (T-IIA) میباشد (22). مقدار تانشینون در ریشه گونههای مریم گلی چینی رشد یافته در طبیعت، در گزارشهای مختلف، تا حدی متفاوت است. در گزارش ژونگ و همکاران (2009)، مجموع مقدار سه تانشینون ذکر شده در بالا، در 74 نمونه از ریشههای این گونه که از مناطق مختلف چین جمعآوری شده بودند، بین 037/0 تا 41/1 درصد وزن خشک ریشه متغیر بود (62). در حالی که در دو بررسی دیگر، این مقدار، معادل 51/0 (8) و 43/0 (52) درصد وزن خشک برآورد شد. وجود CT، T-I، T-IIA و انواع دیگری همانند هیدروکسی کریپتوتانشینون، اکسوکریپتوتانشینون و اکسومیلتیرون در ریشه گیاه برازمبل نیز تائید شده است (39و 55). در گزارش ذاکر و همکاران (2015)، مجموع مقدار CT و T-IIA در ریشه گیاهان خودروی برازمبل، معادل 08/0 درصد وزن خشک ریشه بود (54).
تانشینونها تأثیر محافظت کننده بر سیستم قلب و عروق دارند (15)، ضد دیابت (25)، ضد میکروب، ضد التهاب و آنتیاکسیدان (14و 60) هستند و موجب سمیت سلولی و القای آپوپتوز در ردههای مختلف سلولهای سرطانی میشوند (54و 58).
مراحل بیوسنتز تانشینونها را میتوان در سه بخش معرفی نمود. در ابتدا پیشسازهای سازنده اسکلت ترپنوئیدی یعنی ایزوپنتنیلپیروفسفات (IPP) یا دیمتیلآلیلدیفسفات (DMAPP) از طریق مسیر موالونات (MVA) در سیتوسل و یا از مسیر متیلاریتریتولفسفات (MEP) در پلاستیدها ساخته میشوند. در پائین دست مسیر MVA و MEP، این پیشسازها ابتدا تبدیل به میلتیرادیان (miltiradiene) شده و سپس، به دنبال واکنشهای هیدروکسیلی شدن، دکربوکسیلی شدن و اکسیداسیون-احیای متوالی، به ترتیب CT، T-IIA، تانشینون T-IIB (T-IIB) و T-I به وجود میآیند (22).
تولید متابولیتهای ثانوی مختلف نظیر ترکیبات فنلی و ترپنوئیدها، در مقیاس تجاری، از طریق کشت ریشههای نوپدید گیاهان دارویی، انجام شده است (11و 16). ریشههای نوپدید، یکنواختی ژنتیکی دارند و هنگامیکه در معرض تنظیم کنندههای رشد گیاهی مناسب قرار گیرند، بهخوبی رشد میکنند. استفاده از محرکهای زیستی و غیرزیستی که تحت نام تازن (elicitor) نیز معرفی میشوند، تولید متابولیتهای ثانوی را در ریشههای نوپدید تحریک میکند (31و 41).
پژوهشهای انجام شده با هدف تولید تانشینونها در ریشههای نوپدید و موئین گیاه برازمبل بسیار اندک و محدود به دو گزارش است. ذاکر و همکاران (2015)، با استفاده از تازنهای زیستی و غیرزیستی مختلف از جمله عصاره مخمر (YE) و نیترات نقره (Ag+) تولید CT و T-IIA را در ریشههای نوپدید برازمبل افزایش دادند (55). بنابر گزارش فرج تبار (1396)، تیمار ریشههای موئین برازمبل با غلظت مناسبی از IAA و NAA، منجر به افزایش معنیدار CT شد، در حالی که مقادیر T-I و T-IIA تغییر معنیدار نداشتند یا نسبت به کنترل کاهش یافتند (3). لازم به ذکر است که اغلب بررسیهای انجام شده برای بهینهسازی تولید تانشینونها در شرایط درون شیشه، مربوط به گیاه S. miltiorrhiza است و تأثیر مثبت تازنها و تنظیم کنندههای رشد در تولید این متابولیتها در کشتهای سلول (61) و ریشه مویین (20، 27، 48و 51) آن گزارش شده است.
باتوجه به این که ایران، بهویژه استانهای خراسان، از رویشگاههای اصلی گیاه برازمبل در جهان هستند و این گونه یکی از معدود گیاهانی است که مقادیر قابل توجهی از تانشینونها را در ریشه های خود ذخیره می کند، پژوهش حاضر، ضمن پایدارسازی کشت ریشههای نوپدید این گیاه در شرایط درون شیشه، برای اولین بار تأثیر کاربرد همزمان دو تازن Ag+و YE را جهت ارتقای کمی و کیفی تانشینونها مورد بررسی قرار داد. بدیهی است که این نوع از تحقیقات پایه، با بررسی شرایط لازم برای تولید بهینه تانشینونها در مقیاس تجاری، نهتنها امکان بهرهبرداری از آنها را بدون آسیب رساندن به محیط زیست فراهم میکند، بلکه زمینهساز توسعه و گسترش صنعت گیاهان دارویی، بهعنوان یک منبع درآمد ملی خواهد بود.
مواد و روشها
جمعآوری نمونه گیاهی: بذرهای رسیده گیاه برازمبل از منطقه کلات در استان خراسان رضوی، با طول جغرافیایی "98/7 '52 °59، عرض جغرافیایی "22/3 '38 °36 و ارتفاع 1748 متر از سطح دریا جمعآوری شدند. یک نمونه از گیاه نیز پس از شناسایی، در هرباریوم دانشگاه فردوسی مشهد با شماره 90123 FUMH نگهداری شد.
تولید گیاهچهی سترون و القای ریشه نوپدید از ریزنمونه برگ: برای تولید گیاهچه سترون، از محیط کشت MS 2/1 جامد (30) فاقد هورمون، حاوی 5/0 درصد آگار و 3 درصد ساکارز استفاده شد. ریزنمونههای برگ از گیاهچههای سترون 60-50 روزه، در اندازه cm 1×1، جدا شدند و پس از کشت بر روی محیطکشت MS جامد حاوی 7/0درصد آگار، 3 درصد ساکارز و mg/L NAA 2، در تاریکی و دمای ˚C 25±2 قرارگرفتند. پس از ظهور ریشههای نوپدید (16-14 روز پس از کشت)، قطعاتی به اندازه تقریبی mm 3 از ریشهها جدا و به محیطکشت MS مایع، حاوی mg/L NAA 2 و 3 درصد ساکارز منتقل شدند. نمونهها بر روی شیکر انکوباتور با سرعت rpm 80، دمای ˚C 25±2 و تاریکی قرارگرفتند و هر سه هفته یک بار واکشت شدند.
تیمار ریشههای نوپدید با تازنها: برای استفاده از نقره به عنوان تازن، محلول پایه mM 5/2 نیترات نقره (Merck, K41210612) در آب بدون یون، تهیه شد. بخش کربوهیدراتی عصاره مخمر (Sigma, Y4250) از رسوب آن در اتانل به روش هان و آلبرشیم (1978) به دست آمد (21).
براساس نتایج حاصل از پژوهش قبلی (55)، غلظت µM 25 از نیترات نقره و mg/L 200 از عصاره مخمر، به عنوان بهترین غلظت از این تازنها، برای تحریک تولید تانشینونها در ریشههای نوپدید انتخاب شدند. برای تیمار با تازنها، دو آزمایش طراحی شد. در آزمایش اول، ریشههای نوپدید 21 روزه، با Ag+ تیمار و پس از گذشت 24، 48 و 168 ساعت (یک هفته)، برداشت شدند تا رشد و محتوای تانشینون آنها اندازهگیری شود. پس از آنالیز دادهها، بهترین مدت زمان تیمار با Ag+ (168 ساعت یا یک هفته) تعیین شد و برای آزمایش دوم مورد استفاده قرارگرفت.
در آزمایش دوم، تیمار ترکیبی از این دو تازن انجام شد. ابتدا ریشههای 21 روزه با Ag+ تیمار شدند. سپس 12، 24 و 48 ساعت بعد از افزودن Ag+، YE به محیط کشت وارد شد. در این تیمارها، ریشهها به ترتیب به مدت 5/6 روز (Ag7d+YE6.5d)، 6 روز (Ag7d+YE6d) و 5 روز (Ag7d+YE5d) در معرض YE بودند، ولی مدت زمان تیمار با Ag+ همان هفت روز بود. در یک تیمار هم، Ag+ و YE همزمان به محیط کشت افزوده شدند، یعنی ریشهها به مدت یک هفته، از ابتدا در معرض هر دو تازن بودند (Ag7d+YE7d). در تمام تیمارها، ریشهها یک هفته بعد از اعمال اولین تازن (Ag+) برداشت شدند.
جداسازی و تعیین مقدار ترکیبات تانشینونی در ریشههای نوپدید: جداسازی تانشینونها با حلال متانل به روش فراصوت انجام شد (55). شناسایی تانشینونها توسط دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) (Smartline, Germmany Kenuer) مجهز به پمپهای چهارگانه و ستون فاز معکوس Eurospher-100 C18 (mm 4×mm 125، اندازه ذرات mµ 5) و آشکارساز (D14163) UV-VIS در طول موج nm270 انجام شد. استونیتریل و آب اسیدی شده با اسید استیک 1/0 درصد با زمان-بندی گرادیانی، به عنوان فاز متحرک انتخاب شدند. میزان جریان، mL 1 در دقیقه و حجم تزریق، µL 20 بود. تزریق نمونهها به دستگاه، در دمای محیط انجام شد و سه با تکرار گردید. پس از تهیه غلظتهای مختلف از سه استاندارد مورد استفاده شامل T-I (محدوده غلظت µg/ml80-20)، T-IIA (محدوده غلظت µg/ml30-10) و CT (محدوده غلظت µg/ml80-20) در اتانل مطلق، و تزریق آنها به دستگاه، منحنیهای استاندارد براساس سطح زیر قله کروماتوگرام در برابر غلظت رسم شدند. سپس، مقدار سه تانشینون مورد بررسی در نمونهها، به ترتیب با استفاده از معادلات خط X22523Y=، X106175Y= و X109103Y= محاسبه شدند.
طرح آزمایش و تحلیل آماری دادهها: آزمایش اول در قالب طرح بلوکهای کامل تصادفی و آزمایش دوم در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار برای هر تیمار انجام شدند. تحلیل آماری دادهها در آزمایش اول با استفاده از آزمون T-Student و در آزمایش دوم، با آزمون واریانس یک طرفه (ANOVA) در سطح احتمال 05/0 توسط نرم افزارSPSS (ویرایش 25) انجام شد. میانگینها توسط آزمون چند دامنهای دانکن (DMRT) با سطح اطمینان 95 درصد مقایسه شدند.
نتایج
القا و رشد ریشههای نوپدید: تشکیل ریشههای نوپدید از ریزنمونه برگ، در محیط کشت MS جامد حاویNAA mg/L 2، دو هفته بعد از کشت آغاز گردید و پس از 40 روز، بر روی 60 درصد از ریزنمونهها، ریشههای نوپدید تشکیل شدند (شکل 1).
آزمایش اول
تأثیر مدت زمان تیمار با تازن غیرزیستی Ag+ بر رشد و محتوای تانشینون ریشههای نوپدید: براساس آزمون تی (t-student)، مدت زمان تیمار با غلظت ثابتی (µM 25) از Ag+، بر رشد و محتوای ریشههای نوپدید تأثیر معنیدار (05/0P<) داشت (جدول 1). اگرچه تیمارهای 24 و 48 ساعته با Ag+ اثر مثبتی بر وزن ریشهها در مقایسه با شاهد نداشتند، تیمار یک هفتهای با تازن، موجب افزایش معنیدار وزن تر و خشک ریشهها، نسبت به کنترل شد. بیشترین وزن تر (g 772/11) و وزن خشک (g 657/0) برای ریشهها در تیمار اخیر مشاهده شد، در حالیکه کمترین وزن تر و خشک (به ترتیب 326/ 6 و 44/0 گرم) مربوط به ریشههایی بود که 48 ساعت با تازن تیمار شدند (جدول 1).
با افزایش زمان حضور تازن در محیط کشت، محتوای CT در ریشهها افزایش یافت، اما از نظر آماری معنیدار نبود. بیشترین مقدار CT (µg/g DW 56/5)، متعلق به ریشههایی بود که یک هفته در معرض تازن بودند. حضور Ag+ در محیط کشت ریشههای نوپدید، به مدت 48 و 168 ساعت، منجر به افزایش معنیدار مقدار T-I در مقایسه با کشتهای کنترل شد. بیشترین (µg/g DW 973/26) و کمترین (µg/g DW 31/23) مقدار این متابولیت، به ترتیب مربوط به تیمارهای 48 و 168 ساعته با تازن بود. یک هفته پس از حضور Ag+ در محیط کشت، محتوای T-IIA (µg/g DW 223/18) بهطرز چشمگیری بیشتر از ریشههای کنترل (µg/g DW 486/1) بود، اما در تیمارهای کوتاه مدت 24 و 48 ساعته، تغییرات مشاهده شده در مقدار T-IIA، معنیدار نبودند. مطابق جدول 1، با افزایش مدت زمان تیمار با Ag+، مجموع مقدار سه نوع تانشینون مورد بررسی در ریشههای نوپدید افزایش یافت و این افزایش مقدار، 48 و 168 ساعت پس از تیمار، نسبت به کنترل، معنیدار بود. مقدار کل تانشینونها، پس از یک هفته تیمار، به حداکثر (µg/g DW 103/47) رسید.
شکل1- ریشههای نوپدید باززایی شده از ریزنمونه برگ گیاه P. abrotanoides، الف: 30روز پس از کشت در محیط MS جامد حاویNAA mg/L 2 (بزرگ نمایی4/1 ×) و ب: 50 روز پس از واکشت در محیط MS مایع حاویNAA mg/L 2 (بزرگ نمایی3/1 ×)، فلش نشاندهنده ریشههای نوپدید است.
جدول 1- نتایج آزمون تی دادههای حاصل از بررسی تاثیر زمان تیمار با تازن غیرزیستی نیترات نقره (µM 25)، بر رشد و مقدار تانشینون ریشههای نوپدید P. abrotanoides
مقادیر تی |
||||||
تیمار |
وزن تر (g) |
وزن خشک (g) |
کریپتوتانشینون (g/g DWµ) |
تانشینون I (g/g DWµ) |
تانشینون IIA (g/g DWµ) |
مجموع سه تانشینون (g/g DWµ) |
Control 24h AgNO3 24h |
05/8 ns 11/7 |
54/0 ns47/0 |
77/1 ns 11/2 |
69/26 ns 57/23 |
4/2 ns 98/2 |
86/30 ns 66/28 |
Control 48h AgNO3 48h |
61/6 *33/6 |
49/0 ns44/0 |
37/3 ns 57/2 |
78/11 *97/26 |
66/6 ns 03/10 |
80/21 *59/39 |
Control 168h AgNO3 168h |
66/7 *77/11 |
51/0 *66/0 |
06/4 ns 56/5 |
43/1 *31/23 |
49/1 *22/18 |
98/6 *10/47 |
ns و * به ترتیب، بیانگر عدم معنیداری و معنیداری در سطح اطمینان 95 درصد هستند.
در مجموع، آزمایش اول نشان داد که تیمار ریشهها با غلظت µM 25 از Ag+، به مدت یک هفته، بهترین شرایط از نظر رشد ریشه و محتوای تانشینون بود. در ادامه کار، این شرایط برای انجام آزمایش دوم انتخاب شد تا تأثیر تیمار ترکیبی YE+Ag+که در آن YE با فواصل زمانی متفاوت به کشتهای حاویAg+ اضافه میشد، بر رشد و محتوای تانشینون ریشهها بررسی شود.
آزمایش دوم
تأثیر تیمار ترکیبی YE+Ag+ و مدت زمان تیمار با YE بر رشد و محتوای تانشینون ریشههای نوپدید: تیمار ترکیبی YE+Ag+ و مدت زمان حضور (mg/L 200 )YE در محیط کشت، تأثیر معنیداری (05/0P<) بر رشد و محتوای تانشینون ریشهها داشت.
کروماتوگرام HPLC تانشینونهای استاندارد و عصاره متانلی ریشههای نوپدید در حضور (µM 25) Ag+ و (mg/L 200)YE مربوط به تیمار ترکیبی Ag7d+YE6.5d (بهترین تیمار از نظر رشد و تولید تانشینون در ریشه) در شکل 2 نشان داده شده است.
1 |
2 |
3 |
الف |
1 |
2 |
3 |
ب |
شکل 2- الف: کروماتوگرام HPLC متعلق به تانشینونهای استاندارد و ب: کروماتوگرام HPLC عصاره متانلی ریشههای نوپدید گیاه P. abrotanoides، متعلق به تیمار ترکیبی Ag7d+YE6.5d. Ag: نیترات نقره با غلظت µM 25، YE: عصاره مخمر با غلظت mg/L 200،d : مدت زمان حضور تازن در محیط کشت (روز)، قله شماره 1: کریپتوتانشینون، قله شماره 2: تانشینون I و قله شماره 3: تانشینون IIA
در حضور Ag+، با طولانی شدن زمان تیمار با YE از 5 روز تا 5/6 روز، وزن تر و خشک ریشهها نسبت به کنترل افزایش معنیدار داشت، اما پس از هفت روز، مجدداً وزن ریشهها کاهش یافت. بیشترین وزن تر و خشک ریشه (به ترتیب 727/12 و 781/0 گرم) مربوط به کشتهای حاوی YE به تنهایی (YE7d) بود که تفاوت معنیداری با تیمار ترکیبی Ag7d+YE6.5dنداشت. کمترین وزن تر و خشک (به ترتیب 661/7 و 506/0 گرم) در کشتهای کنترل فاقد تازن اندازهگیری شد (شکل 3 الف و ب).
تیمارهای انفرادی Ag+ و YE، تأثیر معنیداری بر محتوایCT در ریشههای نوپدید نداشتند. حضور همزمان این دو تازن در محیط کشت نیز نتوانست افزایش معنیداری در مقدار این متابولیت ایجاد کند (شکل 4 الف). بهطور کلی، YE بهصورت انفرادی و توام با Ag+، اثر تحریکی بر تولید T-I داشت (به استثنای تیمار Ag7d+YE5d) و این تأثیر با افزایش زمان تیمار از 5 تا 5/6 روز، چشمگیرتر شد، اگرچه در پایان هفتمین روز (تیمار Ag7d+YE7d) مقدار آن تا حدی کاهش یافت. بنابراین بیشینه تراز T-I (µg/g DW 55/82) در تیمار (Ag7d+YE6.5d) و کمینه تراز آن (µg/g DW 763/1) در کشتهای کنترل فاقد تازن سنجش شد (شکل 4 ب).
الف |
ب |
شکل 3- تأثیر تیمارهای انفرادی و ترکیبی نیترات نقره و عصاره مخمر بر وزن تر (الف) و وزن خشک (ب) ریشههای نوپدیدP .abrotanoides، دادهها میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. براساس آزمون دانکن، حروف یکسان نشان دهنده عدم تفاوت معنیدار (05/0<P) میباشند. Ag: نیترات نقره با غلظت µM 25، YE: عصاره مخمر با غلظت mg/L 200، d: مدت زمان حضور تازن در محیط کشت (روز)
حضور توأم YE و Ag+، در مقایسه با تیمار انفرادی Ag+، موجب کاهش معنیدار در محتوای T-IIA شد. به علاوه، با افزایش زمان حضور YE در محیط (از 6 تا 7 روز)، کاهش معنیداری در مقدار این تانشینون مشاهده شد. به این ترتیب، بیشترین مقدار این متابولیت (µg/g DW 223/18) مربوط به ریشههایی بود که به مدت یک هفته فقط با Ag+ تیمار شده بودند (شکل 4 ج).
الف |
ب |
ج |
شکل 4- تاثیر تیمارهای انفرادی و ترکیبی نیترات نقره و عصاره مخمر بر محتوای کریپتوتانشینون (الف)، تانشینون I (ب) و تانشینون IIA (ج) در ریشههای نوپدید P .abrotanoides، دادهها میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. براساس آزمون دانکن، حروف یکسان نشان دهنده عدم تفاوت معنیدار (05/0<P) میباشند. Ag: نیترات نقره با غلظت µM 25، YE: عصاره مخمر با غلظت mg/L 200، d: مدت زمان حضور تازن در محیط کشت (روز)
اگرچه Ag+ و YE به تنهایی تأثیر مثبت و معنیداری بر مجموع مقدار سه تانشینون مورد بررسی داشتند (در مقایسه با کنترل فاقد تازن)، اما افزایش قابل ملاحظه در مقدار کل این ترکیبات (نسبت به تیمارهای انفرادی و کنترل فاقد تازن) فقط در تیمار Ag7d+YE6.5d مشاهده شد که در آن، بیشینه تراز تانشینونها معادل µg/g DW 133/92 بود. حداقل مقدار تانشینون کل (µg/g DW 309/7) متعلق به کشتهای کنترل فاقد تازن بود (شکل 5).
شکل 5- تأثیر تیمارهای انفرادی و ترکیبی نیترات نقره و عصاره مخمر بر مجموع محتوای سه نوع تانشینون در ریشههای نوپدید P .abrotanoides، دادهها میانگین سه تکرار ± انحراف معیار هستند. براساس آزمون دانکن، حروف یکسان نشان دهنده عدم تفاوت معنیدار میباشند (05/0<P). Ag: نیترات نقره با غلظت µM 25، YE: عصاره مخمر با غلظت mg/L 200، d: مدت زمان حضور تازن در محیط کشت (روز)
بحث
فلزات سنگین، تولید ROS را تحریک میکنند و موجب القای تنش اکسیداتیو میشوند و این امر در شرایط کنترل شده، میتواند راهبرد موثری برای تولید متابولیتهای ثانوی گیاهی باشد (2). نیترات نقره به دلیل جلوگیری از عملکرد اتیلن تولید شده در بافتها و ممانعت از بروز پاسخهای وابسته به آن (نظیر به تأخیر انداختن یا کند کردن رشد، تسریع پیری)، در کشت بافت و اندامهای گیاهی مورد استفاده قرار میگیرد. یون نقره با تداخل در عملکرد اتیلن، بیوسنتز متابولیتهای ثانوی را نیز، با یک روش وابسته به غلظت، تحت تأثیر قرار میدهد (4). در دسترس بودن، حلالیت در آب، پایداری و فقدان سمیت در غلظتهای موثر بر باززایی گیاهان، موجب شده است که این ماده بهطور گسترده توسط بسیاری از محققان برای تحریک رشد، ریختزایی و باززایی گیاهان بهکار گرفته شود (4و 26). تأثیر مثبت نیترات نقره، بر باززایی و رشد ریشههای نوپدید، در کشتهای درون شیشهای گیاهان مختلف، گزارش شده و در این رابطه، غلظت بهینه نیترات نقره و گستردگی و شدت پاسخ گونههای گیاهی مختلف، متفاوت بوده است (13، 29، 34و 42).
یون نقره به علت شباهتی که از نظر اندازه و حالت اکسیداسیون با یون مس دارد، برای اتصال به پذیرنده های هورمون اتیلن، با مس، که نقش کوفاکتور را در اتصال هورمون/پذیرنده دارد، رقابت میکند و به عنوان پادکردار (آنتاگونیست) با عملکرد اتیلن، موجب عدم حساسیت سلولها و فروتنظیمی پاسخ به این هورمون میشود (26و 44). به علاوه، تحریک بیوسنتز پلیآمینها در سلول (7و 29) و کنترل برون شارش و حرکت قطبی اکسین در بافتها (43) نیز، به عنوان مکانیسمهای احتمالی تأثیر مثبت نیترات نقره بر باززایی و رشد اندامهای گیاهی گزارش شده اند.
مطالعه تأثیر Ag+ به عنوان یک تازن غیرزیستی، و YE به عنوان یک تازن زیستی، بر رشد و تولید تانشینون در ریشههای نوپدید گیاه برازمبل، محدود به گزارش ذاکر و همکاران (2015) و نتایج پژوهش حاضر است. این محققان، تأثیر معنیداری از کاربرد انفرادی این دو تازن را بر رشد ریشهها گزارش نکردند (55)، اما بررسی پیش رو نشان داد که Ag+ و YE، هرکدام به تنهایی، رشد ریشهها را بهطرز معنیداری بهبود بخشیدند و کاربرد توأم این دو تازن نیز، بسته به مدت زمان حضور YEدر محیط کشت، تأثیر مثبتی بر رشد ریشههای نوپدید داشت و در بهترین حالت، (تیمار Ag7d+YE6.5d) وزن خشک ریشهها 5/1 برابر ریشههای کنترل بود. سایر گزارشها نیز، حاکی از نتایج متفاوت درمورد تأثیر این دو تازن بر رشد ریشههای نوپدید یا ریشههای موئین میباشند. برای مثال، طبق گزارش ژانگ و همکاران (2004)، تیمار ریشههای مویین گیاه S. miltiorrhiza با (µM40-15) Ag+ ، بهصورت وابسته به غلظت، رشد ریشهها را کاهش داد (56). بهطور مشابه، کاهش زیتوده ریشههای موئینS. castanea Diels f. tomentosa Stib نیز در غلظتهای µM45-15 از این تازن گزارش شد (27). در مقابل، طبق یافتههای یانگ و همکاران (2018)، تیمار با (µM 15) Ag+ اثر معنیداری بر وزن خشک ریشه مویین S. miltiorrhiza نداشت، اما یک روز بعد از تیمار، باعث افزایش وزن خشک ریشههای مویین در گونه S. castanea شد (51). به گزارش چن و همکاران (2001)، اثر تحریکی YE بر رشد ریشه موئین
S. miltiorrhiza موجب شد که تولید زیتوده از g/L9/3 به g/L 3/7 بهبود یابد (9). بهبود رشد ریشه موئین S. miltiorrhiza وS. castanea در تیمار mg/L 200 از این تازن نیز گزارش شده است (51). برخلاف موارد فوق، شی و همکاران (2007)، کاهش وزن تر و خشک ریشههای موئین S. miltiorrhiza را در غلظت mg/L 100 از YE گزارش کردند (40). کاهش رشد ریشههای موئین این گونه، تحت تأثیر تیمارهای انفرادی و یا ترکیبی از (µM30) Ag+ و (mg/L 100) YE توسط محققان دیگر نیز گزارش شده است (18و 47).
بررسی منابع نشان میدهد که استفاده از انواع تازن های زیستی نظیر YE و تازنهای غیرزیستی مانند Ag+ موجب بهبود تولید تانشینون در برخی گونههای Salvia میشود و بسته به نوع و غلظت تازن، دوره زمانی تیمار با تازن و همچنین حضور انفرادی یا توام آنها، درجات متفاوتی از افزایش تولید برای انواع مختلف تانشینون گزارش شده است (27، 51و 61). در پژوهش حاضر، محتوای انواع تانشینون در ریشههای نوپدید گیاه برازمبل، تحت تأثیر تیمارهای انفرادی و ترکیبی YE و Ag+ بهطور متفاوتی تغییر کرد. در کاربرد انفرادی تازنها، Ag+ محتوای تانشینون کل (مجموع CT، T-I و T-IIA) را تا 4/6 و YE تا 2/6 برابر ریشههای کنترل افزایش داد. ذاکر و همکاران (2015) نیز، درحضورغلظت های مشابه از Ag+ و YE، دریافتند که مجموع مقدار CT و T-IIA در ریشه های نوپدید برازمبل، به ترتیب تا حدود 3 و 5/3 برابر کشتهای کنترل بهبود مییابد (55). بخش اعظم تحقیقات انجام شده در مورد تأثیر تازنها بر کمیت و کیفیت تانشینونها، مربوط به گونه S. miltiorrhiza میباشد که جهت مقایسه با نتایج مطالعه حاضر، در ادامه به آنها اشاره میشود. تیمارهای انفرادی (µM 25) Ag+ و (mg/L 100) YE، توسط ژائو و همکاران (2010)، محتوای تانشینون (مجموع CT، T-Iو T-IIA) را در کشتهای سلولی این گونه، تا 5/11 برابر مقدار کشتهای کنترل ارتقا دادند (61). به گزارش کای و همکاران (2012) نیز، غلظت µM 30 از Ag+ ، پس از 9 روز، مقدار کل تانشینون (CT+T-IIA) ریشههای موئین را تا 2/2 برابر کنترل افزایش داد، در حالیکه غلظت mg/L 100 از YEدر مدت زمان کوتاهتر (6 روز) تأثیر بیشتری (9/3 برابر کنترل)، بر انباشت تانشینون داشت (23). در یک بررسی دیگر، (mg/L 100) YE، تأثیر قویتری بر مجموع مقدار CT، T-I و T-IIA در کشت ریشه موئین داشت و محتوای تانشینون کل را تا 1/3 برابر کنترل افزایش داد، اما در حضور (µM 30) Ag+، مقدار کل تانشینون به 2/1برابر ریشه های کنترل رسید (18). اخیرا در یک تحقیق مشابه، افزایش 3/2 و 5/2 برابری در تراز تانشینون کل (مجموع CT، T-I، D-TI و T-IIA)، به ترتیب در حضور (mg/L 100) YE و (µM 30) Ag+ گزارش شده است (47). در مقابل، در گزارش زینگ و همکاران (2015)، بالاترین تراز برای مجموع تانشینونهای فوق، در غلظت کمتری از (µM 15) Ag+ به دست آمد (48).
در بررسی حاضر، تأثیر Ag+ بر T-IIA (31/12 برابر کنترل)، بسیار بیشتر از تأثیر YE (2/4 برابر کنترل) بود. در حالیکه، هر دو تازن تأثیر افزاینده مشابهی بر محتوای T-I داشتند. مقادیر مربوط به CT بهطور مشخصی کمتر از دو تانشینون دیگر بود و تیمارها، تأثیر معنیداری بر تولید آن نداشتند. تأثیر بهتر Ag+ بر تجمع T-IIA و YE بر انباشت CT در ریشه های نوپدید برازمبل (55)، ریشه های موئین S. castanea (27) و ریشههای موئین S. miltiorrhiza (51) نیزگزارش شده است. یافتههای پژوهش پیش رو، مشابه با نتایج گزارش یانگ و همکاران (2018) در گونه S. miltiorrhiza (51) نشان داد که T-I به یک میزان تحت تأثیر Ag+ و YE قرار میگیرد. در مقابل، به گزارش جی و وو (2005)، (mg/L 100) YE، در مقایسه با (µM 30) Ag+، تأثیر قویتری بر تجمع CT، T-I و T-IIA در ریشههای موئین S. miltiorrhiza داشت (18).
برتری تیمارهای ترکیبی از تازنها، بهویژه ترکیب تازنهای زیستی با انواع غیرزیستی، نسبت به تیمارهای انفرادی، در جهت بهبود تولید تانشینونها در منابع مطرح شده است و در اغلب موارد، کاربرد YE به عنوان تازن زیستی در کنار یک تازن غیرزیستی نظیر نقره، کبالت یا کادمیم، اثر همکرداری (سینرژیسم) بر تولید تانشینونها دارد (32و 61). برای مثال، در کشتهای ریشه موئین S. miltiorrhiza، تیمار ترکیبی YE+Ag+ با ثابت سینرژیسم 3، بیشترین تأثیر را بر T-I داشت و ترکیب YE+Co، با ثابت سینرژیسم 1/2، موجب تقویت تولید T-IIA شد (50). در یک بررسی دیگر، تیمار ترکیبی YE+Ag+، مجموع مقدار CT و T-IIA در ریشه های موئین همین گیاه را تا حدود 6 برابر تیمار Ag+ به تنهایی و بیش از 3 برابر تیمار انفرادی YE، ارتقا داد (23). قابل ذکر است که در این نوع مطالعات، همه ترکیبهای ممکن از تازنها، لزوماً اثر تحریک کننده بر تجمع تانشینون ندارند. بهکارگیری ترکیبهای دوتایی و سهتایی از Ag+، YE و متیلجاسمونات (MeJA) در کشت ریشه موئین S. miltiorrhiza، توسط چنگ و همکاران (2013) نشان داد که فقط تیمارهای ترکیبی واجد Ag+، بهصورت همکردار انباشت تانشینون را افزایش میدهند. بهعلاوه، در برخی تیمارهای ترکیبی، در مقایسه با تیمارهای انفرادی، تولید انواعی از تانشینونها ممانعت شد (10). در بررسی پیش رو، هنگامی که YE، 12 ساعت پس از Ag+ (Ag7d+YE6.5d) به کشت ریشههای نوپدید برازمبل اضافه شد، مقدار تانشینون کل به 2 برابر تیمارهای انفرادی این دو تازن ارتقا یافت که ناشی از افزایش قابلتوجه T-I (5/3 برابر تیمار Ag+ و 4/2 برابر تیمار YE) بود اما، هیچکدام از تیمارهای ترکیبی ، تیمار بهینه برای انباشت CT و T-IIA نبودند.
تأثیر تازنها بر تولید تانشینون در ریشهها، تابع زمان
حضور آنان در محیط کشت است (27و 32). بررسی منابع نشان داد که در اغلب موارد، هنگام کاربرد ترکیبی تازنها، این مواد بهطور همزمان به کشتهای ریشه افزوده شدهاند. در تحقیق حاضر، تأثیر فاصله زمانی بین تیمار با دو نوع تازن مختلف نیز مورد بررسی قرارگرفت و مشخص شد که همزمان یا غیر همزمان بودن تیمارهای ترکیبی، اثر متفاوتی بر پروفایل تانشینونی ریشهها دارد. استفاده از YE، 12 ساعت پس از کاربرد Ag+ (Ag7d+YE6.5d)، مقدار T-I را بشدت افزایش داد اما موجب کاهش T-IIA شد. طبق گزارش جی و وو (2005)، افزودن (µg/ml100) YE به کشت ریشههای مویین S. miltiorrhiza پس از پیش تیمار با (µM 30) Ag+، تولید CT، T-I و T-IIA را بهبود بخشید و با افزایش فاصله زمانی بین کاربرد دو تازن، (از 12 تا 48 ساعت) محتوای تانشینونها بهطرز پیشروندهای افزایش یافت. به عقیده آنان، پیش تیمار با Ag+ که مانند یک تنش غیرزیستی عمل میکند، سلولها را برای پاسخ به YE، به عنوان یک عامل تنشزای زیستی، حساستر کرده، پاسخ متابولیکی قویتری را به راه میاندازد (18).
تفاوت در پاسخهای متابولیکی داده شده به تازنها، آنچنان که در نتایج پژوهش حاضر نیز مشاهده شد، احتمالاً ناشی از تأثیر متفاوت این عوامل بر بیان ژن آنزیمهای کلیدی مسیر بیوسنتز تانشینونها میباشد. براساس تحقیقات متعدد، ژنهایی از مسیر که تحت تأثیر تازن غیرزیستی Ag+ قرار میگیرند، لزوماً همان ژنهای پاسخ دهنده به تازن زیستی YE نیستند و شدت تأثیر پذیری آنها نیز در مواجهه با این دو نوع محرک متفاوت، یکسان نمیباشد (23، 24و 51). برای مثال، به گزارش جی و وو در سال 2005، پیش تیمار ریشههای موئین S. miltiorrhiza با Ag+ موجب افزایش فعالیت آنزیمهای مسیر MVA شد و افزودن YE یک و دو روز پس از تیمار Ag+ (تیمار ترکیبی)، با القای فعالیت آنزیمهای مسیر MEP، محتوای تانشینون ریشهها را بهبود بخشید (18). مطابق با یافتههای ژائو و همکاران (2014)، تحت تیمار ترکیبی YE+Ag+، ابتدا یک فراتنظیمی اولیه ولی موقتی در ژنهای مسیر MVA و به دنبال آن، افزایش تدریجی اما پایدار ژنهای مسیرMEP، و آنزیمهای پائین دست مسیر که بعد از تولید GGPP عمل میکنند، روی داد که با افزایش محتوای تانشینونها درریشههای موئین S. miltiorrhiza، منطبق بود (17). افزایش محتوای CT توسط YE، در مقایسه با انباشتT-IIA تحت تاثیر Ag+، در ریشههای موئین
S. castanea، به تفاوت در نحوه تأثیر این دو تازن بر بیان دو ژن متوالی مسئول سنتز GGPP نسبت داده شد (27).
تغییر محتوای تانشینونها (افزایش یا حتی کاهش) تحت تأثیر تنشهای زیستی و غیرزیستی طبیعی یا القاء شده توسط تازنها، نتیجه فراتنظیمی (یا فروتنظیمی) هماهنگ ژنهای خاصی در مسیر است که با دخالت عوامل رونویسی (TFs) انجام میشود. در سالهای اخیر، TFs مرتبط با مسیر بیوسنتز تانشینونها تا حد زیادی در
S. miltiorrhiza وS. castanea شناسایی شده و رابطه میان طرح بیان آنها با بیوسنتز تانشینونها مورد مطالعه قرارگرفته است. این مطالعات نشان دادهاند که در پاسخ به نقره و عصاره مخمر، فراتنظیمی یا فروتنظیمی TFs متعلق به خانوادههای WRKY (17)، bZIP (59)، MYB و bHLH (49، 57)، بیان ژنهای کلیدی مسیر و محتوای انواع تانشینون را در ریشههای موئین تحت تأثیر قرار میدهد.
تازنهای زیستی و غیرزیستی در حقیقت از تنشهای محیطی واقعی تقلید میکنند و کاربرد همزمان آنها در کشتهای درون شیشه گیاهان، بهصورتی مشابه با عوامل محیطی زنده و غیرزنده، مسیرهای علامتی متعدد و متفاوتی را بهراه میاندازد (36). تأثیر تحریکی YE بر تولید متابولیتهای ثانوی، ناشی از حضور اجزای پپتیدی و پلی ساکاریدی مختلف از جمله کیتین، الیگومرهای N-استیل گلوکزآمین، بتاگلوگانها، گلیکوپپتیدها، ارگوسترول و کاتیونهایی مانند کلسیم، کبالت و روی در آن است (6و 37) که پاسخهای دفاعی را در گیاهان القا مینمایند. تیمار ریشههای موئین S. miltiorrhiza با YE، تولید گونههای واکنشگر اکسیژن (ROS) و نیتروژن (RNS) را بهعنوان مولکولهای علامتی تحریک میکند. نقش نیتریت اکسید در تحریک بیان ژنهای مسیر MVA و MEP و انباشت تانشینونها بهویژه CT و T-IIA (28) و میانجیگری H2O2 و آنیون سوپراکسید به عنوان مولکولهای علامتی در تجمع تانشینونها اثبات شده است (53). طبق گزارش وانگ و همکاران (2016)، 3 تا 5 دقیقه پس از اعمال تیمار ترکیبی YE+Ag+، غلظت کلسیم سیتوپلاسمی در ریشههای موئین S. miltiorrhiza بشدت زیاد شد و با القای مسیر علامت رسانی وابسته به کلسیم و کالمودولین و تحریک تولید ROS، سنتز تانشینونها و اسیدهای فنلی بهبود یافت (46). بررسی مکانیسم تأثیر Ag+ و YE بر تولید متابولیتهای ثانوی، مسیرهای علامتدهی وابسته به ROS، کلسیم و آبشارهای پروتئین کینازی (MAPKs) را بهعنوان اصلیترین وقایع مولکولی در پاسخ به تازن معرفی کرده است (36). از طرف دیگر، مسیرهای علامتی بهراه افتاده توسط این دو تازن، با ترارسانی علامت هورمونهای گیاهی، نظیر جاسمونیک اسید و اتیلن، نیز برهمکنش دارند (35، 36). بنابراین، ترارسانی علامت القاء شده توسط تازنها، شبکهایی چندجزیی از مسیرهای متعدد موازی و متقاطع است که با اثرات همکردار و یا پادکردار خود، بیان ژنها و پاسخهای متابولیکی متنوعی را هدفگیری و تنظیم میکند. این احتمال وجود دارد که تحریک تولید تانشینونها توسط YE و Ag+، در ریشههای نوپدید گیاه برازمبل نیز، از طریق القای مسیرهای علامتدهی و بیان ژنهای بیوسنتزی، مشابه با آن چه برای گیاه S. miltiorrhiza شناخته شده است، میانجیگری شود.
نتیجهگیری
استفاده از نیترات نقره به مدت یک هفته بدون ایجاد علائم سمیت، توانست رشد و زیتوده ریشههای نوپدید برازمبل را بهبود بخشد و افزودن عصاره مخمر به محیط کشت، 12 ساعت پس از شروع تیمار با نقره، این تأثیر را تقویت نمود و مقدار T-I و مجموع محتوای سه نوع تانشینون مورد بررسی را به حداکثر رساند. نتایج پژوهش حاضر، ضمن تائید تأثیر مثبت تازن غیرزیستی نیترات نقره و تازن زیستی عصاره مخمر، بر تولید تانشینون در گیاه برازمبل، نشان داد که با بهکارگیری روشی مشابه با پرایمینگ بذر، یعنی پیش تیمار ریشهها با تازن غیرزیستی و بهدنبال آن افزودن تازن زیستی، با فواصل زمانی متفاوت، میتوان علاوه بر افزایش محتوای کل تانشینونها، پروفایل تانشینونی ریشهها را نیز متناسب با اهداف پژوهشی و کاربردی تغییر داد و تراز نوع (انواع) خاصی از تانشینون را بهطور ویژه بهبود بخشید.
سپاسگزاری
پژوهش حاضر، در دانشگاه فردوسی مشهد انجام شد و اعتبار آن از محل طرح 40432/3 تأمین گردید. شناسایی تانشینونها توسط دستگاه HPLC در آزمایشگاه شیمی دانشکده علوم دانشگاه شاهد انجام شد.